JP2010088454A - フローサイトメトリーを用いるdna多型の同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ミクロスフェア上に固定されるように設計されたプライマーが、調査中のDNAストランドにアニールされ、蛍光デオキシヌクレオチドを用いてDNAポリメラーゼにより伸長されるか、または蛍光リポーターオリゴヌクレオチドへDNAリガーゼによりライゲーションされる。固定されたプライマーに連結された、デオキシヌクレオチドか、またはリポーターオリゴヌクレオチドが、フローサイトメトリ−により測定され、それにより、DNAストランド上のヌクレオチド多型が同定される。
【選択図】なし
Description
本発明は、概して、DNAヌクレオチド塩基組成の決定のためのフローサイトメトリーの用途、より詳しくは、ヌクレオチド多型、挿入および欠失を含む、1ヌクレオチド多型の塩基を同定するためのフローサイトメトリーの用途に関する。本発明は、米国エネルギー省によりカリフォルニア大学の評議員(Regent)に与えられた契約No.W−7405−ENG−36において政府の支持によりなされた。
固定化プライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定
さて、添付の図面に説明するように本発明の好ましい実施の態様を詳細に言及していく。図に戻って、図1aは、ミクロスフェア上に固定されたプライマーが、少なくともその1つが蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下で、調査中のDNA配列とのハイブリダイズするために用いられている、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。プライマーは、ポリメラーゼの作用により、1塩基だけ伸長される。図1bは、その結果、フローサイトメトリーを用いて検出されることができる末端に結合した1つの蛍光ジデオキシヌクレオチドを有するプライマーの略図であり、およびDNA上のSNPに相補的な塩基を表わしている。サンプルDNA鋳型は、まず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびPCRプライマーをそれぞれ除去するために小エビ(shrimp)アルカリホスファターゼ(SAP)およびエキソヌクレアーゼI(ExoI)で処理される。調査中のDNAストランド上の特定の部位に応答するように設計されるミニ配列決定プライマーが、架橋試薬(たとえば、カルボジイミド)を用いてカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア上の5′−アミノ基により固定される。プライマーを運ぶミクロスフェア(5μl)を、増幅されたDNA(1μl、1nM)、DNAポリメラーゼ(1単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム ライフ サイエンス(Amersham Life Sciences)製、クリーブランド(Cleaveland)、オハイオ州(OH))、1つの蛍光標識化ddNTP(5μM)、他の3つの非蛍光ddNTPの各5μM、および緩衝液(サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製)に添加し、合計容量10μlとする。この工程は、4つの蛍光ddNTPのおのおのを用いて3回繰り返された。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、94℃で10秒間、および60℃で10秒間、99回繰り返される。各反応混合物の2μlをTEB緩衝液(50mMトリス(Tris)−HCl、pH8.0、0.5mM EDTA,0.5%(重量/容量)親ウシ血清アルブミン、BSA)500μlに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、信号(signal)対バックグラウンド(background)比100以上で、オリゴヌクレオチド鋳型上の特定部位について、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
ビオチン化(biotinylated)プライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定
図2aは、ミクロスフェア上に予め固定されているプライマーの代わりに、可溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェアが用いられている以外は、本明細書の図1aおよび1bに記載されたものと同様のフローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。図2bは、調査されるDNAストランドへのビオチン化プライマーのハイブリダイゼーション、および溶液中に存在するDNAポリメラーゼの結果としての、1つの蛍光Aジデオキシヌクレオチド(SNPはT塩基と仮定)によるこのプライマーの伸長を示している。図2cは、ハイブリダイズされたDNAストランドの溶解後の、伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミクロスフェア上の捕捉、およびそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分析を示す。サンプルDNA鋳型は、PCRにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびPCRプライマーをそれぞれ除去するために小エビアルカリホスファターゼ(SAP)およびエキソヌクレアーゼI(ExoI)で処理される。鋳型DNA上の特定部位に応答するように設計され、5′−ビオチン基を運ぶミニ配列決定プライマーが調製される。ビオチン化プライマーを、鋳型DNA(1μl、1nM)、DNAポリメラーゼ(1単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム製)、1つの蛍光標識化ddNTP(5μM)、他の3つの非蛍光ddNTPの各5μM、および緩衝液(サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製)に添加し、合計容量10μlとする。この工程を、異なる蛍光ddNTPを用いて3回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、94℃で10秒間、および60℃で10秒間、99回繰り返される。ビオチン化プライマーを捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア5μlを反応混合物に添加する。各反応混合物2μlをTEB緩衝液(50mM トリス−HCl、pH8.0、0.5mM EDTA,0.5%(重量/容量)親ウシ血清アルブミン、BSA)500μlに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のDNA配列決定技術によって確認されたように、30個のPCR増幅サンプルのうち30個において、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
タグを付けられているプライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定
図3aは、DNAストランド上に4つのSNPが存在すると仮定されている以外は、本明細書の図2aおよび2bに説明されるミニ配列決定と同様の方法で、可溶性の配列タグを付けられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミクロスフェアを用いる、多様な(multiplexed)ミクロスフェアに基づくミニ配列決定手順の略図である。図3bは、フローサイトメトリーを用いて分析されるミクロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。サンプルDNA鋳型はPCRにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびPCRプライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカリホスファターゼ(SAP)およびエキソヌクレアーゼI(ExoI)で処理される。鋳型DNA上の特定部位に応答するように設計され、5′−配列タグを運ぶミニ配列決定プライマーを調製する。捕捉プローブが、プライマーの5′−配列タグに結合するように設計され、ミクロスフェア上に固定される。捕捉タグを運ぶプライマーを、鋳型DNA(1μl、1nM)、DNAポリメラーゼ(1単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム製)、1つの蛍光標識化ddNTP(5μM)、他の3つの非蛍光ddNTPの各5μM、および緩衝液(サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製)に添加し、合計容量10μlとする。この工程を、異なる蛍光ddNTPを用いて3回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、94℃で10秒間、および60℃で10秒間、99回繰り返される。ビオチン化プライマーを捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア5μlを反応混合物に添加する。各反応混合物2μlをTEB緩衝液(50mM トリス−HCl、pH8.0、0.5mM EDTA、0.5%(重量/容量)親ウシ血清アルブミン、BSA)500μlに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。
固定化プライマーを用いるフローサイトメトリーによるオリゴヌクレオチドライゲーション
図4aは、プライマーが、SNPの領域において調査されるDNAストランドにハイブリダイズしているそのプライマーに、ライゲーションするための蛍光相補的プライマーとともに、ミクロスフェア上に固定される、フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定の略図である。図4bは、DNAが溶離されたのちに適当な蛍光相補体がライゲーションされるミクロスフェア結合プライマーの略図であり、フローサイトメトリーで決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がDNAストランドに結合されているのかを示す。サンプルDNA鋳型は、PCRにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびPCRプライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカリホスファターゼ(SAP)およびエキソヌクレアーゼI(ExoI)で処理される。鋳型DNA上の特定の部位に応答するように設計されたオリゴヌクレオチドライゲーションプライマーが、カルボジイミドを用いてカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア上の5′−アミノ基を介して固定される。目的の部位に直に隣接して結合するように設計されているが、5′−末端が異なる4つの蛍光リポーターオリゴヌクレオチドを調製する。プライマーを運ぶミクロスフェア(5μl)を、鋳型DNA(1μl、1nM)、DNAリガーゼ(1単位、サーモリガーゼ(Thermoligase)、エピセンター テクノロジーズ(Epicentre Technologies)製、マジソン(Madison)、ウィスコンシン州(WI))、1つの蛍光標識化リポーターオリゴヌクレオチド(5μM)、および緩衝液(サーモリガーゼ緩衝液、エピセンター製)に添加し、合計容量10μlとする。この工程を、4つの蛍光リポーターオリゴヌクレオチド(5μM)のおのおのを用いて3回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、94℃で10秒間、および60℃で10秒間、99回繰り返される。各反応混合物2μlをTEB緩衝液(50mM トリス−HCl、pH8.0、0.5mM EDTA、0.5%(重量/容量)親ウシ血清アルブミン、BSA)500μlに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のDNA配列決定技術によって確認されたように、30個のPCR増幅サンプルのうち30個において、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
非増幅DNA上での多様な(multiplexed)オリゴヌクレオチドライゲーション、およびその後のPCRによる増幅
図5aおよび5bは、相補塩基がDNAストランド上に見られる場合および相補塩基がDNAストランド上に見られない場合それぞれについての、非増幅DNA上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のPCRによる増幅、ミクロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光の分析の略図である。
Claims (14)
- (a)同定されるべき塩基に直に隣接するDNAストランドへのオリゴヌクレオチドのアニーリング工程;
(b)酵素の存在下で、アニールしたDNAストランドとオリゴヌクレオチドを4種の異なるジデオキシヌクレオチドと共にインキュベートする工程であって、ジデオキシヌクレオチドの1種が蛍光リポーター分子を有し、それにより、オリゴヌクレオチドが一塩基単位だけ伸長する工程;
(c)伸長したオリゴヌクレオチドをミクロスフェア上に固定する工程;および
(d)フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程
の順序からなる、DNAストランド上の塩基を同定するための方法。 - 蛍光リポーター分子が蛍光ジデオキシヌクレオチドを含み、および酵素がDNAポリメラーゼである請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがビオチン化され、およびミクロスフェアがアビジンまたはストレプトアビジンで被覆されている請求項1記載の方法。
- ミクロスフェアがビオチン化され、およびオリゴヌクレオチドがアビジンまたはストレプトアビジンに結合されている請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがミクロスフェアに共有結合されている請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、ミクロスフェア上に固定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、捕捉プローブにハイブリダイズされる配列タグを含み、配列タグおよび捕捉プローブはイソ−Cおよび5−メチル−イソ−Gからなる群より選択された少なくとも1つの非天然型塩基を含む請求項6記載の方法。
- DNAストランド上の部位における塩基を同定するための方法であって、
(a)リガーゼの存在下で、オリゴヌクレオチド1を塩基に直に隣接するDNAストランドにアニールし、オリゴヌクレオチド2をオリゴヌクレオチド1に隣接したDNAストランドにアニールする工程であり、オリゴヌクレオチド2は蛍光リポーター分子および同定されようとしている塩基に相補的である応答塩基の両方を含み、該リガーゼの存在下でオリゴヌクレオチド2がオリゴヌクレオチド1に結合し、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを形成する工程;
(b)DNAストランドを溶解し、ミクロスフェア上へライゲーションされたオリゴヌクレオチドを固定する工程;および
(c)フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程
の順序からなる方法。 - DNAストランド上の部位における塩基を同定するための方法であって、
(a)リガーゼの存在下で、オリゴヌクレオチド1を塩基に直に隣接するDNAストランドにアニールし、オリゴヌクレオチド2をオリゴヌクレオチド1に隣接したDNAストランドにアニールする工程であり、オリゴヌクレオチド2は蛍光リポーター分子および同定されようとしている塩基に相補的である応答塩基の両方を含み、該リガーゼの存在下でオリゴヌクレオチド2がオリゴヌクレオチド1に結合し、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを形成する工程;
(b)ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを増幅する工程;
(c)ミクロスフェア上へライゲーションされたオリゴヌクレオチドを捕捉する工程;および
(d)フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程
の順序からなる方法。 - オリゴヌクレオチド1がビオチン化され、およびミクロスフェアがアビジンまたはストレプトアビジンで被覆されている請求項8または9記載の方法。
- ミクロスフェアがビオチン化され、およびオリゴヌクレオチド1がアビジンまたはストレプトアビジンに結合されている請求項8または9記載の方法。
- オリゴヌクレオチド1がミクロスフェアに共有結合されている請求項8または9記載の方法。
- オリゴヌクレオチド1が、ミクロスフェア上に固定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項8または9記載の方法。
- 配列タグが相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされ、配列タグおよび捕捉プローブはイソ−Cおよび5−メチル−イソ−Gからなる群より選択された非天然型塩基を含む請求項13記載の方法。
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