ES2320604T3 - Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo. - Google Patents
Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento homogéneo para la determinación de la identidad de una base en una cadena de ADN, que comprende en orden las etapas de: (a) alineamiento de un oligonucleótido a la cadena de ADN de forma inmediatamente adyacente a la base cuya identidad se va a determinar; (b) incubación de la cadena de ADN alineada y del oligonucleótido con cuatro dideoxinucleótidos distintos, teniendo uno de los dideoxinucleótidos una molécula indicadora fluorescente en presencia de ADN polimerasa, lo que extiende de ese modo el oligonucleótido por una unidad de base; (c) inmovilización del oligonucleótido extendido en una microesfera y (d) análisis de la microesfera mediante la utilización de citometría de flujo, mediante la cual se determina la base bajo investigación.
Description
Identificación de polimorfismos del ADN mediante
la utilización de citometría de flujo.
La presente invención se refiere en general a la
utilización de citometría de flujo para la determinación de la
composición de una base de nucleótido del ADN y, más en particular,
a la utilización de la citometría de flujo para determinar la
identificación de la base de polimorfismos de un solo nucleótido,
incluyendo polimorfismos, inserciones y eliminación de nucleótidos.
La presente invención se llevó a cabo con ayuda del gobierno bajo
el contrato Nº
W-7405-ENG-36
adjudicado por el Departamento de Energía de Estados Unidos a los
regentes de la Universidad de California. El gobierno tiene ciertos
derechos en la presente invención.
La determinación de la secuencia de bases del
ADN del genoma humano tendrá un impacto trascendental en la ciencia
biomédica en el próximo siglo. La consecución del primer ADN humano
completo reforzará una variedad de aplicaciones, desde la
determinación del mapa genético de genes asociados a enfermedades,
hasta pruebas diagnósticas para susceptibilidad a enfermedades y
respuesta de enfermedades a fármacos. La determinación de la
composición de la base en posiciones del ADN específicas,
variables, conocidas como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP,
por sus siglas en inglés) es especialmente importante. La
generación actual de procedimientos para la determinación de la
secuencia son demasiado lentos y costosos para satisfacer los
requisitos del análisis de SNP a gran escala. Por lo tanto, hay una
necesidad de disponer de procedimientos más rápidos y más
eficientes para el análisis de secuencias genéticas para los
SNP.
Los SNP tienen una serie de utilizaciones en la
determinación del mapa genético, la identificación de genes
asociados a enfermedades y en pruebas diagnósticas. Todas y cada
una de estas aplicaciones incluyen la determinación de la
composición de la base en la posición del SNP. La secuenciación
convencional puede proporcionar esta información, aunque resulta
poco práctica para la identificación de una gran cantidad de
posiciones en una gran cantidad de individuos. Para aumentar la
capacidad de procesamiento se han desarrollado distintos
procedimientos alternativos.
Se han desarrollado dos técnicas para determinar
la composición de la base en una posición individual:
minisecuenciación (véase, por ejemplo, "Minisecuenciación: Una
Herramienta Específica Para Análisis de ADN Y Diagnóstico En
Matrices de Oligonucleótidos" ("Minisequencing: A Specific Tool
For DNA Analysis And Diagnostics On Oligonucleotide Arrays") de
Tomi Pastinen y otros, Genome Research 7, 606 (1997)) y ligación de
oligonucleótidos (véase, por ejemplo, "Determinación En Pocillo
Individual Del Genotipo De Variaciones De La Secuencia Dialélica
Mediante Análisis De Ligación De Oligonucleótidos Basado En ELISA
De Dos Colores" ("Single-Well Genotyping Of
Diallelic Sequence Variations By A Two-Color
ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay") de
Vincent O. Tobe y otros, Nuclear Acids Res. 24, 3728 (1996)). En la
minisecuenciación, se diseña un cebador para interrogar una
posición específica de una cadena molde de muestra y se utiliza
polimerasa para extender el cebador con un dideoxinucleótido
marcado. En la ligación de oligonucleótidos, se diseña un cebador
similar y se utiliza ligasa para unir de forma covalente un
oligonucleótido situado más abajo que es variable en la posición de
interés. En cada uno de los casos, se utiliza la preferencia de una
enzima por los sustratos con bases emparejadas correctamente para
diferenciar la identidad de la base, que se revela mediante la
unión covalente de un marcador al cebador. En la mayoría de las
aplicaciones estos ensayos se configuran con el cebador inmovilizado
sobre un sustrato sólido, que incluye microplacas, perlas
magnéticas y recientemente, oligonucleótidos dispuestos en forma de
micromatriz sobre portaobjetos de microscopio. Las estrategias de
detección incluyen el marcaje directo con detección por
fluorescencia o el marcaje indirecto mediante la utilización de
biotina y de una estreptavidina marcada con detección mediante
fluorescencia, quimioluminiscencia o absorción.
Las micromatrices de oligonucleótido o
"biochips de ADN" han generado mucha atención debido a su
potencial para el análisis masivo en paralelo. La perspectiva de
secuenciar decenas de miles de bases de una muestra pequeña en tan
solo unos pocos minutos es excitante. En este momento, esta
tecnología tiene una disponibilidad limitada puesto que en la
actualidad se encuentran disponibles ensayos para secuenciar solo
unos pocos genes, con costes de hardware y de consumibles
importantes. Además, la metodología general de llevar a cabo la
secuenciación mediante hibridación no es especialmente robusta, con
el requisito de tener una optimización de las condiciones de
hibridación que depende de forma significativa de la secuencia. Sin
embargo, el paralelismo con una tecnología de "matriz" es muy
fuerte y la determinación múltiple de la secuencia es un elemento
importante del nuevo procedimiento de citometría
de flujo.
de flujo.
El documento
US-A-5.670.325 da a conocer
procedimientos para la detección de la presencia de secuencias
mutantes en una subpoblación de secuencias de genes en una muestra
biológica. Estos procedimientos son especialmente útiles para la
identificación de individuos con mutaciones genéticas indicativas
de cáncer colorrectal temprano. Más específicamente, el
procedimiento para la detección de la presencia de una subpoblación
clonal de células transformadas en una muestra biológica obtenida
de un organismo, comprende las etapas de: a) determinación a partir
de la muestra biológica de un número X de un primer polinucleótido
normal característico de una región genómica del citado organismo
que no se encuentra mutado en la citada subpoblación de células
transformadas; b) determinación a partir de la muestra biológica de
un número Y de un segundo polinucleótido normal en una región
genómica del citado organismo sospechosa de haber mutado en la
citada subpoblación de células transformadas; y c) determinación de
si existe una diferencia entre el número X y el número Y, siendo
indicativa la presencia de una diferencia estadísticamente
significativa de una subpoblación clonal de células transformadas
en la citada muestra biológica.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención es dar a conocer un procedimiento para la determinación
de la composición de la base en posiciones específicas de una
cadena de ADN que utiliza la determinación de la composición de la
base en posiciones específicas de una cadena de ADN mediante la
utilización de microesferas y citometría de flujo, en el que la
especificidad de las enzimas para la discriminación de la
composición de la base se combina con el análisis en paralelo de un
conjunto de microesferas fluorescentes.
En la descripción que sigue a continuación se
expondrán una parte de los objetivos, ventajas y nuevas
características adicionales de la invención y en otra parte
resultarán evidentes para los expertos en la materia tras el examen
de lo siguiente, o se podrán deducir mediante la práctica de la
invención. Los objetivos y ventajas de la invención se pueden
alcanzar y llevar a cabo por medio de los instrumentos y de las
combinaciones especialmente indicados en las reivindicaciones
adjuntas.
Para conseguir los objetivos anteriores y otros,
y de acuerdo con los propósitos de la presente invención tal como
se refleja y se describe ampliamente en el presente documento, el
procedimiento para la determinación de la composición de la base en
posiciones específicas de la cadena de ADN del presente documento
incluye las siguientes etapas: preparación de un cebador de
oligonucleótido que lleva un marcador de inmovilización o de
captura, dideoxinucleótidos marcados de forma fluorescente;
extensión del cebador de oligonucleótido mediante la utilización de
ADN polimerasa con el dideoxinucleótido fluorescente; unión de
forma específica de los cebadores marcados a microesferas y
medición de la fluorescencia de las microesferas mediante
citometría de flujo.
Preferentemente, los cebadores de
oligonucleótido se diseñan para alinearse a la muestra de ADN bajo
investigación de forma inmediatamente adyacente a la posición de
interés, de manera que se interrogue a la siguiente base de
nucleótido de la muestra de ADN.
También se prefiere que los cebadores tengan en
su extremo terminal 5' uno de los siguientes: (a) un grupo amino u
otro grupo funcional adecuado para el acoplamiento covalente a una
microesfera; (b) un grupo biotina adecuado para la unión a avidina
o a estreptavidina inmovilizado en una microesfera; o (c) un
marcador de oligonucleótido que sea complementario con una sonda de
captura de oligonucleótido inmovilizada en la superficie de una
microesfera.
Los beneficios y las ventajas de la presente
invención incluyen un procedimiento sensible, homogéneo y flexible
para la determinación de la composición de bases del ADN en
posiciones específicas.
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y que
forman parte de la memoria descriptiva, describen una realización
de la presente invención y, junto con la descripción, sirven para
explicar los principios de la invención. En los
dibujos:
dibujos:
La figura 1a es una representación esquemática
de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de
flujo, en la que se utiliza un cebador inmovilizado en una
microesfera para la hibridación con la secuencia de ADN bajo
investigación en presencia de dideoxinucleótidos, de los que como
mínimo uno se encuentra marcado de forma fluorescente, y de
polimerasa, de manera que el cebador se extiende por una base,
mientras que la figura 1b es una representación esquemática del
cebador resultante que tiene un solo dideoxinucleótido fluorescente
unido al extremo del mismo, que se puede detectar mediante la
utilización de citometría de flujo, y que representa la base
complementaria al SNP en el ADN.
La figura 2a es una representación esquemática
de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de
flujo similar a la descrita en las figuras 1a y 1b del presente
documento, excepto que se utilizan cebadores biotinilados solubles
y microesferas de captura recubiertas de avidina en lugar de los
cebadores que ya se han inmovilizado en las microesferas, la figura
2b muestra la hibridación del cebador biotinilado en la cadena de
ADN que se va a investigar y la extensión de este cebador mediante
un dideoxinucleótido A fluorescente (asumiendo que el SNP es una
base T) como resultado de la ADN polimerasa presente en la
disolución, y la figura 2c muestra la captura del cebador
biotinilado extendido sobre una microesfera recubierta de avidina
después de que se funde la cadena de ADN hibridada, con el
posterior análisis de fluorescencia mediante la utilización de la
citometría de flujo.
La figura 3a es una representación esquemática
de un procedimiento de minisecuenciación múltiple basado en
microesferas que utiliza cebadores de secuencia marcada solubles y
microesferas de captura que llevan sonda de una forma similar a la
minisecuenciación mostrada en las figuras 2a y 2b del presente
documento, excepto porque se ha asumido que en la cadena de ADN se
encuentran presentes cuatro SNP, mientras que la figura 3b muestra
las microesferas y los cebadores extendidos capturados que se van a
analizar mediante la utilización de citometría de flujo.
La figura 4a es una representación esquemática
de un ensayo de ligación de oligonucleótido basado en microesferas
que utiliza citometría de flujo, en la que se muestra un cebador
inmovilizado en una microesfera junto con cebadores complementarios
fluorescentes para la ligación al cebador que se ha hibridado a la
cadena de ADN que se va a investigar en la región del SNP, mientras
que la figura 4b es una representación esquemática del cebador
unido a la microesfera, al que se ha ligado el complemento
fluorescente adecuado después de que se ha fundido el ADN, siendo
indicativa la fluorescencia de la microesfera determinada mediante
citometría de flujo de que el complemento fluorescente se ha unido
a la cadena de ADN.
Las figuras 5a y 5b son representaciones
esquemáticas de ligación de oligonucleótido en ADN sin amplificar,
seguido de amplificación mediante la técnica PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), captura en microesferas y análisis de la
fluorescencia de las microesferas mediante citometría de flujo,
para el caso en el que la base complementaria se encuentra en la
cadena de ADN y para el caso en el que no existe la base
complementaria en la cadena de ADN, respectivamente.
En resumen, la presente invención comprende la
utilización de cebadores de oligonucleótido, dideoxinucleótidos
fluorescentes, ADN polimerasa, microesferas y citometría de flujo
para determinar la composición de la base del ADN en posiciones
específicas en una cadena de ADN. Se incuban cebadores de
oligonucleótido marcados con una muestra de ADN y se permite que se
alineen de forma inmediatamente adyacente a la posición de interés.
Se añaden dideoxinucleótidos fluorescentes y ADN polimerasa y se
permite que se extienda el cebador por una unidad de base, de forma
que tras la incorporación enzimática del dideoxinucleótido
fluorescente individual dentro de la cadena de ADN, la cadena de
ADN se puede .detectar mediante un citómetro de flujo. La ADN
polimerasa puede ser sequenasa, termosequenasa o cualquier otra ADN
polimerasa convencional o termoestable.
Otra realización de la invención utiliza
cebadores de oligonucleótido, indicadores de oligonucleótido y ADN
ligasa junto con microesferas y citometría de flujo para llevar a
cabo esta determinación. Se añaden un oligonucleótido indicador
fluorescente y ADN ligasa y se permite el ligado del cebador al
indicador. Los oligonucleótidos indicadores fluorescentes se
diseñan para unir el ADN de la muestra en la posición
inmediatamente 3' respecto del cebador de oligonucleótido alineado.
Es decir, la secuencia del oligonucleótido indicador es
complementaria a la de la cadena de ADN de la muestra, excepto en
su extremo 5', en el que el indicador es variable para interrogar
la posición de interés en el ADN de la muestra, que a continuación
se puede investigar por su identificación fluorescente mediante la
utilización de citometría de flujo. La ADN ligasa puede ser
cualquier ligasa convencional o termoestable. La extensión o la
ligación del cebador se pueden mejorar a través de la utilización
de ciclos térmicos utilizando ADN polimerasa o ligasa estables
frente al calor.
Los cebadores de oligonucleótido se unen a las
microesferas antes, o después de la extensión o de la ligación
enzimática. Los cebadores marcados con grupos amino se pueden unir
de forma covalente a microesferas carboxiladas mediante la
utilización de EDAC (etil dimetilaminopropil carbodiimida). Los
cebadores biotinilados se pueden unir a microesferas recubiertas de
avidina o de estreptavidina. Los cebadores que llevan un marcador
de secuencia de oligonucleótido se pueden alinear con secuencias de
captura de oligonucleótido complementarias inmovilizadas en
microesferas de forma covalente, o mediante la interacción entre la
biotina y la avidina. Las microesferas pueden estar compuestas de
poliestireno, celulosa u otro material adecuado. Para llevar a cabo
el análisis múltiple de secuencia se pueden utilizar microesferas
que tengan tamaños diferentes, o que se encuentren teñidas con
distintas cantidades de colorantes fluorescentes.
Habiendo descrito en general la invención, los
siguientes ejemplos están destinados a proporcionar más detalles
específicos de la misma.
A continuación se hará referencia con detalle a
las realizaciones preferentes de la presente invención tal como se
muestra en los dibujos adjuntos. Haciendo referencia a las figuras,
la figura 1a es una representación esquemática de minisecuenciación
basada en microesferas para citometría de flujo, en la que se
utiliza un cebador inmovilizado en una microesfera para la
hibridación con la secuencia de ADN bajo investigación en presencia
de dideoxinucleótidos, de los que como mínimo uno se encuentra
marcado de forma fluorescente, y de polimerasa. El cebador se
extiende por una base mediante la acción de la polimerasa. La
figura 1b es una representación esquemática del cebador resultante
que tiene un solo dideoxinucleótido fluorescente unido al extremo
del mismo, que se puede detectar mediante la utilización de
citometría de flujo, y que representa la base complementaria al SNP
en el ADN. La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica en
primer lugar mediante la utilización de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), y el producto resultante se trata con fosfatasa
alcalina de gamba (SAP), y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar
los deoxinucleótidos trifosfato y los cebadores PCR no consumidos,
respectivamente. El cebador de minisecuenciación, diseñado para
interrogar una posición específica en la cadena de ADN bajo
investigación, se inmoviliza por medio de un grupo amino 5' sobre
una microesfera de poliestireno carboxilada utilizando un reactivo
de entrecruzamiento (por ejemplo, carbodiimida). Se añaden las
microesferas que llevan el cebador (5 \mul) al ADN amplificado (1
\mul, 1 nM), ADN polimerasa (una unidad, termosequenasa, Amersham
Life Sciences, Cleveland, OH), un ddNTP marcado con fluoresceína (5
\muM), 5 \muM de cada uno de los otros tres ddNTPs no
fluorescentes y tampón (tampón de termosequenasa, Amersham) en un
volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repitió tres
veces utilizando cada uno de los cuatro ddNTPs fluorescentes. Las
mezclas de reacción se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y
a 60ºC durante 10 s en un termociclador. Se diluyeron dos
microlitros de cada mezcla de reacción en 500 \mul de tampón TEB
(Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albúmina de
suero bovino al 0,5 (p/v), BSA) y se midió la fluorescencia
asociada a las microesferas mediante la utilización de citometría de
flujo. Mediante la utilización de este procedimiento, se determinó
la identidad correcta de la base de nucleótido para una posición
específica en una cadena molde de oligonucleótido con una relación
señal-ruido mayor de cien.
La figura 2a es una representación esquemática
de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de
flujo similar a la descrita en las figuras 1a y 1b del presente
documento, excepto porque se utilizan cebadores biotinilados
solubles y microesferas de captura recubiertas de avidina en lugar
de los cebadores que ya se han inmovilizado en las microesferas. La
figura 2b muestra la hibridación del cebador biotinilado en la
cadena de ADN que se va a investigar y la extensión de este cebador
mediante un dideoxinucleótido A fluorescente (asumiendo que el SNP
es una base T) como resultado de la ADN polimerasa presente en la
disolución. La figura 2c muestra la captura del cebador biotinilado
extendido sobre una microesfera recubierta de avidina después de
que se funde la cadena de ADN hibridada, con el posterior análisis
de fluorescencia mediante la utilización de la citometría de flujo.
La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica mediante PCR y el
producto resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba (SAP)
y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar los deoxinucleótidos
trifosfato y los cebadores PCR no consumidos, respectivamente. Se
prepara el cebador de minisecuenciación, diseñado para interrogar
una posición específica en la cadena de ADN molde, y que lleva un
grupo biotina en posición 5'. Se añade el cebador biotinilado a la
cadena de ADN molde (1 \mul, 1 nM), ADN polimerasa (una unidad,
termosequenasa, Amersham), un ddNTP marcado con fluoresceína (5
\muM), 5 \muM de cada uno de los otros tres ddNTPs no
fluorescentes y tampón (tampón de termosequenasa Amersham) en un
volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repite tres veces
utilizando un ddNTP fluorescente diferente. Las mezclas de reacción
se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y a 60ºC durante 10 s
en un termociclador. Para capturar los cebadores biotinilados se
añadieron a la mezcla de reacción cinco \mul de microesferas
recubiertas de avidina. Se diluyen dos microlitros de cada mezcla
de reacción en 500 \mul de tampón TEB (Tris-HCl 50
mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albúmina de suero bovino al 0,5 (p/v), BSA)
y se mide la fluorescencia asociada a las microesferas mediante la
utilización de citometría de flujo. Mediante la utilización de este
procedimiento, se determinó la identidad de la base de nucleótido
correcta en treinta de treinta muestras amplificadas mediante PCR,
tal como se confirmó mediante técnicas convencionales de
secuenciación del ADN.
La figura 3a es una representación esquemática
de un procedimiento de minisecuenciación múltiple basado en
microesferas que utiliza cebadores de secuencia marcada solubles y
microesferas de captura que llevan sonda de una forma similar a la
minisecuenciación mostrada en las figuras 2a y 2b del presente
documento, excepto porque se ha asumido que en la cadena de ADN se
encuentran presentes cuatro SNP. La figura 3b muestra las
microesferas y los cebadores extendidos capturados para su análisis
mediante la utilización de citometria de flujo. La cadena de ADN
molde de la muestra se amplifica mediante PCR y el producto
resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba (SAP) y con
exonucleasa I (Exo I) para eliminar los deoxinucleótidos trifosfato
y los cebadores PCR no consumidos, respectivamente. Se prepara el
cebador de minisecuenciación, diseñado para interrogar una posición
específica en la cadena de ADN molde, y que lleva un marcador de la
secuencia 5'. Se diseña una sonda de captura para unirse al
marcador de la secuencia 5' del cebador y se inmoviliza en
microesferas. Se añade el cebador que lleva el marcador de captura a
la cadena de ADN molde (1 \mul, 1 nM), ADN polimerasa (una unidad,
termosequenasa, Amersham), un ddNTP marcado con fluoresceína (5
\muM), 5 \muM de cada uno de los otros tres ddNTPs no
fluorescentes y tampón (tampón de termosequenasa Amersham) en un
volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repite tres veces
utilizando un ddNTP fluorescente diferente. Las mezclas de reacción
se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y a 60ºC durante 10 s
en un termociclador. Para capturar los cebadores biotinilados se
añaden a la mezcla de reacción cinco microlitros de microesferas
recubiertas de avidina. Se diluyen dos microlitros de cada mezcla
de reacción en 500 \mul de tampón TEB (Tris-HCl
50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albúmina de suero bovino al 0,5% (p/v),
BSA) y se mide la fluorescencia asociada a las microesferas
mediante la utilización de citometría de flujo.
La figura 4a es una representación esquemática
de un ensayo de ligación de oligonucleótido basado en microesferas
que utiliza citometría de flujo, en la que se muestra un cebador
inmovilizado en una microesfera junto con cebadores complementarios
fluorescentes para la ligación al cebador que se ha hibridado a la
cadena de ADN que se va a investigar en la región del SNP. La
figura 4b es una representación esquemática del cebador unido a la
microesfera, al que se ha ligado el complemento fluorescente
adecuado después de que se ha fundido el ADN, siendo indicativa la
fluorescencia de la microesfera determinada mediante citometria de
flujo de que el complemento fluorescente se ha unido a la cadena de
ADN. La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica mediante PCR
y el producto resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba
(SAP) y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar los
deoxinucleótidos trifosfato y los cebadores PCR no consumidos,
respectivamente. El cebador de ligación a oligonucleótido, diseñado
para interrogar una posición específica en la cadena de ADN molde,
se inmoviliza a través de un grupo amino en posición 5' sobre una
microesfera de polioxiestireno carboxilada mediante la utilización
de carbodiimida. Se preparan cuatro oligonucleótidos indicadores
fluorescentes, diseñados para unirse de forma inmediatamente
adyacente a la posición de interés, aunque variando en el extremo
terminal 5'. Las microesferas que llevan cebador se añaden (5
\mul) a la cadena de ADN molde (1 \mul, 1 nM), ADN ligasa (una
unidad, termoligasa, Epicentre Technologies, Madison, WI), un
oligonucleótido indicador marcado con fluoresceína (5 \muM) y
tampón (tampón de termoligasa, Epicentre) en un volumen total de 10
\mul. Este procedimiento se repite tres veces utilizando cada uno
de los cuatro oligonucleótidos indicadores fluorescentes (5
\muM). Las mezclas de reacción se sometieron a 99 ciclos a 94ºC
durante 10 s y a 60ºC durante 10 s en un termociclador. Se diluyen
dos microlitros de cada mezcla de reacción en 500 \mul de tampón
TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8, 0, EDTA 0,5 mM, albúmina
de suero bovino al 0,5% (p/v), BSA) y se mide la fluorescencia
asociada a las microesferas mediante la utilización de citometría
de flujo. Mediante la utilización de este procedimiento, se
determinó la identidad de la base de nucleótido correcta en treinta
de treinta muestras amplificadas mediante PCR, tal como se confirmó
mediante técnicas convencionales de secuenciación del ADN.
Las figuras 5a y 5b son representaciones
esquemáticas de ligación de oligonucleótido en ADN sin amplificar,
seguida de amplificación mediante la técnica PCR, captura en
microesferas y análisis de la fluorescencia de las microesferas
mediante citometría de flujo, para el caso en el que la base
complementaria se encuentra en la cadena de ADN y para el caso en
el que no existe la base complementaria en la cadena de ADN,
respectivamente.
Se diseña un conjunto de cebadores de
oligonucleótido que incluyen un oligonucleótido (oligonucleótido
-1-) que es complementario con la secuencia de la cadena de ADN
molde situada de forma inmediatamente adyacente a una posición de
interés, y cuatro oligonucleótidos (oligonucleótidos -1A-, -1C-,
-1G- y -1T-) que son complementarios con la secuencia de la cadena
de ADN molde situada de forma inmediatamente adyacente al
oligonucleótido -1-, y que contiene la posición de interés. Cada
uno de los cuatro oligonucleótidos (-1A-, -1C-, -1G- y -1T-)
difiere en la base de nucleótido situada junto al otro
oligonucleótido (oligonucleótido -1-), que se corresponde con cada
una de las cuatro bases posibles -A-, -C-, -G- y -T-. El
oligonucleótido -1- está destinado a su ligación con uno de los
otros oligonucleótidos (-1A-, -1C-, -1G- o -1T-), dependiendo del
que contenga la base complementaria para la posición de interés.
Además, cada uno de los dos oligonucleótidos de una pareja
potencial (total de cinco oligonucleótidos) contiene nucleótidos
adicionales que forman una "cola" constituida por una posición
de cebado para la PCR. Esta posición es diferente para el
oligonucleótido -1- respecto de los oligonucleótidos -1A-, -1C-,
-1G- y -1T-, que tienen la misma posición de unión del cebador
dentro de este grupo, pero que es diferente de la del
oligonucleótido -1-. Se llevan a cabo cuatro reacciones de ligación
en paralelo, cada una con el oligonucleótido -1-, una con cada uno
de los demás oligonucleótidos (-1A-, -1C-, -1G- o -1T-) y con una
enzima ADN ligasa. Se espera que todos los oligonucleótidos se
hibriden con la cadena molde, aunque solo se ligará al
oligonucleótido -1- el oligonucleótido con una correspondencia
perfecta. El producto de ligación resultante servirá como la cadena
molde para una reacción mediante PCR posterior mediante la
utilización de un cebador (cebador -1-) complementario a la cola
introducida dentro del oligonucleótido -1-, y utilizando el otro
cebador (cebador -2-) que tiene la misma secuencia que la de la
cola de oligonucleótidos -1A-, -1C-, -1G- y -1T-. Los
oligonucleótidos que no se han ligado no se pueden amplificar con
la técnica PCR (figura 5b) debido a que no existe posición de
cebado para el oligonucleótido -2- a menos que la amplificación
mediante PCR del cebador -1- se extienda a través de un fragmento
ligado, lo que crea una secuencia complementaria para el cebador -
2-. Además de los dNTPs sin marcar utilizados durante la etapa de
PCR, se añaden dNTPs marcados de forma fluorescente para marcar los
fragmentos procedentes de la PCR durante la amplificación. De forma
alternativa, el cebador -2- se marca con un colorante fluorescente,
lo que genera productos de amplificación mediante PCR marcados con
colorante en el caso de que tenga lugar la amplificación.
La etapa final implica la adición a la mezcla
procedente de la PCR de microesferas con un oligonucleótido
inmovilizado en su superficie que tiene la misma secuencia que los
oligonucleótidos -1A-, -1C-, -1G- y -1T-, excepto por el nucleótido
variable situado en un extremo y por la posición de cebado situada
en el otro. Se pretende que esta microesfera capture a los
productos marcados obtenidos mediante la PCR si se encuentran
presentes en la mezcla PCR por medio del alineamiento con el
complemento recién sintetizado del complejo de oligonucleótido
ligado. A continuación se analiza mediante citometría de flujo la
fluorescencia de las perlas debida a los fragmentos hibridados.
Muchos conjuntos de cebadores pueden clasificar en categorías de
forma simultánea muchos SNP en disolución, siendo capturado cada
uno sobre una perla diferente en un conjunto múltiple que se va a
leer de forma simultánea en un citómetro de flujo.
La descripción anterior de la invención se ha
presentado para propósitos ilustrativos y de descripción y no se
pretende que sea exhaustiva ni que limite la invención a la forma
precisa que se ha descrito y, obviamente, son posibles muchas
modificaciones y variaciones a la luz de las explicaciones
anteriores. Por ejemplo, para unir los cebadores de oligonucleótido
a las microesferas para realizar análisis que utiliza la citometría
de flujo, los cebadores de oligonucleótido pueden incluir un
marcador de secuencia que se hibrida a una sonda de captura que es
complementaria con el marcador de secuencia y que se inmoviliza en
las microesferas, marcadores de secuencia y sondas de captura que
contienen, como mínimo, una de las bases no naturales
iso-C y
5-metil-iso-G. Las
realizaciones se escogieron y se describieron para ofrecer la mejor
explicación de los principios de la invención y de su aplicación
práctica para, de ese modo, permitir que otros expertos en la
materia utilicen de la mejor forma la invención en distintas
realizaciones y con diferentes modificaciones que resulten idóneas
para la utilización contemplada en particular. Se pretende que el
alcance de la invención se encuentre definido por las
reivindicaciones adjuntas del presente documento.
Claims (11)
1. Procedimiento homogéneo para la determinación
de la identidad de una base en una cadena de ADN, que comprende en
orden las etapas de:
(a) alineamiento de un oligonucleótido a la
cadena de ADN de forma inmediatamente adyacente a la base cuya
identidad se va a determinar;
(b) incubación de la cadena de ADN alineada y
del oligonucleótido con cuatro dideoxinucleótidos distintos,
teniendo uno de los dideoxinucleótidos una molécula indicadora
fluorescente en presencia de ADN polimerasa, lo que extiende de ese
modo el oligonucleótido por una unidad de base;
(c) inmovilización del oligonucleótido extendido
en una microesfera y
(d) análisis de la microesfera mediante la
utilización de citometría de flujo, mediante la cual se determina
la base bajo investigación.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el oligonucleótido es biotinilado y la microesfera es
recubierta con avidina o con estreptavidina.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el oligonucleótido se une de forma covalente a la
microesfera.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el oligonucleótido se hibrida a una sonda de captura
complementaria inmovilizada en una microesfera.
5. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que el oligonucleótido comprende un marcador de secuencia que se
hibrida a la sonda de captura y en el que el marcador de secuencia
y la sonda de captura comprenden, como mínimo, una base no natural
seleccionada entre el grupo compuesto por iso-C y
5-metil-iso-G.
6. Procedimiento homogéneo para la determinación
de la identidad de una base en una posición de una cadena de ADN,
que comprende en orden las etapas de:
(a) alineamiento de un primer oligonucleótido y
de un segundo oligonucleótido a la cadena de ADN adyacente al
primer oligonucleótido y en presencia de ADN ligasa, en el que el
segundo oligonucleótido contiene una molécula indicadora
fluorescente y una base interrogadora, que es variable de forma que
interroga la posición de interés en el ADN de la muestra, en el que
solo se ligará al primer nucleótido el segundo oligonucleótido que
tenga una correspondencia perfecta en la base interrogadora.
(b) disociación de la cadena de ADN e
inmovilización de los oligonucleótidos ligados en una microesfera;
y
(c) análisis de la microesfera mediante la
utilización de citometría de flujo, mediante la cual se determina
la base bajo investigación.
7. Procedimiento homogéneo para la determinación
de la identidad de una base en una posición de una cadena de ADN,
que comprende en orden las etapas de:
(a) alineamiento de un primer oligonucleótido y
de un segundo oligonucleótido a la cadena de ADN adyacente al
primer oligonucleótido y en presencia de ADN ligasa, en el que el
segundo oligonucleótido contiene una molécula indicadora
fluorescente y una base interrogadora, que es variable de forma que
interroga la posición de interés en el ADN de la muestra, en el que
solo se ligará al primer nucleótido el segundo oligonucleátido que
tenga una correspondencia perfecta en la base interrogadora.
(b) amplificación de los oligonucleótidos
ligados;
(c) captura de oligonucleótidos ligados
amplificados en una microesfera;
(d) análisis de la microesfera mediante la
utilización de citometria de flujo, mediante la cual se determina
la base bajo investigación.
8. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que el primer oligonucleótido es biotinilado y la microesfera es
recubierta con avidina o con estreptavidina.
9. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que el primer oligonucleótido se une de forma covalente a las
microesferas.
10. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que el primer oligonucleótido se hibrida a una sonda de captura
complementaria inmovilizada en una microesfera.
11. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que se hibrida un marcador de secuencia a la sonda de captura
que es complementaria a ella, y en el que el marcador de secuencia
y la sonda de captura comprenden una base no natural seleccionada
entre el grupo compuesto por iso-C y
5-metil-iso-G.
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|---|---|---|---|
| US6368597P | 1997-10-28 | 1997-10-28 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98955222T Expired - Lifetime ES2320604T3 (es) | 1997-10-28 | 1998-10-28 | Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo. |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6287766B1 (es) |
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Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999022030A1 (en) * | 1997-10-28 | 1999-05-06 | The Regents Of The University Of California | Dna polymorphism identity determination using flow cytometry |
| EP1036332B1 (en) * | 1997-12-04 | 2005-07-13 | Amersham Biosciences UK Limited | Multiple assay method |
| WO2000056925A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods for single nucleotide polymorphism detection |
| JP3668075B2 (ja) * | 1999-10-12 | 2005-07-06 | 光夫 板倉 | 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 |
| DE19958980A1 (de) * | 1999-11-18 | 2001-09-27 | Wolfgang Goehde | Verfahren zur Bestimmung von PCR-Produkten, sowie ein PCR-Detektions-Kit und eine Vorrichtung für ein solches Verfahren |
| US20020006617A1 (en) * | 2000-02-07 | 2002-01-17 | Jian-Bing Fan | Nucleic acid detection methods using universal priming |
| US6340566B1 (en) * | 2000-03-28 | 2002-01-22 | The Regents Of The University Of California | Detection and quantitation of single nucleotide polymorphisms, DNA sequence variations, DNA mutations, DNA damage and DNA mismatches |
| US6365355B1 (en) | 2000-03-28 | 2002-04-02 | The Regents Of The University Of California | Chimeric proteins for detection and quantitation of DNA mutations, DNA sequence variations, DNA damage and DNA mismatches |
| JP5138141B2 (ja) * | 2000-05-19 | 2013-02-06 | ルミネックス コーポレーション | 核酸の検出用物質及び検出方法 |
| AU7873001A (en) * | 2000-08-30 | 2002-03-13 | Sanko Junyaku Co., Ltd. | Method of detecting gene |
| US7465540B2 (en) * | 2000-09-21 | 2008-12-16 | Luminex Corporation | Multiple reporter read-out for bioassays |
| AU1317502A (en) | 2000-10-14 | 2002-04-29 | Eragen Biosciences Inc | Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases |
| US6592713B2 (en) | 2000-12-18 | 2003-07-15 | Sca Hygiene Products Ab | Method of producing a nonwoven material |
| US7083951B2 (en) * | 2001-02-14 | 2006-08-01 | The Regents Of The University Of California | Flow cytometric detection method for DNA samples |
| US20020115116A1 (en) * | 2001-02-22 | 2002-08-22 | Yong Song | Multiplex protein interaction determinations using glutathione-GST binding |
| US7153656B2 (en) * | 2001-09-11 | 2006-12-26 | Los Alamos National Security, Llc | Nucleic acid sequence detection using multiplexed oligonucleotide PCR |
| CA2497740C (en) | 2001-10-15 | 2011-06-21 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection |
| AU2002366179A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-06-10 | The Regents Of The University Of California | Early leukemia diagnostics using microsphere arrays |
| AU2002357249A1 (en) * | 2001-12-13 | 2003-07-09 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Methods for removal of double-stranded oligonucleotides containing sequence errors using mismatch recognition proteins |
| WO2003078587A2 (en) | 2002-03-13 | 2003-09-25 | Syngenta Participations, Ag. | Nucleic acid detection method |
| US7304128B2 (en) * | 2002-06-04 | 2007-12-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Carbon nanotube binding peptides |
| AU2003243700B2 (en) * | 2002-06-28 | 2009-04-30 | Qiagen Mansfield, Inc. | Methods of detecting sequence differences |
| US20040224336A1 (en) * | 2003-03-11 | 2004-11-11 | Gene Check, Inc. | RecA-assisted specific oligonucleotide extension method for detecting mutations, SNPs and specific sequences |
| EP1606419A1 (en) | 2003-03-18 | 2005-12-21 | Quantum Genetics Ireland Limited | Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds |
| US7820808B2 (en) | 2003-04-01 | 2010-10-26 | Eragen Biosciences, Inc. | Polymerase inhibitor and method of using same |
| EP1613776A1 (en) * | 2003-04-02 | 2006-01-11 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Error reduction in automated gene synthesis |
| US8637650B2 (en) | 2003-11-05 | 2014-01-28 | Genovoxx Gmbh | Macromolecular nucleotide compounds and methods for using the same |
| US20050202484A1 (en) | 2004-02-19 | 2005-09-15 | The Governors Of The University Of Alberta | Leptin promoter polymorphisms and uses thereof |
| DE102005008583B4 (de) * | 2005-02-24 | 2007-10-25 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA |
| JP4399575B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2010-01-20 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 遺伝子断片中のヌクレオチドの種類の特定方法 |
| EP2489746B1 (en) | 2005-06-07 | 2016-02-03 | Luminex Corporation | Methods for detection and typing of nucleic acids |
| EP1953241A1 (en) * | 2005-11-29 | 2008-08-06 | Olympus Corporation | Method of analyzing change in primary structure of nucleic acid |
| US8871687B2 (en) * | 2007-09-28 | 2014-10-28 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Nucleic acid sequencing by single-base primer extension |
| US7960116B2 (en) * | 2007-09-28 | 2011-06-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
| US8093063B2 (en) | 2007-11-29 | 2012-01-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids |
| CN101445832B (zh) * | 2008-12-23 | 2011-09-14 | 广州益善生物技术有限公司 | Pik3ca基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 |
| CN101487051B (zh) * | 2009-02-24 | 2011-07-20 | 广州益善生物技术有限公司 | Braf基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 |
| JP5938348B2 (ja) * | 2009-10-23 | 2016-06-22 | ルミネックス コーポレーション | 反応特異性の増加のための非標準塩基を含む増幅プライマー |
| ITPV20100009A1 (it) * | 2010-07-15 | 2012-01-16 | Luca Lova | Rilevamento multiparametrico in sospensione per sequenze nucleotidiche |
| GB2497838A (en) | 2011-10-19 | 2013-06-26 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
| EP4372084A3 (en) | 2012-01-26 | 2024-08-14 | Tecan Genomics, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
| CN104619894B (zh) | 2012-06-18 | 2017-06-06 | 纽亘技术公司 | 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法 |
| US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
| US9411930B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-08-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
| CN108624668B (zh) | 2013-02-01 | 2022-12-02 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于基因组组装及单体型定相的方法 |
| US9540699B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-01-10 | William Beaumont Hospital | Methods of diagnosing increased risk of developing MRSA |
| US20140274738A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
| CA2929596C (en) | 2013-11-13 | 2022-07-05 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
| EP3540074A1 (en) | 2013-12-11 | 2019-09-18 | The Regents of the University of California | Method of tagging internal regions of nucleic acid molecules |
| WO2015131107A1 (en) | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
| CN106574305B (zh) | 2014-06-13 | 2021-03-02 | 生命技术公司 | 多重核酸扩增 |
| WO2016019360A1 (en) | 2014-08-01 | 2016-02-04 | Dovetail Genomics Llc | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
| JP6803327B2 (ja) | 2014-08-06 | 2020-12-23 | ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 標的化されたシークエンシングからのデジタル測定値 |
| EP3259696A1 (en) | 2015-02-17 | 2017-12-27 | Dovetail Genomics LLC | Nucleic acid sequence assembly |
| US11807896B2 (en) | 2015-03-26 | 2023-11-07 | Dovetail Genomics, Llc | Physical linkage preservation in DNA storage |
| KR20180096586A (ko) | 2015-10-19 | 2018-08-29 | 더브테일 제노믹스 엘엘씨 | 게놈 어셈블리, 하플로타입 페이징 및 표적 독립적 핵산 검출을 위한 방법 |
| CA3014911A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Dovetail Genomics, Llc | Generation of phased read-sets for genome assembly and haplotype phasing |
| IL262946B2 (en) | 2016-05-13 | 2023-03-01 | Dovetail Genomics Llc | Retrieving long-range grip information from preserved samples |
| US10190155B2 (en) | 2016-10-14 | 2019-01-29 | Nugen Technologies, Inc. | Molecular tag attachment and transfer |
| DE102016124692B4 (de) * | 2016-12-16 | 2019-05-16 | Gna Biosolutions Gmbh | Verfahren und System zum Vervielfältigen einer Nukleinsäure |
| CN110612355B (zh) * | 2017-06-20 | 2024-01-12 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 用于定量pcr扩增的组合物及其应用 |
| CN109652499B (zh) * | 2017-10-12 | 2022-06-03 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 快速检测dna聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒 |
| US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
| WO2019152543A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Dovetail Genomics, Llc | Sample prep for dna linkage recovery |
| US10768173B1 (en) * | 2019-09-06 | 2020-09-08 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| CA3145212A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-30 | Dovetail Genomics, Llc | Methods and compositions for proximity ligation |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US12059674B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-08-13 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent storage system |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4770992A (en) * | 1985-11-27 | 1988-09-13 | Den Engh Gerrit J Van | Detection of specific DNA sequences by flow cytometry |
| US4962037A (en) * | 1987-10-07 | 1990-10-09 | United States Of America | Method for rapid base sequencing in DNA and RNA |
| US4988617A (en) * | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5512439A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
| US5629158A (en) * | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
| US5437976A (en) * | 1991-08-08 | 1995-08-01 | Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona | Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA |
| AU3919293A (en) * | 1992-03-27 | 1993-11-08 | University Of Maryland At Baltimore | Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes |
| EP0705905B1 (de) * | 1994-07-16 | 2001-10-10 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren |
| US5681702A (en) * | 1994-08-30 | 1997-10-28 | Chiron Corporation | Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes |
| WO1996015271A1 (en) * | 1994-11-16 | 1996-05-23 | Abbott Laboratories | Multiplex ligations-dependent amplification |
| US5736330A (en) * | 1995-10-11 | 1998-04-07 | Luminex Corporation | Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences |
| ATE496288T1 (de) * | 1995-10-11 | 2011-02-15 | Luminex Corp | Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben |
| US5670325A (en) * | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| WO1997023651A1 (en) * | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| CA2257109C (en) * | 1996-06-04 | 2009-10-06 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring hybridization during pcr |
| AU8162498A (en) * | 1997-06-25 | 1999-01-04 | Orchid Biosciences, Inc. | Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction |
| WO1999022030A1 (en) * | 1997-10-28 | 1999-05-06 | The Regents Of The University Of California | Dna polymorphism identity determination using flow cytometry |
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