CN106574305B

CN106574305B - 多重核酸扩增

Info

Publication number: CN106574305B
Application number: CN201580042837.5A
Authority: CN
Inventors: D·朱恩; C-Y·李; B·里德; C·奥贝格费尔; D·德勒斯曼; A·罗森鲍姆; S·班森; A·布罗卡; S·高希
Original assignee: Life Technologies Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2035-06-11
Also published as: WO2015191815A1; US11773426B2; US20190338343A1; EP3155127B1; EP3155127A1; CN106574305A; US20240102079A1; US20150361481A1

Abstract

在一些实施例中，本发明大体上涉及包含单一反应混合物的组合物，所述单一反应混合物含有多个不同离散载体群体和多个不同靶核酸群体。所述单一反应混合物可以含有第一珠粒群体；第二珠粒群体；第一靶核酸群体，其中所述第一靶核酸群体中的至少两个不同靶核酸可以结合到所述第一珠粒群体中的珠粒；和第二靶核酸群体，其中所述第二靶核酸群体中的至少两个不同靶核酸可以结合到所述第二珠粒群体中的珠粒。所述单一反应混合物可以用以在所述第一珠粒上单克隆地扩增所述第一靶核酸，和在所述第二珠粒上单克隆地扩增所述第二靶核酸。

Description

多重核酸扩增

背景技术

本申请要求2014年6月13日提交的美国临时申请第62/012,213号和2015年2月6日提交的美国临时申请第62/113,257号的优先权，所述临时申请中的每一者以全文引用的方式并入本文中。

在本申请通篇，引用各种公开、专利和/或专利申请。所述公开、专利和/或专利申请的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请中以便更充分地描述本发明所涉及的目前最先进的水平。

许多核酸分析平台，包括“下一代测序(NGS)”、PCR和/或遗传分析平台，利用与一个或多个单克隆扩增子连接的珠粒或单一表面(例如，阵列)(例如，模板化珠粒或模板化阵列)。这些模板化珠粒和/或阵列典型地经由基于扩增的方法产生。举例来说，模板化珠粒可以使用如乳液PCR的方法形成，所述乳液PCR采用油包水乳液。此类型的乳液形成众多彼此由油相分隔的水性微液滴。理想地，微液滴含有单一模板核酸和一个珠粒，以及酶、核苷酸和用于执行核酸扩增反应的其它试剂。每个微液滴充当单独隔室，在所述隔室内进行克隆扩增。当此类微液滴在适合扩增条件下孵育时，个别微液滴产生一个连接到模板核酸的单克隆扩增子的珠粒。以其它方法，核酸模板可以与珠粒混合并且克隆地扩增到珠粒上而不需要乳液。参看例如，美国序列号13/328,844(美国专利公开第20120156728号)和13/842,296(美国专利公开第20130225421号)，以全文引用的方式并入本文中。然而，此类方法典型地需要对模板核酸和珠粒的相对浓度进行紧密控制的稀释和/或小心的调节以便稀释核酸分子的数目，以使得仅一个模板核酸分子扩增到任何既定珠粒上。这实现起来可能具挑战性。举例来说，乳液中的至少一些微液滴通常将含有多个不同模板核酸，这导致形成多克隆珠粒，所述多克隆珠粒在下游分析中可能不产生有用信息。其它微液滴可以含有一个模板核酸分子和多个珠粒，这导致多个珠粒各自连接到同一模板核酸的单克隆扩增子，这产生重复测序读数。多克隆性和重复读数是用于解释下一代测序数据的显著问题。需要改进的用于以较高产率和通量平行克隆扩增多个模板的核酸扩增方法。还需要避免了对限制稀释的需要的克隆扩增方法，和允许在扩增反应混合物内使用较高有效浓度的模板和引物同时充分保留克隆性的方法。

附图说明

图1是描绘用于核酸合成的组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置的一个实施例的示意图。来自与第一捕获引物(110)连接的第一多个第一类型的珠粒的一个珠粒(100)、来自包括第一衔接子(120)和第二衔接子(130)的第一靶核酸群体的一个靶核酸(140)、以及第一反向引物(150)。图1还描绘了来自与第二捕获引物(210)连接的第二多个第二类型的珠粒的一个珠粒(200)、来自包括第三衔接子(220)和第四衔接子(230)的第二靶核酸群体的一个靶核酸(240)、以及第二反向引物(250)。第一和第二珠粒、第一和第二靶核酸、以及第一和第二反向引物可以含于单一反应混合物中。

图2是描绘用于核酸合成的组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置的一个实施例的示意图。来自与第一捕获引物(110)连接的第一多个第一类型的珠粒的一个珠粒(100)、来自包括第一衔接子(120)和第二衔接子(130)的第一靶核酸群体的一个靶核酸(140)、第一反向引物(150)、以及第一融合引物(160)。图2还描绘了来自与第二捕获引物(210)连接的第二多个第二类型的珠粒的一个珠粒(200)、来自包括第三衔接子(220)和第四衔接子(230)的第二靶核酸群体的一个靶核酸(240)、第二反向引物(250)、以及第二融合引物(260)。第一和第二珠粒、第一和第二靶核酸、第一和第二反向引物、以及第一和第二融合引物可以含于单一反应混合物中。

图3A是描绘用于核酸合成的组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置的一个实施例的示意图。来自包括第一衔接子(120)和第二衔接子(130)的第一靶核酸群体的一个靶核酸(140)、以及可以是融合引物的第一转换引物(170a/b)。任选地，第一转换引物(170a/b)包括不含于第一衔接子(120)的一部分中或不与其互补的序列(170a)。在一个例示性实施例中，第一转换引物(170a/b)可以在引物延伸反应中用以将转换衔接子(170a)附接到第一衔接子(120)以产生具有序列170a、120、140和130的第一核酸分子。图3A还描绘了来自包括第三衔接子(220)和第四衔接子(230)的第二靶核酸群体的一个靶核酸(240)、以及可以是融合引物的第二转换引物(270a/b)。任选地，第二转换引物(270a/b)包括不含于第三衔接子(220)的一部分中或不与其互补的序列(270a)。在另一例示性实施例中，第二转换引物(270a/b)可以在引物延伸反应中用以将转换衔接子序列(270a)附接到第三衔接子(220)以产生具有序列270a、220、240和230的第二核酸分子。第一和第二靶核酸、以及第一和第二转换引物可以含于单一反应混合物中。

图3B是描绘用于核酸合成的组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置的一个实施例的示意图。来自与第一捕获引物(110)连接的第一多个第一类型的珠粒的一个珠粒(100)、来自包括第一转换衔接子(170a)和第一衔接子(120)和第二衔接子(130)的第一靶核酸群体的一个靶核酸(140)、第一反向引物(150)、以及第一融合引物(160)。图3B还描绘了来自与第二捕获引物(210)连接的第二多个第二类型的珠粒的一个珠粒(200)、来自包括第二转换衔接子(270a)和第三衔接子(220)和第四衔接子(230)的第二靶核酸群体的一个靶核酸(240)、第二反向引物(250)、以及第二融合引物(260)。第一和第二珠粒、第一和第二靶核酸、第一和第二反向引物、以及第一和第二融合引物可以含于单一反应混合物中。

图4A展示了使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的四个不同珠粒制备的第一批模板化珠粒的荧光图。

图4B展示了使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的四个不同珠粒制备的第二批模板化珠粒的荧光图。

图5A展示了使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的四个不同珠粒制备的第一批模板化珠粒(富集前)的荧光图。

图5B展示了使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的四个不同珠粒制备的在图5A中展示的相同的第一批模板化珠粒(富集)的荧光图。

图5C展示了使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的四个不同珠粒制备的第二批模板化珠粒(富集前)的荧光图。

图5D展示了使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的四个不同珠粒制备的在图5C中展示的相同的第一批模板化珠粒(富集)的荧光图。

图6是展示使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的一种、两种、三种或四种不同类型的珠粒所得的单独批次的模板化珠粒的重复率的图。

图7是展示使用与捕获引物和其同源衔接子、融合引物和反向引物连接的一种、两种、三种或四种不同类型的珠粒所得的单独批次的模板化珠粒的重复率的图。将所得模板化珠粒负载到一个、三个或四个Ion Torrent^TM Proton I^TM芯片上，并且测序。

具体实施方式

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于用不同离散载体(例如，珠粒)或向单一载体的不同离散区域(例如，阵列)上扩增不同模板核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置。所述方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置所提供的优势包括产生较少多克隆扩增子同时产生较多单克隆扩增子(或至少实质上单克隆的扩增子)。优势还包括减少重复测序读数。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过一个或多个回合的核酸合成来扩增不同靶核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置。在一些实施例中，所述方法可以包括使多个不同靶核酸扩增到珠粒上，以产生多个模板化珠粒，其中每个珠粒连接到靶核酸之一的实质上单克隆的群体。在一些实施例中，所述方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置包含在单一反应混合物中用多个珠粒平行扩增不同靶核酸。在一些实施例中，单一反应混合物可以经区室化(例如，经由乳液)，或可替代地单一反应混合物可以不经区室化。在一些实施例中，所述方法包括减少反应混合物内的多克隆扩增子产量。所述减少任选地包括增加单一反应混合物内待扩增的个别靶核酸之间的平均距离。在一些实施例中，减少多克隆扩增子的产量可以包括增加反应混合物的体积。应理解，应用适合技术，如本文所描述的那些，可以导致增加反应混合物的体积和增加待扩增的个别靶核酸之间的平均距离。

在一些实施例中，反应混合物内靶核酸之间的平均距离和/或反应混合物的体积可以通过向反应混合物添加额外组分而增加。在一些实施例中，额外组分可以包括一个或多个离散物理组分，如颗粒、珠粒、载体等。在一些实施例中，离散物理组分可以适用于维持待扩增的两个不同靶核酸之间的分隔。在一些实施例中，离散物理组分可以适用于增加待扩增的两个靶核酸之间的有效距离。如本文所用，“有效距离”是指在同一反应混合物内第一靶核酸从其当前位置行进到第二靶核酸的位置所得的平均路径长度。

在一些实施例中，反应混合物中的额外组分可以结合到迁移或可扩散的靶核酸。在一些实施例中，额外组分可以非特异性地结合到迁移或可扩散的靶核酸。在一些实施例中，额外组分可以结合到迁移或可扩散的靶核酸的至少一部分上的一个或多个特异性核苷酸序列。在一些实施例中，额外组分的核苷酸序列结合的序列特异性可以由一个或多个捕获引物提供。捕获引物任选地连接到一个或多个珠粒或表面上的一个或多个位置。在一些实施例中，捕获引物连接到反应混合物中的至少一个额外组分。在一些实施例中，捕获引物包括与靶核酸的至少一部分互补的序列。在一些实施例中，连接到珠粒、表面和/或额外组分连接或以其它方式与其缔合的捕获引物是随机或简并捕获引物，以使得随机或简并引物能够结合迁移或可扩散的靶核酸上的多个互补序列部分。在一些实施例中，连接到珠粒、表面和/或额外组分的捕获引物能够进行模板定向的延长。举例来说，捕获引物任选地具有末端3'OH基。在一些实施例中，捕获引物包括可延伸3'末端。在一些实施例中，连接到额外组分的捕获引物不能进行模板定向的延长，如通过修饰寡核苷酸的3'末端核苷酸上的3'-羟基。以此方式，不能延伸的引物可以以序列特异性或序列非特异性方式结合到迁移或可扩散的靶核酸，但因为其不能进一步进行模板定向的延长，所以其将不促进可能会导致多克隆性的进一步扩增。在一些实施例中，捕获引物的3'末端核苷酸是双脱氧核苷酸，以使得捕获引物是不胜任延长的。在一些实施例中，这些不胜任延长的捕获引物如由经修饰的核苷酸间键(例如，硫代磷酸酯)或封端基团修饰，以便对核酸外切酶或校读(如3'-5')核酸外切酶活性具有抗性。在一些实施例中，一个或多个捕获引物可以连接到颗粒、珠粒或载体，其中捕获引物选择性或非选择性结合到靶核酸，并且其中捕获引物能够负载引物延伸反应。

不希望受任何特定模型或理论束缚，通过向扩增反应混合物添加上文所述的额外组分(例如，珠粒、颗粒或载体)，额外组分用以包围靶核酸并且将其彼此分隔，因此增加个别靶核酸分子之间的有效距离，并且因此增加迁移靶核酸必须穿越遇到另一模板位置(可能会导致多克隆性)的实际距离。在一些实施例中，额外组分的存在还可以物理上阻碍或阻断靶核酸在反应混合物内的迁移，因为额外组分典型地对迁移靶核酸不可渗透。在一些实施例中，额外组分基本上对迁移靶核酸不可渗透，因为组分具有与反应混合物(例如液体)不同的物质相(例如固体或气体)。

在一些实施例中，向反应混合物添加额外组分(如珠粒、捕获引物和/或衔接子)可以用以减少或消除小体积反应混合物中的靶核酸迁移和多克隆性。具体来说，在某些实施例中，减少扩增反应混合物的体积可以是合意的，因为其可以提高反应效率、或减少所需试剂的量、或减小反应容器的大小、或具有其它优势或其任何组合。然而，减少体积还可能缩短反应混合物中的不同模板分子之间的距离，因此可能增加靶核酸迁移和因此多克隆性的问题。因此，在一些实施例中，通过还引入如本文所述的额外组分，可以减少、减轻或防止可能导致多克隆性的靶核酸迁移，尽管如本文所述是小反应体积。

在一些实施例中，向含有待扩增的不同靶核酸的反应混合物添加上文所述的额外组分用以增加反应体积的总体积。在此类实施例中并且不希望受任何模型或理论束缚，增加体积可以增加反应混合物中的任两个或更多个不同靶核酸之间的平均距离。以此方式，通过增加平均距离，迁移靶分子穿越不同靶分子之间的距离的可能性，并且因此减少、减轻或防止既定扩增位置处不同靶核酸扩增的多克隆性。

与常规扩增方法(包括emPCR)相比，所公开的方法(以及相关组合物、系统、试剂盒和试剂)可以提供若干优势。举例来说，与所公开的方法相比，常规PCR工作流程耗时并且浪费设备和试剂。举例来说，为了在高通量系统上执行多重测序，必须制备单独批次的模板化珠粒(每个批次不同于其它批次)，这需要在单独反应容器中装配多个扩增反应混合物，每个容器含有不同珠粒和/或不同靶核酸和/或单独试剂。所得单独批次的不同类型的模板化珠粒汇集在一起制得混合物。每个单独扩增反应的通量典型地受泊松统计(Poissonstatistics)限制。举例来说，emPCR反应中的生产性液滴的比例(包括产生单克隆或实质上单克隆的扩增群体的液滴的比例，或产生单克隆或实质上单克隆的模板化珠粒的液滴的比例)典型地根据泊松统计限制于接受单一模板核酸的液滴的数目。

相比之下，根据本发明传授内容的核酸合成方法提供了未由常规扩增方法提供的优势。核酸合成方法产生了从珠粒模板化步骤到测序步骤的简化工作流程，因为在单一反应容器中使用单一反应混合物(具有或不具有乳液)制备不同类型的模板化珠粒的混合物，所述单一反应混合物具有(i)不同珠粒类型，每种珠粒类型与不同捕获引物连接；和(ii)不同靶核酸群体，每个群体具有接合到靶核酸的不同衔接子序列，其中不同衔接子序列选择性结合到不同类型的捕获引物之一。因此，简化方法不需要多个反应容器，使用减少量的试剂，并且不采用汇集步骤。

许多下一代测序工作流程涉及至少一个核酸扩增步骤。扩增步骤可能会引入扩增偏差，包括多克隆性和重复。这些偏差成问题，因为其扭曲了待测序的遗传物质的初始复杂性(例如，相对丰度)。

通过降低模板化珠粒的多克隆性和重复率两者，所公开的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置提供了优于标准乳液PCR程序的优势。

基于区室化或以其它方式分离单一模板核酸分子以实现克隆扩增的需求，通过克服基于泊松的限制，所公开的方法还提供了增加的通量和反应效率。举例来说，所公开的方法克服了基于泊松的限定，并且允许在单一扩增反应内、任选地在基于乳液的扩增反应内在单一液滴内将不同类型的模板扩增到不同类型的珠粒上。

标准emPCR方法需要对珠粒和靶核酸的相对浓度进行缜密稀释和调节，以使得理想地，乳液中的每个水性液滴接受仅单一靶核酸和与捕获引物连接的单一珠粒。举例来说，归因于基于泊松的限定，典型地约20-35％的由标准乳液PCR程序产生的模板化珠粒是多克隆的。在大规模平行测序系统中，单克隆和多克隆模板化珠粒一起负载于同一测序装置(例如，孔、沟槽和流通池)上。多克隆珠粒不产生有意义的测序信息，因为每个珠粒用不同靶序列模板化。因此，测序装置上多克隆珠粒的存在降低了有用测序读数的总百分比并且降低了测序通量。相比之下，根据本发明传授内容制备的模板化珠粒的多克隆性比率可以降低约12-30％，所述多克隆性比率产生改进的有用总体测序信息，所述信息导致获自单一测序运行的测序读数的数目增加并且总测序通量增加。本发明传授内容提供了在不对珠粒和靶核酸的相对浓度进行稀释和/或调节的情况下提高多克隆性比率的方法，并且在含有任选地具有乳液的单一反应混合物的单一反应容器中执行。

测序读数数目的增加还可以通过在测序装置上产生充足的模板化珠粒以负载最大数目的可用位点(例如，孔、沟槽、流通池等)来实现。标准emPCR程序不产生充足的模板化珠粒，因此必须制备多个反应，并且模板化珠粒汇集和负载到测序装置上。

根据本发明传授内容的核酸合成方法可以用以制备水性液滴数目增加、反应体积不变化的乳液以导致模板化珠粒数目增加。这将免除对制备多个扩增反应和珠粒汇集的需要，并且将增加测序读数的数目。

当执行标准emPCR程序时，反应体积的变化还将改变重复珠粒的产率。举例来说，扩增反应体积的减小将增加珠粒重复率。

根据本发明传授内容的核酸合成方法可以在减小的总反应体积中在不显著增加重复珠粒的产率的情况下执行。举例来说，使用核酸合成方法(具有乳液)，与在约1.2mL反应体积中制备的模板化珠粒产生约9.4％重复珠粒相比，模板化珠粒在约2.4mL反应体积中制备并且产生约3.8％重复珠粒。相比之下，对照emPCR反应在约1.2mL中执行并且产生约26％重复珠粒。根据本发明传授内容的核酸合成方法可以在小到600μL或更小体积的反应体积中执行。

标准emPCR反应将产生具有约15-20％重复珠粒的模板化珠粒。大规模平行测序系统中的重复珠粒对于比较丰度的分析是不合意的。举例来说，起始RNA库可以含有不同丰度的不同转录物质。不同RNA物质的相对丰度将因具有高重复率的模板化珠粒制剂而歪曲。

通过根据本发明传授内容的核酸合成方法制备的模板化珠粒具有约2-12％的显著降低的珠粒重复率(使用RNA或DNA作为起始物质)，这使得测序数据的解释与初始遗传物质的复杂性更紧密比对。

扩增偏差的另一实例包括批次效应，其由在同一天或不同天执行不同反应的变化引起，例如归因于移液不准确、试剂批次差异、反应条件和执行扩增反应的技术员的差异。批次效应的另一来源来自展现微弱扩增效率差异的不同引物和/或衔接子序列。在标准emPCR条件下，当在单独反应容器(例如，单独批次)中扩增时，不同扩增效率可能加剧。

根据本发明传授内容的核酸合成方法可以用以通过在单一反应容器中使用单一反应混合物(具有或不具有乳液)执行扩增反应，来制备具有减小的批次偏差的不同类型模板化珠粒的混合物。

根据本发明传授内容的核酸合成方法可以用以减少可能在单一反应核酸合成方法中发生的珠粒凝集。举例来说，捕获引物、衔接子、反向引物、融合引物和/或转换引物中的任一者可以导致珠粒凝集，这可能导致产生多克隆珠粒或重复珠粒。不希望受理论所束缚，我们假定，珠粒凝集可以由两种或更多种不同类型的与珠粒连接的捕获引物之间的引物二聚体相互作用引起。一种解决珠粒凝集问题的方法包括选择引物中的任一者的长度和/或序列以减少珠粒凝集，其中引物包括捕获引物、衔接子、反向引物、融合引物和/或转换引物中的任一者或任何组合。

根据本发明传授内容的核酸合成方法可以用以减少可能在单一反应核酸合成方法中发生的重复珠粒形成。举例来说，捕获引物、衔接子、反向引物、融合引物和/或转换引物中的任一者可以导致重复珠粒形成。不希望受理论所束缚，我们假定，珠粒凝集可以导致重复模板珠粒的产量增加。一种解决重复珠粒形成问题的方法包括选择引物中的任一者的长度和/或序列以重复珠粒形成，其中引物包括捕获引物、衔接子、反向引物、融合引物和/或转换引物中的任一者或任何组合。另一方法包括增加核酸合成方法中的不同类型珠粒的数目。举例来说，重复珠粒形成可以通过将用以执行核酸合成方法的不同类型珠粒的数目从两种类型增加到三种、四种、五种、六种或更多种不同类型珠粒而减少。在一些实施例中，减少的重复珠粒形成产生改进的测序度量值，包括比对读数、覆盖率、多克隆性和平均读取长度。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含多个不同载体群体和多个不同靶核酸群体。在一些实施例中，不同靶核酸群体可以各自结合(例如，选择性结合)到对应珠粒群体。在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)还包括以下中的任一者或任何组合：引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(例如，重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

在一些实施例中，多个不同离散载体群体和多个不同靶核酸群体含于单一反应混合物中。在一些实施例中，单一反应混合物包含单一扩增反应混合物。在一些实施例中，多个不同离散载体群体和多个不同靶核酸群体可以含于单一反应容器中。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含至少两个不同离散载体(例如，珠粒等)群体和至少两个不同靶核酸群体。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体各自连接到特定核酸序列，例如捕获引物序列。在一些实施例中，每个不同载体群体连接到不同捕获引物序列。在一些实施例中，离散载体各自连接到一个或多个捕获引物，所述捕获引物经由杂交结合到可以与捕获引物杂交的其相应靶核酸群体。在一些实施例中，离散载体包含多个颗粒或珠粒。在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)还包括以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体各自结合到单一反应混合物中的不同靶核酸群体。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体和至少两个不同靶核酸群体可以含于单一扩增反应混合物中。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体和至少两个不同靶核酸群体可以含于单一反应容器中。在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包含多于两个不同离散载体群体和多于两个不同靶核酸群体。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含(i)至少第一珠粒群体，(ii)至少第一靶核酸群体，(iii)至少第二珠粒群体，和(iv)至少第二靶核酸群体。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包含单一反应混合物，所述单一反应混合物包括：(i)至少第一珠粒群体，(ii)至少第一靶核酸群体，(iii)至少第二珠粒群体，和(iv)至少第二靶核酸群体。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含还包括以下中的任一者或任何组合的单一反应混合物：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

在一些实施例中，第一珠粒群体可以结合第一靶核酸群体(图1)。任选地，第一珠粒群体与第一靶核酸群体之间的结合包括核酸杂交。任选地，第一群体的珠粒包括第一捕获引物并且结合包括使第一群体的靶核酸与第一捕获引物杂交。任选地，第一群体的珠粒包括第一捕获引物并且不包括其它类型的捕获引物。

在一些实施例中，第一珠粒群体结合到第一靶核酸群体。

在一些实施例中，一个或多个第一类型的捕获引物连接到第一珠粒群体。

在一些实施例中，第一靶核酸群体含有多个具有相同序列的靶核酸和/或多个具有不同序列的靶核酸。在一些实施例中，第一群体的靶核酸包括存在于第一群体的一些或所有成员中的共同序列(“第一共同序列”)。在一些实施例中，第一群体的靶核酸各自包括一个或多个共同序列和任选地一个或多个并非共同的额外序列。在一些实施例中，第一共同序列可以包括与第一捕获引物互补或一致的引物结合位点(“第一引物结合位点”)。

在一些实施例中，第一珠粒群体连接到一个或多个可以与第一靶核酸群体或其互补序列杂交的第一捕获引物。在一些实施例中，第一捕获引物可以与第一引物结合位点或其互补序列杂交。

在一些实施例中，第二珠粒群体可以结合第二靶核酸群体(图1)。任选地，第二珠粒群体与第二靶核酸群体之间的结合包括核酸杂交。任选地，第二群体的珠粒包括第二捕获引物并且结合包括使第二群体的靶核酸与第二捕获引物杂交。任选地，第二群体的珠粒包括第二捕获引物并且不包括其它类型的捕获引物。

在一些实施例中，第二珠粒群体结合到第二靶核酸群体。任选地，第二珠粒群体与第二靶核酸群体之间的结合包括核酸杂交。

在一些实施例中，一个或多个第二类型的捕获引物连接到第二珠粒群体。

在一些实施例中，第二靶核酸群体含有多个具有相同序列的靶核酸和/或多个具有不同序列的靶核酸。在一些实施例中，第二群体的靶核酸包括存在于第二群体的一些或所有成员中的共同序列(“第二共同序列”)。在一些实施例中，第二群体的靶核酸各自包括一个或多个共同序列和任选地一个或多个并非共同的额外序列。在一些实施例中，第二共同序列可以包括与第二捕获引物互补或一致的引物结合位点(“第二引物结合位点”)。

在一些实施例中，第二珠粒群体连接到一个或多个可以与第二靶核酸群体或其互补序列杂交的第二捕获引物。在一些实施例中，第二捕获引物可以与第二引物结合位点或其互补序列杂交。

在一些实施例中，至少第一珠粒群体、至少第一靶核酸群体、至少第二珠粒群体和至少第二靶核酸群体含于单一反应混合物中。

单一反应混合物可以进一步包括第三靶核酸群体和第三珠粒群体。第三靶核酸群体可以包括含有第三引物结合位点的第三共同序列。第三珠粒群体可以包括与第三引物结合位点互补或一致的第三捕获引物。

单一反应混合物可以进一步包括第四靶核酸群体和第四珠粒群体。第四靶核酸群体可以包括含有第四引物结合位点的第四共同序列。第四珠粒群体可以包括与第四引物结合位点互补或一致的第四捕获引物。

单一反应混合物可以进一步包括第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十靶核酸群体和第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十珠粒群体。第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十靶核酸群体可以包括含有第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十引物结合位点的第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十共同序列。第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十珠粒群体可以包括与第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十引物结合位点互补或一致的第五、第六、第七、第八、第九、第十或高于第十捕获引物。

在一些实施例中，单一反应混合物包含单一扩增反应混合物。

在一些实施例中，至少第一珠粒群体、至少第一靶核酸群体、至少第二珠粒群体和至少第二靶核酸群体含于单一反应容器中。

单一反应混合物还包括以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶和/或重组酶)、辅助蛋白、一种或多种核苷酸、二价阳离子、亲和部分和/或辅因子。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含含有以下的单一反应混合物：(i)第一珠粒群体，所述第一珠粒群体连接到一个或多个第一捕获引物；(ii)第二珠粒群体，所述第二珠粒群体连接到一个或多个第二捕获引物，其中所述第一与第二捕获引物不同；(iii)第一靶核酸群体，其中所述第一群体包括至少两个可以各自独立地结合到所述第一捕获引物的不同靶核酸；和(iv)第二靶核酸群体，其中所述第二群体包括至少两个可以各自独立地结合到所述第二捕获引物的不同靶核酸。任选地，第一靶核酸群体包括结合第一捕获引物的引物结合序列。任选地，第二靶核酸群体包括结合第二捕获引物的引物结合序列。任选地，单一反应混合物包括以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第二多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体。在一些实施例中，第一类型的珠粒包括第一捕获引物。在一些实施例中，第二类型的珠粒包括第二捕获引物。第一捕获引物可以不同于第二捕获引物。在一些实施例中，第一靶核酸群体包括可以结合到第一捕获引物的第一引物结合序列。第二靶核酸群体可以包括可以结合到第二捕获引物的第二引物结合序列。在一些实施例中，根据本发明的组合物存在于单一反应混合物内。在一些实施例中，组合物包括聚合酶和/或核苷酸和/或其它扩增试剂。在一些实施例中，组合物存在于乳液微液滴内。在一些实施例中，组合物进一步包括连接到第三捕获引物的第三类型的珠粒。组合物可以进一步包括第三靶核酸群体，所述第三靶核酸群体包括第三引物结合序列，其中第三引物结合序列可以与第三捕获引物杂交但不与第一和第二捕获引物杂交。

在一些实施例中，组合物进一步包括连接到第四捕获引物的第四类型的珠粒。组合物可以进一步包括第四靶核酸群体，所述第四靶核酸群体包括第四引物结合序列，其中第四引物结合序列可以与第四捕获引物杂交但不与第一、第二和第三捕获引物杂交。

在一些实施例中，组合物进一步包括连接到第五捕获引物的第五类型的珠粒。组合物可以进一步包括第五靶核酸群体，所述第五靶核酸群体包括第五引物结合序列，其中第五引物结合序列可以与第五捕获引物杂交但不与第一、第二、第三和第四捕获引物杂交。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含如下的单一反应混合物：(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第二多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包含如下的单一反应混合物：(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第二多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体，其中单一反应混合物不提供区室化或分隔。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包含含有以下的单一反应混合物：(i)第一多个第一类型的珠粒、所述第一类型的珠粒连接到一个或多个第一捕获引物；(ii)多个第二类型的珠粒，所述第二类型的珠粒连接到一个或多个第二捕获引物，其中所述第一与第二捕获引物不同；(iii)第一靶核酸群体，其中所述第一群体包括至少两个可以各自独立地结合到第一捕获引物的不同靶核酸；和(iv)第二靶核酸群体，其中所述第二群体包括至少两个可以各自独立地结合到第二捕获引物的不同靶核酸。在一些实施例中，单一反应混合物不提供区室化。

在一些实施例中，第一类型的珠粒可以连接到一个或多个第一捕获引物。

在一些实施例中，第二类型的珠粒可以连接到一个或多个第二捕获引物。

在一些实施例中，第一靶核酸群体包括至少两个可以各自独立地结合到第一捕获引物的不同靶核酸。

任选地，第一靶核酸群体中的至少两个不同靶核酸包括可以与第一捕获引物或其互补序列杂交的引物结合序列(“第一引物结合序列”)。

在一些实施例中，第二靶核酸群体包括至少两个可以各自独立地结合到第二捕获引物的不同靶核酸。

任选地，第二靶核酸群体中的至少两个不同靶核酸包括可以与第二捕获引物或其互补序列杂交的引物结合序列(“第二引物结合序列”)。

在一些实施例中，单一反应混合物包含单一连续液相。任选地，单一连续液相包含水相液体。任选地，单一连续液相不具有疏水相。

在一些实施例中，单一连续液相不将第一类型的珠粒与第二类型的珠粒分隔。在一些实施例中，单一连续液相不将第一靶核酸群体与第二靶核酸群体分隔。在一些实施例中，单一连续液相不将任何类型的珠粒与任何类型的靶核酸分隔。

在一些实施例中，单一反应容器含有单一反应混合物，所述单一反应混合物包括第一和第二多个分别第一和第二类型的珠粒以及第一和第二靶核酸群体，其中单一反应混合物不经区室化或分隔。

在一些实施例中，第一靶核酸群体含有具有相同序列或不同序列的混合物的靶核酸。

任选地，第一靶核酸群体含有两个或更多个可以结合第一多个珠粒的靶核酸。

任选地，第一多个珠粒与第一靶核酸群体之间的结合包含选择性结合，所述结合包括两个核酸之间的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对。

任选地，一个或多个第一类型的捕获引物连接到第一多个珠粒。

任选地，第一靶核酸群体含有两个或更多个可以独立地结合到第一捕获引物的不同靶核酸。

任选地，第一多个珠粒与具有相同序列或不同序列的混合物的第一类型的捕获引物中的一者或多者连接。

任选地，第一类型的捕获引物共价连接到第一多个珠粒。

任选地，第一多个珠粒与具有相同序列的一种类型的捕获引物连接。

任选地，第一多个珠粒不包括任何第二捕获引物。

任选地，第一类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸结合到第一多个珠粒。

任选地，第一靶核酸群体的靶核酸通过杂交结合到第一多个珠粒。

任选地，第一靶核酸群体的至少两个不同靶核酸各自与第一捕获引物杂交。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区具有与第一或第二捕获引物的至少一区互补或一致的序列。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区具有与第一或第二捕获引物的至少一区一致的序列。

在一些实施例中，第二靶核酸群体含有具有相同序列或不同序列的混合物的靶核酸。

任选地，第二靶核酸群体含有两个或更多个可以结合第二多个珠粒的靶核酸。

任选地，第二多个珠粒与第二靶核酸群体之间的结合包含选择性结合。

任选地，一个或多个第二类型的捕获引物连接到第二多个珠粒。

任选地，第二靶核酸群体含有两个或更多个可以独立地结合到第二捕获引物的不同靶核酸。

任选地，第二多个珠粒与具有相同序列或不同序列的混合物的第二类型的捕获引物中的一者或多者连接。

任选地，第二类型的捕获引物共价连接到第二多个珠粒。

任选地，第二多个珠粒与具有相同序列的一种类型的捕获引物连接。

任选地，第二多个珠粒不包括任何第一捕获引物。

任选地，第二类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸结合到第二多个珠粒。

任选地，第二靶核酸群体的靶核酸通过杂交结合到第二多个珠粒。

任选地，第二靶核酸群体的至少两个不同靶核酸各自与第二捕获引物杂交。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区具有与第一或第二捕获引物的至少一区互补或一致的序列。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区具有与第一或第二捕获引物的至少一区一致的序列。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸可以具有相同序列或不同序列的混合物。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸可以具有相同序列或不同序列的混合物。

任选地，第一靶核酸群体的至少一个靶核酸和第二靶核酸群体的至少一个靶核酸具有相同序列。

任选地，第一靶核酸群体和第二靶核酸群体不含有具有相同序列的任何靶核酸。

任选地，第一多个珠粒与第一类型的捕获引物连接，并且第二多个珠粒与第二类型的捕获引物连接，并且第一类型的捕获引物与第二类型的捕获引物的序列相同或不同。

任选地，第一多个珠粒仅包括第一类型的捕获引物。

任选地，第二多个珠粒仅包括第二类型的捕获引物。

任选地，第一珠粒群体经由杂交选择性结合到第一靶核酸群体。

任选地，第二珠粒群体经由杂交选择性结合到第二靶核酸群体。

任选地，第一珠粒群体与第一靶核酸群体之间和第二珠粒群体与第二靶核酸群体之间的选择性结合在单一反应混合物中发生。

任选地，第一珠粒群体与第一靶核酸群体之间和第二珠粒群体与第二靶核酸群体之间的选择性结合在不提供区室化的单一反应混合物中发生。

在一些实施例中，包含单一反应混合物的组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)进一步包括额外引物类型，包括第三、第四、第五或高于第五不同引物类型。

在一些实施例中，包含单一反应混合物的组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)进一步包括以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

任选地，酶催化了核苷酸掺入(例如，聚合酶)。

任选地，酶包含辅助蛋白。

任选地，额外引物包括溶液中的或连接到载体(例如，珠粒或颗粒)的引物。

任选地，核苷酸包含天然核苷酸或其类似物。

任选地，结合伴侣包含生物素。

任选地，辅因子包括盐、阳离子、ATP、磷酸肌酸、镁、锰和钙。

任选地，第一多个第一类型的珠粒、第一靶核酸群体、第二多个第二类型的珠粒和第二靶核酸群体含于单一反应混合物中。

任选地，单一反应混合物包含扩增反应混合物。

任选地，第一多个第一类型的珠粒、第一靶核酸群体、第二多个第二类型的珠粒和第二靶核酸群体含于单一反应容器中。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其在提供区室化或分隔的单一反应混合物中包含至少两种不同类型的珠粒和至少两种不同类型的靶核酸。在一些实施例中，单一反应混合物提供至少一个隔室，所述隔室含有至少两种不同类型的珠粒和至少两种不同类型的靶核酸。举例来说，单一反应混合物具有至少一个含有以下的隔室：(1)第一多个第一类型的珠粒和第二多个第二类型的珠粒，以及(2)第一靶核酸群体和第二靶核酸群体。任选地，至少一个隔室可以含有额外不同类型的珠粒和额外不同类型的靶核酸。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含如下的单一反应混合物：(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第二多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体，其中单一反应混合物提供区室化或分隔。在一些实施例中，单一反应混合物提供至少一个隔室。任选地，至少一个隔室可以含有额外不同类型的珠粒和额外不同类型的靶核酸。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含提供至少一个隔室的单一反应混合物，其中所述至少一个隔室含有(i)第一多个第一类型的珠粒，所述第一类型的珠粒连接到一个或多个第一捕获引物；(ii)多个第二类型的珠粒，所述第二类型的珠粒连接到一个或多个第二捕获引物，其中所述第一与第二捕获引物不同；(iii)第一靶核酸群体，其中所述第一群体包括至少两个可以各自独立地结合到第一捕获引物的不同靶核酸；和(iv)第二靶核酸群体，其中所述第二群体包括至少两个可以各自独立地结合到第二捕获引物的不同靶核酸。

任选地，单一反应混合物含于单一反应容器中。

任选地，第一靶核酸群体中的至少两个不同靶核酸包括结合第一捕获引物的引物结合序列。

任选地，第二靶核酸群体中的至少两个不同靶核酸包括结合第二捕获引物的引物结合序列。

任选地，单一反应混合物进一步包括以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含提供区室化或分隔的单一反应混合物，所述单一反应混合物包括乳液。

任选地，乳液包含非连续亲水相和连续疏水相。

任选地，非连续亲水相由连续疏水相包围。

任选地，乳液包含至少一个由连续疏水相包围的亲水相隔室(例如，液滴或微反应器)。

任选地，非连续亲水相提供了隔室。

任选地，乳液包含多个亲水相液滴和连续疏水相。

任选地，乳液包含多个水性液滴和连续疏水相。

任选地，乳液包含至少一个水性液滴。

任选地，至少一个水性液滴包括一个或多个珠粒。

任选地，至少一个水性液滴包括一个或多个不同靶核酸。

任选地，乳液包括至少一个水性液滴，所述至少一个水性液滴包括一个或多个第一类型、第二类型的珠粒或第一和第二两种类型的珠粒。

任选地，乳液包括至少一个水性液滴，所述至少一个水性液滴包括一个或多个不同靶核酸，包括第一群体、第二群体或第一和第二两种群体的靶核酸。

在一些实施例中，乳液包含两个不可混溶的液相。在一些实施例中，两个不可混溶的液相混合在一起制得乳液。在一些实施例中，液相中的一者分散于另一者中。任选地，乳液包含水性液体和水不可混溶的有机液体的混合物。任选地，乳液包含至少一种阴离子、阳离子或非离子表面活性剂。任选地，乳液可以具有包含水包油、油包水或双连续微乳液的液滴型分散液。

在一些实施例中，水不可混溶的有机液体包含油。在一些实施例中，油可以来自天然来源，包括动物(例如，牛脂或猪油)、鱼(例如，鱼油)、鲨鱼、种子、坚果或植物(例如，植物油)。任选地，油可以衍生自石油，包括矿物油。任选地，油包含氟化学油、聚α-烯烃或酯油。

在一些实施例中，表面活性剂包括小分子表面活性剂、聚合表面活性剂、三嵌段共聚物表面活性剂或非离子嵌段共聚物表面活性剂。任选地，表面活性剂包含脱水山梨糖醇油酸酯或硅酮表面活性剂。

任选地，亲水相隔室可以含有至少两种不同类型的珠粒。任选地，亲水相隔室可以含有至少两种不同类型的靶核酸。

任选地，至少一个亲水相隔室可以含有(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第一靶核酸群体，(iii)第二多个第二类型的珠粒，和(iv)第二靶核酸群体。任选地，至少一个亲水相隔室可以含有额外不同类型的珠粒和额外不同类型的靶核酸。任选地，亲水相隔室可以进一步含有以下中的任一者或任何组合：引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

任选地，至少一个隔室(例如，亲水相隔室)含有第一靶核酸群体，所述第一靶核酸群体包括具有相同序列或不同序列的混合物的靶核酸。

任选地，第一多个珠粒与第一靶核酸群体之间的结合包含选择性结合。

任选地，第一多个珠粒连接到一个或多个第一类型的捕获引物。

任选地，第一类型的捕获引物共价连接到第一多个珠粒。

任选地，第一多个珠粒不包括任何第二捕获引物。

任选地，第一类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸结合到第一多个珠粒。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区与第一或第二捕获引物的至少一区互补。

任选地，至少一个隔室(例如，亲水相隔室)含有第二靶核酸群体，所述第二靶核酸群体包括具有相同序列或不同序列的混合物的靶核酸。

在一些实施例中，一个或多个第二类型的捕获引物连接到第二多个珠粒。

任选地，第二类型的捕获引物共价连接到第二多个珠粒。

任选地，第二多个珠粒不包括任何第一捕获引物。

任选地，第二类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸结合到第二多个珠粒。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区与第一或第二捕获引物的至少一区互补。

任选地，至少一个隔室(例如，亲水相隔室)含有第一靶核酸群体的至少一个靶核酸和第二靶核酸群体的至少一个靶核酸，所述靶核酸具有相同序列。

任选地，至少一个隔室(例如，亲水相隔室)含有第一靶核酸群体和第二靶核酸群体，所述群体不包括具有相同序列的任何靶核酸。

任选地，第一多个珠粒仅包括第一类型的捕获引物。

任选地，第二多个珠粒仅包括第二类型的捕获引物。

任选地，选择性结合在至少一个隔室(例如，亲水相隔室)中发生。

任选地，至少一个隔室(例如，亲水相隔室)含有额外引物，包括第三、第四、第五或高于第五不同引物类型。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含具有至少一个隔室(例如，亲水相隔室)的单一反应混合物，所述隔室含有(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第一靶核酸群体，(iii)第二多个第二类型的珠粒，(iv)第二靶核酸群体，和(v)以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

任选地，酶催化了核苷酸掺入(例如，聚合酶)。

任选地，酶包含辅助蛋白(例如，重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)。

任选地，额外引物包括溶液中的或连接到至少一个离散载体的引物。任选地，额外引物包括不共价连接到第一或第二或任何类型的珠粒的引物。

任选地，核苷酸包含天然核苷酸或其类似物。

任选地，结合伴侣包含生物素。

任选地，单一反应混合物包含扩增反应混合物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含含有多个不同模板核酸与多个离散载体(例如，珠粒)和多个靶核酸分子(本文中也简单地称为“靶核酸”)的反应混合物，其中所述珠粒和所述靶核酸以产生规定珠粒与靶核酸比率的特定量存在。在一些实施例中，珠粒与靶核酸比率是规定体积的反应混合物中存在的珠粒的数目除以规定体积的反应混合物内的靶核酸的数目。在一些实施例中，珠粒和靶核酸添加到既定量的油和/或水相以形成含有珠粒、靶核酸和油相和/或水相的反应混合物；任选地，比率是用以形成规定体积的反应混合物的所添加的珠粒的数目除以所添加的靶核酸的数目。在一些实施例中，反应混合物在规定体积的反应混合物中包括特定、预定或预选的珠粒与靶核酸比率。任选地，反应混合物在一定体积的包括或不具有区室化的反应混合物中含有一定的珠粒与靶核酸比率。任选地，反应混合物是单一反应混合物。在一些实施例中，反应混合物在一定体积中含有的珠粒与靶核酸比率包括：约平均1个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物到平均约2个离散载体:平均1个靶核酸/1mL反应混合物，或约平均2个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物到平均约5个离散载体:平均1个靶核酸/1mL反应混合物。在一些实施例中，反应混合物包括一平均珠粒与靶核酸比率，其可以是规定体积的反应混合物中存在的珠粒的平均数目除以核酸的平均数目。举例来说，反应混合物任选地包括平均5个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物的比率(“5:1平均珠粒与靶核酸比率”)、或平均7个离散载体与平均1个靶核酸/1mL的比率(“7:1平均珠粒与靶核酸比率”)、或平均10个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物的比率(“10:1平均珠粒与靶核酸比率”)。在一些实施例中，反应混合物包括约1、约5、或约7、或约10、或约15、或约25的平均珠粒与靶核酸比率。在一些实施例中，反应混合物包括约1到约10、或1到10、1到15、或1到25、或约1到约5、或1到5、或5到25、或5到15、或5到10、或5到7、或7到15、或7到10、或7到25、或15到25的平均珠粒与靶核酸比率。在一些实施例中，反应混合物包括约10个离散载体:1个靶核酸/1mL反应混合物到约15个离散载体:1个核酸/1mL的比率、或约15个离散载体:1个核酸/1mL到约20个离散载体:1个核酸/1mL的比率、或约20个离散载体:1个核酸/1mL到约25个离散载体:1个靶核酸/1mL的比率、或约25个离散载体:1个靶核酸/1mL到约30个离散载体:1个核酸/1mL的比率、或约30个离散载体:1个靶核酸/1mL到约50个离散载体:1个靶核酸/1mL反应混合物的比率。

任选地，反应混合物在一定体积的反应混合物中含有包括约5亿个离散载体和约5000万个靶核酸/1mL体积的反应混合物的珠粒与靶核酸比率。

任选地，反应混合物在一定体积的反应混合物中含有包括约10亿个离散载体和约1亿个靶核酸/1mL体积的反应混合物的珠粒与靶核酸比率。

任选地，离散载体与靶核酸比率/1mL反应混合物可以增加或减小。

任选地，离散载体的量可以增加约2到10倍/1mL反应混合物(例如，增加到约10-50亿个离散载体/1mL反应混合物)。

任选地，离散载体的量可以增加约2到10倍/1mL反应混合物(例如，增加到约20-100亿个离散载体/1mL反应混合物)，或增加约10到20倍/1mL反应混合物(例如，增加到约100-200亿个离散载体/1mL反应混合物)，或增加约20到30倍/1mL反应混合物(例如，增加到约200-300亿个离散载体/1mL反应混合物)，或增加约30到40倍/1mL反应混合物(例如，增加到约300-400亿个离散载体/1mL反应混合物)，或增加约40到50倍或更大/1mL反应混合物(例如，增加到约400-500亿个或更多个离散载体/1mL反应混合物)。

任选地，离散载体的量可以减少约2到10倍/1mL反应混合物，或减少约10到25倍/1mL反应混合物，或减少约25到50倍/1mL反应混合物。

任选地，靶核酸的量可以增加约2到约5倍/1mL反应混合物(例如，增加到约1-2.5亿个靶核酸/1mL反应混合物)。

任选地，靶核酸的量可以增加约2到约5倍/1mL反应混合物(例如，增加到约2-5亿个靶核酸/1mL反应混合物)，或增加约5到约10倍/1mL反应混合物(例如，增加到约5-10亿个靶核酸/1mL反应混合物)，或增加约10到约20倍/1mL反应混合物(例如，增加到约10-20亿个靶核酸/1mL反应混合物)，或增加约20到约50倍/1mL反应混合物(例如，增加到约20-50亿个靶核酸/1mL反应混合物)。

任选地，靶核酸的量可以增加高达100倍或更大/1mL反应混合物(例如，增加到约100亿个或更多个靶核酸/1mL反应混合物)。

任选地，靶核酸的量可以减少约2到10倍/1mL反应混合物，或减少约10到25倍/1mL反应混合物，或减少约25到50倍/1mL反应混合物。

在一些实施例中，所述组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置包含单一反应混合物，所述单一反应混合物在约2.4mL反应混合物中含有约60亿个离散载体和约3-8亿个靶核酸。

在一些实施例中，所述组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置包含单一反应混合物，所述单一反应混合物在规定体积中含有约180-240亿个之间的离散载体和约18亿个靶核酸。任选地，反应混合物的规定体积在1mL与5mL之间，典型地2与4mL之间，更典型地2与3mL之间。在一些实施例中，规定体积是2.4mL。任选地，反应混合物包括或不具有区室化。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供多个不同靶核酸群体和多个不同类型的离散载体，和(b)形成连接到不同类型的离散载体的不同扩增靶核酸群体。在一些实施例中，合成核酸的方法可以用以扩增核酸。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过一个或多个回合的核酸合成来扩增不同靶核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置。

在一些实施例中，多个不同靶核酸群体可以结合多个不同类型的离散载体。在一些实施例中，不同类型的离散载体包括不同类型的捕获引物。在一些实施例中，多个不同靶核酸群体结合不同类型的捕获引物。在一些实施例中，多个不同靶核酸群体和多个不同类型的离散载体提供于单一反应混合物中。在一些实施例中，单一反应混合物包含核酸扩增反应混合物。在一些实施例中，单一反应混合物包括以下中的任一者或任何组合：引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。任选地，单一反应混合物提供区室化，或不提供区室化。任选地，单一反应混合物包含乳液。任选地，单一反应混合物可以含于单一反应容器中。在一些实施例中，多个不同离散载体包括多个不同珠粒。在一些实施例中，多个不同类型的离散载体包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或更多种不同类型的离散载体。在一些实施例中，不同扩增靶核酸群体通过执行任何类型的核酸扩增反应形成，所述核酸扩增反应包括PCR扩增、等温扩增、滚环扩增或基于乳液的扩增。在一些实施例中，不同扩增靶核酸群体大体上是单克隆的。任选地，所述方法进一步包含对连接到不同类型的离散载体的不同扩增靶核酸群体测序。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供至少两个不同靶核酸群体和至少两个不同离散载体群体，和(b)形成连接到不同类型的离散载体的至少两个不同扩增靶核酸群体。

在一些实施例中，多个不同靶核酸群体可以结合多个不同类型的离散载体。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体包括不同类型的捕获引物。在一些实施例中，至少两个不同靶核酸群体选择性结合不同类型的捕获引物。在一些实施例中，多个不同靶核酸群体和多个不同类型的离散载体提供于单一反应混合物中。在一些实施例中，单一反应混合物包含核酸扩增反应混合物。在一些实施例中，单一反应混合物包括以下中的任一者或任何组合：引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。任选地，单一反应混合物提供区室化，或不提供区室化。任选地，单一反应混合物包含乳液。任选地，单一反应混合物可以含于单一反应容器中。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体包括至少两个不同珠粒群体。在一些实施例中，至少两个不同离散载体群体包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或更多种不同类型的离散载体。在一些实施例中，至少两个不同扩增靶核酸群体通过执行任何类型的核酸扩增反应形成，所述核酸扩增反应包括PCR扩增、等温扩增、滚环扩增或基于乳液的扩增。在一些实施例中，至少两个不同扩增靶核酸群体大体上是单克隆的。任选地，所述方法进一步包含对连接到不同类型的离散载体的至少两个不同扩增靶核酸群体测序。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)至少第一珠粒群体，(ii)至少第一靶核酸群体，(iii)至少第二珠粒群体，和(iv)至少第二靶核酸群体；以及(b)形成分别连接到第一和第二珠粒群体的第一和第二靶核酸群体的第一和第二扩增群体。

在一些实施例中，至少第一靶核酸群体可以结合至少第一珠粒群体。在一些实施例中，至少第二靶核酸群体可以结合至少第二珠粒群体。在一些实施例中，至少第一珠粒群体包括第一类型的捕获引物。在一些实施例中，至少第二珠粒群体包括第二类型的捕获引物。在一些实施例中，至少第一靶核酸群体选择性结合第一类型的捕获引物。在一些实施例中，至少第二靶核酸群体选择性结合第二类型的捕获引物。在一些实施例中，单一反应混合物包含核酸扩增反应混合物。在一些实施例中，单一反应混合物包括以下中的任一者或任何组合：引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。任选地，单一反应混合物提供区室化，或不提供区室化。任选地，单一反应混合物包含乳液。任选地，单一反应混合物可以含于单一反应容器中。在一些实施例中，单一反应混合物含有两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或更多个不同珠粒群体。在一些实施例中，第一和第二靶核酸群体的第一和第二扩增群体通过执行任何类型的核酸扩增反应形成，所述核酸扩增反应包括PCR扩增、等温扩增、滚环扩增或基于乳液的扩增。在一些实施例中，第一靶核酸群体的第一扩增群体大体上是单克隆的。在一些实施例中，第二靶核酸群体的第二扩增群体大体上是单克隆的。任选地，所述方法进一步包含对第一和第二扩增靶核酸群体测序。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，(ii)多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，所述第一类型的珠粒包括第一捕获引物，(ii)多个第二类型的珠粒，所述第二类型的珠粒包括第二捕获引物，其中所述第一与第二捕获引物不同，(iii)第一靶核酸群体，其中所述第一群体包括至少一个结合到所述第一捕获引物的第一类型的靶核酸，和(iv)第二靶核酸群体，其中所述第二群体包括至少一个结合到所述第二捕获引物的第二类型的靶核酸；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体，其中所述第一扩增群体连接到所述第一类型的一个或多个珠粒；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体，其中所述第二扩增群体连接到所述第二类型的一个或多个珠粒。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于单克隆地扩增第一靶核酸群体的第一靶序列和第二靶核酸群体的第一靶序列的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其包含：(a)提供单一反应混合物，所述单一反应混合物具有：(i)多个第一类型的珠粒，所述珠粒包括第一捕获引物，(ii)多个第二类型的珠粒，所述珠粒包括第二捕获引物，(iii)第一靶核酸群体，(iv)第一融合引物，其包括与所述第一捕获引物互补的部分，(v)第二靶核酸群体，和(vi)第二融合引物，其包括与所述第二捕获引物互补的部分；(b)使用所述第一融合引物在所述第一类型的珠粒上形成所述第一靶核酸群体的所述第一靶序列的实质上单克隆的群体；以及使用所述第二融合引物在所述第二类型的珠粒上形成所述第二靶核酸群体的所述第一靶序列的实质上单克隆的群体。任选地，第一与第二捕获引物不同。任选地，第一群体包括至少一个结合到第一融合引物的靶核酸。任选地，第二群体包括至少一个结合到第二融合引物的靶核酸。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于扩增单一反应混合物中的多个不同核酸群体的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其包含：(a)提供单一反应混合物，所述单一反应混合物包括：(i)第一和第二核酸群体，其中所述第一核酸群体含有第一引物结合序列，并且其中所述第二核酸群体含有第二引物结合序列，和(ii)第一多个珠粒，所述珠粒包括可以结合到所述第一引物结合序列的第一捕获序列，(iii)第二多个珠粒，所述珠粒包括可以结合到所述第二引物结合序列的第二捕获序列；以及(b)在所述单一反应混合物内，扩增所述第一群体的一个或多个核酸以形成第一扩增群体和所述第二群体的一个或多个核酸以形成第二扩增群体。

在一些实施例中，第一与第二引物结合序列的序列彼此不同。

在一些实施例中，第一与第二捕获序列的序列彼此不同。

在一些实施例中，第一扩增群体可以结合到一个或多个第一类型的珠粒。

在一些实施例中，第二扩增群体可以结合到一个或多个第二类型的珠粒。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置。

在一些实施例中，多个第一类型的珠粒包括一个或多个第一类型的捕获引物。

在一些实施例中，多个第二类型的珠粒包括一个或多个第二类型的捕获引物。

在一些实施例中，第一类型的珠粒上的一个或多个第一捕获引物的序列相同或是不同序列的混合物。

在一些实施例中，第二类型的珠粒上的一个或多个第二捕获引物的序列相同或是不同序列的混合物。

在一些实施例中，第一捕获引物的序列与第二捕获引物的序列相同。

在一些实施例中，第一捕获引物的序列与第二捕获引物的序列不同。

任选地，第一与第二捕获引物的浓度(例如，密度)大致相同。

在一些实施例中，第一靶核酸群体可以结合多个第一类型的珠粒。

在一些实施例中，第一靶核酸群体包括至少一个结合到第一捕获引物的第一类型的靶核酸。

任选地，第一靶核酸群体包括至少一个具有与第一捕获引物的序列互补或一致的序列的第一类型的靶核酸。

在一些实施例中，第一靶核酸群体选择性结合第一类型的捕获引物。

任选地，第一靶核酸群体包括至少一个通过与第一捕获引物杂交而结合第一类型的珠粒的第一类型的靶核酸

在一些实施例中，第二靶核酸群体可以结合多个第二类型的珠粒。

在一些实施例中，第二靶核酸群体包括至少一个结合到第二捕获引物的第二类型的靶核酸。

任选地，第二靶核酸群体包括至少一个具有与第二捕获引物的序列互补或一致的序列的第二类型的靶核酸。

任选地，第二靶核酸群体选择性结合第二捕获引物。

任选地，第二靶核酸群体包括至少一个通过与第二捕获引物杂交而结合第二类型的珠粒的第二类型的靶核酸

在一些实施例中，单一反应混合物包含核酸扩增反应混合物。

在一些实施例中，单一反应混合物包括以下中的任一者或任何组合：引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

任选地，单一反应混合物提供区室化，或不提供区室化。

任选地，单一反应混合物包含乳液。任选地，乳液包含油包水乳液。

任选地，单一反应混合物可以含于单一反应容器中。

在一些实施例中，单一反应混合物含有两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或更多种不同类型的珠粒，其中每种不同类型的珠粒包括不同类型的捕获引物。

在一些实施例中，第一扩增核酸群体通过扩增第一群体的一个或多个靶核酸而形成。

在一些实施例中，形成第一扩增核酸群体包括使第一靶核酸群体的至少一个靶核酸与第一类型的珠粒上的第一捕获引物杂交。

任选地，形成第一扩增核酸群体进一步包括以模板依赖性引物延伸反应延伸第一捕获引物。

在一些实施例中，第一扩增核酸群体共价连接到第一类型的一个或多个珠粒。

在一些实施例中，第一扩增核酸群体通过执行任何类型的核酸扩增反应形成，所述核酸扩增反应包括PCR扩增、等温扩增、滚环扩增或基于乳液的扩增。

在一些实施例中，第一扩增核酸群体大体上是单克隆的。

在一些实施例中，第二扩增核酸群体通过扩增第二群体的一个或多个靶核酸而形成。

在一些实施例中，形成第二扩增核酸群体包括使第二靶核酸群体的至少一个靶核酸与第二类型的珠粒上的第二捕获引物杂交。

任选地，形成第二扩增核酸群体进一步包括以模板依赖性引物延伸反应延伸第二捕获引物。

在一些实施例中，第二扩增核酸群体共价连接到第二类型的一个或多个珠粒。

在一些实施例中，第二扩增核酸群体通过执行任何类型的核酸扩增反应形成，所述核酸扩增反应包括PCR扩增、等温扩增、滚环扩增或基于乳液的扩增。

在一些实施例中，第二扩增核酸群体大体上是单克隆的。

在一些实施例中，第一和第二扩增核酸群体都大体上是单克隆的。

任选地，所述方法进一步包含对第一扩增核酸群体测序。任选地，所述方法进一步包含对第二扩增核酸群体测序。任选地，对第一和第二扩增核酸群体平行测序。任选地，测序包括检测一种或多种核苷酸掺入副产物。任选地，测序包括检测氢离子或焦磷酸。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，(ii)多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体，其中所述单一反应混合物不提供区室化或分隔。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，(ii)多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体，其中所述单一反应混合物不提供区室化或分隔，并且任选地其中所述单一反应混合物还包括一种或多种辅助蛋白，包括重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，所述第一类型的珠粒连接到一个或多个第一捕获引物，(ii)多个第二类型的珠粒，所述第二类型的珠粒连接到一个或多个第二捕获引物，其中所述第一与第二捕获引物不同，(iii)第一靶核酸群体，其中所述第一群体包括至少两个可以各自独立地结合到第一捕获引物的不同靶核酸，和(iv)第二靶核酸群体，其中所述第二群体包括至少两个可以各自独立地结合到第二捕获引物的不同靶核酸；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体，其中所述单一反应混合物不提供区室化或分隔，并且任选地其中所述单一反应混合物还包括一种或多种辅助蛋白，包括重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶。

在一些实施例中，在合成核酸的方法中，单一反应混合物包含单一连续液相。在一些实施例中，单一连续液相包含水相液体。在一些实施例中，单一连续液相不具有疏水相。

在一些实施例中，单一反应容器含有包括至少两种不同类型的珠粒和至少两种不同类型的靶核酸的单一反应混合物，其中单一反应混合物不提供区室化或分隔。

在一些实施例中，单一反应混合物不提供区室化，并且第一靶核酸群体含有具有相同序列或不同序列的混合物的靶核酸。

任选地，第一类型的捕获引物共价连接到第一多个珠粒。

任选地，第一多个珠粒不包括任何第二捕获引物。

任选地，第一类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸结合到第一多个珠粒。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区具有与第一或第二捕获引物的至少一区互补的序列。

在一些实施例中，单一反应混合物不提供区室化，并且第二靶核酸群体含有具有相同序列或不同序列的混合物的靶核酸。

任选地，第二类型的捕获引物共价连接到第二多个珠粒。

任选地，第二多个珠粒不包括任何第一捕获引物。

任选地，第二类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸结合到第二多个珠粒。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区具有与第一或第二捕获引物的至少一区互补的序列。

任选地，第一多个珠粒仅包括第一类型的捕获引物。

任选地，第二多个珠粒仅包括第二类型的捕获引物。

在一些实施例中，包含单一反应混合物(例如，其不提供区室化)的方法(以及相关组合物、系统、试剂盒和装置)进一步包括额外引物类型，包括第三、第四、第五或高于第五不同引物类型。

在一些实施例中，包含单一反应混合物(例如，其不提供区室化)的方法(以及相关组合物、系统、试剂盒和装置)进一步包括以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子。

任选地，酶催化了核苷酸掺入(例如，聚合酶)。

任选地，酶包含辅助蛋白。

任选地，核苷酸包含天然核苷酸或其类似物。

任选地，结合伴侣包含生物素。

任选地，单一反应混合物包含扩增反应混合物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，(ii)多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体，其中所述单一反应混合物提供区室化或分隔。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供包括乳液的单一反应混合物，所述单一反应混合物含有(i)多个第一类型的珠粒，(ii)多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，和(iv)第二靶核酸群体；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体。

在一些实施例中，单一反应混合物提供至少一个隔室，所述隔室含有至少两种不同类型的珠粒和至少两种不同类型的靶核酸。举例来说，单一反应混合物具有至少一个含有以下的隔室：(1)第一多个第一类型的珠粒和第二多个第二类型的珠粒，以及(2)第一靶核酸群体和第二靶核酸群体。任选地，至少一个隔室可以含有额外不同类型的珠粒和额外不同类型的靶核酸。

在一些实施例中，在合成核酸的方法中，单一反应混合物含有乳液，提供区室化或分隔。

任选地，乳液包含非连续亲水相和连续疏水相。

任选地，非连续亲水相由连续疏水相包围。

任选地，非连续亲水相提供了隔室。

任选地，乳液包含多个亲水相液滴和连续疏水相。

任选地，乳液包含多个水性液滴和连续疏水相。

任选地，乳液包含至少一个水性液滴。

任选地，至少一个水性液滴包括一个或多个珠粒。

任选地，至少一个水性液滴包括一个或多个不同靶核酸。

任选地，第一类型的捕获引物共价连接到第一多个珠粒。

任选地，第一多个珠粒不包括任何第二捕获引物。

任选地，第一类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸结合到第一多个珠粒。

任选地，第二类型的捕获引物共价连接到第二多个珠粒。

任选地，第二多个珠粒不包括任何第一捕获引物。

任选地，第二类型的捕获引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸结合到第二多个珠粒。

任选地，第一多个珠粒仅包括第一类型的捕获引物。

任选地，第二多个珠粒仅包括第二类型的捕获引物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于通过以下方式合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置：(a)提供含有以下的单一反应混合物：(i)多个第一类型的珠粒，(ii)多个第二类型的珠粒，(iii)第一靶核酸群体，(iv)第二靶核酸群体，和(v)以下中的任一者或任何组合：额外引物(例如，捕获引物、融合引物和/或反向引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、一种或多种核苷酸、二价阳离子、结合伴侣和/或辅因子；(b)通过扩增所述第一群体的一个或多个靶核酸来形成第一扩增核酸群体；以及(c)通过扩增所述第二靶核酸群体的一个或多个靶序列来形成第二扩增核酸群体，其中所述单一反应混合物提供区室化或分隔。

任选地，酶催化了核苷酸掺入(例如，聚合酶)。

任选地，额外引物包括溶液中的或连接到至少一个离散载体的引物。

任选地，核苷酸包含天然核苷酸或其类似物。

任选地，结合伴侣包含生物素。

任选地，单一反应混合物包含扩增反应混合物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其包含(a)提供含有多个不同模板核酸与多个不同离散载体的反应混合物，其中所述反应混合物在一定体积的反应混合物中包括一定的珠粒与靶核酸比率；和(b)用不同离散载体扩增不同靶核酸。任选地，反应混合物在包括或不具有区室化的反应混合物中含有一定的珠粒与靶核酸比率。任选地，反应混合物是单一反应混合物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其中所述反应混合物在一定体积中含有一定的珠粒与靶核酸比率，包括约平均1个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物到平均约2个离散载体:平均1个靶核酸/1mL反应混合物，或约平均2个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物到平均约5个离散载体:平均1个靶核酸/1mL反应混合物。在一些实施例中，反应混合物包括一平均珠粒与靶核酸比率，其可以是规定体积的反应混合物中存在的珠粒的平均数目除以核酸的平均数目。举例来说，反应混合物任选地包括平均5个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物的比率(“5:1平均珠粒与靶核酸比率”)、或平均7个离散载体与平均1个靶核酸/1mL的比率(“7:1平均珠粒与靶核酸比率”)、或平均10个离散载体与平均1个靶核酸/1mL反应混合物的比率(“10:1平均珠粒与靶核酸比率”)。在一些实施例中，反应混合物包括约1、约5、或约7、或约10、或约15、或约25的平均珠粒与靶核酸比率。在一些实施例中，反应混合物包括约1到约10、或1到10、1到15、或1到25、或约1到约5、或1到5、或5到25、或5到15、或5到10、或5到7、或7到15、或7到10、或7到25、或15到25的平均珠粒与靶核酸比率。

在一些实施例中，反应混合物包括约10个离散载体:1个靶核酸/1mL反应混合物到约15个离散载体:1个核酸/1mL的比率、或约15个离散载体:1个核酸/1mL到约20个离散载体:1个核酸/1mL的比率、或约20个离散载体:1个核酸/1mL到约25个离散载体:1个靶核酸/1mL的比率、或约25个离散载体:1个靶核酸/1mL到约30个离散载体:1个核酸/1mL的比率、或约30个离散载体:1个靶核酸/1mL到约50个离散载体:1个靶核酸/1mL反应混合物的比率。

任选地，反应混合物含有一定体积的反应混合物以及包括约5亿个离散载体和约5000万个靶核酸/1mL反应混合物的珠粒与靶核酸比率。

任选地，反应混合物含有一定体积的反应混合物以及包括约10亿个离散载体和约1亿个靶核酸/1mL反应混合物的珠粒与靶核酸比率。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其包含(a)提供单一反应混合物，所述单一反应混合物在约2.4mL反应混合物中含有约60亿个离散载体和约3-8亿个靶核酸；和(b)通过使反应混合物经历扩增条件来扩增至少一些部分的靶核酸。任选地，反应混合物中的珠粒与靶核酸比率包括或不具有区室化。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其包含(a)[1}提供单一反应混合物，所述单一反应混合物{2]在规定体积中含有180-240亿个之间的离散载体和约18亿个靶核酸；和[1}(b)通过使反应混合物经历扩增条件来扩增反应混合物中的靶核酸。任选地，反应混合物的规定体积在1mL与5mL之间，典型地2与4mL之间，更典型地2与3mL之间。在一些实施例中，规定体积是2.4mL。任选地，反应混合物包括或不具有区室化。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含至少第一多个第一类型的珠粒和第二多个第二类型的珠粒。本领域技术人员将了解，组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置可以包括第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或高于第十一不同多个珠粒。

在一些实施例中，多个珠粒可以是固体，或可以具有外表面和内表面。多个珠粒可以是多孔的、半多孔的或非多孔的。多个珠粒可以具有空穴或孔隙，或可以包括三维架构。在一些实施例中，多个珠粒可以是Ion Sphere^TM颗粒(来自离子激流(Ion Torrent)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,California)的生命技术(Life Technologies)的一部分)。

在一些实施例中，多个珠粒包含聚合物材料。举例来说，多个珠粒包含凝胶、水凝胶或丙烯酰胺聚合物。在一些实施例中，多个珠粒可以具有球形、半球形、圆柱形、筒管形、环形、棒状、盘状、圆锥形、三角形、立方形、多边形、管状、线状或不规则的任何形状。

在一些实施例中，珠粒可以是可以放入反应腔室中的任何大小。举例来说，珠粒可以小到足以将一个珠粒放入反应腔室中。在一些实施例中，珠粒可以小到足以使得多于一个珠粒可以放入反应腔室中。在一些实施例中，珠粒的最小截面长度(例如，直径)可以是约50微米或更小、或约10微米或更小、或约3微米或更小、约1微米或更小、约0.5微米或更小，例如约0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如，小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米、或约100-500纳米)。

在一些实施例中，珠粒可以与一个或多个不同捕获引物(例如，寡核苷酸)连接。在一些实施例中，珠粒可以与多个一种具有相同序列的捕获引物连接，或可以与多个两种或更多种具有不同序列的不同捕获引物连接。在一些实施例中，珠粒可以与多个至少1,000个寡核苷酸引物、或约1,000-10,000个寡核苷酸引物、或约10,000-50,000个寡核苷酸引物、或约50,000-75,000个寡核苷酸引物、或约75,000-100,000个或更多个寡核苷酸引物连接。

在一些实施例中，外部珠粒表面可以与一个或多个捕获引物连接。在一些实施例中，珠粒的外部珠粒表面和内部架构可以与一个或多个捕获引物连接。珠粒表面(包括内部架构)可以涂布有丙烯酰胺、羧基或胺化合物以便连接核酸(例如，捕获引物)。在一些实施例中，氨基修饰的捕获引物可以连接到涂布有羧酸的珠粒表面。在一些实施例中，氨基修饰的捕获引物可以与乙基(二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)或EDAC反应以便连接到经羧酸涂布的表面(具有或不具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))。捕获引物可以固定到珠粒表面上的丙烯酰胺化合物涂层。珠粒可以涂布有抗生物素蛋白类化合物(例如，抗生蛋白链菌素)以便结合生物素化捕获引物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含一个或多个连接到珠粒的捕获引物。在一些实施例中，组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置包含第一和第二捕获引物。在一些实施例中，组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置包含额外捕获引物，包括第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或高于第十一不同捕获引物。在一些实施例中，不同捕获引物具有不同核苷酸序列。在一些实施例中，捕获引物包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合物。在一些实施例中，捕获引物包含天然存在、合成、重组、克隆、扩增或未经扩增的形式。在一些实施例中，捕获引物包含DNA、cDNA、RNA、嵌合RNA/DNA或核酸类似物。在一些实施例中，捕获引物包含随机或简并序列。在一些实施例中，捕获引物的至少一个部分包含可以与靶核酸或接合到靶核酸的衔接子的至少一个部分杂交的序列。在一些实施例中，捕获引物的至少一个部分包含可以与融合引物的至少一个部分杂交的序列。在一些实施例中，捕获引物的至少一个部分包含与靶核酸、衔接子或融合引物的一部分一致或互补的序列。在一些实施例中，捕获引物包含单链寡核苷酸。在一些实施例中，一个或多个捕获引物的5'或3'端可以连接到珠粒。

在一些实施例中，捕获引物的3'端在引物延伸反应中可延伸。任选地，捕获引物的3'端包括3'OH基。在一些实施例中，捕获引物具有防止在引物延伸反应中延伸的封端部分。

在一些实施例中，捕获引物可以是任何长度，包括约2-100个核苷酸、或约5-10个核苷酸、或约10-25个核苷酸、或约25-40个核苷酸、或约40-55个核苷酸、或约55-70个核苷酸、或约70-85个核苷酸、或约85-100个核苷酸或更多个核苷酸。

在一些实施例中，捕获引物包括至少一个对核酸外切酶或核酸内切酶的降解具有抗性的键或碱基。举例来说，融合引物和反向扩增引物可以包括至少一个针对核酸外切酶抗性的硫代磷酸酯键或3'-3'端键，或至少一个针对核酸内切酶抗性的2'氟或2'O-甲基修饰。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其还包括至少一个第三引物。第三引物的至少一个部分包括可以与第一靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区杂交或可以与第一靶核酸群体中的靶核酸的互补序列的至少一个区杂交的序列。在一些实施例中，第三引物包括可以与第二靶核酸群体中的靶核酸的至少一个区杂交或可以与第二靶核酸群体中的靶核酸的互补序列的至少一个区杂交的序列。

任选地，第三引物连接到第一类型或第二类型的珠粒，或连接到任何珠粒。任选地，连接是共价的。

任选地，第三引物是溶液相引物(例如，不连接到任何珠粒)。

任选地，第三引物包含反向引物(参看图1中的150)。

任选地，第三引物包含反向扩增引物。

任选地，第三引物包括通用引发序列或位点。

任选地，第三引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第三引物包括结合伴侣。

任选地，结合伴侣包含生物素。

任选地，第三引物的5'端可以包括不含于第一或第二靶核酸群体中的靶核酸中的序列中或不与其互补的序列。举例来说，第三引物可以是加尾引物。

在一些实施例中，第三引物包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合物。在一些实施例中，第三引物包含天然存在、合成、重组、克隆、扩增或未经扩增的形式。在一些实施例中，第三引物包含DNA、cDNA、RNA、嵌合RNA/DNA或核酸类似物。在一些实施例中，第三引物包含随机或简并序列。在一些实施例中，第三引物的至少一个部分包含可以与靶核酸或接合到靶核酸的衔接子、捕获引物或融合引物的至少一个部分杂交的序列。在一些实施例中，第三引物的至少一个部分包含与靶核酸、衔接子、捕获引物或融合引物的一部分一致或互补的序列。在一些实施例中，第三引物包含单链寡核苷酸。

在一些实施例中，第三引物的3'端在引物延伸反应中可延伸。任选地，第三引物的3'端包括3'OH基。在一些实施例中，第三引物具有防止在引物延伸反应中延伸的封端部分。

在一些实施例中，第三引物可以是任何长度，包括约2-100个核苷酸、或约5-10个核苷酸、或约10-25个核苷酸、或约25-40个核苷酸、或约40-55个核苷酸、或约55-70个核苷酸、或约70-85个核苷酸、或约85-100个核苷酸或更多个核苷酸。

在一些实施例中，第三引物包括至少一个对核酸外切酶或核酸内切酶的降解具有抗性的键或碱基。举例来说，融合引物和反向扩增引物可以包括至少一个针对核酸外切酶抗性的硫代磷酸酯键或3'-3'端键，或至少一个针对核酸内切酶抗性的2'氟或2'O-甲基修饰。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其还包括多个不同融合引物，所述融合引物包含捕获引物(或其一部分)和靶核酸(或其一部分)的互补或一致序列。举例来说，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包括多个第一融合引物(参看图2的160)，所述第一融合引物包含与第一捕获引物(参看图2的110)的至少一部分和第一靶核酸(参看图2的120和140)的至少一部分互补或一致的序列。组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包括多个第二融合引物(参看图2的260)，所述第二融合引物包含与第二捕获引物(参看图2的210)的至少一部分和第二靶核酸(参看图2的220和240)的至少一部分互补或一致的序列。

组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)可以进一步包括多个第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或高于第十一不同融合引物。

在一些实施例中，融合引物包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合物。在一些实施例中，融合引物包含天然存在、合成、重组、克隆、扩增或未经扩增的形式。在一些实施例中，融合引物包含DNA、cDNA、RNA、嵌合RNA/DNA或核酸类似物。在一些实施例中，融合引物包含随机或简并序列。在一些实施例中，融合引物的至少一个部分具有与其它融合引物相比不同的核苷酸序列。在一些实施例中，融合引物的至少一个部分包含可以与靶核酸、或接合到靶核酸的衔接子、或捕获引物的至少一个部分杂交的序列。在一些实施例中，捕获引物的至少一个部分包含与靶核酸、衔接子或捕获引物的一部分一致或互补的序列。在一些实施例中，融合引物包含单链寡核苷酸。

在一些实施例中，融合引物可以是任何长度，包括约2-100个核苷酸、或约5-10个核苷酸、或约10-25个核苷酸、或约25-40个核苷酸、或约40-55个核苷酸、或约55-70个核苷酸、或约70-85个核苷酸、或约85-100个核苷酸或更多个核苷酸。

在一些实施例中，多个第一融合引物包含与第一捕获引物的至少一区/部分互补或一致的第一序列。

任选地，多个第一融合引物进一步包括与第一靶核酸群体中的靶核酸的至少一区/部分互补或一致的第二序列(参看图2的160)。

任选地，包括于多个第一融合引物中的第二序列与靶核酸上的至少一个衔接子互补(参看图2的160)。

任选地，第一融合引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第一融合引物连接到珠粒。任选地，连接是共价的。

任选地，第一融合引物是溶液相引物(例如，不连接到任何珠粒)。

任选地，第一融合引物可以包括与捕获引物互补的序列和与靶核酸的一部分互补的序列(例如，衔接子序列)(参看图2的160)。第一融合引物可以用以扩增不具有将结合珠粒上的捕获引物的序列的靶核酸。任选地，第一融合引物是可溶引物并且不连接到载体。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)还包括第二融合引物，所述第二融合引物包含与第二捕获引物的至少一区/部分互补或一致的第一序列。

任选地，第二融合引物进一步包括与第二靶核酸群体中的靶核酸的至少一区/部分互补或一致的第二序列(参看图2的260)。

任选地，包括于多个第二融合引物中的第二序列与靶核酸上的至少一个衔接子互补(参看图2的160)。

任选地，第二融合引物包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第二融合引物连接到珠粒。任选地，连接是共价的。

任选地，第二融合引物是溶液相引物(例如，不连接到任何珠粒)。

任选地，第二融合引物可以包括与捕获引物互补的序列和与靶核酸的一部分互补的序列(例如，衔接子序列)(参看图2的260)。第二融合引物可以用以扩增不具有将结合珠粒上的捕获引物的序列的靶核酸。任选地，第二融合引物是可溶引物并且不连接到载体。

在一些实施例中，融合引物包括至少一个对核酸外切酶或核酸内切酶的降解具有抗性的键或碱基。举例来说，融合引物和反向扩增引物可以包括至少一个针对核酸外切酶抗性的硫代磷酸酯键或3'-3'端键，或至少一个针对核酸内切酶抗性的2'氟或2'O-甲基修饰。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含至少第一靶核酸群体和第二靶核酸群体。本领域技术人员将了解，组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置可以包括第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或高于第十一不同核酸群体。在一些实施例中，靶核酸包含单链或双链多核苷酸或两者的混合物。在一些实施例中，靶核酸群体中的靶核酸包括具有相同或不同序列的多核苷酸。在一些实施例中，靶核酸群体中的靶核酸包括具有相同或不同长度的多核苷酸。在一些实施例中，靶核酸群体可以具有约2-10个、或约10-50个、或约50-100个、或约100-500个、或约500-1,000个、或约1,000-5,000个、或约103-106个、或约106-1010个或更多个不同靶核酸分子。在一些实施例中，靶核酸包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合物。在一些实施例中，靶核酸包含天然存在、合成、重组、克隆、扩增、未经扩增或存档(例如，保藏)的形式。在一些实施例中，靶核酸包含DNA、cDNA、RNA、RNA/DNA和核酸类似物。

在一些实施例中，靶核酸群体中的两个或更多个靶核酸包含有一端或两端接合到核酸衔接子的核酸。举例来说，靶核酸的第一端可以接合到第一核酸衔接子。任选地，靶核酸的第二端可以接合到第二核酸衔接子。第一与第二衔接子可以具有相同或不同序列。在一些实施例中，第一或第二核酸衔接子的至少一部分可以与捕获引物、融合引物、反向引物、扩增引物或测序引物杂交。

在一些实施例中，靶核酸群体中的靶核酸对于用于任何类型的测序平台可以是相容的，所述测序平台包括化学降解、链封端、合成测序、焦磷酸、大规模平行、离子敏感和单分子测序平台。

在一些实施例中，第一和第二靶核酸群体中的至少一个靶核酸包括一个或多个衔接子序列。

在一些实施例中，第一靶核酸群体中的靶核酸包括第一衔接子序列。

任选地，第一衔接子序列(参看图1的120)的至少一部分与第一类型的捕获引物(参看图1的110)内的序列互补或一致。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸进一步包括第二衔接子序列。

任选地，第二衔接子序列(参看图1的130)的至少一部分与第三引物(例如，反向引物)(参看图1的150)互补或一致。

任选地，第一靶核酸群体中的靶核酸包括具有相同或不同序列的第一衔接子和第二衔接子。

在一些实施例中，第二靶核酸群体中的靶核酸包括第三衔接子序列。

任选地，第三衔接子序列(参看图1的220)的至少一部分与第二类型的捕获引物(参看图1的210)内的序列互补或一致。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸进一步包括第四衔接子序列。

任选地，第四衔接子序列(参看图1的230)的至少一部分与第三引物(例如，反向引物)(参看图1的250)互补或一致。

任选地，第二靶核酸群体中的靶核酸包括具有相同或不同序列的第三衔接子和第四衔接子。

任选地，第一靶核酸群体的第一衔接子与第二靶核酸群体的第三衔接子具有相同或不同序列。

任选地，第一靶核酸群体的第二衔接子与第二靶核酸群体的第四衔接子具有相同或不同序列。

任选地，第二和第四衔接子包含为第一和第二靶核酸群体之中的通用序列的序列。

任选地，第一、第二、第三和/或第四衔接子中的任一者或任何组合包括至少一个唯一标识序列。

任选地，第一、第二、第三和/或第四衔接子中的任一者或任何组合包括与扩增引物结合序列一致或互补的序列。

任选地，第一、第二、第三和/或第四衔接子中的任一者或任何组合包括与测序引物结合序列一致或互补的序列。

任选地，第一、第二、第三和/或第四衔接子中的任一者或任何组合包括结合伴侣。

任选地，第一捕获引物、第二捕获引物、第一融合引物、第二融合引物和/或第三引物(例如，反向引物)中的任一者或任何组合包括与扩增引物结合序列一致或互补的序列。

任选地，第一捕获引物、第二捕获引物、第一融合引物、第二融合引物和/或第三引物(例如，反向引物)中的任一者或任何组合包括与测序引物结合序列一致或互补的序列。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含靶核酸和至少一个衔接子。

在一些实施例中，一个或多个衔接子可以通过连接而接合到靶核酸。在一些实施例中，加尾扩增引物可以在引物延伸反应(例如，PCR反应)中用以将一个或多个衔接子附接到靶核酸，其中加尾扩增引物包括一个或多个衔接子的序列。举例来说，加尾引物包括第一或第二转换引物(参看图3A中的170a/b和270a/b)，所述转换引物包括至少一个具有与接合到靶核酸(例如，参看图3A中的140和240)的衔接子(例如，参看图3A中的120和220)的一部分互补或一致的序列的部分。任选地，第一或第二转换引物可以在引物延伸反应中用以将转换引物的一部分附接到靶核酸或第一或第三衔接子。在另一实例中，加尾引物包括第一或第二融合引物(参看图2和3B中的160和260)，所述融合引物包括至少一个具有与接合到靶核酸(例如，参看图2和3B中的140和240)的衔接子(例如，参看图2中的120和220，或图3B中的170a和270a)的一部分互补或一致的序列的部分。在一些实施例中，加尾引物包括第一或第二融合引物(参看图2和3B中的160和260)，所述融合引物包括至少一个具有与接合到靶核酸(例如，参看图2和3B中的140和240)的衔接子(例如，参看图2中的120和220，或图3B中的170a和270a)的一部分不互补或不一致的序列的部分。任选地，第一或第二融合引物可以在引物延伸反应中用以将融合引物的一部分附接到靶核酸或第一或第三衔接子。

在一些实施例中，衔接子包含核酸，包括DNA、RNA、RNA/DNA分子或其类似物。在一些实施例中，衔接子可以包括一个或多个脱氧核糖核苷或核糖核苷残基。在一些实施例中，衔接子可以是单链或双链核酸，或可以包括单链和/或双链部分。在一些实施例中，衔接子可以具有任何结构，包括线性、发夹、分叉(Y形)或茎-环。

在一些实施例中，衔接子可以具有任何长度，包括少于10个碱基长，或约10-20个碱基长，或约20-50个碱基长，或约50-100个碱基长，或更长。

在一些实施例中，衔接子可以具有钝端和/或粘端的任何组合。在一些实施例中，衔接子的至少一端可以与核酸片段的至少一端相容。在一些实施例中，衔接子的相容端可以接合到核酸片段的相容端。在一些实施例中，衔接子可以具有5'或3'突出端。

在一些实施例中，衔接子可以具有5'或3'突出尾。在一些实施例中，尾可以是任何长度，包括1-50个或更多个核苷酸长。

在一些实施例中，衔接子可以包括内部切口。在一些实施例中，衔接子可以具有至少一个不具有末端5'磷酸酯残基的链。在一些实施例中，不具有末端5'磷酸酯残基的衔接子可以接合到核酸片段以在衔接子与核酸片段之间的接合处引入切口。

在一些实施例中，衔接子可以包括与捕获引物、融合引物、反向引物、扩增引物或测序引物的任何部分一致或互补的核苷酸序列。

在一些实施例中，衔接子可以包括鉴别序列，如可唯一标识的序列(例如，条形码序列)。在一些实施例中，带条形码的衔接子可以用于构筑多重靶核酸库。在一些实施例中，带条形码的衔接子可以附接到靶核酸并且用于分选或追踪靶核酸的来源。在一些实施例中，一个或多个条形码序列可以允许在具有不同条形码序列的不同衔接子的混合物之中鉴别特定衔接子。举例来说，混合物可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7-10个、10-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或更多个具有唯一条形码序列的不同衔接子。

在一些实施例中，衔接子可以包括简并序列。在一些实施例中，衔接子可以包括一个或多个肌苷残基。

在一些实施例中，衔接子可以包括至少一个易切断键。在一些实施例中，易切断键可能易受通过酶或化合物进行的裂解或降解影响。在一些实施例中，衔接子可以包括至少一个硫赶磷酸酯、硫代磷酸酯和/或氨基磷酸酯键。

在一些实施例中，衔接子可以包括任何类型的限制酶识别序列，包括I型、II型、IIs型、IIB型、III型、IV型限制酶识别序列，或具有回文或非回文识别序列的识别序列。

在一些实施例中，衔接子可以包括细胞调节序列，包括启动子(诱导型或组成型)、增强子、转录或翻译起始序列、转录或翻译终止序列、分泌信号、Kozak序列、细胞蛋白结合序列等。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含一个或多个聚合酶。在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包括一种类型或不同类型混合物的聚合酶。在一些实施例中，聚合酶包括可以催化核苷酸和/或核苷酸类似物的聚合的任何酶或其片段或亚单位。在一些实施例中，聚合酶需要具有可延伸3'端的核酸。举例来说，聚合酶可以需要核酸引物的末端3'OH来起始核苷酸聚合。

聚合酶包含可以催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。典型地但未必，此类核苷酸聚合可以以模板依赖性方式进行。在一些实施例中，聚合酶可以是高保真度聚合酶。此类聚合酶可以包括(不限于)天然存在的聚合酶和其任何亚单位和截断、突变聚合酶、变异聚合酶、重组、融合或以其它方式工程化的聚合酶、经化学修饰的聚合酶、合成分子或组件以及保留催化此类聚合的能力的任何类似物、衍生物或其片段。任选地，聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变聚合酶，所述突变涉及用其它氨基酸置换一个或多个氨基酸、来自聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失、或两个或更多个聚合酶的部分的键联。如本文所用，术语“聚合酶”和其变化形式还指包含至少两个键联到彼此的部分的融合蛋白，其中第一部分包含可以催化核苷酸聚合成核酸链的肽并且键联到包含第二多肽(如报告酶或持续合成能力增强结构域)的第二部分。典型地，聚合酶包含可以进行核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。在一些实施例中，聚合酶包括或不具有其它酶活性，如3'到5'核酸外切酶活性或5'到3'核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶可以从细胞中分离，或使用重组DNA技术或化学合成方法产生。在一些实施例中，聚合酶可以表达于原核生物、真核生物、病毒或噬菌体生物体中。在一些实施例中，聚合酶可以是翻译后修饰的蛋白质或其片段。

在一些实施例中，聚合酶可以是DNA聚合酶并且包括(但不限于)细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。

在一些实施例中，聚合酶可以是复制酶、DNA依赖性聚合酶、引发酶、RNA依赖性聚合酶(包括RNA依赖性DNA聚合酶，如逆转录酶)、热不稳定聚合酶或热稳定聚合酶。在一些实施例中，聚合酶可以是任何家族A或B型聚合酶。许多类型的家族A(例如，大肠杆菌(E.coli)Pol I)、B(例如，大肠杆菌Pol II)、C(例如，大肠杆菌Pol III)、D(例如，广古菌(Euryarchaeotic)Pol II)、X(例如，人类Polβ)和Y(例如，大肠杆菌UmuC/DinB和真核生物RAD30/着色性干皮病变异体)聚合酶描述于Rothwell和Watsman 2005《蛋白质化学进展(Advances in Protein Chemistry)》71:401-440中。在一些实施例中，聚合酶可以是T3、T5、T7或SP6 RNA聚合酶。

在一些实施例中，聚合酶包含热稳定或热不稳定聚合酶。在一些实施例中，聚合酶包含低保真度或高保真度聚合酶。

在一些实施例中，聚合酶可以不具有5'-3'核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶可以具有链移位活性。

在一些实施例中，古细菌DNA聚合酶可以是(但不限于)热稳定或嗜热性DNA聚合酶，如：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，Bsu)DNA聚合酶I大片段；水生栖热菌(Thermusaquaticus，Taq)DNA聚合酶；丝状栖热菌(Thermus filiformis，Tfi)DNA聚合酶；Phi29 DNA聚合酶；嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶；热球菌属(Thermococcus sp.)9°N-7DNA聚合酶；史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii，Bsm)DNA聚合酶大片段；海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis，Tli)DNA聚合酶或Vent^TM(外-)DNA聚合酶(来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs))；或“Deep Vent”(外-)DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)。在一些实施例中，聚合酶包含大肠杆菌大片段DNA聚合酶I(例如，克列诺(Klenow))。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含至少一种辅助蛋白。在一些实施例中，辅助蛋白可以结合单链或双链核酸。任选地，辅助蛋白可以介导将其它蛋白质(例如，重组酶)负载到核酸上。任选地，辅助蛋白可以解旋核酸底物，使核酸松弛，分辨核酸结构，水解核酸(例如，核酸酶)，拆解核酸与蛋白质的复合物，或拆解核酸结构。任选地，辅助蛋白可以使双链第一或第二靶核酸部分或完全变性。任选地，辅助蛋白可以催化链侵入或解旋。任选地，辅助蛋白包含滑动夹蛋白。任选地，辅助蛋白可以以序列特异性或序列独立性方式介导或催化其各别活性。

在一些实施例中，辅助蛋白包含多聚蛋白质复合物。任选地，多聚蛋白质复合物包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个亚单位。任选地，多聚辅助蛋白复合物包含同聚或异聚蛋白质复合物。

在一些实施例中，辅助蛋白包含野生型、突变体、重组体、融合物或其片段。

在一些实施例中，辅助蛋白可以来源于任何细菌噬菌体，包括肌病毒(myoviral)噬菌体。辅助蛋白可以来源于细菌噬菌体T2、T4、T5或T7。辅助蛋白可以来源于任何原核生物、细菌(例如，大肠杆菌)、真核生物或哺乳动物(例如，人类)。

在一些实施例中，辅助蛋白包含单链结合蛋白，包括肌病毒gp32(例如，T4或RB69)，来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Sso SSB、来自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的MjA SSB或大肠杆菌SSB蛋白。

在一些实施例中，单一反应混合物包含来源于相同或不同物种的不同辅助蛋白的混合物。任选地，单一反应混合物包含来源于相同或不同物种的不同辅助蛋白的混合物作为重组酶。

在一些实施例中，辅助蛋白包含单链结合蛋白(例如，SSB或gp32蛋白)、重组酶(例如，recA或uvsX)、重组酶负载蛋白(例如，uvsY蛋白)、解旋酶(例如，uvsW蛋白)或拓扑异构酶。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含至少一种辅助蛋白。在一些实施例中，辅助蛋白包含催化同源重组的酶。任选地，催化同源重组的酶可以通过结合单链寡核苷酸(例如，引物)而形成核蛋白复合物。任选地，作为核蛋白复合物的一部分，同源重组酶可以结合双链靶核酸的至少一个链的同源部分。任选地，同源重组酶可以催化链解旋。任选地，靶核酸的同源部分可以与单链寡核苷酸的至少一部分杂交。任选地，靶核酸的同源部分可以与单链寡核苷酸的至少一部分部分或完全互补。

在一些实施例中，辅助蛋白可以通过以下方式催化链侵入：形成核蛋白复合物和结合到双链靶核酸的同源部分，以形成具有三链结构的重组中间物(例如，D-环形成)。

在一些实施例中，辅助蛋白包含重组酶。

在一些实施例中，重组酶可以通过结合第一引物(例如，第一捕获引物)形成核蛋白复合物。任选地，核蛋白复合物进一步包括第一靶核酸，其中第一引物的一部分与第一靶核酸的一部分杂交。任选地，第一靶核酸包含双链多核苷酸分子。任选地，重组酶可以使双链第一靶核酸部分或完全变性。

在一些实施例中，重组酶可以通过结合第二引物(例如，第二捕获引物)形成核蛋白复合物。任选地，核蛋白复合物进一步包括第二靶核酸，其中第二引物的一部分与第二靶核酸的一部分杂交。任选地，第二靶核酸包含双链多核苷酸分子。任选地，重组酶可以使双链第二靶核酸部分或完全变性。

在一些实施例中，重组酶包含来自任何生物体的重组酶的至少一部分，包括细菌噬菌体T4(例如，usvX)、大肠杆菌(例如，recA)或人类(例如，RAD51)(Zarling的美国专利第5,223,414号，Sena的美国专利第5,273,881号和第5,670,316号，以及美国专利第7,270,981号、第7,399,590号、第7,435,561号、第7,666,598号、第7,763,427号、第8,017,339号、第8,030,000号、第8,062,850号和第8071308号)。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含一种或多种核苷酸。在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包括一种类型或不同类型混合物的核苷酸。核苷酸包含可以选择性结合到聚合酶或可以通过聚合酶聚合的任何化合物。典型地但未必，核苷酸与聚合酶的选择性结合后面是核苷酸通过聚合酶聚合成核酸链。此类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括可以与聚合酶选择性结合或可以通过聚合酶聚合的任何类似物(无关于其结构)。虽然天然存在的核苷酸典型地包含碱基、糖和磷酸酯部分，但本发明的核苷酸可以包括不具有此类部分中的任一者、一些或全部的化合物。在一些实施例中，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施例中，磷链可以连接到糖环的任何碳，如5'碳。磷链可以用介入O或S键联到糖。在一些实施例中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P和O的磷酸酯基的一部分。在一些实施例中，链中的磷原子可以用介入O、NH、S、亚甲基、经取代亚甲基、亚乙基、经取代亚乙基、CNH₂、C(O)、C(CH₂)、CH₂CH₂或C(OH)CH₂R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)键联在一起。在一些实施例中，链中的磷原子可以具备具有O、BH₃或S的侧基。在磷链中，具有除O以外的侧基的磷原子可以是经取代磷酸酯基。在磷链中，具有除O以外的介入原子的磷原子可以是经取代磷酸酯基。核苷酸类似物的一些实例描述于Xu,美国专利第7,405,281号中。

可以用于所公开的组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)中的核苷酸的一些实例包括(但不限于)核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰核糖核苷酸、经修饰脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸酯、脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯、经修饰核糖核苷酸聚磷酸酯、经修饰脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯、肽核苷酸、经修饰肽核苷酸、金属核苷酸、膦酸酯核苷和经修饰磷酸-糖骨架核苷酸、前述化合物的类似物、衍生物或变异体等。在一些实施例中，核苷酸可以包含非氧部分(如硫基或硼烷部分)代替氧部分，所述氧部分桥接核苷酸的α磷酸酯与糖、或核苷酸的α与β磷酸酯、或核苷酸的β与γ磷酸酯、或核苷酸的任何其它两种磷酸酯之间、或其任何组合。在一些实施例中，核苷酸可以包括嘌呤或嘧啶碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶或尿嘧啶。在一些实施例中，核苷酸包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。

在一些实施例中，核苷酸是未经标记的。在一些实施例中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“经标记核苷酸”。在一些实施例中，标记可以呈连接到核苷酸的任何部分(包括碱基、糖或任何介入磷酸酯基或末端磷酸酯基，即最远离糖的磷酸酯基)的荧光染料形式。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含以下中的任一者或任何组合：未经标记或连接到至少一个标记的捕获引物、反向引物、融合引物、靶核酸和/或核苷酸。在一些实施例中，标记包含可检测部分。在一些实施例中，标记可以产生或导致产生可检测信号。在一些实施例中，可检测信号可以由化学或物理变化(例如，热、光、电、pH、盐浓度、酶活性或接近事件)产生。举例来说，接近事件可以包括两个接近彼此或彼此缔合或彼此结合的报告部分。在一些实施例中，可检测信号可以以光学方式、以电学方式、以化学方式、以酶方式、以热方式或经由质谱分析或拉曼光谱分析(Raman spectroscopy)检测。在一些实施例中，标记可以包括发光、光致发光、电致发光、生物发光、化学发光、荧光、磷光或电化学的化合物。在一些实施例中，标记可以包括为荧光团、发色团、放射性同位素、半抗原、亲和标签、原子或酶的化合物。在一些实施例中，标记包含典型地不存在于天然存在的核苷酸中的部分。举例来说，标记可以包括荧光、发光或放射性部分。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关系统、方法、试剂盒和装置，其包含结合伴侣的至少一个成员。在一些实施例中，结合伴侣包括对于彼此具有特异性结合亲和力并且典型地将优先于结合到其它分子地结合到彼此的两种分子或其部分。在一些实施例中，结合伴侣包括“亲和部分”和“受体部分”。典型地但未必，特异性结合对的一种成员的一些或全部结构与由另一成员具有的一些或全部结构互补，两种成员能够借助于互补结构之间的键、任选地借助多个非共价吸引力特异性结合在一起。

在一些实施例中，充当结合伴侣的分子包括：生物素(和其衍生物)和其结合伴侣抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素和其衍生物；结合镍、钴或铜的His标签；结合Ni-NTA的半胱氨酸、组氨酸或组氨酸片；与麦芽糖结合蛋白(MBP)结合的麦芽糖；凝集素-碳水化合物结合伴侣；钙-钙结合蛋白(CBP)；乙酰胆碱和受体-乙酰胆碱；蛋白A和结合伴侣抗FLAG抗体；GST和结合伴侣谷胱甘肽；尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和ugi(尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂)蛋白；结合到抗体或抗体片段的抗原或表位标签，特别是抗原，如地高辛、荧光素、二硝基苯酚或溴脱氧尿苷和其各别抗体；小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白；IgG结合和蛋白A；受体-受体激动剂或受体拮抗剂；酶-酶辅因子；酶-酶抑制剂；和甲状腺素-皮质醇。生物素的另一结合伴侣可以是来自鸡的生物素结合蛋白(Hytonen等人,《BMC结构生物学(BMCStructural Biology)》7:8)。

在一些实施例中，抗生物素蛋白部分可以包括抗生物素蛋白蛋白质，以及抗生物素蛋白的可以结合到生物素部分的任何衍生物、类似物和其它非天然形式。抗生物素蛋白部分的其它形式包括天然和重组抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素以及衍生化分子，例如非糖基化抗生物素蛋白、N-酰基抗生物素蛋白和截短的抗生蛋白链菌素。举例来说，抗生物素蛋白部分包括抗生物素蛋白的脱糖基化形式、由链霉菌属(Streptomyces)(例如，阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii))产生的细菌抗生蛋白链菌素、截短的抗生蛋白链菌素、重组抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素，以及天然、脱糖基化和重组抗生物素蛋白以及天然、重组和截短的抗生蛋白链菌素的衍生物，例如N-酰基抗生物素蛋白，例如N-乙酰基、N-酞酰基和N-琥珀酰基抗生物素蛋白，和商业产品ExtrAvidin^TM、Captavidin^TM、Neutravidin^TM和Neutralite Avidin^TM。

在一些实施例中，本发明大体上涉及可以用于核酸合成或扩增反应的组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含单一反应混合物。单一反应混合物可以包括引物(例如，捕获引物、融合引物、反向引物和其它额外引物)、酶(例如，聚合酶)、辅助蛋白(例如，重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白、解旋酶或拓扑异构酶)、核苷酸、二价阳离子、结合伴侣、辅因子和/或缓冲液。任选地，引物包括连接到珠粒的引物(例如，固定引物)和/或可溶引物中的任一者或任何组合。任选地，酶包含包括重组、融合、突变、热稳定或热不稳定形式的聚合酶。任选地，辅助蛋白包括以下中的任一者或任何组合：单链结合蛋白(例如，SSB或gp32蛋白)、重组酶(例如，recA或uvsX)、重组酶负载蛋白(例如，uvsY蛋白)、解旋酶(例如，uvsW蛋白)或拓扑异构酶。任选地，核苷酸可以包括具有与天然存在的核苷酸相同或类似的结构的化合物，或具有衍生化碱基、糖和/或磷酸酯基的核苷酸类似物，或经标记或未经标记的核苷酸。任选地，二价阳离子包括镁、锰和/或钙。任选地，结合伴侣包括生物素和抗生物素蛋白类化合物，如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。任选地，缓冲液包含离子源，如KCl、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、NH₄Cl或硫酸铵。任选地，缓冲液包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS、ACES、MES或可以提供约4-12的pH范围的无机缓冲液(如基于磷酸盐或乙酸盐的缓冲液)。任选地，缓冲液包括螯合剂，如EDTA或EGTA。任选地，缓冲液包括二硫苏糖醇(DTT)、甘油、亚精胺和/或BSA(牛血清白蛋白)。任选地，缓冲液包括ATP。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含可以在热循环或等温条件或两种类型条件的组合下执行的核酸合成或核酸扩增反应。

在一些实施例中，热循环扩增条件包含核酸扩增反应混合物，其经历高温持续足以使双链靶核酸的至少约30-95％变性的一段时间，并且然后经历较低温度持续足以允许单链靶核酸与引物中的任一者(例如，捕获引物、反向引物或融合引物)之间杂交的一段时间。

在一些实施例中，等温扩增条件包含核酸扩增反应混合物，其在扩增的至少某一部分期间经历限定于受限范围内的温度变化，包括例如温度变化在约20℃、或约10℃、或约5℃、或约1-5℃、或约0.1-1℃、或小于约0.1℃内。

在一些实施例中，等温核酸扩增反应可以执行约2、5、10、15、20、30、40、50、60或120分钟或更久。

在一些实施例中，等温核酸扩增反应可以在约15-30℃、或约30-45℃、或约45-60℃、或约60-75℃、或约75-90℃、或约90-93℃、或约93-99℃下执行。

在一些实施例中，本发明大体上涉及方法、以及相关组合物、系统、试剂盒和装置，其进一步包括富集步骤。在一些实施例中，扩增核酸群体可以包括亲和部分。举例来说，在执行根据本发明传授内容的核酸合成方法中的任一者时，连接到亲和部分(例如，生物素)的反向引物可以用以执行扩增反应以产生连接到亲和部分的扩增核酸群体。在一些实施例中，富集步骤包含通过用连接到受体部分(例如，抗生蛋白链菌素)的纯化珠粒(例如，顺磁性珠粒)结合亲和部分(其连接到扩增核酸群体)形成富集复合物。纯化珠粒的一实例包括来自Dynabeads的MyOne^TM珠粒，其是连接到抗生蛋白链菌素的顺磁性珠粒。在一些实施例中，磁体可以用以从不具有亲和部分的扩增核酸群体分离/移出富集复合物。

在一些实施例中，本发明大体上涉及方法、以及相关组合物、系统、试剂盒和装置，其进一步包括至少一个洗涤步骤。洗涤步骤可以在核酸合成方法期间的任何时间执行。在一些实施例中，洗涤步骤可以去除核酸合成(例如，扩增)或富集反应的过量或未反应的组分。

在一些实施例中，根据本发明传授内容的核酸合成或扩增方法、或富集步骤中的任一者可以手动或自动执行。在一些实施例中，(1)提供单一反应混合物、(2)形成扩增核酸群体中的任一者、(3)富集、和/或(4)洗涤的步骤可以手动或自动执行。举例来说，用于核酸合成(例如，扩增)、富集或洗涤的任何试剂可以经由手动或自动模式放置到反应容器中或从反应容器移出。在一些实施例中，用于核酸合成的试剂包括(但不限于)：珠粒、捕获引物、反向引物、融合引物、靶核酸、酶、聚合酶、辅助蛋白、重组酶、一种或多种核苷酸、标记、结合伴侣、二价阳离子和/或辅因子。

在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物、以及相关方法、系统、试剂盒和装置，其包含含有以下的单一反应容器：(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第一靶核酸群体，(iii)第二多个第二类型的珠粒，和(iv)第二靶核酸群体。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包含(i)第一多个第一类型的珠粒，(ii)第一靶核酸群体，(iii)第二多个第二类型的珠粒，和(iv)第二靶核酸群体，其中项(i)-(iv)放置到第一反应容器中。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)进一步包含(i)第三多个第一类型的珠粒，(ii)第三靶核酸群体，(iii)第四多个第二类型的珠粒，和(iv)第四靶核酸群体，其中项(i)-(iv)放置到第二反应容器中。

在一些实施例中，组合物(以及相关方法、系统、试剂盒和装置)包含(i)至少两个不同多个两种不同类型的珠粒，和(ii)至少两个不同靶核酸群体，放置到两个或更多个不同反应容器中。

在一些实施例中，反应容器包括管(例如，Eppendorf TM管)、管的内壁、孔、反应腔室、沟槽、通道储槽、流通池。

在一些实施例中，两个或更多个反应容器可以是两个或更多个以阵列布置的反应腔室。在一些实施例中，阵列可以包括一个或多个反应腔室固体表面。反应腔室可以具有界定宽度和深度的壁。反应腔室的尺寸可以足以允许放置试剂或用于执行反应。反应腔室可以具有任何形状，包括圆柱形、多边形或不同形状的组合。反应腔室的任何壁可以具有光滑或不规则表面。反应腔室可以具备具有平表面、凹表面或凸表面的底部。反应腔室的底部和侧壁可以包含相同或不同材料和/或可以涂布有可以与生物分子(如核酸、蛋白质或酶)反应的化学基团。

在一些实施例中，反应腔室可以是多个以栅格或阵列布置的反应腔室之一。阵列可以包括两个或更多个反应腔室。多个反应腔室可以随机地或以有序阵列布置。有序阵列可以包括以行或以具有行和列的二维栅格布置的反应腔室。

阵列可以包括多个反应腔室用于放置试剂和执行众多个别反应。举例来说，阵列可以包括至少256个反应腔室，或至少256,000个、或至少100-300万个、或至少300-500万个、或至少500-700万个、或至少700-900万个、至少900-1100万个、至少1100-1300万个反应腔室，或甚至包括1300万-7亿个或更多个反应腔室的高密度。以栅格布置的反应腔室可以具有小于约10微米、或小于约5微米、或小于约1微米、或小于约0.5微米的相邻反应腔室之间中心到中心距离(例如，节距)。

阵列可以包括具有任何宽度和深度尺寸的反应腔室。举例来说，反应腔室可以具有容纳单一微粒(例如，微珠粒)或多个微粒的尺寸。反应腔室可以容纳0.001-100皮升的水性体积。

在一些实施例中，至少一个反应容器(例如，至少一个反应腔室)可以耦接到一个或多个传感器或可以在一个或多个传感器上制造。耦接到传感器的反应腔室可以提供放置于其中的试剂的限定，以使得反应的产物可以由传感器检测。传感器可以检测反应容器内任何类型的反应(包括任何核酸反应，如引物延伸、扩增或核苷酸掺入反应)的产物的变化。传感器可以检测离子(例如，氢离子)、质子、磷酸基(如焦磷酸基)的变化。传感器可以检测核苷酸掺入的至少一种副产物，包括焦磷酸、氢离子、电荷转移或热。在一些实施例中，至少一个反应腔室可以耦接到一个或多个场效应晶体管(FET)，包括例如离子敏感场效应晶体管(ISFET)。耦接到ISFET传感器的反应腔室的阵列的实例可以见于美国专利第7,948,015号和美国第12/002,781号，所述文献特此以全文引用的方式并入。检测核苷酸掺入反应的副产物的传感器的其它实例可以见于例如Pourmand等人,《国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,103:6466-6470(2006)；Purushothaman等人,IEEE ISCAS,IV-169-172；Anderson等人,《传感器与致动器B：化学(Sensors and Actuators B Chem.)》,129:79-86(2008)；Sakata等人,《应用化学(Angew.Chem.)》118:2283-2286(2006)；Esfandyapour等人,美国专利公开第2008/01666727号；和Sakurai等人,《分析化学(Anal.Chem.)》64:1996-1997(1992)。

在一些实施例中，本发明大体上涉及方法、以及相关组合物、系统、试剂盒和装置，其进一步包括测序反应。在一些实施例中，可以对已经根据本发明传授内容扩增的任何靶核酸测序。

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于合成核酸的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，其进一步包含对第一扩增群体中的一个或多个核酸测序，或对第二扩增群体中的一个或多个核酸测序，或对第一和第二两种扩增靶核酸群体中的一个或多个核酸测序。

在一些实施例中，可以采用任何类型的测序平台，包括：通过寡核苷酸探针连接和检测来测序(例如，来自生命技术的SOLiD^TM，WO 2006/084131)、探针锚定连接测序(例如，Complete Genomics^TM或Polonator^TM)、合成测序(例如，遗传分析仪(Genetic Analyzer)和HiSeq^TM，来自Illumina)、焦磷酸测序(例如，来自454生命科学(454 Life Sciences)的Genome Sequencer FLX)、离子敏感测序(例如，个人基因组机器(Personal GenomeMachine，PGM^TM)和Ion Proton^TM测序仪，两者都来自离子激流系统公司)和单分子测序平台(例如，来自Helicos^TM的HeliScope^TM)。

在一些实施例中，已经根据本发明传授内容合成或扩增的核酸可以通过任何测序方法来测序，包括合成测序、涉及使用场效应晶体管(例如，FET和ISFET)检测测序副产物的基于离子的测序、化学降解测序、基于连接的测序、杂交测序、焦磷酸检测测序、毛细管电泳、凝胶电泳、下一代、大规模平行测序平台、检测氢离子或其它测序副产物的测序平台以及单分子测序平台。在一些实施例中，测序反应可以使用至少一种可以与多核苷酸构筑体的任何部分(包括核酸衔接子或靶多核苷酸)杂交的测序引物来执行。

在一些实施例中，根据本发明传授内容扩增的核酸可以使用检测核苷酸掺入的一种或多种副产物的方法来测序。通过检测延伸反应的物理化学副产物检测聚合酶延伸可以包括焦磷酸、氢离子、电荷转移、热等，如例如Rothberg等人的美国专利第7,948,015号；和Rothberg等人,美国专利公开第2009/0026082号中所公开，所述文献特此以全文引用的方式并入。检测基于聚合酶的延伸的方法的其它实例可以见于例如Pourmand等人,《国家科学院院刊》,103:6466-6470(2006)；Purushothaman等人,IEEE ISCAS,IV-169-172；Anderson等人,《传感器与致动器B：化学》,129:79-86(2008)；Sakata等人,《应用化学》118:2283-2286(2006)；Esfandyapour等人,美国专利公开第2008/01666727号；和Sakurai等人,《分析化学》64:1996-1997(1992)。

广泛进行涉及产生和检测离子的反应。使用直接离子检测方法来监测此类反应的进展可以简化许多当前生物分析。举例来说，可以通过检测作为由聚合酶催化的核苷酸掺入的天然副产物产生的氢离子来监测通过聚合酶的模板依赖性核酸合成。离子敏感测序(也称为“基于pH的”或“基于离子的”核酸测序)利用作为核苷酸掺入的副产物产生的离子副产物(如氢离子)的直接检测。在用于基于离子的测序的一个例示性系统中，可以在微孔中捕获待测序的核酸，并且核苷酸可以在核苷酸掺入条件下一次一个地流动通过孔。聚合酶将合适核苷酸掺入到生长链中，并且释放的氢离子可以改变溶液中的pH，其可以通过与孔耦接的离子传感器检测。此技术不需要标记核苷酸或昂贵光学组件，并且允许快得多地完成测序运行。此类基于离子的核酸测序方法和平台的实例包括Ion Torrent PGM^TM或Proton^TM测序仪(Ion Torrent^TM Systems，生命技术公司)。

在一些实施例中，使用本发明传授内容的方法、系统和试剂盒产生的靶多核苷酸可以用作通过传感器(包括场效应晶体管(FET))检测和/或监测的生物或化学反应的底物。在各种实施例中，FET是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管是充当化学传感器的场效应晶体管类型。其是MOSFET晶体管的结构类似物，其中栅电极上的电荷通过化学方法施加。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(如H+)改变时，通过晶体管的电流将因此改变。ISFET的操作的详细理论给出于“ISFETOLOGY的三十年：过去30年发生的和未来30年可能发生的(Thirty years of ISFETOLOGY:whathappened in the past 30years and what may happen in the next 30years)”,P.Bergveld,《传感器与致动器》,88(2003),第1-20页。

在一些实施例中，FET可以是FET阵列。如本文所用，“阵列”是如传感器或孔的元件的平面布置。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是在第一维度具有一列(或行)元件并且在第二维度具有多个列(或行)的阵列。第一和第二维度中的列(或行)的数目可以相同或不同。FET或阵列可以包含102个、103个、104个、105个、106个、107个或更多个FET。

在一些实施例中，可以在FET传感器阵列上制造一个或多个微流体结构以提供生物或化学反应的容纳或限定。举例来说，在一个实施方案中，微流体结构可以配置成一个或多个安置在阵列的一个或多个传感器上的孔(或微孔，或反应腔室，或反应孔，所述术语在本文中可互换地使用)，使得上面安置有既定孔的一个或多个传感器检测和测量既定孔中分析物的存在、含量和/或浓度。在一些实施例中，FET传感器和反应孔之间可以存在1:1对应。

微孔或反应腔室典型地是可以制造到衬底中并且可以使用常规微制造技术制造的具有定义明确的形状和体积的空穴或孔，例如如以下参考文献中所公开：Doering和Nishi编,《半导体制造技术手册(Handbook of Semiconductor ManufacturingTechnology)》,第二版(CRC出版社(CRC Press),2007)；Saliterman,《BioMEMS与医疗微装置的原理(Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices)》(SPIE出版物(SPIEPublications),2006)；Elwenspoek等人,《硅微机械加工(Silicon Micromachining)》(剑桥大学出版社(Cambridge University Press),2004)；等。微孔或反应腔室的配置(例如间隔、形状和体积)的实例公开于Rothberg等人,美国专利公开2009/0127589；Rothberg等人,英国专利申请GB24611127中。

在一些实施例中，生物或化学反应可以在溶液或与FET(如chemFET或ISFET)接触、可操作地耦接或电容耦接的反应腔室中进行。FET(或chemFET或ISFET)和/或反应腔室可以分别是FET或反应腔室的阵列。

在一些实施例中，生物或化学反应可以在反应腔室的二维阵列中进行，其中每个反应腔室可以耦接到FET，并且每个反应腔室的体积不大于10μm³(即，1pL)。在一些实施例中，每个反应腔室的体积不大于0.34pL、0.096pL或甚至0.012pL。反应腔室的顶部横截面积可以任选地不大于2、5、10、15、22、32、42、52、62、72、82、92或102平方微米。优选地，阵列具有至少10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个或更多个反应腔室。在一些实施例中，反应腔室中的至少一者可操作地耦接到FET中的至少一者。

除在CMOS制造中常规地采用的那些技术以外，如在根据本发明的各种实施例中所使用的FET阵列可以根据常规CMOS制造技术以及修改的CMOS制造技术和其它半导体制造技术制造。另外，各种光刻技术可以用作阵列制造方法的一部分。

适用于所公开的方法的例示性FET阵列以及微孔和伴随流体学以及制造其的方法公开于例如美国专利公开第20100301398号；美国专利公开第20100300895号；美国专利公开第20100300559号；美国专利公开第20100197507号；美国专利公开第20100137143号；美国专利公开第20090127589号；以及美国专利公开第20090026082号中，所述文献以全文引用的方式并入。

在一个方面，所公开的方法、组合物、系统、装置和试剂盒可以用于进行无标记核酸测序，并且具体来说，基于离子的核酸测序。无标记检测核苷酸掺入的概念已经描述于文献中，包括以引用的方式并入的以下参考文献：Rothberg等人,美国专利公开2009/0026082；Anderson等人,《传感器与致动器B：化学》,129:79-86(2008)；和Pourmand等人,《国家科学院院刊》,103:6466-6470(2006)。简单来说，在核酸测序应用中，通过测量聚合酶催化的延伸反应的天然副产物，包括氢离子、聚磷酸酯、PPi和Pi(例如，在焦磷酸酶存在下)测定核苷酸掺入。此类基于离子的核酸测序方法和平台的实例包括Ion Torrent PGM^TM或Proton^TM测序仪(Ion Torrent^TM Systems，生命技术公司)。

在一些实施例中，本发明大体上涉及对已经通过本文所提供的传授内容扩增的核酸测序的方法。在一个例示性实施例中，本发明大体上涉及一种获得多核苷酸的序列信息的方法，其包含：(a)扩增核酸；和(b)使用在步骤(a)期间产生的扩增核酸中的至少一者作为模板来进行模板依赖性核酸合成。扩增可以任选地根据本文所描述的扩增方法中的任一者进行。

在一些实施例中，模板依赖性合成包括以模板依赖性方式将一种或多种核苷酸掺入到新合成的核酸链中。

任选地，所述方法可以进一步包括产生此类核苷酸掺入的一种或多种离子副产物。

在一些实施例中，所述方法可以进一步包括检测一种或多种核苷酸向测序引物中的掺入。任选地，检测可以包括检测氢离子的释放。

在另一实施例中，本发明大体上涉及一种对核酸测序的方法，其包含：(a)根据本文所公开的方法扩增核酸；(b)将扩增核酸安置到多个反应腔室中，其中一个或多个反应腔室与场效应晶体管(FET)接触。任选地，所述方法进一步包括使安置到反应腔室之一中的扩增核酸与聚合酶接触，因此通过依序将一种或多种核苷酸掺入到核酸分子中而合成新核酸链。任选地，所述方法进一步包括产生一个或多个氢离子作为此类核苷酸掺入的副产物。任选地，所述方法进一步包括通过使用FET检测一个或多个氢离子的产生来检测一种或多种核苷酸的掺入。

在一些实施例中，检测包括响应于一个或多个氢离子的产生来检测在阵列内的至少一个FET处的电压和/或电流的变化。

在一些实施例中，FET可以选自由以下组成的群组：离子敏感FET(isFET)和化学敏感FET(chemFET)。

一种涉及经由检测核苷酸掺入的离子副产物测序的例示性系统是Ion TorrentPGM^TM或Proton^TM测序仪(生命技术)，其是通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的氢离子来对核酸模板测序的基于离子的测序系统。典型地，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸掺入的副产物释放。Ion Torrent PGM^TM或Proton^TM测序仪通过检测核苷酸掺入的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。Ion Torrent PGM^TM或Proton^TM测序仪可以包括多个待测序的核酸模板，每个模板安置于阵列中的各别测序反应孔内。阵列的孔可以各自耦接到至少一个离子传感器，所述传感器可以检测作为核苷酸掺入的副产物产生的H⁺离子的释放或溶液pH的变化。离子传感器包含耦接到离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，所述检测层可以感应H⁺离子的存在或溶液pH的变化。离子传感器可以提供指示核苷酸掺入的输出信号，其可以表示为量值与各别孔或反应腔室中的H⁺离子浓度相关的电压变化。不同核苷酸类型可以连续流入反应腔室中，并且可以通过聚合酶以通过模板序列确定的顺序掺入到延伸引物(或聚合位点)中。每个核苷酸掺入可以伴随着反应孔中的H⁺离子释放，连同局部pH的伴随变化。可以通过传感器的FET登记H⁺离子的释放，所述FET产生指示发生核苷酸掺入的信号。在特定核苷酸流动期间未掺入的核苷酸不产生信号。来自FET的信号的幅值也可以与掺入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸数目有关，进而允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应腔室中，以及多个孔或反应腔室上的掺入监测可以允许仪器同时分辨许多核酸模板的序列。关于Ion Torrent PGM^TM或Proton^TM测序仪的组合物、设计和操作的其它细节可以见于例如美国专利申请第12/002781号，现以美国专利公开第2009/0026082号公开；美国专利申请第12/474897号，现以美国专利公开第2010/0137143号公开；和美国专利申请第12/492844号，现以美国专利公开第2010/0282617号公开，所述申请全部以全文引用的方式并入本文中。

实例

可以根据以下实例来进一步理解本发明传授内容的实施例，所述实例不应理解为以任何方式限制本传授内容的范围。

实例1：

在一些实施例中，本发明大体上涉及方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，(a)提供多个不同靶核酸群体和多个不同类型的离散载体，和(b)形成连接到不同类型的离散载体的不同扩增靶核酸群体。制备四种不同人类基因组DNA片段库。库含有200bp插入序列，并且包括在一端接合的L1(SEQ ID NO:11和12)、L2(SEQ ID NO:13和14)、L3(SEQ IDNO:15和16)或L4双链衔接子(SEQ ID NO:17和18)以及在另一端接合的通用衔接子A。制备四种不同类型的珠粒，每种类型的珠粒与多个一种类型的捕获引物AV1、AV2、AV3或AV4(分别是SEQ ID NO:1-4)共价连接。制备1.2mL水性混合物，其含有四种不同人类库中的每一者的约2.5亿个分子；和四种类型中的每一者的约15亿个珠粒；和四种不同类型的融合引物(AV1_L1、AV2_L2、AV3_L3和AV4_L4)(分别是SEQ ID NO:23-26)；以及通用反向A引物。用1.2mL混合物制备油包水乳液。

制备对照1.2mL emPCR反应混合物。对照emPCR混合物含有具有接合到一端的AV1衔接子(SEQ ID NO:11和12)和在另一端接合的通用衔接子A的一种类型的人类库(其包括200bp插入序列)的约2.5亿个分子；和约60亿个一种类型的珠粒(B珠粒)；以及B_AV1融合引物和通用反向A引物。

根据含于用户手册Ion PI^TM Template OT2 200 Kit v3(公开第MAN0009133号)中的制造商说明执行使用热循环的emPCR程序。

在Ion Torrent^TM PI芯片上对来自每个反应的模板化珠粒单独测序。将测序数据与人类基因组比对，并且测定每一组比对中的重复序列数目。含有四种珠粒类型的反应产生9.4％的重复率，而仅具有一种珠粒类型的对照反应产生26.5％的重复率。两种条件之间的其它度量值，如模板化珠粒的产率、多克隆百分比和比对数目类似(参看表1)。

表1：

实例2：

在一些实施例中，本发明大体上涉及方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，(a)提供多个不同靶核酸群体和多个不同类型的离散载体，和(b)形成连接到不同类型的离散载体的不同扩增靶核酸群体。制备四种不同人类基因组DNA片段库。库含有200bp插入序列，并且包括在一端接合的L1(SEQ ID NO:11和12)、L2(SEQ ID NO:13和14)、L3(SEQ IDNO:15和16)或L4双链衔接子(SEQ ID NO:17和18)以及在另一端接合的通用衔接子A。制备四种不同类型的珠粒，每种类型的珠粒与多个一种类型的捕获引物AV1、AV2、AV3或AV4(分别是SEQ ID NO:1-4)共价连接。制备2.4mL水性混合物，其含有四种不同人类库中的每一者的约1.25亿个分子；和四种类型中的每一者的约15亿个珠粒；和四种不同类型的融合引物(AV1_L1、AV2_L2、AV3_L3和AV4_L4)(分别是SEQ ID NO:23-26)；以及通用反向A引物。用2.4mL混合物制备油包水乳液。

制备对照2.4mL emPCR反应混合物。对照emPCR混合物含有具有接合到一端的AV1衔接子(SEQ ID NO:11和12)和在另一端接合的通用衔接子A的一种类型的人类库(其包括200bp插入序列)的约1.25亿个分子；约60亿个一种类型的珠粒(B珠粒)；以及B_AV1融合引物和反向通用A引物。

根据含于用户手册Ion PI^TM Template OT2 200Kit v3(公开第MAN0009133号)中的制造商说明执行使用热循环的emPCR程序。

典型地，使用5亿个分子/珠粒类型来执行此emPCR反应，其产生约30％多克隆性。在此反应中，仅1.25亿个库分子/珠粒类型包括于emPCR反应混合物中。

对来自每个反应的模板化珠粒单独测序，将其与人类基因组比对，并且测定每一组比对中的重复序列数目。两个反应都产生低数目的多克隆珠粒(19％和21％，参看表2)。然而，含有四种珠粒类型的反应产生12％的重复率，而仅具有一种珠粒类型的对照反应产生27.7％的重复率。两种条件之间的其它度量值，如模板化珠粒的产率和比对数目类似(参看表2)。

表2：

实例3

在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备富集样品的方法、以及相关系统、组合物、试剂盒和装置，所述富集样品含有连接到靶核酸之一的实质上单克隆的群体的模板化珠粒。在一些实施例中，手动或自动进行富集步骤。举例来说，可以使用Ion Torrent OneTouch装置和试剂盒(例如，Ion PGMTM Template OT2 200Kit，来自Ion TorrentTMSystems，生命技术公司)执行自动富集步骤。或者，可以使用来自Ion PGMTM Template OT2200Kit的试剂和溶液、不使用OT2TM装置执行手动富集步骤。通过将280μL Tween溶液(来自Ion PGMTM Template OT2 200Kit)和40μL的1M NaOH混合在一起制备新鲜熔化(Melt-Off)溶液。制备新鲜3mM SDS。从回收管去除回收溶液，在管中留下约100μL。将剩余回收溶液汇集到1.7mL管中。用约100μL水冲洗回收管，并且添加到1.7mL管中。用水使1.7mL管的体积达到1000mL。任选地，移出一等分试样用于Guava。分成两个1.7mL管，并且添加500μL的OneTouch洗涤溶液到每个1.7mL管中。涡旋MyOne珠粒约30秒。添加约100μL的未经洗涤的OneTouchTM珠粒到1.7mL管中。涡旋1.7mL管约30秒。在室温下孵育约2分钟。将管放在磁体(例如，来自生命技术的DynaMagTM)上以便分离约2分钟。移出上清液并且丢弃。添加200μL的熔化溶液到管中。涡旋所述管约30秒并且离心约2秒。在室温下孵育约2分钟。将管放在磁体上约2分钟。移出上清液(含有富集模板化珠粒群体)并且添加到新鲜1.7mL管(富集管)中。用水使得富集管的体积达到1000μL。在约15,500×g下离心约8分钟以使富集模板化珠粒群体成团粒。移出上清液，留下约20μL，并且弃置上清液。添加约180μL的无核酸酶的水到四个0.2mL管中。移出约1μL的富集样品用于Guava分析。将富集样品分到四个0.2mL管中，并且用水使得每个管中的体积达到200μL。在约15,500×g下对0.2mL管进行离心约5分钟以使富集模板化珠粒成团粒。移出上清液并且弃置，在约10μL液体中留下团粒形式的富集模板化珠粒。向每个0.2mL管中添加20μL的退火缓冲液和20μL的测序缓冲液并且混合(两种缓冲液都来自生命技术的Ion TorrentTM测序试剂盒)。通过在热循环仪(使用加热盖选项)中在95度下孵育120秒和37度下孵育120秒来使测序引物退火。在退火步骤之后，汇集样品并且添加40μL负载缓冲液。负载几个PGM或PI Ion TorrentTM测序芯片，并且根据制造说明(例如，Ion PGMTM Sequencing 200 Kit v2，目录号4482006；或Ion PITM Sequencing 200Kit v3，目录号4488315)执行测序步骤。

实例4：

可以使用以下方案进行根据本发明制备含有模板化颗粒(例如，珠粒)的富集样品的另一实例。

库制备：

在库制备中，遵循Ion Xpress^TM Plus gDNA Fragment Library Preparation用户指南(MAN0009847 Rev C.0)中关于产物信息和所需材料和设备、以及Ion Xpress^TM PlusgDNA Fragment Library Preparation用户指南(MAN0009847 Rev C.0)中关于gDNA片段化的制备工作流程说明。使用以上说明进行制备直到第4章,“连接衔接子、切口修复和纯化经连接的DNA(Ligate adapters,nick-repair,and purify the ligated DNA)”的衔接子连接和切口修复程序。

如下进行连接和切口修复。在0.2mL管(例如，PCR管)中，组合如不带条形码的或带条形码的库的合适表中指示的试剂，并且通过上下移液而充分混合。对于带条形码的库，关于反应设置使用下表：

在产生了上文概述的管反应混合物并且经由移液混合后，将管放在热循环仪中并且如下热循环管：

阶段	温度	时间
			保持	25℃	15min
保持	72℃	5min
			保持	4℃	保持

然后，将整个反应混合物转移到1.5mL管(例如，Eppendorf

管)中用于下一净化步骤。对于净化，遵循Ion Xpress^TM Plus gDNA Fragment Library Preparation(MAN0009847 Rev C.0)第4章,“纯化衔接子连接和切口修复的DNA(Purify the adapter-ligated and nick-repaired DNA)”和第5章,“对未经扩增的库进行大小选择-选项2：用Pippin Prep^TM仪器对库进行大小选择(Size-select the unamplified library-Option2:Size-Select the library with Pippin Prep^TM instrument)”中的说明。

对于220碱基读数的库，使用Pippin Prep^TM仪器从盒型下拉菜单选择2％标记B无溢出检测(2％Marker B No Overflow Detection)。对每个泳道选择Tight收集模式，并且然后对所用1-4个泳道中的每一者定义BP目标设定。

测序系统	库大小	BP目标设定
			Proton	220碱基读数	310bp

通过在参考泳道框中键入“5”并且选择向全部泳道应用参考按钮，将泳道1-4定义为样品泳道并且5定义为梯型泳道。确保每个泳道的“参考泳道”值是5。将运行时间设定为1.5小时。并且然后进行到“负载样品：用于100-300碱基读数库”。在完成后，使用离子文库定量试剂盒(目录号

4468802)定量库。

接着，使用OT2 PSP4进行模板化反应。在模板化反应中，关于产物信息以及所需材料和设备，参考Ion PI^TM Template OT2 200 Kit v3用户指南(MAN0009133修订B.0)。

将150μL Ion PI^TM OT2断裂(Breaking)溶液分配到两个管(例如，回收管)中的每一者中。添加4μL的1mM AV1-4 Mosaic Oligo Pool到每个回收管中的150断裂溶液中。安装管和Ion OneTouch^TM回收路由器(Recovery Router)，然后关闭离心盖。关于OneTouch^TM 2扩增板、一次性注射器和试剂的安装，遵循Ion PI^TM Template OT2 200 Kit v3用户指南(MAN0009133修订B.0)中概述的程序。

接着，如下制备扩增溶液。在最大速度下涡旋AV1-4 Ion Sphere^TM颗粒混合物1分钟，离心2秒，上下移液以混合；然后立即进行到下一步骤。在2.5mL反应管中在15℃到30℃下，以指定次序添加以下组分。添加每种组分，然后将扩增溶液上下移液以混合：

在最大速度下涡旋所制备的完整扩增溶液5秒。立即进行到遵循见于Ion PI^TMTemplate OT2 200 Kit v3用户指南(MAN0009133修订B.0)中描述的“在Ion OneTouch^TM 2仪器上填充和安装Ion PI^TM Plus Reaction Filter Assembly(Fill and install theIon PI^TM Plus Reaction Filter Assembly on the Ion OneTouch^TM 2Instrument)”中的说明。

在扩增之后，回收模板阳性颗粒(Ion PI^TM Ion Sphere^TM颗粒)。参考Ion PI^TMTemplate OT2 200 Kit v3用户指南(MAN0009133修订B.0)中概述的产物、信息、材料和设备。在扩增运行结束时，遵循屏幕提示对样品进行离心。如果反应管在运行结束时移出，随后Ion OneTouch^TM 2仪器使样品自旋或在15分钟之后尚未处理样品，那么

如下在仪器上对样品进行离心：

a.在仪器的主屏幕上，触摸Open Lid，等待直到盖

点击打开，然后在离心转子中插入

来自运行的两个经填充的Ion OneTouch^TM回收管。关闭盖直到其锁定。

b.触摸Options，然后触摸Final Spin(参看下图)，然后遵循

屏幕提示(在随后的2个屏幕上触摸Next)直到离心

开始。样品的离心花费10分钟。

紧接在离心停止之后，在仪器显示器上触摸Open Lid，等待直到盖点击打开，然后拆卸并且丢弃Ion OneTouch^TM回收路由器。从仪器移出两个Ion OneTouch^TM回收管，并且将两个回收管放在管架中。管中可观察到一定的浑浊性，这是正常的。

在不在低温下对所回收的模板阳性颗粒进行任何介入储存的情况下，立即进行到洗涤模板阳性颗粒。标记新1.5mL管(例如，1.5mL Eppendorf

管)用于模板阳性颗粒。使用移液管从每个管(例如，Ion OneTouch^TM回收管)移出几乎约100μL的IonOneTouch^TM回收溶液。从表面和在团粒的相对侧抽取上清液。不干扰模板阳性颗粒的团粒。通过将悬浮液上下移液将模板阳性颗粒再悬浮于每个管中的剩余回收溶液中。将每个回收管的悬浮液转移到新的经标记的管(例如，1.5mL管Eppendorf

管)中。添加100μL的无核酸酶的水到回收管中的每一者中，然后将管中的每个等分试样上下移液以混合，并且回收残余颗粒。将来自每个回收管的100μL等分试样转移到新的经标记的管(例如，1.5mLEppendorf

管)中以组合等分试样。

用无核酸酶的水使得悬浮液的体积达到1mL。模板阳性颗粒可以在2℃到8℃下储存多达3天。不储存Ion OneTouch^TM回收溶液中的回收的模板阳性颗粒。在储存多达3天之后，涡旋模板阳性颗粒管30秒以使颗粒完全再悬浮，并且然后对管进行离心2秒。取2μL用于Qubit分析。将样品分到总计2个1.5mL管中，并且添加500μL洗涤溶液(例如，Ion OneTouch^TM洗涤溶液)。涡旋e

MyOne^TM抗生蛋白链菌素C1珠粒30秒，并且添加100μL未经洗涤的e

MyOne^TM抗生蛋白链菌素C1珠粒到每个管中。涡旋含有模板阳性颗粒和eDynabeads的管30秒，并且在室温下孵育2分钟。将管放在磁体(例如，来自生命技术的DynaMagTM)上，并且使颗粒成团粒到管壁。在不干扰团粒的情况下移出上清液，并且添加1mL Ion PI^TM ES洗涤溶液(W)。从磁体移开并且涡旋30秒，并且返回到磁体以进行分离。移出上清液并且分配200μL新制的熔化溶液并且涡旋30秒，快速自旋并且在室温下孵育2分钟。再次将管放在磁体上以进行分离。

此时，富集颗粒现位于上清液中，并且上清液不应丢弃。将两个1.7mL上清液转移并且汇集到新的经标记的1.7mL管中。用无核酸酶的水使得管内容物的体积达到1mL，并且在15,500×g下离心8分钟。使得管的体积降到约20μL并且分配约180μL无核酸酶的水，使得体积达到200μL。上下移液以使珠粒再悬浮并且取2μL用于Qubit。将样品相等地分到四(4)个0.2mL管(例如，PCR管)中，并且用无核酸酶的水使得体积达到200μl。

此时，可以如Ion PI^TM Sequencing 200 Kit v3(MAN0009136修订B.0)中所概述进行测序。

实例5：

将实例4(上文)中描述的方案用以制备2批模板化珠粒，并且通过使用四种不同类型的珠粒在具有乳液的单一反应容器中执行核酸合成反应来比较珠粒凝集。在第一批中，珠粒模板化反应采用一组四种不同珠粒/捕获引物以及其同源衔接子、融合引物和反向引物(图4A)。第一批包括捕获引物AV1、AV2、AV3和AV4(分别是SEQ ID NO:1-4)；双链衔接子L1(SEQ ID NO:11和12)、L2(SEQ ID NO:13和14)、L3(SEQ ID NO:15和16)和L4(SEQ ID NO:17和18)；以及融合引物AV1_L1、AV2_L2、AV3_L3和AV4_L4(分别是SEQ ID NO:23-26)。在第二批中，珠粒模板化反应采用一组改进的四种不同珠粒/捕获引物以及其同源衔接子、融合引物和反向引物，其经设计以减少引物-二聚体形成(图4B)。第二批包括捕获引物AV1、AV3、AV5和AV6(分别是SEQ ID NO:1、3、5和6)；双链衔接子L1(SEQ ID NO:11和12)、L3(SEQ IDNO:15和16)、L5(SEQ ID NO:19和20)和L6(SEQ ID NO:21和22)；融合引物AV1_L1、AV3_L3、AV5_L5和AV6_L6(分别是SEQ ID NO:23、25、27和28)。使用经荧光标记的探针监测模板化珠粒的分布。图4A和B中的数据显示，当用改进的引物集执行珠粒模板化反应时，珠粒凝集的量减少。

实例6：

将实例4(上文)中描述的方案用以制备2批模板化珠粒，并且通过使用四种不同类型的珠粒在具有乳液的单一反应容器中执行核酸合成反应来比较珠粒凝集。在第一批中，珠粒模板化反应采用一组四种不同珠粒/捕获引物以及其同源衔接子、融合引物和反向引物(图5A和B)。第一批包括捕获引物AV1、AV2、AV3和AV4(分别是SEQ ID NO:1-4)；双链衔接子L1(SEQ ID NO:11和12)、L2(SEQ ID NO:13和14)、L3(SEQ ID NO:15和16)和L4(SEQ IDNO:17和18)；以及融合引物AV1_L1、AV2_L2、AV3_L3和AV4_L4(分别是SEQ ID NO:23-26)。在第二批中，珠粒模板化反应采用一组改进的四种不同珠粒/捕获引物以及其同源衔接子、融合引物和反向引物，其经设计以减少引物-二聚体形成(图5C和D)。第二批包括捕获引物AV1、AV3、AV5和AV6(分别是SEQ ID NO:1、3、5和6)；双链衔接子L1(SEQ ID NO:11和12)、L3(SEQ ID NO:15和16)、L5(SEQ ID NO:19和20)和L6(SEQ ID NO:21和22)；融合引物AV1_L1、AV3_L3、AV5_L5和AV6_L6(分别是SEQ ID NO:23、25、27和28)。使用经荧光标记的探针监测模板化珠粒的分布。图5A和B分别展示了使用初始引物集制备的富集前和富集的模板化珠粒。图5C和D分别展示了使用改进的引物集制备的富集前和富集的模板化珠粒。图5A-D中的圆圈区域指示了不良地模板化并且凝集的珠粒。图5A-D中的数据显示，当用改进的引物集执行珠粒模板化反应时，珠粒凝集的量减少。

实例7：

将实例4(上文)中描述的方案用以制备4批模板化珠粒，通过使用四种不同类型的珠粒和含有来自人类DNA样品(NA12878)的220bp靶多核苷酸插入序列的库，在具有乳液的单一反应容器中执行核酸合成反应。将两批所得模板化珠粒组合，并且然后负载到六个IonTorrentTM Proton ITM芯片上，并且测序以实现约30X覆盖率(参看下表3)。举例来说，珠粒模板反应中的每一者含有四种类型的珠粒(AV1+AV3+AV5+AV6)。

表3：

实例8：

将实例4(上文)中描述的方案用以制备模板化珠粒，并且通过使用一种、两种、三种和四种不同类型的珠粒在具有乳液的单一反应容器中执行核酸合成反应来比较重复珠粒形成，并且将所得模板化珠粒负载到四个Ion TorrentTM Proton ITM芯片上并且进行测序。

举例来说，珠粒模板化反应含有一种类型的珠粒(P1)、两种类型的珠粒(AV1+AV3)三种类型的珠粒(V1+AV3+AV6)和四种类型的珠粒(AV1+AV3+AV5+AV6)。下表4中和图6中呈现的数据展示了每单一乳液负载到4个Ion Proton ITM芯片上的每不同珠粒类型数目的组合重复率。珠粒模板化反应含有180亿个珠粒和3.5亿个每种库分子。

表4：

表4和图6中的数据显示，重复珠粒百分比从一种类型珠粒的约36％降低到四种不同类型珠粒的约13％。

实例9：

将实例4(上文)中描述的方案用以制备模板化珠粒，并且通过使用一种、两种、三种和四种不同类型的珠粒在具有乳液的单一反应容器中执行核酸合成反应来比较重复珠粒形成，并且将所得模板化珠粒负载到一个、三个或四个Ion TorrentTM Proton ITM芯片上并且进行测序(参看图7)。举例来说，珠粒模板化反应含有一种类型的珠粒(P1)、两种类型的珠粒(AV1+AV3)三种类型的珠粒(V1+AV3+AV6)和四种类型的珠粒(AV1+AV3+AV5+AV6)。

图7中的图展示了含有一种、两种、三种或四种不同类型珠粒负载到4个IonProton ITM芯片上的珠粒模板化反应的重复珠粒产生(◆)，其产生约3.7亿个读数。(◆)表示珠粒重复率的数据(起始+终止)并且类似于计算的线性重复率。

图7中的图还展示了含有一种、两种、三种或四种不同类型珠粒负载到3个IonProton ITM芯片上的珠粒模板化反应的重复珠粒产生(■)，其产生约2.75亿个读数。(■)表示珠粒重复率的数据(起始+终止)并且类似于计算的线性重复率。

图7中的图还展示了含有一种、两种、三种或四种不同类型珠粒负载到1个IonProton ITM芯片上的珠粒模板化反应的重复珠粒产生(▲)，其产生约8000万个读数。(▲)表示珠粒重复率的数据(起始+终止)并且类似于计算的线性重复率。

下文列出了用以执行以上实例1-9中所描述的实验的捕获引物、衔接子和融合引物的序列。

珠粒捕获引物：

AV1：5'-GCACACATTCAGAGTCAGCAGCTCAGCATCAT(SEQ ID NO:1)

AV2：5'-TTAGGAGATGTTCATGCAGACTCACGATCAGT(SEQ ID NO:2)

AV3：5'-AGTCACTTATCATCGGTGGTACGCAGCTCATT(SEQ ID NO:3)

AV4：5'-ATTCGAGCTGTTCATCTGTATCTTGCGCTACCAA(SEQ ID NO:4)

AV5：5'-GAATCTGTTCTCACTATTCACGCTGGAGGAGT(SEQ ID NO:5)

AV6：5'-GTAACTCGATCAGGTCACACGACCGTTCTCAGCAT(SEQ ID NO:6)

AV7：5'-GATTTCGCAGCTAACCTTGGTGGAAGCTCTCAT(SEQ ID NO:7)

AV8：5'-CTTGAACTACACCACTCTGATGTGCCAGTCTA(SEQ ID NO:8)

AV9：5'-TATCGAGCTAGTGCGTGCTATCAGAACCTATCAGT(SEQ ID NO:9)

AV10：5'-ACGTCGACACTAGCTACCTGTCAGCTACGTGTA(SEQ ID NO:10)

库衔接子(包含顶部和底部链，并且具有硫赶磷酸酯、硫代磷酸酯和/或氨基磷酸酯键(*))：

ML1a：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTG

AAGCTCTCATGAT(SEQ ID NO:11)

ML1b：5'-ATCATGAGAGCTTCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAA

GCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQ ID NO:12)

ML2a：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTG

TGCCAGTCTAGAT(SEQ ID NO:13)

ML2b：5'-ATCTAGACTGGCACACCGACTGCCCATAGAGAGGAAA

GCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQ ID NO:14)

ML3a：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTG

ACCTATCAGTGAT(SEQ ID NO:15)

ML3b：5'-ATCACTGATAGGTCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAA

GCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQ ID NO:16)

ML4a：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTG

GCTACGTGTAGAT(SEQ ID NO:17)

ML4b：5'-ATCTACACGTAGCCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQID NO:18)

ML5a：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGTGCCAGTCTAGAT(SEQ IDNO:19)

ML5b：5'-ATCTAGACTGGCACACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQID NO:20)

ML6a：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGGCTACGTGTAGAT(SEQ IDNO:21)

ML6b：5'-ATCTACACGTAGCCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQID NO:22)

P1(a)衔接子：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO:30)

P1(b)衔接子：5'-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T(SEQ IDNO:31)

融合引物：

AV1/ML1：5'-GCACACATTCAGAGTCAGCAGCTCAGCATCATGCAGTCGGTGAAGCTCTCAT(SEQID NO:23)

AV2/ML2：5'-TTAGGAGATGTTCATGCAGACTCACGATCAGTGCAGTCGGTGTGCCAGTCTA(SEQID NO:24)

AV3/ML3：5'-AGTCACTTATCATCGGTGGTACGCAGCTCATTGCAGTCGGTGACCTATCAGT(SEQID NO:25)

AV4/ML4：5'-ATTCGAGCTGTTCATCTGTATCTTGCGCTACCAAGCAGTCGGTGGCTACGTGTA(SEQID NO:26)

AV5/ML5：5'-GAATCTGTTCTCACTATTCACGCTGGAGGAGTGCAGTCGGTGTGCCAGTCTA(SEQID NO:27)

AV6/ML6：5'-GTAACTCGATCAGGTCACACGACCGTTCTCAGCATGCAGTCGGTGGCTACGTGTA(SEQ ID NO:28)

B/P1：5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ IDNO:29)

Claims

1.一种单克隆地扩增第一靶核酸群体的第一靶序列和第二靶核酸群体的第二靶序列的非疾病诊断目的的方法，其包含：

(a) 提供含有乳液的单一反应混合物，所述单一反应混合物提供区室化，具有：多个第一类型的珠粒，所述珠粒具有共价连接的第一捕获引物；多个第二类型的珠粒，所述珠粒具有共价连接的第二捕获引物，其中所述第一捕获引物与第二捕获引物不同；第一靶核酸群体，其中所述第一靶核酸群体包括至少一个结合到第一融合引物并包含第一衔接子的靶核酸；第一融合引物，其包括与所述第一捕获引物互补的部分；第二靶核酸群体，其中所述第二靶核酸群体包括至少一个结合到第二融合引物并包含第二衔接子的靶核酸；第二融合引物，其包括与所述第二捕获引物互补的部分；

(b) 提供第一可溶反向引物和第二可溶反向引物，其中所述第一可溶反向引物与所述第一衔接子互补或一致或者与所述第一衔接子和第二衔接子互补或一致，并且其中所述第二可溶反向引物与所述第二衔接子互补或一致或者与所述第一衔接子和第二衔接子互补或一致；

(c) 使用所述第一融合引物在所述第一类型的珠粒上形成所述第一靶核酸群体的所述第一靶序列的大体上单克隆的群体；以及

(d) 使用所述第二融合引物在所述第二类型的珠粒上形成所述第二靶核酸群体的所述第二靶序列的大体上单克隆的群体。

2.一种扩增单一反应混合物中的多个不同核酸群体的非疾病诊断目的的方法，其包含：

a) 提供含有乳液的单一反应混合物，所述单一反应混合物提供区室化，包含：第一核酸群体和第二核酸群体，其中所述第一核酸群体含有第一引物结合序列和第一衔接子，并且所述第二核酸群体含有第二引物结合序列和第二衔接子，并且其中所述第一引物结合序列与第二引物结合序列不同；第一多个珠粒，所述珠粒具有共价连接的结合到所述第一引物结合序列的第一捕获引物；第二多个珠粒，所述珠粒具有共价连接的结合到所述第二引物结合序列的第二捕获引物，其中所述第一与第二捕获引物不同；

b) 提供第一可溶反向引物和第二可溶反向引物，其中所述第一可溶反向引物与所述第一衔接子互补或一致或者与所述第一衔接子和第二衔接子互补或一致，并且其中所述第二可溶反向引物与所述第二衔接子互补或一致或者与所述第一衔接子和第二衔接子互补或一致；和

c) 在所述单一反应混合物的区室内，扩增所述第一核酸群体的一个或多个核酸以形成第一扩增群体和所述第二核酸群体的一个或多个核酸以形成第二扩增群体，其中所述第一扩增群体结合到所述第一多个珠粒的一个或多个珠粒并且所述第二扩增群体结合到所述第二多个珠粒的一个或多个珠粒。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一扩增群体、所述第二扩增群体或这两者大体上是单克隆的。

4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤（c）中的所述扩增包括PCR扩增。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述乳液包括油包水乳液。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一扩增群体共价结合到所述第一多个珠粒的一个或多个珠粒。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二扩增群体共价结合到所述第二多个珠粒的一个或多个珠粒。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述单一反应混合物进一步包括至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种类型的珠粒，每种类型的珠粒包括不同类型的捕获引物。

9.根据权利要求2所述的方法，其进一步包含对所述第一扩增群体的一个或多个核酸和所述第二扩增群体的一个或多个核酸平行测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述测序包括检测一种或多种核苷酸掺入副产物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述测序包括检测氢离子或焦磷酸。

12.根据权利要求2所述的方法，其中步骤（c）中的所述扩增包括使至少一个第一共同引物结合序列在所述第一多个珠粒上与第一引物结合序列杂交；以及使所述第二群体的至少一个第二共同引物结合序列在所述第二多个珠粒上与第二引物结合序列杂交。

13.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括以模板依赖性方式延伸一个或多个第一引物结合序列和第二引物结合序列。

14.根据权利要求2所述的方法，其中步骤（c）中的所述扩增包括等温扩增。

15.根据权利要求2所述的方法，其中步骤（c）中的所述扩增包括滚环扩增。