KR20210138017A - 핵산 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 같은 기술을 사용하여 핵산 시퀀싱의 효율성 및 정확성을 증가시키기 위한 방법 및 과정을 제공한다. 본 명세서에 기술된 방법은 에멀션으로 핵산 주형 및/또는 비드의 포아송 분포에 비해 훨씬 크더라도 클론 증폭을 획득하는데 사용될 수 있다. PCR 방법은 적어도 2개 비드 및/또는 적어도 2개 핵산 분자를 포함하는 파티션(예를 들어, 액적)을 생성하는 단계 및 그의 적어도 서브세트가 비드에 부착될 수 있는 것인 핵산 분자에 상응하는 클론 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
Description
교차-참조
본 출원은 2019년 2월 11일 출원된 미국 가출원 제62/804,082호, 2019년 8월 22일 출원된 미국 가출원 제62/890,240호, 및 2019년 10월 17일 출원된 미국 가출원 제62/916,683호의 우선권을 청구하고, 이들 각각은 모든 목적을 위해서 참조로 본 명세서에 전체로 편입된다.
배경기술
생물학적 분자의 연구에서의 진보는 부분적으로, 분자 및/또는 그들 생물학적 반응을 특징규명하는데 사용되는 기술의 개선에 의해 견인되었다. 특히, 핵산 연구는 서열 분석에 사용되는 기술을 개발하여 이득을 얻었다. 핵산의 시퀀싱은 분자 생물학 및 의학 분야 (예를 들어, 진단 및 치료 모니터링)에서 다양한 응용성을 갖는다. 핵산 시퀀싱은 대상체에서 일정 병태를 진단하고/하거나 치료 계획을 조정하는데 사용될 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 시퀀싱은 벡터 디자인, 유전자 요법, 백신 디자인, 산업적 균주 디자인 및 검증을 포함하여, 분자 생물학 응용에 광범위하게 사용된다. 궁극적인 서열 분석이 수행되는 방식은 이러한 분석에서 수득될 수 있는 정보의 유형 및 품질에서 역할을 할 수 있다.
핵산 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법(예를 들어, 에멀션 PCR)의 효율, 감도, 및 정확성을 증가시키기 위한 방법, 과정, 및 조성물에 대한 필요성을 본 명세서에서 인식한다. 본 개시는 높은 정확성 및 감도 및 효율적인 시약 용법으로 핵산 분자(예를 들어, 생물학적 샘플에 존재하는 것들)를 분석 및/또는 처리하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 핵산 증폭 또는 서열 분석(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR)을 위한 에멀션 액적(또는 다른 유형의 파티션, 예컨대 웰) 중에 더 높은 수의 비드의 사용(예를 들어, 더 높은 비율의 비드 대 핵산 분자 사용)은 더 높은 클론 카피수 및 감소된 주형 손실을 일으킬 수 있고, 이것은 이후 효율적인 작업흐름을 유지하면서 증가된 정확성 및 감도를 야기시킬 수 있다. 본 개시는 또한 1개 초과의 핵산 주형이 파티션(예를 들어, 에멀션 파티션)에 존재하는 경우에도 클론 증폭을 획득하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 여기서 기술된 시스템 및 방법은 예를 들어 시약(예를 들어, PCR 시약)을 효율적으로 사용할 수 있도록 파티션 중에 (예를 들어, 포아송 분포보다 큰 밀도로) 다수 비드 및/또는 핵산 주형의 로딩을 허용할 수 있다.
일 양태에서, 핵산을 처리하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 다수의 파티션으로서, 다수의 파티션의 파티션은 (i) 다수 비드의 적어도 2개 비드, (ii) 핵산 분자, 및 (iii) 하나 이상의 시약을 포함하는 것인 다수의 파티션을 제공하는 단계; (b) 파티션에서, 핵산 분자 및 하나 이상의 시약을 사용하여 핵산 분자의 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 하나 이상의 증폭 산물 중 적어도 하나의 서브세트는 적어도 2개 비드의 비드에 부착되는 것인 단계; (c) 파티션으로부터 비드를 회수하는 단계; 및 (d) 비드에 부착된 하나 이상의 증폭 산물 또는 이의 유도체의 증폭 산물을 어세이하여 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, (a)는 (i) 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자를 포함한 제1 용액, 및 (ii) 적어도 2개 비드를 포함하는 다수의 비드를 포함한 제2 용액을, 제1 용액 및 제2 용액과 비혼화성인 유체와 접촉시켜, 다수의 파티션을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 용액 및 제2 용액은 동일한 용액이다. 일부 실시형태에서, 제1 용액 및 제2 용액은 상이한 용액이다.
일부 실시형태에서, 비드는 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응을 수행하기 위해서 그에 다수의 프라이머 분자가 부착되고, (b)는 다수의 프라이머 분자의 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물의 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위해 그에 다수의 추가 프라이머 분자가 부착되었고, 다수의 추가 프라이머 분자는 다수의 프라이머 분자와 상이하다.
일부 실시형태에서, (b)는 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계를 더 포함하고, 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 비드에 부착되고, (d)는 비드에 부착된 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자의 제1 가닥에 상응하는 증폭 산물은 다수의 프라이머 분자를 사용하여 생성되고, 핵산 분자의 제2 가닥에 사응하는 증폭 산물은 다수의 추가 프라이머 분자를 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, (d)는 하나 이상의 증폭 산물 또는 이의 유도체의 서열과 연관된 페어드-엔드 시퀀싱 리드(paired-end sequencing reads)를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 2개 비드 중 추가 비드는 핵산 분자를 사용한 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위한 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 다수의 프라이머 분자와 상이하다. 일부 실시형태에서, 방법은 (e) 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 적어도 2개 비드의 추가 비드에 부착되는 것인 단계; (f) 파티션으로부터 추가 비드를 회수하는 단계; 및 (g) 추가 비드에 부착된 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자의 제1 가닥에 상응하는 증폭 산물은 비드에 커플링된 다수의 프라이머 분자를 사용하여 생성되고, 핵산 분자의 제2 가닥에 상응하는 증폭 산물은 추가 비드에 커플링된 다수의 추가 프라이머 분자를 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, (d)는 다수의 증폭 산물 또는 이의 유도체의 서열과 연관된 페어드-엔드 시퀀싱 리드를 생성하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 적어도 80%는 각각이 다수의 비드의 2 이상의 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 적어도 85%는 각각이 다수의 비드의 2 이상의 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 적어도 90%는 각각이 다수의 비드의 2 이상의 비드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 적어도 80%는 각각이 다수의 비드의 3 이상의 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 적어도 85%는 각각이 다수의 비드의 3 이상의 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 적어도 90%는 각각이 다수의 비드의 3 이상의 비드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 2개 비드는 서로에 부착된다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개 비드는 적어도 하나의 화학적 링커를 통해서 서로에 부착된다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개 비드는 스플린트 올리고뉴클레오티드를 통해서 서로에 부착된다.
일부 실시형태에서, 방법은 각각이 적어도 2개 비드를 포함하는 다수의 파티션의 파티션을 각각이 많아야 하나의 비드를 포함하는 다수의 파티션의 다른 파티션으로부터 분리하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 분리 단계는 각각이 적어도 2개 비드를 포함하는 파티션 및/또는 각각이 많아야 하나의 비드를 포함하는 다른 파티션을 광학적으로 검출하는 단계, 및 적어도 부분적으로 광학적으로 검출하는 단계를 기반으로, 각각이 유체 장치의 제1 채널에 적어도 2개 비드를 포함하는 파티션 및 각각이 유체 장치의 제2 채널에 많아야 하나의 비드를 포함하는 다른 파티션을 제공하도록 유체 장치에서 유체의 흐름의 방향을 조정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 시약은 프라이밍 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 서열을 포함하는 핵산 분자는 고유 분자 식별자 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 서열을 포함하는 핵산 분자는 바코드 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 서열은 표적-특이적 프라이밍 서열이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 서열은 비-표적 특이적 프라이밍 서열이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 시약은 하나 이상의 중합 효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 세포 또는 세포의 성분으로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 다수의 파티션은 다수의 액적이다.
일부 실시형태에서, (d)는 증폭 산물 또는 이의 유도체를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, (a)에서, 핵산 분자는 비드에 부착된다.
다른 양태에서, (a) 다수의 파티션으로서, 다수의 파티션의 파티션은 (i) 적어도 2개 비드가 서로 부착된 것인 다수 비드의 적어도 2개 비드, (ii) 핵산 분자, 및 (iii) 하나 이상의 시약을 포함하는 것인 다수의 파티션을 제공하는 단계; 및 (b) 파티션에서, 핵산 분자 및 하나 이상의 시약을 사용하여 핵산 분자의 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 하나 이상의 증폭 산물의 적어도 서브세트는 적어도 2개 비드의 비드에 부착된 것인 단계를 포함하는, 핵산 처리 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 방법은 (c) 파티션으로부터 비드를 회수하는 단계; 및 (d) 비드에 부착된 하나 이상의 증폭 산물의 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, (a)는 (i) 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자를 포함하는 제1 용액 및 (ii) 적어도 2개 비드를 포함하는 다수의 비드를 포함하는 제2 용액을, 제1 용액 및 제2 용액과 비혼화성인 유체와 접촉시켜서, 다수의 파티션을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비드는 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응을 수행하기 위한 다수의 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, (b)는 다수의 프라이머 분자의 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물의 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비드는 핵산 분자를 사용하는 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위해 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 다수의 프라이머 분자와 상이하다. 일부 실시형태에서, (b)는 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계를 더 포함하고, 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 비드에 부착되고, (d)는 비드에 부착된 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 2개 비드의 추가 비드는 핵산 분자를 사용한 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위해서 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 다수의 프라이머 분자와 상이하다. 일부 실시형태에서, 방법은 (e) 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 적어도 2개 비드의 추가 비드에 부착되는 것인 단계; (f) 파티션으로부터 추가 비드를 회수하는 단계; 및 (g) 추가 비드에 부착된 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다.
다른 양태에서, 핵산 분자를 클론으로 증폭시키는 방법을 제공하고, 방법은 (a) (i) 고정화된 다수의 제1 프라이머를 포함하는 표면으로서, 다수의 제1 프라이머는 제1 서열과의 서열 동일성(또는 상동성)을 갖는 것인, 표면, (ii) 핵산 분자로서, 제1 서열의 상보체와 상이한 말단 서열을 포함하는 것인 핵산 분자, 및 (iii) 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 제2 프라이머로서, 제1 부분은 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고 제2 부분은 연장 서열을 포함하고, 연장 서열, 또는 이의 상보체는 제1 서열과 혼성화하도록 구성되는 것인, 제2 프라이머를 포함하는, 반응 혼합물을 제공하는 단계; (b) 핵산 분자 및 제2 프라이머를 사용하여 연장 산물을 생성하는 단계로서, 연장 산물은 연장 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 것인 단계; 및 (c) 표면에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 사용하여 연장 산물을 증폭시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 표적에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 (b) 단계 이전에 다수의 제1 프라이머와 혼성화되지 않는다.
일부 실시형태에서, 표면은 증폭 부위의 어레이를 포함하고, 증폭 부위의 어레이는 그에 고정화된 제1 프라이머의 다수 세트를 포함하고, 제1 프라이머의 다수 세트는 제1 서열과 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 반응 혼합물 중 증폭 부위의 어레이에 대한 유체적 접근성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 증폭 부위의 어레이의 각 증폭 부위는 표면에 고정화된 제1 프라이머의 다수 세트의 제1 프라이머의 세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표면은 비드이다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 에멀션의 분산상의 부피에 제공된다. 일부 실시형태에서, 에멀션은 제2 표면을 포함하는 제2 반응 혼합물을 포함하는 분산상의 제2 부피를 포함한다.
일부 실시형태에서, (b) 및 (c)는 반응 혼합물에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 다수의 핵산 분자를 포함하고, 다수의 핵산 분자는 상이한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 핵산 분자의 각각은 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 연장 산물을 생성하기 위해 제2 프라이머에 커플링되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 방법은 다수의 반응 혼합물을 포함하는 다수의 파티션을 제공하는 단계를 더 포함하고, 다수의 파티션은 (i) 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자 및 (ii) 표면을 포함하는 다수의 표면을 포함하고, 다수의 파티션의 제1 파티션은 반응 혼합물을 포함하고, 다수의 파티션의 제2 파티션은 다수의 핵산 분자의 제2 핵산 분자 및 다수의 표면의 제2 표면을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 핵산 분자는 다수의 파티션 중의 파티션당 평균 1개 핵산 분자를 초과하는 밀도로 다수의 파티션 중에 분포된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 제3 핵산 분자 및 추가 제2 프라이머를 포함하고, 핵산 분자, 또는 이의 유도체는 제2 핵산 분자가 추가 제2 프라이머에 커플링되기 전에 다수의 제1 프라이머의 적어도 99%에 커플링된다.
일부 실시형태에서, (c)는 (b)의 속도에 비해서 적어도 10배 더 빠른 속도로 일어난다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 단일 가닥이다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 (c)의 속도에 대해서 (b)의 속도를 제한하는 반응 혼합물 중의 소정의 농도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 표면에 고정화되지 않은 추가 제1 프라이머를 더 포함하고, 추가 제1 프라이머는 제1 서열과 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 제1 프라이머 또는 제2 프라이머와 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응에서 사용될 때 핵산 분자를 기하급수적으로 증폭시키도록 구성된 다수의 제3 프라이머를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 제4 프라이머를 더 포함하고, 제4 프라이머는 제3 부분 및 제4 부분을 갖고, 제3 부분은 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고 제2 부분은 제2 연장 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 (d) 핵산 분자 및 제4 프라이머를 사용하여 제2 연장 산물을 생성하는 단계로서, 제2 연장은 제3 프라이머와 혼성화하도록 구성된, 제2 연장 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 것인, 단계; 및 (e) 다수의 제3 프라이머를 사용하여 제2 연장 산물을 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 (d) 이전에 다수의 제3 프라이머의 제3 프라이머와 혼성화하지 않는다. 일부 실시형태에서, 다수의 제3 프라이머의 농도는 반응 혼합물 중 제4 프라이머의 농도에 비해 적어도 10-배 더 크다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 핵산 폴리머라제를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, (b)는 등온 조건 하에서 수행된다.
일부 실시형태에서, (c)는 등온 조건 하에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 표면을 회수하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 방법은 핵산 분자의 증폭 산물 또는 이의 유도체를 어세이하여 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 핵산 분자의 5' 말단에 부착된 제1 어댑터 및 핵산 분자의 3' 말단에 부착된 제2 어댑터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 어댑터 및 제2 어댑터는 동일한 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 방법은 반응 혼합물에 대해서 (b)를 (c)에 대해서 더 느리고/느리거나 더 드문 사건으로 만드는 조건을 가하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 조건은 온도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 온도는 핵산 분자와 제2 프라이머 간의 어닐링 온도와 대략 동일하다.
다른 양태에서, 핵산 분자를 클론으로 증폭시키는 시스템을 제공하고, 시스템은 (i) 그에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 포함하는 표면으로서, 다수의 제1 프라이머는 제1 서열과 서열 동일성(또는 상동성)을 갖는 것인, 표면; (ii) 핵산 분자로서, 제1 서열의 상보체와 상이한 말단 서열을 포함하는 것인 핵산 분자; (iii) 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 제2 프라이머로서, 제1 부분은 핵산 분자를 어닐링하도록 구성되고 제2 부분은 연장 서열을 포함하고, 연장 서열, 또는 이의 상보체는 제1 서열과 혼성화하도록 구성되는 것인, 제2 프라이머; 및 (iv) 핵산 분자를 사용한 핵산 연장 반응을 수행하도록 구성된 시약을 포함하는, 반응 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 단일 가닥이다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 제1 서열과 혼성화하도록 구성된, 연장 서열을 포함하는 연장 산물, 또는 상보체를 생성하기 위해 핵산 분자에 커플링되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 연장 산물은 반응 혼합물 중에서 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 연장 산물은 등온 조건 하에서 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 연장 산물, 또는 이의 증폭 산물은 표면에 고정화된 다수의 제1 프라이머에 커플링되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 연장 산물, 또는 이의 증폭 산물은 반응 혼합물에서 표면에 고정화된 다수의 제1 프라이머에 커플링되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 연장 산물의 증폭 산물은 등온 조건 하에서 생성을 위해 구성된다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 제2 핵산 분자 및 추가 제2 프라이머를 포함하고, 핵산 분자, 또는 이의 유도체는 제2 핵산 분자가 추가 제2 프라이머에 커플링되기 전에 다수의 제1 프라이머의 적어도 99%에 커플링되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 연장 산물이 표면 상에서 증폭되는 속도에 대해서 연장 산물을 생성하도록 핵산 분자가 제2 프라이머에 커플링되는 속도를 제한하는 반응 혼합물 중의 소정의 농도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 표면에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 표면은 증폭 부위의 어레이를 포함하고, 증폭 부위의 어레이는 그에 고정화된 제1 프라이머의 다수 세트를 포함하고, 제1 프라이머의 다수 세트는 제1 서열과 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 반응 혼합물 중 증폭 부위의 어레이에 대한 유체적 접근성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 증폭 부위의 어레이의 각 증폭 부위는 표면에 고정화된 제1 프라이머의 다수 세트의 제1 프라이머의 세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표면은 비드이다.
일부 실시형태에서, 시스템은 에멀션을 더 포함하고, 반응 혼합물은 에멀션의 분산상의 부피로 제공된다. 일부 실시형태에서, 에멀션은 제1 표면을 포함하는 제2 반응 혼합물을 포함하는 분산상의 제2 부피를 포함한다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 다수의 핵산 분자를 포함하고, 다수의 핵산 분자는 상이한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 핵산 분자의 각각은 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 연장 산물을 생성하기 위해 제2 프라이머에 커플링되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 시스템은 다수의 반응 혼합물을 포함하는 다수의 파티션을 더 포함하고, 다수의 파티션은 (i) 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자 및 (ii) 표면을 포함하는 다수의 표면을 포함하고, 다수의 파티션의 제1 파티션은 반응 혼합물을 포함하고, 다수의 파티션의 제2 파티션은 다수의 핵산 분자의 제2 핵산 분자 및 다수의 표면의 제2 표면을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 핵산 분자는 다수의 파티션 중의 파티션당 평균 1개 핵산 분자 초과인 밀도로 다수의 파티션 중에 분포된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 표면에 고정화되지 않은 추가 제1 프라이머를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 제1 프라이머 또는 제2 프라이머와 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응에서 사용될 때 핵산 분자를 기하급수적으로 증폭시키도록 구성된 다수의 제3 프라이머를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 제4 프라이머를 더 포함하고, 제4 프라이머는 제3 부분 및 제4 부분을 포함하며, 제3 부분은 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고, 제4 부분은 제2 연장 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 시스템은 핵산 분자의 서열을 확인하기 위해서 핵산 분자의 증폭 산물 또는 이의 유도체를 어세이하도록 구성된, 하나 이상의 프로세서를 개별적으로 또는 집합적으로 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 표면은 다수의 증폭 부위를 포함하고 증폭 부위의 각각은 표면에 부착된 상이한 제1 프라이머의 다수 카피를 갖는다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 핵산 분자의 5' 말단에 부착된 제1 어댑터 및 핵산 분자의 3' 말단에 부착된 제2 어댑터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 어댑터 및 제2 어댑터는 동일한 서열을 갖는다.
다른 양태에서, 핵산 샘플을 클론으로 증폭시키는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 다수의 파티션을 포함하는 에멀션을 형성하는 단계로서, 다수의 파티션의 파티션은 (i) 핵산 분자, (ii) 그에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 포함하는 비드로서, 다수의 제1 프라이머는 제1 서열과 서열 동일성(또는 상동성)을 갖는 것인 비드, 및 (iii) 핵산 분자 또는 이의 유도체가 비드에 부착되도록 허용하는 부착 반응 및 다수의 제1 프라이머를 사용하는 증폭 반응을 수행하도록 구성된 시약 혼합물을 포함하는 것인, 단계; 및 (b) 에멀션을 인큐베이션시켜서, (i) 핵산 분자, 또는 이의 유도체를 비드에 부착하기 위한 부착 반응을 수행하고, (ii) 비드에 부착된, 핵산 분자 또는 이의 유도체의 카피를 생성하기 위한 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하고, 제1 기간은 제2 기간에 비해 길고, 제1 기간은 (b)의 인큐베이션과 함께 시작되어 핵산 분자, 또는 이의 유도체가 비드에 부착될 때 종료되고, 제1 기간은 핵산 분자, 또는 이의 유도체가 비드에 부착될 때 시작되어 증폭 반응이 종료될 때 종료된다.
일부 실시형태에서, 제1 기간은 제2 기간에 비해서 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 100배 더 크다.
일부 실시형태에서, (b)의 인큐베이션은 에멀션에 대해서 적어도 2종의 상이한 조건을 가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에멀션은 (i) 제1 기간 동안 적어도 2종의 상이한 조건의 제1 조건, 및 (ii) 제2 기간 동안 적어도 2종의 상이한 조건의 제2 조건이 가해진다.
일부 실시형태에서, (b)의 인큐베이션은 에멀션에 대해서 부착 반응을 개시하기에 충분한 조건이 가해질 때 시작된다. 일부 실시형태에서, 조건은 온도, 압력, 시약 농도, 전기장, 자기장, 및 방사선 노출로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 시약 혼합물에 용해되고 시약 혼합물은 비드와 접촉된다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 에멀션의 인큐베이션 이전에 비드에 부착될 수 없다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 에멀션의 인큐베이션 이전에 제1 프라이머와 혼성화되지 않는다.
일부 실시형태에서, 부착 반응은 결찰 반응이다.
일부 실시형태에서, 부착 반응은 프라이머 연장 반응이다.
일부 실시형태에서, 시약 혼합물은 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 제2 프라이머이고, 제1 부분은 핵산 분자에 어닐링되고 제2 부분은 연장 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 비드에 부착된다. 일부 실시형태에서, 부착 반응은 연장 산물을 생성하기 위해 제2 프라이머 및 핵산 분자를 사용하고, 산물은 제1 서열과 혼성화하도록 구성된, 연장 서열, 또는 이의 상보체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 증폭 반응은 연장 산물을 증폭시키기 위해서 비드에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 사용한다. 일부 실시형태에서, 제2 프라이머는 제1 기간이 제2 기간에 비해 크도록 소정의 농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 에멀션은 제1 프라이머 또는 제2 프라이머와 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응에서 사용될 때 핵산 분자를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 다수의 제3 프라이머를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 증폭 반응은 비드에 부착된 다수의 제1 프라이머의 적어도 99%가 연장 산물, 또는 이의 유도체에 커플링될 때 종료된다.
일부 실시형태에서, 에멀션은 다수의 파티션 중의 파티션당 평균 1개 핵산 분자를 초과하는 밀도로 다수의 파티션 중에 분포되는, 핵산 분자를 포함한 핵산 분자의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자의 라이브러리의 각각의 핵산 분자는 제2 프라이머에 커플링될 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수의 파티션의 파티션은 다수의 핵산 분자를 포함하고, 다수의 핵산 분자는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 제2 핵산 분자가 비드에 부착되기 전에 부착 반응 및 증폭 반응을 완료한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 단일 가닥이다.
일부 실시형태에서, 에멀션은 비드에 부착되지 않은 추가 제1 프라이머를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 에멀션은 핵산 폴리머라제를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 연장 반응은 등온 조건 하에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 증폭 반응은 등온 조건 하에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 에멀션으로부터 비드를 회수하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 핵산 분자의 증폭 산물 또는 이의 유도체를 어세이하여 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 시약 혼합물은 증폭 반응을 진행시키도록 허용하는 부착 반응 이전에 연장 반응을 수행하도록 더욱 구성된다. 일부 실시형태에서, 연장 반응은 제3 기간 동안 일어나고, 제3 기간은 에멀션이 인큐베이션되기 시작할 때 시작되어 증폭 반응이 개시될 때 종료된다. 일부 실시형태에서, 제3 기간은 제1 기간과 동시발생적으로 발생된다. 일부 실시형태에서, 제3 기간은 제2 기간 이전에 발생된다.
본 개시의 다른 양태는 핵산 분자에 부착되도록 구성된 지지체를 제조하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 다수의 지지체 및 다수의 연장 기를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 다수 지지체의 지지체는 제1 프라이머를 포함하고, 다수 연장 기의 연장 기는 연장 프라이머 분자를 포함하는 것인 단계; (b) 혼합물에 대해서 연장 기의 연장 프라이머에 지지체의 제1 프라이머를 부착시키기에 충분한 조건을 가하여, (i) 다수 연장 기와 회합되지 않은 비-연장된 지지체 및 (ii) 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 포획 실체와 회합된 연장된 지지체를 포함하는 최종 혼합물을 생성하는 단계로서, 연장된 지지체는 연장 프라이머 분자의 서열에 상보성인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 것인 단계; 및 (c) 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획시켜서 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 연장된 지지체로부터 연장 기를 해리하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 해리 단계는 용융을 포함한다. 일부 실시형태에서 방법은 핵산 분자를 제2 프라이머에 어닐링시켜 주형-부착된 지지체를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 주형-부착된 지지체를 파티션에 분할하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서 방법은 연장된 지지체에 핵산 분자의 다수의 증폭 산물을 고정화하기 위한 증폭 반응을 수행하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 지지체는 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지지체는 다수의 제1 프라이머를 포함하고, 다수의 제1 프라이머는 제1 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 비오틴을 포함하고 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 포획성 실체는 포획 서열에 대한 상보성 포획 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획 실체는 자성 입자를 포함하고 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함한다.
일부 실시형태에서, (a)에서 연장 기는 포획 실체를 포함한다.
일부 실시형태에서, (b)는 제1 프라이머를 사용한 연장 반응을 수행하여 포획 실체를 포함하는 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계는 (i) 포획성 실체 및 (ii) 2차 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 2차 포획 실체를 포함하는 포획성 기를 제공하는 단계; 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 연장된 지지체와 포획성 기를 회합시키는 단계; 및 2차 포획성 실체를 사용하여 2차 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 비오틴을 포함하고 2차 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 2차 포획성 실체는 포획 서열에 대한 상보성 포획 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 자성 입자를 포함하고 2차 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 2차 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획성 실체는 다수의 연장된 지지체를 포획하고, 다수의 연장된 지지체는 연장된 지지체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 연장된 지지체로부터 포획 기를 해리하는 단계를 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시는 핵산 분자에 부착되도록 구성된 지지체를 제조하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 다수의 비-연장된 지지체 및 다수의 연장된 지지체를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 다수의 비-연장된 지지체의 비-연장된 지지체는 프라이머 서열을 포함하지 않고 다수의 연장된 지지체의 연장된 지지체는 프라이머 서열을 포함하고, 프라이머 서열은 핵산 분자에 부착되도록 구성되는 것인 단계; (b) (i) 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 포획 실체 및 (ii) 연장된 지지체의 프라이머 서열 및 포획 기의 서열을 사용하여 포획 기와 연장된 지지체를 회합하기 위해 혼합물에 프라이머 서열을 부착시키도록 구성된 서열을 포함하는 포획 기를 제공하는 단계; 및 (c) 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 연장된 지지체로부터 포획 기를 해리하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 해리 단계는 용융을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계 이후에, 프라이머 서열에 핵산 분자를 부착시키는 포획성 실체를 사용하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 연장된 지지체는 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 비오틴을 포함하고 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 포획성 실체는 포획 서열에 상보성 포획 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 자성 입자를 포함하고 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시는 지지체를 제조하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 다수의 지지체 및 다수의 주형 핵산 분자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 다수 지지체의 지지체는 다수의 프라이머를 포함하고, 다수의 주형 핵산 분자의 주형 핵산 분자는 (i) 다수의 프라이머의 프라이머에 부착되도록 구성된 어댑터 및 (ii) 그에 커플링된 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 포획 실체를 포함하는 것인 단계; (b) 혼합물에 대해 주형 핵산 분자의 어댑터에 지지체의 프라이머를 부착시키기에 충분한 조건을 가하여, (i) 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않은 비-연장된 지지체 및 (ii) 주형 핵산 분자에 커플링된 포획 실체와 회합된 연장된 지지체를 포함하는 최종 혼합물을 생성하는 단계로서, 연장된 지지체는 주형 핵산 분자의 서열에 상보성인 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 연장된 지지체 상의 다수의 프라이머 중 적어도 50%는 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는 것인 단계; 및 (c) 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시는 지지체를 제조하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 다수의 지지체 및 다수의 주형 핵산 분자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 다수 지지체의 지지체는 다수의 프라이머를 포함하고, 다수의 주형 핵산 분자의 주형 핵산 분자는 다수의 프라이머의 프라이머에 부착되도록 구성된 어댑터를 포함하는 것인 단계; (b) 혼합물에 대해서 주형 핵산 분자의 어댑터에 지지체의 프라이머를 부착시키기에 충분한 조건을 가하여, (i) 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않은 비-연장된 지지체 및 (ii) 주형 핵산 분자에 커플링된 포획 실체와 회합된 연장된 지지체를 포함하는 최종 혼합물을 생성하는 단계로서, 포획 실체는 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성되고, 연장된 지지체는 주형 핵산 분자의 서열에 상보성인 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 연장된 지지체 상의 다수의 프라이머의 적어도 50%는 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는 것인 단계; (c) 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계; 및 (d) 다수의 연장된 지지체를 다수의 액적에 분할하는 단계로서, 다수의 연장된 지지체는 연장된 지지체를 포함하고, 다수의 액적의 액적은 연장된 지지체를 포함하는 것인 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 연장된 지지체 상의 다수의 프라이머의 적어도 80%는 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 연장된 지지체 상의 다수의 프라이머의 적어도 90%는 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 연장된 지지체 상의 다수의 프라이머의 적어도 95%는 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 연장된 지지체 상의 다수의 프라이머의 적어도 99%는 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 방법은 연장된 지지체로부터 주형 핵산 분자를 해리하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 해리 단계는 용융을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지지체는 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 비오틴을 포함하고 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 포획성 실체는 포획 서열에 대한 상보성 포획 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 자성 입자를 포함하고, 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계는 (i) 포획성 실체 및 (ii) 2차 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 2차 포획 실체를 포함하는 포획 기를 제공하는 단계; 포획성 실체를 사용하여 포획 실체를 포획하여 연장된 지지체와 포획성 기를 회합시키는 단계; 및 2차 포획성 실체를 사용하여 2차 포획 실체를 포획하여 최종 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 비오틴을 포함하고 2차 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 2차 포획성 실체는 포획 서열에 대한 상보성 포획 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획 실체는 자성 입자를 포함하고 2차 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 2차 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 포획성 실체는 다수의 연장된 지지체를 포획하고, 다수의 연장된 지지체는 연장된 지지체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 연장된 지지체로부터 포획 기를 해리하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, (a)에서 주형 핵산 분자는 포획 실체를 포함한다.
일부 실시형태에서, (b)는 프라이머를 사용한 연장 반응을 수행하여 포획 실체를 포함하는 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 액적은 다수의 연장된 지지체의 단일 연장된 지지체를 포함하고, 단일 연장된 지지체는 연장된 지지체이다. 일부 실시형태에서, 다수의 액적의 대부분의 점유 액적은 다수의 연장된 지지체의 단일 연장된 지지체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 액적은 비점유 액적을 포함하고, 비점유 액적은 다수의 연장된 지지체의 임의의 연장된 지지체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, (d)는 혼합물을 분할하는 단계를 포함하고, 혼합물은 다수의 연장된 지지체를 포함하고, 혼합물은 비-연장된 지지체에 비해서 더 많은 연장된 지지체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합물 중 실질적으로 모든 지지체가 연장된 지지체이다.
본 개시의 다른 양태는 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 통해서 실행 시, 상기 또는 본 명세서의 다른 곳의 임의 방법을 구현하는 기계 실행가능한 코드를 포함한 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.
본 개시의 다른 양태는 하나 이상의 컴퓨터 프로세서 및 그에 결합된 컴퓨터 메모리를 포함하느 시스템을 제공한다. 컴퓨터 메모리는 하나 이상의 컴퓨터 프로세서에 의해 실행 시, 상기 또는 본 명세서의 다른 곳의 임의의 방법을 구현하는 기계 실행가능한 코드를 포함한다.
본 개시의 추가 양태 및 장점은 오직 본 개시의 예시적인 실시형태가 표시되고 기술되는, 하기 상세한 설명을 통해서 당업자에게 쉽게 자명해 질 것이다. 인식하게 되는 바와 같이, 본 개시는 다른 상이한 실시형태가 가능하고 이의 몇몇 상세한 설명은 모두 본 개시를 벗어나지 않고, 다양한 분명한 측면에서 변형이 가능하다. 따라서, 도면 및 설명은 제한이 아니라, 본질적으로 예시로서 간주되어야 한다.
참조의 편입
본 명세서에서 언급되는 모든 공개물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물, 특허, 또는 특허 출원인 참조로 편입된다고 특별히 개별적으로 표시한 바와 같은 정도로 참조로 본 명세서에 편입된다. 참조로 편입된 공개물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시를 반박하는 정도까지, 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 자료를 대체하고/하거나 우선한다.
본 발명의 새로운 특징은 첨부된 청구항에서 구체적으로 기재된다. 본 발명의 특징 및 장점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리를 이용하는, 예시적인 실시형태를 기재하는 하기의 상세한 설명, 및 첨부된 그림 (여기서는 "도면" 및 "도"라고도 함)을 참조하여 얻게 될 것이다:
도 1은 포괄적 차세대 시퀀싱(NGS) 접근법의 개략도를 도시하고 유전 물질이 분석을 피할 수 있는 상황을 보여주고/주거나 작업 흐름에 존재할 수 있는 잠재적인 노이즈 공급원 및 돌연변이를 표시한다.
도 2 는 포괄적 NGS 접근법의 개략도를 도시하고 분석 작업흐름에 대한 변형이 수율(예를 들어, 분석된 생물학적 샘플로부터 획득된 정보량)을 증가시킬 수 있고 핵산 분석 동안 노이즈 및 돌연변이의 확률을 감소시킬 수 있는 상황을 보여준다.
도 3은 파티션의 단일-비드 (좌측 도표) 및 다중-비드 (우측 도표) 로딩의 비교를 도시한다. 도면에 도시된 바와 같이, 에멀션 중합효소 연쇄 반응(emPCR 또는 ePCR) 동안 액적(또는 다른 파티션 예컨대 웰)의 다중-비드 로딩은 ePCR 작업흐름에서 샘플 물질(예를 들어, 게놈 물질)의 손실을 유의하게 감소시킬 수 있어서, 단일-비드 로딩(좌측 도표)을 포함한 방법과 비교하여 서열 분석 동안 노이즈를 감소시키면서 시약의 개선된 정확성 및 활용성을 야기시킨다.
도 4는 핵산 분석 작업흐름 예컨대 코딩 및 역 상보성 가닥의 판독(예를 들어, 페어드-엔드 서열 리드 생성)에 추가 척도를 도입시켜 더욱 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 5a 및 5b는 액적 로딩, L액적, 및 스위프(F분할 = 50%, Fseq = 100%)에 대한 리드 페어링 결과를 도시한다.
도 6은 프로그램되거나 또는 아니면 본 명세서에 제공된 방법을 구현하도록 구성된 컴퓨터 제어 시스템을 도시한다.
도 7은 별개 어댑터 서열이 측접된 생물학적 샘플(핵산 분자 5)의 개략도를 도시한다. 어댑터 A는 프라이머 A(1-7) 및 프라이머 A'(703)을 포함하고 어댑터 B는 프라이머 B(4-7) 및 프라이머 B'(702)을 포함한다.
도 8은 2개 유형의 비드(806)의 개략도를 도시한다. 비드의 한 유형은 고정화된 프라이머 A(1-8) 또는 이의 단편 또는 부분을 포함한다. 비드의 한 유형은 고정화된 프라이머 B(4-8) 또는 이의 단편 또는 부분을 포함한다.
도 9는 각각 주형 로딩 및 시퀀싱을 위한 제1 및 제2 비드 세트를 포함한 작업흐름을 예시한다.
도 10a는 비드 및 주형 둘 모두에 대한 포아송 로딩에 의해 제한되는 ePCR 방법을 예시한다.
도 10b는 비드에 대한 포아송 로딩에 의해 제한되지만 포아송 분포에 비해 큰 주형 밀도를 획득한 ePCR 방법을 예시한다.
도 10c는 포아송 분포에 비해 큰 비드 밀도 및 주형 밀도를 획득한 ePCR 방법을 예시한다.
도 11은 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 12는 다클론 비드를 생성하는 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 13은 본 개시의 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 14는 다수의 주형을 갖는 본 개시의 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 15a, 도 15b, 및 도 15c는 본 개시의 ePCR 방법의 추가의 상세 설명을 예시한다.
도 16a 및 도 16b는 본 개시의 ePCR 방법의 추가 상세 설명을 예시한다.
도 17a, 도 17b, 도 17c, 및 도 17d는 개방 표면 상에서 수행된 본 개시의 방법을 예시한다.
도 18a 및 도 18b는 제2 프라이머가 표면에 부착된 본 개시의 실시형태를 예시한다.
도 18c, 도 18d 및 도 18e는 표면 상의 콜로니 위치 각각이 상이한 제1 프라이머를 갖는 본 개시의 일 실시형태를 예시한다.
도 19a, 도 19b, 도 19c, 및 도 19d는 제2의 느린 연장 단계를 포함하는 본 개시의 일 실시형태를 예시한다.
도 20은 주형 핵산 분자의 각 말단에 어댑터가 부착된 일례를 예시한다.
도 21은 연장된 지지체를 생성하는 일례를 예시한다.
도 22a-b는 자기력을 인가하여 용액으로부터 연장된 지지체를 분리하는 예들을 예시한다.
도 23은 자기력을 인가하여 용액으로부터 연장된 지지체를 분리하는 다른 예를 예시한다.
도 24a-b는 다수의 사전-농축된 지지체를 생성하기 위한 일례의 사전-농축 방법을 예시한다.
도 25는 사전-농축 과정을 사용한 증폭 결과를 도시한다.
도 26은 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 포획된 농축 비드의 존재를 도시한다.
도 27은 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 농축 비드 중 연장 프라이머 서열의 존재를 도시한다.
도 28은 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 증폭된 비드의 존재를 도시한다.
도 29는 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 증폭된 비드의 다클론성을 도시한다.
도 1은 포괄적 차세대 시퀀싱(NGS) 접근법의 개략도를 도시하고 유전 물질이 분석을 피할 수 있는 상황을 보여주고/주거나 작업 흐름에 존재할 수 있는 잠재적인 노이즈 공급원 및 돌연변이를 표시한다.
도 2 는 포괄적 NGS 접근법의 개략도를 도시하고 분석 작업흐름에 대한 변형이 수율(예를 들어, 분석된 생물학적 샘플로부터 획득된 정보량)을 증가시킬 수 있고 핵산 분석 동안 노이즈 및 돌연변이의 확률을 감소시킬 수 있는 상황을 보여준다.
도 3은 파티션의 단일-비드 (좌측 도표) 및 다중-비드 (우측 도표) 로딩의 비교를 도시한다. 도면에 도시된 바와 같이, 에멀션 중합효소 연쇄 반응(emPCR 또는 ePCR) 동안 액적(또는 다른 파티션 예컨대 웰)의 다중-비드 로딩은 ePCR 작업흐름에서 샘플 물질(예를 들어, 게놈 물질)의 손실을 유의하게 감소시킬 수 있어서, 단일-비드 로딩(좌측 도표)을 포함한 방법과 비교하여 서열 분석 동안 노이즈를 감소시키면서 시약의 개선된 정확성 및 활용성을 야기시킨다.
도 4는 핵산 분석 작업흐름 예컨대 코딩 및 역 상보성 가닥의 판독(예를 들어, 페어드-엔드 서열 리드 생성)에 추가 척도를 도입시켜 더욱 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 5a 및 5b는 액적 로딩, L액적, 및 스위프(F분할 = 50%, Fseq = 100%)에 대한 리드 페어링 결과를 도시한다.
도 6은 프로그램되거나 또는 아니면 본 명세서에 제공된 방법을 구현하도록 구성된 컴퓨터 제어 시스템을 도시한다.
도 7은 별개 어댑터 서열이 측접된 생물학적 샘플(핵산 분자 5)의 개략도를 도시한다. 어댑터 A는 프라이머 A(1-7) 및 프라이머 A'(703)을 포함하고 어댑터 B는 프라이머 B(4-7) 및 프라이머 B'(702)을 포함한다.
도 8은 2개 유형의 비드(806)의 개략도를 도시한다. 비드의 한 유형은 고정화된 프라이머 A(1-8) 또는 이의 단편 또는 부분을 포함한다. 비드의 한 유형은 고정화된 프라이머 B(4-8) 또는 이의 단편 또는 부분을 포함한다.
도 9는 각각 주형 로딩 및 시퀀싱을 위한 제1 및 제2 비드 세트를 포함한 작업흐름을 예시한다.
도 10a는 비드 및 주형 둘 모두에 대한 포아송 로딩에 의해 제한되는 ePCR 방법을 예시한다.
도 10b는 비드에 대한 포아송 로딩에 의해 제한되지만 포아송 분포에 비해 큰 주형 밀도를 획득한 ePCR 방법을 예시한다.
도 10c는 포아송 분포에 비해 큰 비드 밀도 및 주형 밀도를 획득한 ePCR 방법을 예시한다.
도 11은 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 12는 다클론 비드를 생성하는 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 13은 본 개시의 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 14는 다수의 주형을 갖는 본 개시의 일례의 ePCR 방법을 예시한다.
도 15a, 도 15b, 및 도 15c는 본 개시의 ePCR 방법의 추가의 상세 설명을 예시한다.
도 16a 및 도 16b는 본 개시의 ePCR 방법의 추가 상세 설명을 예시한다.
도 17a, 도 17b, 도 17c, 및 도 17d는 개방 표면 상에서 수행된 본 개시의 방법을 예시한다.
도 18a 및 도 18b는 제2 프라이머가 표면에 부착된 본 개시의 실시형태를 예시한다.
도 18c, 도 18d 및 도 18e는 표면 상의 콜로니 위치 각각이 상이한 제1 프라이머를 갖는 본 개시의 일 실시형태를 예시한다.
도 19a, 도 19b, 도 19c, 및 도 19d는 제2의 느린 연장 단계를 포함하는 본 개시의 일 실시형태를 예시한다.
도 20은 주형 핵산 분자의 각 말단에 어댑터가 부착된 일례를 예시한다.
도 21은 연장된 지지체를 생성하는 일례를 예시한다.
도 22a-b는 자기력을 인가하여 용액으로부터 연장된 지지체를 분리하는 예들을 예시한다.
도 23은 자기력을 인가하여 용액으로부터 연장된 지지체를 분리하는 다른 예를 예시한다.
도 24a-b는 다수의 사전-농축된 지지체를 생성하기 위한 일례의 사전-농축 방법을 예시한다.
도 25는 사전-농축 과정을 사용한 증폭 결과를 도시한다.
도 26은 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 포획된 농축 비드의 존재를 도시한다.
도 27은 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 농축 비드 중 연장 프라이머 서열의 존재를 도시한다.
도 28은 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 증폭된 비드의 존재를 도시한다.
도 29는 상이한 연장 프라이머 투입 농도에서, 증폭된 비드의 다클론성을 도시한다.
본 발명의 다양한 실시형태가 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시형태는 오직 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 수많은 변동, 변화, 및 대체가 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 당업자에게 일어날 수 있다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
값이 범위로 기술되는 경우에, 이러한 개시는 특정 수치값 또는 특정 하위 범위가 명확하게 명시되었는지 여부와 무관하게 이러한 범위 내에 속하는 특별한 수치값뿐만 아니라 이러한 범위 내 모든 가능한 하위 범위의 개시를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특정 값부터, 및/또는 "약" 다른 특정값까지로서 표시될 수 있다. 용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로 소정 값 또는 값의 범위에 대한 허용가능한 오차 또는 변동 정도, 예컨대, 예를 들어, 소정 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내의 오차 또는 변동 정도를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증폭"은 일반적으로 연장 산물(예를 들어, 핵산 분자에 대한 프라이머 연장 반응의 산물)의 하나 이상의 카피의 생산을 의미한다. 핵산 분자의 증폭은 핵산 분자에 혼성화된 단일 가닥, 또는 핵산 분자의 다수 카피 또는 이의 상보체를 산출할 수 있다. 앰플리콘은 출발 주형 핵산 분자로부터 증폭 절차를 통해서 생성되는 단일-가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자일 수 있다. 앰플리콘은 핵산 가닥을 포함할 수 있고, 이의 적어도 일부분은 출발 주형의 적어도 일부분과 실질적으로 동일할 수 있거나 또는 실질적으로 상보성일 수 있다. 출발 주형이 이중 가닥 핵산 분자인 경우에, 앰플리콘은 한 가닥의 적어도 일부분과 실질적으로 동일하고 다른 가닥의 적어도 한 부분과 실질적으로 상보성인 핵산 가닥을 포함할 수 있다. 앰플리콘은 초기 주형이 단일-가닥 또는 이중 가닥인지 여부와 무관하게 단일-가닥일 수 있거나 또는 이중 가닥일 수 있다. 증폭 반응은 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예컨대 에멀션 중합효소 연쇄 반응(ePCR; 예를 들어, 미세반응기 예컨대 웰 또는 액적 내에서 수행되는 PCR)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변성"은 일반적으로 단일-가닥 분자로 이중 가닥 분자(예를 들어, DNA)의 분리를 의미한다. 변성은 완전 또는 부분 변성일 수 있다. 부분 변성에서, 단일-가닥 영역은 DNA에서 이중 가닥 영역이 측접된 2개 데옥시리보핵산(DNA) 가닥의 변성에 의해 이중 가닥 분자에서 형성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "클론"은 일반적으로 이의 구성원의 실질적인 부분(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과)이 실질적으로 동일한 서열을 갖는 핵산 개체군을 의미한다. 핵산 분자의 클론 개체군의 구성원은 서로 서열 상동성을 가질 수 있다. 일부 예에서, 이러한 구성원은 주형 핵산 분자와 서열 상동성을 가질 수 있다. 일부 예에서, 이러한 구성원은 주형 핵산 분자의 상보체(단일 가닥인 경우)와 서열 상동성을 가질 수 있다. 클론 개체군의 구성원은 이중 가닥일 수 있거나 또는 단일 가닥일 수 있다. 개체군의 구성원은 100% 동일하지 않거나 또는 상보성이지 않을 수 있는데 예를 들어, "오류"가 합성 과정 동안 발생될 수 있어서 소정 개체군 중 소수가 대부분의 개체군과 서열 상동성을 갖지 않을 수 있기 때문이다. 예를 들어, 개체군의 구성원의 적어도 50%는 서로 또는 기준 핵산 분자(즉, 서열 비교를 위해 기준으로서 사용되는 정의된 서열의 분자)와 실질적으로 동일할 수 있다. 개체군의 구성원의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 이상은 기준 핵산 분자와 실질적으로 동일할 수 있다. 2개 분자는 2개 분자 간 동일성 백분율이 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 이상이면 실질적으로 동일(또는 상동성)한 것으로 간주될 수 있다. 2개 분자는 2개 분자 간 상보성 백분율이 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 이상이면 실질적으로 상보성인 것으로 간주될 수 있다. 낮거나 또는 비실질적인 수준의 비상동성 핵산의 혼합이 발생될 수 있으므로, 따라서, 클론 개체군은 소수의 다양한 핵산(예를 들어, 30% 미만, 예를 들어, 10% 미만)을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보성 서열"은 다른 서열과 혼성화하거나 또는 이러한 다른 서열과 서열 상보성을 갖는 서열을 의미한다. 2개 단일-가닥 핵산 분자 간 혼성화는 일정 조건 하에서 안정한 이중 가닥 구조의 형성을 포함할 수 있다. 2개 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 그들이 2 이상의 순차적으로 인접한 염기의 쌍형성을 통해서 결합되면 혼성화된 것으로 간주될 수 있다. 이중 가닥 구조 중 한 가닥에서 실질적인 비율의 뉴클레오티드는 다른 가닥의 뉴클레오시드와 왓슨-크릭 염기-쌍형성을 겪을 수 있다. 혼성화는 또한 이러한 쌍형성이 수소 결합의 형성을 포함하는지 여부와 무관하게, 프로브의 축퇴성을 감소시키기 위해 적용할 수 있는, 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 데옥시이노신, 2-아미노푸린 염기를 갖는 뉴클레오시드 등의 쌍형성을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중합 효소"는 일반적으로 중합 반응을 촉매하는 물질을 의미한다. 중합 효소는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입에 의해 주형 가닥과 쌍형성된 핵산 프라이머를 연장시키는데 사용될 수 있다. 중합 효소는 포스포디에스테르 결합의 생성을 통해서 한번에 하나씩 주형 가닥에 부응하는 새로운 뉴클레오티드를 첨가하여, 존재하는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 연장시킴으로써 DNA의 새로운 가닥을 첨가할 수 있다. 중합 효소는 폴리머라제 예컨대 핵산 폴리머라제일 수 있다. 폴리머라제는 천연 발생될 수 있거나 또는 합성될 수 있다. 폴리머라제는 상대적으로 높은 진행성, 즉 핵산 주형을 방출하지 않고 핵산 주형으로 뉴클레오티드를 연속하여 도입하는 폴리머라제의 능력을 가질 수 있다. 중합 효소는 전사효소일 수 있다. 폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 열안정성 폴리머라제, 야생형 폴리머라제, 변형 폴리머라제, 이. 콜라이(E. coli) DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제, 029 (phi29) DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, VENT 폴리머라제, DEEPVENT 폴리머라제, EXTaq 폴리머라제, LA-Taq 폴리머라제, Sso 폴리머라제, Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제, ES4 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tea 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, 플래티늄 Taq 폴리머라제, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Pfutubo 폴리머라제, Pyrobest 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, 클레노우 단편, 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제, 및 이의 변이체, 변형된 산물 및 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리머라제는 단일 서브유닛 폴리머라제일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "용융 온도" 또는 "용융점"은 일반적으로 샘플 내 핵산 분자의 가닥의 적어도 일부분이 상보성 가닥의 적어도 일부분으로부터 분리되는 온도를 의미한다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산 분자가 부분적으로 또는 완전히 변성된 온도일 수 있다. 용융 온도는 소정 핵산 분자의 다수 서열 중 서열의 온도, 또는 다수 서열의 온도를 의미할 수 있다. 이중 가닥 핵산 분자의 상이한 영역은 상이한 용융 온도를 가질 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 핵산 분자는 제1 용융점을 갖는 제1 영역 및 제1 용융점에 비해 높은 제2 용융점을 갖는 제2 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 이중 가닥 핵산 분자의 상이한 영역은 상이한 온도에서 용융(예를 들어, 부분적으로 변성)될 수 있다. 핵산 분자 또는 이의 영역(예를 들어, 핵산 서열)의 용융점은(예를 들어, 용융 분석 또는 다른 절차를 통해) 실험적으로 결정될 수 있거나 또는 핵산 분자의 서열 및 길이를 기반으로 추정될 수 있다. 예를 들어, 소프트웨어 프로그램 예컨대 MELTING은 핵산 서열에 대한 용융 온도를 추정하는데 사용될 수 있다(Dumousseau M, Rodriguez N, Juty N, Le Novere N, MELTING, a flexible platform to predict the melting temperatures of nucleic acids. BMC Bioinformatics. 2012 May 16;13:101. doi: 10.1186/1471-2105-13-101). 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 용융점은 추정 용융점일 수 있다. 핵산 서열의 진짜 용융점은 관심 핵산 서열에 인접한 서열 또는 이의 결여를 비롯하여 다른 인자들을 기반으로 가변적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 염기(예를 들어, 핵염기), 당 모이어티, 및 포스페이트 모이어티를 포함하는 물질을 의미한다. 뉴클레오티드는 부착된 포스페이트 기를 갖는 유리 염기를 포함할 수 있다. 3개의 부착된 포스페이트 기를 포함한 물질은 뉴클레오시드 트리포스페이트라고 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드가 성장하는 핵산 분자 가닥에 첨가될 때, 성장하는 사슬에 대한 뉴클레오티드의 근위 포스페이트 간 포스포디에스테르 결합의 형성은 파이로포스페이트로서 2개 원위 포스페이트의 방출과 함께 고-에너지 포스페이트 결합의 가수분해를 수반할 수 있다. 뉴클레오티드는 천연 발생일 수 있거나 또는 비천연 발생(예를 들어, 변형 또는 조작 뉴클레오티드)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 천연 발생 뉴클레오티드일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 뉴클레오티드 유사체는 표준 뉴클레오티드 예컨대 아데닌- (A), 티민- (T), 시토신- (C), 우라실- (U), 또는 구아닌- (G) 포함 뉴클레오티드로부터 유래될 수 있고/있거나 그와 구조적 유사성을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 천연 뉴클레오티드에 비해서 하나 이상의 차이 또는 변형을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 예는 이노신, 디아미노푸린, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 데아자잔틴, 데아자구아닌, 이소시토신, 이소구아닌, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실큐오신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-D46-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 큐오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노푸린, 에티닐 뉴클레오티드 염기, 1-프로피닐 뉴클레오티드 염기, 아지도 뉴클레오티드 염기, 포스포로셀레노에이트 핵산, 및 이의 변형된 형태 (예를 들어, 산화, 환원, 및/또는 치환기 예컨대 알킬, 히드록시알킬, 히드록실, 또는 할로겐 모이어티의 첨가에 의함)를 포함한다. 핵산 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 핵산 분자, 단일-가닥 핵산 분자, 프라이머, 어댑터 등)는 염기 모이어티(예를 들어, 전형적으로 상보성 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 원자 및/또는 전형적으로 상보성 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 없는 하나 이상의 원자에서), 당 모이어티, 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드는 트리포스페이트 모이어티에 대한 변형을 포함하여, 이의 포스페이트 모이어티에 변형을 포함할 수 있다. 추가로, 변형의 비제한적인 예는 보다 긴 길이의 포스페이트 사슬(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 포스페이트 모이어티를 갖는 포스페이트 사슬), 티올 모이어티에 의한 변형(예를 들어, 알파-티오 트리포스페이트 및 베타-티오트리포스페이트), 및 셀레늄 모이어티에 의한 변형(예를 들어, 포스포로셀레노에이트 핵산)을 포함한다. 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 리보스, 데옥시리보스, 및 이의 변형된 형태(예를 들어, 산화, 환원, 및/또는 치환기 예컨대 알킬, 히드록시알킬, 히드록실, 또는 할로겐 모이어티의 첨가에 의함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 당을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 변형된 링커 모이어티(예를 들어,포스페이트 모이어티 대신)를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 아민 반응성 모이어티, 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS)의 공유 부착을 허용하도록 아민-변형기, 예컨대 아미노알릴-dUTP(aa-dUTP) 및 아미노헥실아크릴아미드-dCTP(aha-dCTP)을 함유할 수 있다. 본 개시의 올리고뉴클레오티드에서 표준 DNA 염기쌍 또는 RNA 염기쌍에 대한 대안은 예를 들어, 입방 mm당 비트의 더 높은 밀도, 더 높은 안전성(천연 독성의 우발적이거나 또는 의도적인 합성에 대한 내성), 광-프로그램된 폴리머라제의 보다 용이한 구별, 및/또는 저급 2차 구조를 제공할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드 검출을 위해 검출가능한 모이어티와 반응할 수 있거나 또는 결합할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지지체" 또는 "기재"는 일반적으로 시약 예컨대 핵산 분자가 고정화될 수 있는 임의의 고형 또는 반-고형 물품을 지칭한다. 핵산 분자는 합성될 수 있거나, 부착될 수 있거나, 결찰될 수 있거나, 또는 아니면 고정화될 수 있다. 핵산 분자는 제한없이, 물리적 흡착, 이온 또는 공유 결합 형성, 또는 이의 조합을 포함한 임의의 방법을 통해서 기재 상에 고정화될 수 있다. 기재는 2-차원(예를 들어, 평면 2D 기재) 또는 3-차원일 수 있다. 일부 경우에, 기재는 플로우 셀의 성분일 수 있고/있거나 시퀀싱 장비에 의해 수신되도록 개조될 수 있거나 또는 그 안에 포함될 수 있다. 기재는 중합체, 유리, 또는 금속성 물질을 포함할 수 있다. 기재의 예는 막, 평면 기재, 마이크로타이터 플레이트, 비드(예를 들어, 자성 비드), 필터, 시험 스트립, 슬라이드, 커버 슬립, 및 시험 튜브를 포함한다. 기재는 유기 중합체 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시, 및 폴리아크릴아미드(예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔)를 비롯하여, 이의 공중합체 및 그라프트를 포함할 수 있다. 기재는 라텍스 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 기재는 또한 무기, 예컨대 유리, 실리카, 금, 제어-기공-유리(controlled-pore-glass)(CPG), 또는 역상 실리카일 수 있다. 지지체의 구성은 예를 들어, 비드, 구체, 입자, 과립, 겔, 다공성 매트릭스, 또는 기재의 형태일 수 있다. 일부 경우에, 기재는 단일 고형 또는 반-고형 물품(예를 들어, 단일 입자)일 수 있는 한편, 다른 경우에 기재는 다수의 고형 또는 반-고형 물품(예를 들어, 입자의 수집물)을 포함할 수 있다. 기재는 평면, 실질적인 평면, 또는 비-평면일 수 있다. 기재는 다공성 또는 비다공성일 수 있고, 팽윤 또는 비-팽윤 특징을 가질 수 있다. 기재는 하나 이상의 웰, 오목부, 또는 다른 컨테이너, 용기, 피처, 또는 위치를 포함하도록 성형될 수 있다. 다수의 기재는 다양한 위치에서 어레이로 구성될 수 있다. 기재는 주소지정 가능할 수 있거나 (예를 들어, 시약의 로봇식 전달을 위함), 또는 검출 접근법, 예컨대 레이저 조사 및 공초점 또는 편향광 수집에 의한 스캐닝일 수 있다. 예를 들어, 기재는 검출기와 광학적 및/또는 물리적 통신을 할 수 있다. 대안적으로, 기재는 일정 거리에 의해 검출기로부터 물리적으로 분리될 수 있다. 증폭 기재(예를 들어, 비드)는 다른 기재 내에 또는 그 위에 (예를 들어, 제2 지지체의 웰 내에) 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표지"는 일반적으로 종, 예컨대, 예를 들어, 뉴클레오티드 유사체와 커플링될 수 있는 모이어티를 지칭한다. 표지는 친화성 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표지는 검출할 수 있는 신호를 방출하는 (또는 이미 방출된 신호를 감소시키는) 검출가능한 표지일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 신호는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입을 의미할 수 있다. 일부 경우에, 표지는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 커플링될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 프라이머 연장 반응에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 표지는 프라이머 연장 반응 이후에 뉴클레오티드 유사체에 커플링될 수 있다. 표지는, 일부 경우에, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 특이적으로 반응성일 수 있다. 커플링은 공유 또는 비공유(예를 들어, 이온성 상호작용, 반 데르 발스 힘 등)일 수 있다. 일부 경우에, 커플링은 절단성, 예컨대 광-절단성(예를 들어, 자외선 하에서 절단가능), 화학적-절단성 (예를 들어, 환원제, 예컨대 디티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(히드록시프로필)포스핀(THP)에 의함) 또는 효소적 절단성(예를 들어, 에스터라제, 리파제, 펩티다제, 또는 프로테아제를 통함)일 수 있는 링커를 통할 수 있다. 일부 경우에, 표지는 발광성일 수 있는데; 다시 말해서, 형광성 또는 인광성일 수 있다. 표지는 소광제 분자일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "소광제"는 방출된 신호를 감소시킬 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 주형 핵산 분자는 검출가능한 신호를 방출하도록 디자인될 수 있다. 소광제를 포함하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입은 신호를 감소 또는 제거시킬 수 있고, 이러한 감소 또는 제거를 검출한다. 일부 경우에, 본 명세서에의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 소광제에 의한 표지화는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 도입 이후에 발생될 수 있다. 염료 및 표지는 핵산 서열로 도입될 수 있다. 염료 및 표지는 또한 링커, 예컨대 하나 이상의 비드를 다른 것에 연결하는 링커로 도입될 수 있다. 염료의 비제한적인 예는 SYBR 그린, SYBR 블루, DAPI, 프로피듐 아이오딘, 획스트, SYBR 골드, 에티듐 브로마이드, 아크리딘, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리플라빈, 플루오르쿠마린, 엘립티신, 다우노마이신, 클로로퀸, 디스타마이신 D, 크로모마이신, 호미듐, 미트라마이신, 루테늄 폴리피리딜, 안트라마이신, 펜안트리딘 및 아크리딘, 에티듐 브로마이드, 프로피듐 아이오다이드, 헥시듐 아이오다이드, 디히드로에티듐, 에티듐 동종이량체-1 및 -2, 에티듐 모노아지드, 및 ACMA, 획스트 33258, 획스트 33342, 획스트 34580, DAPI, 아크리딘 오렌지, 7-AAD, 악티노마이신 D, LDS751, 히드록시스틸바미딘, SYTOX 블루, SYTOX 그린, SYTOX 오렌지, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO-3, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, SYBR 골드, SYBR 그린 I, SYBR 그린 II, SYBR DX, SYTO-40, SYTO-41, SYTO-42, SYTO-43, SYTO-44, SYTO-45 (파란색), SYTO-13, SYTO-16, SYTO-24, SYTO-21, SYTO-23, SYTO-12, SYTO-11, SYTO-20, SYTO-22, SYTO-15, SYTO-14, SYTO-25 (녹색), SYTO-81, SYTO-80, SYTO-82, SYTO-83, SYTO-84, SYTO-85 (오렌지), SYTO-64, SYTO-17, SYTO-59, SYTO-61, SYTO-62, SYTO-60, SYTO-63 (적색), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 로다민, 테트라메틸 로다민, R-파이코에리쓰린, Cy-2, Cy-3, Cy-3.5, Cy-5, Cy5.5, Cy-7, 텍사스 레드, Phar-Red, 알로파이코시아닌 (APC), SYBR 그린 I, SYBR 그린 II, SYBR 골드, CellTracker Green, 7-AAD, 에티듐 동종이량체 I, 에티듐 동종이량체 II, 에티듐 동종이량체 III, 에티듐 브로마이드, 엄벨리페론, 에오신, 녹색 형광 단백질, 에리쓰로신, 쿠마린, 메틸 쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스캐이드 블루, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 형광성 란타니드 착체 예컨대 유로퓸 및 테르븀을 포함한 것들, 카르복시 테트라클로로 플루오레세인, 5 및/또는 6-카르복시 플루오레세인 (FAM), VIC, 5- (또는 6-) 아이오도아세타미도플루오레세인, 5-{[2(및 3)-5-(아세틸머캅토)-숙시닐]아미노} 플루오레세인 (SAMSA-플루오레세인), 리싸민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 5 및/또는 6 카르복시 로다민 (ROX), 7-아미노-메틸-쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산 (AMCA), BODIPY 형광단, 8-메톡시피렌-1,3,6-트리술폰산 3나트륨 염, 3,6-디술포네이트-4-아미노-나프탈리미드, 파이코빌리단백질, AlexaFluor 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750, 및 790 염료, DyLight 350, 405, 488, 550, 594, 633, 650, 680, 755, 및 800 염료, 또는 다른 형광단, 블랙 홀 소광제 염료 (Biosearch Technologies) 예컨대 BH1-0, BHQ-1, BHQ-3, BHQ-10); QSY Dye 형광 소광제 (Molecular Probes/Invitrogen) 예컨대 QSY7, QSY9, QSY21, QSY35, 및 다른 소광제 예컨대 Dabcyl 및 Dabsyl; Cy5Q 및 Cy7Q 및 다크 시아닌 염료 (GE Healthcare); Dy-소광제 (Dyomics), 예컨대 DYQ-660 및 DYQ-661; 및 ATTO 형광 소광제 (ATTO-TEC GmbH), 예컨대 ATTO 540Q, 580Q, 612Q를 포함한다. 일부 경우에, 표지는 자가-소광하지 않거나 또는 근위 소광을 나타내지 않는 유형일 수 있다. 자가-소광하지 않거나 또는 근위 소광을 나타내지 않는 표지 유형의 비제한적인 예는 비만 유도체 예컨대 모노브로모비만을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "근위 소광"은 일반적으로 그들이 개별적으로 나타내는 형광과 비교하여 서로 가까운 하나 이상의 염료가 더 낮은 형광을 나타낼 수 있는 현상을 의미한다. 일부 경우에, 염료는 근위 소광을 겪을 수 있고 여기서 도너 염료 및 억셉터 염료는 서로 1 nm 내지 50 nm 이내이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "검출기"는 일반적으로 신호, 예컨대 도입된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 또는 부재를 의미하는 신호를 검출할 수 있는 장치를 지칭한다. 검출기는 신호를 검출할 수 있는 광학 및/또는 전자 성분을 포함할 수 있다. 검출기를 포함하는 검출 방법의 비제한적인 예는 제한없이 광학 검출, 분광 검출, 정전기 검출, 및 전기화학 검출을 포함한다. 광학 검출 방법은 제한없이, 형광측정, UV-vis 광 흡광을 포함한다. 분광 검출 방법은 제한없이 질량 분광법, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법, 및 적외선 분광법을 포함한다. 정전기 검출 방법은 제한없이, 겔 기반 기술, 예컨대, 예를 들어, 겔 전기영동을 포함한다. 전기화학 검출 방법은 제한없이, 증폭된 산물의 전기화학 검출을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시퀀싱"은 일반적으로 생물학적 분자, 예컨대 핵산 분자의 서열을 생성 또는 확인하기 위한 과정을 지칭한다. 이러한 서열은 핵산 염기(예를 들어, 핵염기)의 서열을 포함할 수 있는, 핵산 서열일 수 있다. 시퀀싱은 예를 들어, 단일 분자 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 혼성화에 의한 시퀀싱, 또는 결찰에 의한 시퀀싱일 수 있다. 시퀀싱은 지지체, 예컨대 플로우 셀 또는 하나 이상의 비드 상에 고정화된 주형 핵산 분자를 사용하여 수행될 수 있다. 시퀀싱 어세이는 하나 이상의 주형 핵산 분자에 상응하는 하나 이상의 시퀀싱 리드를 산출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리드"는 일반적으로 핵산 서열, 예컨대 시퀀싱 리드를 지칭한다. 시퀀싱 리드는 핵산 시퀀싱 어세이를 통해 수득된 염기쌍 또는 핵산 염기(예를 들어, 뉴클레오티드)의 추론 서열일 수 있다. 시퀀싱 리드는 핵산 시퀀싱기, 예컨대 대량 병렬 어레이 시퀀싱기(예를 들어, Illumina 또는 Pacific Biosciences of California)에 의해 생성될 수 있다. 시퀀싱 리드는 대상체의 게놈의 일부분, 또는 일부 경우에 전부에 상응할 수 있다. 시퀀싱 리드는 대상체의 게놈의 서열을 산출하기 위해서, 예를 들어, 정렬(예를 들어, 기준 게놈에 대함)을 통해서 조합될 수 있는 시퀀싱 리드의 수집물의 일부분일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 일반적으로 생물학적 샘플(예를 들어, 처리 또는 분석을 겪고 있거나 또는 겪게될 생물학적 샘플)이 유래될 수 있는 개체 또는 실체를 지칭한다. 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물 또는 비-포유동물) 또는 식물일 수 있다. 대상체는 인간, 개, 고양이, 말, 돼지, 새, 비-인간 영장류, 원숭이, 농장 동물, 반려 동물, 스포츠 동물, 또는 설치류일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 질환 또는 장애, 예컨대 암(유방암, 직결장암, 뇌암, 백혈병, 폐암, 피부암, 간암, 췌장암, 림프종, 식도암 또는 자궁경부암) 또는 감염성 질환을 가질 수 있거나 또는 가질 것으로 의심될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 대상체는 이전에 질환 또는 장애를 앓았던 적이 있는 것으로 알려질 수 있다. 대상체는 유전 장애 예컨대 연골무형성증, 알파-1 안티트립신 결핍증, 항인지질 증후군, 자폐증, 상염색체 우성 다낭성 신장 질환, 샤르코-마리-투쓰, 크리 뒤 샤, 크론병, 낭성 섬유증, 더컴병, 다운 증후군, 두안 증후군, 뒤센 근이영양증, 인자 V 라이덴 혈전성향증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 지중해열, 취약 x 증후군, 고셔 질환, 혈색소증, 혈우병, 전전뇌증, 헌팅톤병, 크라인펠터 증후군, 마르판 증후군, 근긴장성 이영양증, 신경섬유종증, 누난 증후군, 골형성 부전증, 파킨슨병, 페닐케톤뇨증, 폴란드 기형, 포르피린증, 조로증, 망막 색소 변성증, 중증 복합 면역결핍증, 겸상 세포 질환, 척추성 근위축증, 타이-삭스, 탈라세미아, 트리메틸아민뇨증, 터너 증후군, 구개심장안면증후군, WAGR 증후군, 또는 윌슨 질환을 가질 수 있거나 또는 가질 것으로 의심될 수 있다. 대상체는 질환 또는 장애에 대한 치료를 겪을 수 있다. 대상체는 소정 질환 또는 장애의 증상성일 수 있거나 또는 무증상일 수 있다. 대상체는 건강할 수 있다 (예를 들어, 질환 또는 장애를 가질 것으로 의심되지 않음). 대상체는 소정 질환에 대한 하나 이상의 위험 인자를 가질 수 있다. 대상체는 소정 체중, 신장, 체질량 지수 또는 다른 신체 특징을 가질 수 있다. 대상체는 소정 민족적 또는 인종적 유산, 국적, 질환 또는 관해 상태, 가족 병력, 또는 다른 특징을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 일반적으로 대상체로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 직접적으로 또는 간접적으로 수득될 수 있다. 샘플은 제한없이, 침뱉기, 면봉채취, 채혈, 생검, 배설물(예를 들어, 소변, 대변, 객담, 토사물, 또는 타액) 수득, 절제, 스크래핑, 및 천공을 포함한, 임의의 적합한 방법을 통해서 대상체로부터 수득될 수 있다. 샘플은 대상체로부터, 예를 들어, 정맥내로 또는 동맥내로, 순환 시스템에 접근하거나, 분비된 생물학적 샘플(예를 들어, 대변, 소변, 타액, 객담 등)을 수집하거나, 호흡하거나, 또는 외과적으로 조직을 추출(예를 들어, 생검)하여, 수득할 수 있다. 샘플은 제한없이 피부 또는 자구경부의 스크래핑, 볼의 면봉 채취, 또는 타액, 소변, 대변, 생리 분비물, 눈물, 또는 정액의 수집을 포함한 비침습적 방법으로 수득될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 침습적 절차 예컨대 생검, 세침 흡인, 또는 사혈을 통해 수득될 수 있다. 샘플은 체액 예컨대, 제한없이, 혈액 (예를 들어, 전혈, 적혈 세포, 백혈구 또는 백혈 세포, 혈소판), 혈장, 혈청, 땀, 눈물, 타액, 객담, 소변, 정액, 점액, 활액, 모유, 초유, 양수, 담즙, 골수, 간질 또는 세포외 유체 또는 뇌척수액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 혈액 및/또는 혈장을 포함하는 체액을 수득하기 위해 천자법을 통해 수득될 수 있다. 이러한 샘플은 세포 및 세포-무함유 핵산 물질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 샘플은 제한없이, 혈액, 땀, 모낭, 구강 조직, 눈물, 생리 분비물, 대변, 또는 타액을 포함한 임의의 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 조직 샘플, 예컨대 조직 생검일 수 있다. 샘플은 제한없이, 피부, 심장, 폐, 신장, 유 방, 췌장, 간, 장, 뇌, 전립선, 식도, 근육, 평활근, 방광, 담낭, 결장 또는 갑상선을 포함한 본 명세서에 제공되는 임의 조직으로부터 수득될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 수득 방법은 세침 흡인, 중심부 바늘 생검, 진공 보조 생검, 대심 생검, 절개 생검, 절제 생검, 펀치 생검, 면도 생검 또는 피부 생검을 포함한 생검 방법을 포함한다. 생물학적 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 하나 이상의 핵산 분자 예컨대 하나 이상의 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA) 분자 (예를 들어, 세포 내에 포함되거나 또는 세포 내에 포함되지 않음)를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 세포 내에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 핵산 분자는 세포 내에 포함되지 않을 수 있다 (예를 들어, 세포-무함유 핵산 분자). 생물학적 샘플은 세포-무함유 샘플일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "세포-무함유 샘플"은 일반적으로 실질적으로 세포를 함유하지 않는 샘플(예를 들어, 부피 기준으로 10% 미만의 세포)을 지칭한다. 세포-무함유 샘플은 임의 공급원으로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술됨). 예를 들어, 세포-무함유 샘플은 혈액, 땀, 소변, 또는 타액으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포-무함유 샘플은 조직 또는 체액으로부터 유래될 수 있다. 세포-무함유 샘플은 다수의 조직 또는 체액으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 제1 조직 또는 유체 유래 샘플은 (예를 들어, 샘플이 수득되는 동안 또는 샘플을 수득한 이후에) 제2 조직 또는 유체 유래 샘플과 조합될 수 있다. 일례에서, 제1 유체 및 제2 유체는 (예를 들어, 동시에 또는 상이한 시점에) 대상체로부터 수집될 수 있고 제1 및 제2 유체는 조합되어 샘플을 제공할 수 있다. 세포-무함유 샘플은 하나 이상의 핵산 분자 예컨대 하나 이상의 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다.
세포-무함유 샘플이 아닌 샘플(예를 들어, 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플)은 처리되어 세포-무함유 샘플을 제공할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 비롯하여 세포에 포함되지 않은 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA 분자) (예를 들어, 세포-무함유 핵산 분자)는 대상체로부터 수득될 수 있다. 샘플에 대해서 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은) 처리를 수행하여 세포 및 세포 내에 포함되지 않은 핵산 분자 유래 다른 물질을 분리시켜서, 세포-무함유 샘플 (예를 들어, 세포 내에 포함되지 않은 핵산 분자 포함)을 제공할 수 있다. 다음으로 세포-무함유 샘플에 대해서 (예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은) 추가 분석 및 처리를 수행할 수 있다. 세포 내에 포함되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 세포-무함유 핵산 분자)는 세포 및 조직으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포-무함유 핵산 분자는 (예를 들어, 신체 조직의) 종양 조직 또는 분해된 세포로부터 유래될 수 있다. 세포-무함유 핵산 분자는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 임의 유형의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 세포-무함유 핵산 분자는 이중 가닥, 단일-가닥, 또는 이의 조합일 수 있다. 세포-무함유 핵산 분자는 분비 또는 세포 사멸 과정, 예를 들어, 세포 괴사, 아폽토시스 등을 통해서 체액으로 방출될 수 있다. 세포-무함유 핵산 분자는 암 세포로부터 체액으로 방출될 수 있다 (예를 들어, 순환 종양 DNA (ctDNA)). 세포 무함유 핵산 분자는 또한 모계 혈류에서 자유롭게 순환하는 태아 DNA (예를 들어, 세포-무함유 태아 핵산 분자 예컨대 cffDNA)일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 세포-무함유 핵산 분자는 건강한 세포로부터 체액으로 방출될 수 있다.
대상체로부터 직접적으로 수득되는 생물학적 샘플은 대상체로부터 수득된 이후에 더욱 처리되지 않을 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 대상체의 순환계에 접근하여, (예를 들어, 바늘을 통해서) 대상체로부터 혈액을 제거하고, 제거된 혈액을 리셉터클로 옮겨서 대상체로부터 직접적으로 수득될 수 있다. 리셉터클은 시약(예를 들어, 항응고제)을 포함하여서 혈액 샘플이 추가 분석에 유용하게 한다. 다른 예에서, 면봉을 사용하여 대상체의 구강인두 표면 상의 상피 세포에 접근할 수 있다. 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득한 후에, 생물학적 샘플을 함유하는 면봉을 유체(예를 들어, 완충액)와 접촉시켜서 면봉으로부터 생물학적 유체를 수집할 수 있다.
하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 임의의 적합한 생물학적 샘플은 대상체로부터 수득될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법에 따라서 사용에 적합한 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플 또는 세포-무함유 생물학적 샘플)은 시험하려는 개체의 조직, 세포, 분해된 세포, 핵산, 유전자, 유전자 단편, 발현 산물, 유전자 발현 산물, 및/또는 유전자 발현 산물 단편을 포함한 임의의 물질일 수 있다. 생물학적 샘플은 고형 물질(예를 들어, 생물학적 조직)일 수 있거나 또는 유체(예를 들어, 생물학적 유체)일 수 있다. 일반적으로, 생물학적 유체는 살아있는 유기체와 회합된 임의 유체를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 대상체의 임의의 해부학적 위치(예를 들어, 조직, 순환계, 골수)로부터 수득된 혈액 (또는 혈액의 성분 - 예를 들어, 백혈 세포, 적혈 세포, 혈소판), 대상체의 임의의 해부학적 위치로부터 수득된 세포, 피부, 심장, 폐, 신장, 호흡, 골수, 대변, 정액, 질액, 종양성 조직 유래 간질액, 유방, 췌장, 뇌척수액, 조직, 목구멍 면봉, 생검, 태수, 양수, 간, 근육, 평활근, 방광, 담낭, 결장, 장, 뇌, 내강액, 객담, 고름, 마이크로바이오타, 태변, 모유, 전립선, 식도, 갑상선, 혈청, 타액, 소변, 위 및 소화 액, 눈물, 안구액, 땀, 점액, 귀지, 오일, 선 분비물, 척추액, 모발, 손톱, 피부 세포, 혈장, 비강 면봉 또는 비인두 세척액, 척추액, 제대혈, 림프액, 및/또는 다른 배설물 또는 신체 조직을 포함할 수 있다. 샘플 적합성 및/또는 타당성을 결정하기 위한 방법이 제공된다. 샘플은 제한없이, 혈액, 혈장, 조직, 세포, 분해된 세포, 세포-무함유 핵산 분자, 및/또는 세포 유래 또는 개체의 세포 유래 생물학적 물질 예컨대 세포-무함유 핵산 분자를 포함할 수 있다. 샘플은 세포, 조직, 또는 세포-무함유 생물학적 물질의 불균질성 또는 균질성 개체군일 수 있다. 생물학적 샘플은 본 명세서에 기술된 분석 방법에 적합한 샘플을 제공할 수 있는 임의 방법을 사용하여 수득될 수 있다.
샘플(예를 들어, 생물학적 샘플 또는 세포-무함유 생물학적 샘플)은 제한없이, 여과, 원심분리, 선택적 침전, 투과성, 단리, 교반, 가열, 정제, 및/또는 다른 과정을 포함한, 분석을 위한 하나 이상의 제조 과정을 겪을 수 있다. 예를 들어, 샘플은 오염물 또는 다른 물질을 제거하도록 여과될 수 있다. 일례에서, 세포를 포함하는 샘플은 샘플 중 다른 물질로부터 세포를 분리하도록 처리될 수 있다. 이러한 과정은 오직 세포-무함유 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 과정은 다단계 원심분리 과정으로 이루어질 수 있다. 다수 샘플, 예컨대 동일 대상체 유래 다수 샘플(예를 들어, 동일하거나 또는 상이한 신체 위치로부터 동일하거나 또는 상이한 방식으로 수득되고/되거나, 동일하거나 또는 상이한 시간 (예를 들어, 초, 분, 시간, 일, 주, 개월, 또는 수년 떨어져서)에 수득) 또는 상이한 대상체 유래 다수 샘플이 본 명세서에 기술된 바와 같은 분석을 위해 수득될 수 있다. 일례에서, 제1 샘플은 대상체가 치료 용법 또는 절차를 겪기 이전에 대상체로부터 수득되고 제2 샘플은 대상체가 치료 용법 또는 절차를 겪은 이후에 대상체로부터 수득된다. 대안적으로 또는 추가로, 다수 샘플은 동시에 또는 대략 동시에 동일한 대상체로부터 수득될 수 있다. 동일한 대상체로부터 수득된 상이한 샘플은 동일하거나 또는 상이한 방식으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 제1 샘플은 생검을 통해 수득될 수 있고 제2 샘플은 채혈을 통해 수득될 수 있다. 상이한 방식으로 수득된 샘플은 상이한 의료 전문가가 상이한 기술을 사용하여, 상이한 시점, 및/또는 상이한 위치에서 수득할 수 있다. 동일한 대상체로부터 수득된 상이한 샘플은 신체의 상이한 영역에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 제1 샘플은 신체의 제1 영역 (예를 들어, 제1 조직)에서 수득될 수 있고 제2 샘플은 신체의 제2 영역 (예를 들어, 제2 조직)에서 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 생물학적 샘플 (예를 들어, 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플)은 반응 용기에 제공될 때 정제되지 않을 수 있다. 더 나아가서, 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플 경우에, 하나 이상의 핵산 분자는 생물학적 샘플이 반응 용기에 제공될 때 추출되지 않을 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플의 리보핵산(RNA) 및/또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자는 생물학적 샘플을 반응 용기에 제공할 때 생물학적 샘플로부터 추출되지 않을 수 있다. 게다가, 생물학적 샘플에 존재하는 표적 핵산 (예를 들어, 표적 RNA 또는 표적 DNA 분자)은 생물학적 샘플을 반응 용기에 제공할 대 농축되지 않을 수 있다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 정제될 수 있고/있거나 핵산 분자는 생물학적 샘플 중 다른 물질로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 기술되는 생물학적 샘플은 표적 핵산을 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "주형 핵산", "표적 핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", "핵산 단편", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 일반적으로 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 (dNTP) 또는 리보뉴클레오티드 (rNTP), 또는 이의 유사체를 의미하고, 상호교환적으로 사용될 수 있다. 핵산은 임의의 3-차원 구조를 가질 수 있고, 기지 또는 미지의 임의 기능을 수행할 수 있다. 핵산 분자는 적어도 약 10 핵산 염기 ("염기"), 20 염기, 30 염기, 40 염기, 50 염기, 100 염기, 200 염기, 300 염기, 400 염기, 500 염기, 1 킬로베이스 (kb), 2 kb, 3, kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 50 kb 이상의 길이를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 4개 뉴클레오티드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T) (폴리뉴클레오티드가 RNA일 때 티민 (T) 대신 우라실 (U))의 특별한 서열로 구성된다. 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산의 비제한적인 예는 DNA, RNA, 게놈 DNA (예를 들어, gDNA 예컨대 전단 gDNA), 세포-무함유 DNA (예를 들어, cfDNA), 합성 DNA/RNA, 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로 정의된 유전자좌 (유전자좌들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 리보자임, 상보성 DNA (cDNA), 재조합 핵산, 분지 핵산, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 핵산의 조립 이전 또는 이후에 만들어질 수 있다. 핵산의 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 핵산은 중합, 예컨대 리포터제와 결합 또는 접합 이후에 더 변형될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 핵산 또는 샘플 핵산은 증폭된 산물을 생성하기 위해 증폭될 수 있다. 표적 핵산은 표적 RNA 또는 표적 DNA일 수 있다. 표적 핵산이 표적 RNA인 경우에, 표적 RNA는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 RNA 유 형을 포함한, 임의 유형의 RNA일 수 있다. 표적 RNA는 바이러스 RNA 및/또는 종양 RNA일 수 있다. 바이러스 RNA는 대상체에 병원성일 수 있다. 병원성 바이러스 RNA의 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스 I (HIV I), 인간 면역결핍 바이러스 n (HIV 11), 오르쏘믹소바이러스, 에볼라 바이러스, 뎅기 바이러스, 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, H1N1, H3N2, H7N9, 또는 H5N1), 헤페스바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 (예를 들어, 장갑 RNA-HCV 바이러스) 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 단핵구증 바이러스, 사이토메갈로바이러스, SARS 바이러스, 웨스트 나일 열 바이러스, 폴리오 바이러스, 및 홍역 바이러스를 포함한다.
생물학적 샘플은 다수의 표적 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 단일 대상체로부터의 다수의 표적 핵산 분자를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 생물학적 샘플은 제1 대상체로부터의 제1 표적 핵산 분자 및 제2 대상체로부터의 제2 표적 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 반응 용기 (예를 들어, 에멀션 중 액적, 또는 다수 웰 중 웰)에서 수행될 수 있다. 임의의 적합한 반응 용기를 사용할 수 있다. 반응 용기는 내부 표면, 외부 표면, 및 일부 경우에, 개방 말단 및 반대 밀폐 말단을 포함할 수 있는 몸체를 포함한다. 일부 경우에, 반응 용기는 개방 또는 밀폐 말단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 용기는 액적일 수 있다. 다른 경우에, 반응 용기는 캡을 포함할 수 있고, 이러한 캡은 개방 말단에서 몸체와 접촉하도록 구성될 수 있어서, 접촉될 때 반응 용기의 개방 말단은 밀폐된다. 캡은 반응 용기와 영구적으로 회합될 수 있어서 개방 및 밀폐 구조로 반응 용기에 부착된 채로 있게 된다. 캡은 제거가능하여서, 반응 용기가 개방될 때, 캡은 반응 용기로부터 분리된다. 반응 용기 예컨대 플로우 셀 챔버 (예를 들어, 유중수 에멀션을 포함하는 플로우 셀 챔버 또는 다수 웰)는 하나 이상의 입구 또는 출구를 포함할 수 있고, 이러한 입구 또는 출구는 반응에서 사용을 위한 시약을 제공하고 제거하는데 사용될 수 있다. 시약은 압력 및 진공 제어를 통해서 챔버의 안과 밖으로 이동할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 반응 용기는 밀봉될 수 있고, 임의로 기밀 밀봉될 수 있다 (예를 들어, 밀봉 마이크로웰 플레이트).
반응 용기는 다양한 크기, 형상, 무게, 및 구조일 수 있다. 일부 반응 용기는 실질적으로 둥글거나 또는 타원 관형 형상일 수 있다. 일부 반응 용기는 직사각형, 사각형, 다이아몬드형, 원형, 타원형, 또는 삼각형 형상일 수 있다. 반응 용기는 규칙적 형상일 수 있거나 또는 불규칙적 형상일 수 있다. 예를 들어, 액적 (에멀션 중 액적, 예컨대 수성 액적)인 반응 용기는 실질적으로 구체일 수 있다. 반응 용기의 밀폐 말단 (예를 들어, 플로우셀 또는 마이크로웰 플레이트의 웰)은 가늘어지거나, 둥글거나, 또는 편평한 표면을 가질 수 있다. 반응 용기의 유형의 비제한적인 예는 튜브, 웰, 모세관, 카트리지, 큐벳, 원심분리 튜브, 액적, 또는 파이펫 팁을 포함한다. 반응 용기는 임의의 적합한 물질로 구성될 수 있고 이러한 물질의 비제한적인 예는 유리, 금속, 플라스틱, 비혼화성 유체, 및 이의 조합을 포함한다. 일례에서, 반응 용기는 액적, 예컨대 비혼화성 유체 예컨대 오일 중 수성 액적일 수 있다. 반응 용기는 임의의 적합한 크기일 수 있다. 예를 들어, 반응 용기는 적어도 약 1 나노미터(nm), 10 nm, 50 nm, 100 nm, 1 미크로(㎛), 10 ㎛, 50 ㎛, 100 ㎛, 1 밀리미터(mm), 10 mm, 50 mm, 100 mm, 또는 1 센티미터(cm)의 직경을 갖는 대략 구체 액적일 수 있다. 대안적으로, 반응 용기는 적어도 약 100 ㎛, 1 mm, 5 mm, 또는 10 mm의 직경을 갖는 웰일 수 있다. 웰의 깊이는 웰의 직경과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 웰은 약 5 mm의 직경 및 약 10 mm의 깊이를 가질 수 있다.
반응 용기는 반응 용기의 수집체 또는 어레이의 일부일 수 있다. 반응 용기의 수집체 또는 어레이는 자동화 방법 및/또는 동시 처리 다수 샘플에 특히 유용할 수 있다. 반응 용기는 다수 웰로 구성된 마이크로웰 플레이트의 웰일 수 있다. 반응 용기는 열순환기의 열 블록의 웰에 수용될 수 있고, 열 순환의 블록은 각각이 샘플 용기를 수용할 수 있는 다수 웰을 포함한다. 반응 용기 (예를 들어, 액적 또는 마이크로웰)로 구성된 수집체 또는 어레이는 임의의 적절한 수의 반응 용기를 포함할 수 있다. 반응 용기의 수집체 또는 어레이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000, 10,000 이상의 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 용기의 수집체 또는 어레이는 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 35, 48, 96, 144, 384 이상의 반응 용기를 포함할 수 있다. 반응 용기 (예를 들어, 마이크로웰)의 수집체 또는 어레이의 반응 용기 부분은 또한 유체 취급 장치에 의해 개별적으로 주소지정 가능하여서, 유체 취급 장치는 올바르게 반응 용기를 확인할 수 있고 적절한 유체 물질을 반응 용기에 분배할 수 있다. 유체 취급 장치는 반응 용기에 유체 물질의 첨가를 자동화하는데 유용할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 반응 용기는 다른 반응 용기 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다수의 액적은 컨테이너 예컨대 비이커, 시험관, 플로우 셀 챔버, 또는 다른 컨테이너에 포함될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 플로우 셀의) 다수의 웰은 컨테이너, 예컨대 플로우 셀 챔버에 포함될 수 있다. 일례에서, 다수의 웰은 플로우 셀 챔버의 표면 상에 제공될 수 있어서, 핵산 반응은 플로우 셀 상에서 직접적으로 일어날 수 있다. 다른 예에서, 하나 이상의 액적은 소정 영역, 예컨대 컨테이너의 표면에 물리적으로 국한될 수 있다. 액적은 예를 들어, 전자기력을 통해서, 예컨대 컨테이너의 물질 (예를 들어, 표면)과 액적 내에 포함된 물질 (예를 들어, 상자성 비드 또는 비드에 커플링된 자성 표지) 간 자성 인력을 통해서, 또는 광학 트위저의 사용을 통해서, 물리적으로 국한시킬 수 있다. 일례에서, 액적은 (예를 들어, 플로우 셀 또는 마이크로웰 플레이트의) 웰 내에 국한될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 반응 용기 (예를 들어, 액적 또는 웰)는 다수의 열 구획을 포함할 수 있다. 열 구획은 반응 용기 내 감열 적층 물질의 도움으로 반응 용기 내에 생성될 수 있다. 이러한 경우에, 감열 적층 물질의 가열은 한 열 구획에서 다음 것으로 반응 혼합물을 방출하는데 사용될 수 있다. 반응 용기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 이상의 열 구획을 포함할 수 있다. 반응 용기 내 열 구획은 반응 용기의 상이한 영역을 상이한 온도 순환 조건에 노출시켜 획득할 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 다수의 웰 및/또는 액적을 포함하는) 플로우 셀 챔버의 상이한 영역은 상이한 온도 순환 조건을 겪을 수 있다. 대안적으로, 반응 용기의 어레이 또는 수집체의 하나 이상의 반응 용기는 하나 이상의 상이한 열 구획을 겪을 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 다양한 반응 용기를 물리적으로 분리시켜서) 반응 용기의 제1 세트는 제1 열 구획 내에 위치될 수 있고 반응 용기의 제2 세트는 제2 열 구획 내에 위치할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 반응 용기의 어레이 또는 수집체의 하나 이상의 반응 용기는 다수의 상이한 온도를 겪을 수 있다 (예를 들어, 과정 전반에서 상이한 시점에). 반응 용기에 적용되는 온도는 예를 들어, 핵산 반응의 개시, 핵산 분자의 어닐링, 어닐링된 핵산 분자의 연장 (예를 들어, 프라이머 연장), 이중 가닥 핵산 서열 또는 이의 일부분의 부분 또는 완전 변성, 또는 임의의 다른 유용한 과정에 적합할 수 있다. 예를 들어, 온도는 열순환 프로토콜에 따라서 제어될 수 있다. 일례에서, 반응 용기의 전부 또는 일부는 제1 기간 동안 제1 시간에 제1 온도를 겪을 수 있고, 반응 용기 또는 이의 일부는 후속하여 제2 기간 동안 제2 시간에 제2 온도를 겪을 수 있다. 제1 온도는 예를 들어, 핵산 반응 (예를 들어, PCR)의 개시 또는 제2 핵산 분자에 제1 핵산 분자의 어닐링 (예를 들어, 혼성화)에 적합한 온도일 수 있다. 제2 온도는 예를 들어, 어닐링된 핵산 분자 (예를 들어, 프라이머 분자)의 연장 및/또는 어닐링된 핵산 분자의 변성에 적합한 온도일 수 있다. 추가의 상이한 온도가 또한 적용될 수 있다. 온도는 임의의 적합한 횟수 (예를 들어, 열순환의 임의 횟수)로 반복될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 용어 "비드"는 일반적으로 임의 형상 및 치수의 고형 지지체, 수지, 겔 (예를 들어, 히드로겔), 콜로이드, 또는 입자를 지칭한다. 비드는 임의의 적합한 물질 예컨대 유리 또는 세라믹, 하나 이상의 중합체, 및/또는 금속을 포함할 수 있다. 적합한 중합체의 예는 제한없이 나일론, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 한천, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 또는 덱스트란을 포함한다. 적합한 금속의 예는 상자성 금속, 예컨대 철을 포함한다. 비드는 자성일 수 있거나 또는 비-자성일 수 있다. 예를 들어, 비드는 하나 이상의 자성 표지를 보유하는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 자성 비드는 전자기력을 사용하여 조작될 수 있다 (예를 들어, 위치 사이를 이동하거나 또는 예를 들어, 반응 용기 예컨대 플로우 셀 챔버의 소정 위치에 물리적으로 국한). 비드는 직경을 포함하여 하나 이상의 상이한 치수를 가질 수 있다. 비드의 치수 (예를 들어, 비드의 직경)는 약 1 mm 미만, 약 0.1 mm 미만, 약 0.01 mm 미만, 약 0.005 mm 미만, 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 1㎛ 내지 약 100 ㎛, 또는 약 1 mm 내지 약 100 mm 일 수 있다. 비드의 수집체는 동일하거나 또는 상이한 특징을 갖는 하나 이상의 비드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비드의 수집체의 제1 비드는 제1 직경을 가질 수 있고 비드의 수집체의 제2 비드는 제2 직경을 가질 수 있다. 제1 직경은 제2 직경과 동일할 수 있거나 또는 대략 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 유사하게, 제1 비드는 제2 비드와 동일하거나 또는 상이한 형상 및 조성을 가질 수 있다. 일례에서, 제1 비드는 제1 중합성 물질을 포함할 수 있고 제2 비드는 제2 중합성 물질을 포함할 수 있다. 제1 중합성 물질은 제2 중합성 물질과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 제1 비드는 제1 물질, 예컨대 이에 커플링된 제1 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머)를 포함할 수 있고, 제2 비드는 제2 물질, 예컨대 이에 커플링된 제2 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머)를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제1 프라이머)는 제2 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제2 프라이머)와 동일한 핵산 서열 또는 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 제1 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제1 프라이머)는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함할 수 있고, 제2 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제2 프라이머)는 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열을 포함할 수 있다. 제1 및 제3 핵산 서열은 동일할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제3 핵산 서열은 바코드 서열일 수 있다. 제2 및 제4 핵산 서열은 상이할 수 있다. 예를 들어, 제2 및 제4 핵산 서열은 상이한 기능을 수행하도록 구성된 기능성 서열일 수 있다. 제2 및 제4 핵산 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같은, 상이한 핵산 분자를 포획하도록 구성된 프라이머 (예를 들어, 포획) 서열일 수 있다. 일례에서, 제1 비드는 이에 커플링된 다수의 제1 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제1 프라이머)를 가질 수 있고 제2 비드는 이에 커플링된 다수의 제2 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제2 프라이머)를 가질 수 있고, 다수의 제1 올리고뉴클레오티드의 소정 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하고, 다수의 제2 올리고뉴클레오티드의 소정 제2 올리고뉴클레오티드는 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열을 포함한다. 제1 및 제3 핵산 서열은 동일할 수 있다 (예를 들어, 바코드 서열). 제2 및 제4 핵산 서열은 상이할 수 있다 (예를 들어, 상이한 기능성 서열). 일부 경우에, 제1 비드에 커플링된 다수의 제1 올리고뉴클레오티드의 제2 핵산 서열은 다양할 수 있고/있거나, 제2 비드에 커플링된 다수의 제1 올리고뉴클레오티드의 제4 핵산 서열은 다양할 수 있다. 예를 들어, 제2 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열은 다양한 주형 핵산 분자를 포획하는데 적합할 수 있는 무작위 N-량체일 수 있다. 비드에 커플링된 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열은 임의의 유용한 염기 조성 및 길이의 임의의 유용한 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 비드에 커플링된 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열은 오직 정규 뉴클레오티드만을 포함할 수 있는 반면, 다른 경우에, 비드에 커플링된 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 하나 이상의 표지 또는 염료, 예컨대 하나 이상의 형광성 표지, 염료, 자성 표지, 무선주파수 표지, 또는 다른 태그를 포함할 수 있다. 비드에 커플링된 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열은 하나 이상의 추가 특성 예컨대 복제 블록, 절단성 염기, 또는 가역적 종결인자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머" 또는 "프라이머 분자"는 일반적으로 주형 핵산 분자의 일부에 상보성인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 프라이머는 주형 핵산 분자의 가닥의 일부에 상보성일 수 있다. 프라이머는 핵산 반응 (예를 들어, 핵산 증폭 반응, 예컨대 PCR)의 성분일 수 있는 프라이머 연장 반응같은, 핵산 합성을 위한 출발점으로서 제공되는 핵산의 가닥일 수 있다. 이어서 프라이머는 주형 가닥에 혼성화할 수 있고 뉴클레오티드 (예를 들어, 정규 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체)는 때대로 중합 효소 예컨대 폴리머라제의 도움으로, 프라이머의 말단(들)에 첨가될 수 있다. 따라서, DNA 샘플의 복제 동안, 복제를 촉매하는 효소는 DNA 샘플에 부착된 프라이머의 3'-말단에서 복제를 시작하여 반대 가닥을 복제할 수 있다. 프라이머 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 프라이머를 지지체 또는 담체, 예컨대 비드 또는 입자에 커플링하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 작용기를 가질 수 있다.
프라이머는 주형 핵산에 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 프라이머는 주형 핵산에 대한 서열 동일성 또는 상동성 또는 상보성을 나타낼 수 있다. 프라이머 및 주형 핵산 간 상동성 또는 서열 동일성 또는 상보성은 프라이머의 길이를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 길이가 약 20 핵산이면, 이것은 주형 핵산에 대해 10 이상의 인접한 핵산 염기 상보성을 함유할 수 있다.
프라이머 및 주형 핵산 간 상보성 또는 상동성 또는 서열 동일성은 제한될 수 있다. 프라이머의 길이는 8 뉴클레오티드 염기 내지 50 뉴클레오티드 염기일 수 있다. 프라이머의 길이는 2 뉴클레오티드 염기 초과, 3 뉴클레오티드 염기 초과, 4 뉴클레오티드 염기, 5 뉴클레오티드 염기, 6 뉴클레오티드 염기, 7 뉴클레오티드 염기, 8 뉴클레오티드 염기, 9 뉴클레오티드 염기, 10 뉴클레오티드 염기, 11 뉴클레오티드 염기, 12 뉴클레오티드 염기, 13 뉴클레오티드 염기, 14 뉴클레오티드 염기, 15 뉴클레오티드 염기, 16 뉴클레오티드 염기, 17 뉴클레오티드 염기, 18 뉴클레오티드 염기, 19 뉴클레오티드 염기, 20 뉴클레오티드 염기, 21 뉴클레오티드 염기, 22 뉴클레오티드 염기, 23 뉴클레오티드 염기, 24 뉴클레오티드 염기, 25 뉴클레오티드 염기, 26 뉴클레오티드 염기, 27 뉴클레오티드 염기, 28 뉴클레오티드 염기, 29 뉴클레오티드 염기, 30 뉴클레오티드 염기, 31 뉴클레오티드 염기, 32 뉴클레오티드 염기, 33 뉴클레오티드 염기, 34 뉴클레오티드 염기, 35 뉴클레오티드 염기, 37 뉴클레오티드 염기, 40 뉴클레오티드 염기, 42 뉴클레오티드 염기, 45 뉴클레오티드 염기, 47 뉴클레오티드 염기 또는 50 뉴클레오티드 염기일 수 있다. 프라이머의 길이는 50 뉴클레오티드 염기 미만, 47 뉴클레오티드 염기, 45 뉴클레오티드 염기, 42 뉴클레오티드 염기, 40 뉴클레오티드 염기, 37 뉴클레오티드 염기, 35 뉴클레오티드 염기, 34 뉴클레오티드 염기, 33 뉴클레오티드 염기, 32 뉴클레오티드 염기, 31 뉴클레오티드 염기, 30 뉴클레오티드 염기, 29 뉴클레오티드 염기, 28 뉴클레오티드 염기, 27 뉴클레오티드 염기, 26 뉴클레오티드 염기, 25 뉴클레오티드 염기, 24 뉴클레오티드 염기, 23 뉴클레오티드 염기, 22 뉴클레오티드 염기, 21 뉴클레오티드 염기, 20 뉴클레오티드 염기, 19 뉴클레오티드 염기, 18 뉴클레오티드 염기, 17 뉴클레오티드 염기, 16 뉴클레오티드 염기, 15 뉴클레오티드 염기, 14 뉴클레오티드 염기, 13 뉴클레오티드 염기, 12 뉴클레오티드 염기, 11 뉴클레오티드 염기, 10 뉴클레오티드 염기, 9 뉴클레오티드 염기, 8 뉴클레오티드 염기, 7 뉴클레오티드 염기, 6 뉴클레오티드 염기, 5 뉴클레오티드 염기, 4 뉴클레오티드 염기, 3 뉴클레오티드 염기 또는 2 뉴클레오티드 염기일 수 있다.
용어 "% 서열 동일성"은 본 명세서에서 용어 "% 동일성"과 상호교환적으로 사용될 수 있고 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬시, 2 이상의 뉴클레오티드 서열 간 뉴클레오티드 서열 동일성의 수준을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 80% 동일성은 정의된 알고리즘을 통해서 결정된 80% 서열과 동일한 것일 수 있고, 소정 서열이 다른 길이의 다른 서열과 적어도 80% 동일하다는 것을 의미한다. % 동일성은 예를 들어, 소정 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, or 적어도 99% 이상의 서열 동일성으로부터 선택될 수 있다. % 동일성은 예를 들어, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위일 수 있다.
용어 "% 서열 상동성" 또는 "퍼센트 서열 상동성" 또는 "퍼센트 서열 동일성"은 본 명세서에서 용어 "% 상동성", "% 서열 동일성" 또는 "% 동일성"과 상호교환적으로 사용될 수 있고 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬 시, 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 간 뉴클레오티드 서열 상동성의 수준을 의미할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용시, 80% 상동성은 정의된 알고리즘으로 정의된 80% 서열 상동성과 동일한 것일 수 있고, 따라서, 소정 서열의 상동성은 소정 서열 길이 전반에서 80% 초과의 서열 상동성을 가질 수 있다. % 상동성은 예를 들어, 소정 서열에 대한 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 이사으이 서열 상동성으로부터 선택될 수 있다. % 상동성은 예를 들어 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99% 범위일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머 연장 반응"은 일반적으로, 주형 핵산 가닥에 프라이머의 결합에 이어서, 프라이머(들)의 연장을 의미한다. 또한 이중 가닥 핵산의 변성 및 변성된 주형 가닥 중 하나 또는 둘 모두에 프라이머 가닥의 결합에 이어서, 프라이머(들)의 연장을 포함할 수 있다. 프라이머 연장 반응은 효소 (예를 들어, 중합 효소 예컨대 폴리머라제)를 사용하여 주형-지향 방식으로 프라이머에 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 도입하는데 사용될 수 있다. 프라이머 연장 반응은 핵산 증폭 반응의 과정일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "어댑터"는 일반적으로 예컨대 시퀀싱 (예를 들어, 차 세대 시퀀싱(NGS))을 촉진하기 위해서 표적 핵산 분자와 상호작용에 의해서, 시퀀싱 장비가 표적 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱할 수 있게 조정된 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)를 의미한다. 시퀀싱 어댑터는 시퀀싱 장비에 의해 표적 핵산 분자를 시퀀싱할 수 있게 허용할 것이다. 예를 들어, 시퀀싱 어댑터는 시퀀싱 시스템, 예컨대 비드 또는 플로우 셀의 고형 지지체에 부착된 폴리뉴클레오티드를 포획하도록 혼성화 또는 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 시퀀싱 어댑터는 시퀀싱 시스템에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하도록 허용하는, 헤어핀 루프를 생성시키도록 폴리뉴클레오티드에 혼성화 또는 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 시퀀싱 어댑터는 표적 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하기 위해서 시퀀싱 시스템에 의해 이용가능하고 다른 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)의 플로우 셀 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열일 수 있는, 시퀀싱 모티프를 포함할 수 있다. 시퀀싱기 모티프는 또한 시퀀싱, 예컨대 합성에 의한 시퀀싱에서 사용을 위한 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 시퀀싱기 모티프는 시퀀싱 시스템에 라이브러리 어댑터를 커플링하기 위한 서열(들)을 포함할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 샘플 핵산)를 시퀀싱할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 어댑터는 제1 하위-부분 및 제2 하위-부분을 가질 수 있다. 제1 하위-부분 및 제2 하위-부분은 서열 상보성을 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 어댑터는 페어드-엔드 서열 리드를 생성하는데 유용한 페어드-엔드 어댑터일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리머라제", "중합성 효소" 또는 "중합 효소"는 일반적으로 중합 반응을 촉매할 수 있는 임의 효소를 의미하고 상호교환적으로 사용될 수 있다. 중합 효소는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입으로 프라이머를 연장시키는데 사용될 수 있다. 폴리머라제의 예는 제한없이, 핵산 폴리머라제를 포함한다. 폴리머라제는 천연 발생일 수 있거나 또는 합성일 수 있다. 일례의 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 또는 이의 유도체이다. 폴리머라제는 중합 효소일 수 있다. 전사효소 또는 리가제가 또한 사용될 수 있다 (즉, 결합의 형성을 촉매하는 효소). 종합효소의 예는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 열안정성 폴리머라제, 야생형 폴리머라제, 변형된 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 Φ29 (phi29) DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제 Pwo 폴리머라제, VENT 폴리머라제, DEEPVENT 폴리머라제, Ex-Taq 폴리머라제, LA-Taw 폴리머라제, Sso 폴리머라제 Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제 ES4 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tca 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, 플래티늄 Taq 폴리머라제, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Pfutubo 폴리머라제, Pyrobest 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 클레노우 단편 폴리머라제, 및 이의 변이체, 변형된 산물 및 유도체를 포함한다. 폴리머라제는 단일 서브유닛 폴리머라제일 수 있다. 폴리머라제는 높은 진행성, 즉 핵산 주형을 방출하지 않고 핵산 주형에 연속적으로 뉴클레오티드를 도입하는 폴리머라제의 능력을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "적어도 부분적으로"는 일반적으로 전체량의 임의 분율을 의미한다. 예를 들어, "적어도 부분적으로"는 전체량의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.9%를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바코드" 또는 "바코드 서열"은 일반적으로 하나 이상의 특정 핵산을 확인하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 바코드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 연속 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 바코드는 적어도 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 증폭 및/또는 시퀀싱 과정 (예를 들어, NGS)에서 사용되는 모든 바코드는 상이할 수 있다. 바코드를 포함하는 핵산 개체군 중 상이한 바코드의 다양성은 무작위적으로 생성될 수 있거나 비-무작위적으로 생성될 수 있다.
바코드는 하나 이상의 절편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바코드는 제1 핵산 서열을 갖는 제1 절편 및 제2 핵산 서열을 갖는 제2 절편을 포함할 수 있다. 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 다수 절편을 포함하는 바코드 서열은 분할-풀 계획에 따라서 조합 방식으로 조립될 수 있고, 여기서 다수의 상이한 제1 절편이 다수의 제1 파티션 중에 분포되며, 이의 내용물을 풀링하여 다수의 제2 파티션 중에 분포시킨다. 이어서 다수의 상이한 제2 절편은 다수의 제2 파티션 중에 분포되고 다수의 제2 파티션 내 다수의 상이한 제1 절편에 연결되고, 이어서 다수의 제2 파티션의 내용물이 풀링된다. 과정은 임의 수준의 바코드 다양성을 제공하도록 임의 수의 상이한 절편 및 파티션을 사용하여 임의 횟수로 반복될 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 제1 절편은 비드에 커플링될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 바코드의 사용은 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 다수 샘플의 고속 대량 분석을 허용할 수 있다. 다수의 핵산 분자를 포함하는 샘플은 다수의 파티션 (예를 들어, 에멀션 중 액적) 전반에 분포될 수 있고, 여기서 각각의 파티션은 고유한 바코드 서열을 포함하는 핵산 바코드 분자를 포함한다. 샘플은 분할되어서 다수의 파티션의 전부 또는 대부분의 파티션이 다수의 핵산 분자의 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다. 이어서 소정 파티션의 핵산 분자 및 핵산 바코드 분자는 (예를 들어, 핵산 증폭 반응을 통해서) 적어도 핵산 분자의 서열의 하나 이상의 카피 및/또는 상보체를 생성하는데 사용될 수 있고, 이러한 카피 및/또는 상보체는 핵산 바코드 분자의 바코드 서열 또는 이의 상보체를 포함한다. 다음으로 다양한 파티션의 내용물(예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)을 풀링하여 시퀀싱을 수행할 수 있다. 일부 경우에, 핵산 바코드 분자는 비드에 커플링될 수 있다. 이러한 경우에, 카피 및/또는 상보체는 또한 비드에 커플링될 수 있다. 핵산 바코드 분자, 및 카피 및/또는 상보체는 시퀀싱 장비를 사용하여 핵산 시퀀싱을 촉진하기 위해서 풀링 이후에 또는 파티션 내에서 비드로부터 방출될 수 있다. 다수의 핵산 분자의 핵산 분자의 카피 및/또는 상보체는 각각이 고유한 바코드 서열 또는 이의 상보체를 포함하기 때문에, 핵산 시퀀싱 어세이를 사용하여 수득되는 시퀀싱 리드는 그들이 상응하는 다수의 핵산 분자의 핵산 분자와 회합될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 파티션 중에 분배된 세포 내에 포함된 핵산 분자, 및/또는 다수의 상이한 샘플로부터 유래된 핵산 분자에 적용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 파티션이 하나 초과의 비드를 포함하는 것인, 시스템, 방법, 및 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 명세서는 파티션이 하나 초과의 피분석물 (예를 들어, 핵산 분자, 예를 들어, 주형 핵산 분자)을 포함하는 것인, 시스템, 방법, 및 조성물을 제공한다. 유리하게, 본 개시의 시스템, 방법, 및 조성물은 성공적인 하류 처리를 위해서 (예를 들어, 단일 비드, 단일 피분석물을 사용한) 내용물의 단일 로딩에 의존할 필요가 없다. 유리하게, 본 개시의 시스템, 방법, 및 조성물은 실질적인 수의 파티션이 일정 공급원 (예를 들어, 비드, 피분석물, 시약 등)을 소비하지만, 하나 이상의 일정한 다른 공급원 (예를 들어, 비드, 피분석물)의 결여 (또는 달리 잘못된 수 또는 잘못된 조성) 때문에 유용하지 않은 공급원의 낭비를 종종 초래할 수 있는, 포아송 분포에 따라서 많아야 단일하게 로딩되는 (예를 들어, 단일 비드, 단일 피분석물 사용) 파티션의 형성에 의존할 필요가 없다. 일부 예에서, 유리하게, 본 개시의 시스템, 방법, 및 조성물은 단일 로딩에 의존하는 시스템, 방법, 및 조성물에 비해 더 높은 효율 및/또는 더 높은 출력을 달성할 수 있다.
방법
본 개시는 생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법을 제공한다. 특히, 본 개시는 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 다수의 핵산 분자)를 포함하는 핵산 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법을 개시한다. 핵산 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플 또는 세포-무함유 생물학적 샘플)은 다수의 핵산 분자, 예컨대 다수의 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA) 분자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적을 포함하는 에멀션을 생성시킴으로써, 다수의 웰 또는 액적)을 생성하는 단계를 포함할 수 있고, 각각의 파티션 (예를 들어, 액적 또는 웰)은 (i) 다수의 비드 및 (ii) 적어도 하나의 핵산 분자 (예를 들어, 생물학적 샘플의 표적 핵산 분자)를 포함할 수 있다. 다수의 파티션의 소정 파티션은 또한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 다수의 파티션의 파티션 (예를 들어, 소정 파티션)은 적어도 2개 비드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시의 방법은 파티션 예컨대 에멀션 중 액적 내부에서 핵산 분자에 대한 비드의 증가된 비율 (예를 들어, 2 이상, 또는 4 이상의 비율 등)을 제공할 수 있다. 다수의 파티션의 제1 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자는 다수의 파티션의 제2 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자와 상이 (예를 들어, 상이한 뉴클레오티드 서열을 가짐)할 수 있다. 예를 들어, 제1 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자는 제1 생물학적 샘플 유래 (예를 들어, 제1 대상체 유래)일 수 있고 제2 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자는 제2 생물학적 샘플 유래 (예를 들어, 제2 대상체 유래 또는 제1 대상체 유래이지만 상이한 시점에 또는 상이한 방법을 통해 채취)될 수 있다. 다른 예에서, 제1 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 제1 세포에서 유래될 수 있고 제2 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자는 동일한 생물학적 샘플로부터의 제2 세포에서 유래될 수 있다. 대안적으로, 다수의 파티션의 제1 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자는 다수의 파티션의 제2 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자와 동일할 수 있거나 (예를 들어, 동일한 뉴클레오티드 서열을 가짐) 또는 대략 동일할 수 있다 (예를 들어, 높은 서열 상보성을 가짐).
다수의 파티션의 파티션에 배치된 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 하나의 핵산 분자의 하나 이상의 증폭 산물을 생성시켜서 파티션 내부 (예를 들어, 에멀션 중 액적 내부)에서 증폭될 수 있다. 증폭 방법 및/또는 시퀀싱 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해서 수행될 수 있다. 증폭 과정은 적어도 하나의 핵산 분자를 비드에 부착 (예를 들어, 공유적 또는 비공유적 연결)시킨 상태에서 또는 적어도 하나의 핵산 분자를 비드에 부착시키지 않은 상태에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 핵산 분자의 하나 이상의 증폭 산물은 적어도 하나의 핵산 분자를 파티션 내에 포함된 적어도 2개 비드의 비드에 부착시킨 상태에서 다수의 파티션의 파티션 내에서 생성될 수 있다. 다수의 파티션의 내용물을 풀링할 수 있다 (예를 들어, 핵산 분자 및 상응하는 증폭 산물 및 비드는 에멀션 중 다수의 액적의 액적으로부터 방출될 수 있음). 다수의 파티션의 파티션으로부터 비드-핵산 분자 복합체 (또는 복합체들)의 방출 시에, 비드-핵산 분자 복합체 (또는 복합체들)는 다른 물질 (예를 들어, 에멀션의 다수의 액적의 액적의 풀링된 내용물)로부터 분리 (예를 들어, 자성으로 분리)될 수 있다. 후속하여, 형성될 수 있는 다수의 파티션의 파티션의 적어도 하나의 핵산 분자 또는 이에 상응하는 임의의 증폭 산물 또는 이의 유도체를 (예를 들어, 시퀀싱기에서 뉴클레오티드 서열을 결정하여) 어세이할 수 있거나 또는 분석할 수 있다.
도 1은 포괄적인 차세대 시퀀싱(NGS) 접근법의 개략도를 도시하고 유전 물질이 분석을 피할 수 있고/있거나 잠재적인 노이즈원 및 돌연변이를 도입시킬 수 있는 작업흐름의 부분들을 표시한다. 생물학적 샘플을 제공할 수 있다 (101). 예를 들어, 생물학적 샘플은 적절한 크기의 DNA, 예컨대 cfDNA 및 전단 gDNA를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 희귀 변이체를 포함하는 전체 물질을 대표하는 제한된 투입물(111)일 수 있다. 생물학적 샘플에 대해서 어댑터 결찰을 수행할 수 있다 (102). 이러한 과정 동안, 게놈 물질은 예컨대 불완전 결찰 및 비-생산적 어댑터 조합에 기인하여 손실될 수 있다 (112). 어댑터-결찰된 샘플에 대해서 PCT 증폭(103)을 수행할 수 있고, 그 결과로 증가된 카피수 및 돌연변이를 일으킬 수 있다 (113). 산물에 대해서 예컨대 에멀션 PCR을 통해서 클론 증폭을 수행할 수 있다 (104). 이러한 과정 동안, 더 많은 물질이 손실될 수 있고 돌연변이 수는 예컨대 이중 포아송 로딩 계획, 혼합 주형의 클론 카피를 최소화하기 위한 최적 계획에 기인하여 증가될 수 있다 (114). 클론 증폭 산물에 대해서 시퀀싱을 수행할 수 있다 (105). 이러한 과정 동안, 오차가 일반 노이즈 및 신호 붕괴로 인한 것일 수 있다 (115). 도 2는 작업흐름에 대한 변형이 수율 (예를 들어, 분석된 생물학적 샘플로부터 획득된 정보량)을 증가시킬 수 있고 핵산 분석 동안 노이즈 및 돌연변이의 확률을 감소시키는 도 1의 개략도의 변형된 형태를 도시한다. 생물학적 샘플이 제공될 수 있다 (201). 이러한 제공 동안, PCR 농축의 수행은 샘플 손실을 감소시킬 수 있다 (211). 일부 경우에, 돌연변이율이 증가될 수 있다. 생물학적 샘플에 대해서 어댑터 결찰을 수행할 수 있다 (202). 이러한 과정 동안, 무작위적 식별자를 갖는 어댑터가 적용될 수 있다. 일부 경우에, 페어드-엔드 어댑터가 사용될 수 있다 (212). 시퀀싱 동안 (예를 들어, 205), 이러한 어댑터는 다수 리드에 대한 요구를 감소시킬 수 있거나 또는 제거시킬 수 있다. 어댑터-결찰된 샘플에 대해서 PCT 증폭(203)을 수행할 수 있고, 이 동안 돌연변이는 무작위적 식별자에 의해 교정가능할 수 있다 (213). 산물에 대해서 예컨대 에멀션 PCR에 의한, 클론 증폭을 수행할 수 있다 (204). 이러한 과정 동안, 라이브러리 주형당 다수 비드가 적용될 수 있고 (214), 이것은 주형 손실을 최소화시킬 수 있다. 클론적으로 증폭된 산물에 대해서 시퀀싱을 수행할 수 있다 (205). 이러한 과정 동안, 다수 리드 및/또는 페어드-엔드 리드를 처리할 수 있다 (215). 일부 경우에, 라이브러리 주형당 다수 비드의 사용 (예를 들어, 214)은 다수 리드를 생성시키고/시키거나 무작위적 식별자를 사용하여 PCR 증폭-유래 돌연변이를 교정해야만 하는 필요성을 감소 또는 제거할 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법은 포괄적 NGS 접근법에 변형을 도입시켜서 증가된 핵산 증폭 및 시퀀싱을 제공한다. 본 개시의 방법의 장점은 예를 들어, 소정 핵산 분자의 높은 클론 카피수 및 감소된 샘플 또는 주형 손실에 기인하여 샘플 분석 동안 증가된 정확도 및 감도를 얻을 수 있는, 파티션 (예를 들어, 액적) 내부에서 핵산 분자에 대한 비드의 증가된 비율 (예를 들어, >2)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '이중 포아송'은 일반적으로 무작위 샘플채취 동안 파티션으로 항목의 2개 상이한 종으로부터 단일 별개 항목을 분포시키는 통계적 어려움을 의미한다. 일반적으로, 각 종의 로딩은 포아송 통계에 의해 지배된다. M 과 동등한 파티션 중에 무작위적으로 분포된 N 항목의 소정 경우에서, 파티션에 존재하는 상대적 개체군은 파티션에 대한 항목의 비율, λ에 의존한다:
2개 종의 항목이 파티션에 개별적으로 분포될 때 각각은 그 자신의 포아송 분포를 따를 것이고, 이중 포아송 분포를 유도하여, 단지 각 종의 단일 사례를 갖는 파티션의 소분율을 야기한다. 항목 대 파티션 비율, λ를 고려하여 n 개수의 항목을 함유하는 파티션의 확률은 다음과 같이 계산될 수 있다:
단일 포아송 과정의 경우에, 파티션당 하나의 로딩 시 오직 하나의 항목을 갖는 파티션의 분율은 다음과 같이 계산된다:
이것은 도함수 
로 설정하고 극값이 임의의 n에 대해 n = λ일 때 발생됨을 유의하여 유도시킬 수 있다. 이것은 항목의 36.8%를 나타낸다. 2개 종, a 및 b가 파티션에 로딩되면, 분포는 다음과 같다:
이것은 각 종에 대한 λ = 1에 대해 표 1에 하기에 표 작성되어 있다. 이러한 경우에, 파티션의 오직 
은 각 a 및 b의 단일 항목을 갖는다.
핵산 주형의 종 (예를 들어, a) 및 비드의 종 (예를 들어, b)이 액적 (예를 들어, 파티션)에 분할되면, 본 명세서에서 고려되는 바와 같이, 주형, 비드, 파티션 및 양성 비드 (적어도 하나의 주형을 갖는 파티션의 비드)의 상대 비용이 실질적으로 가변적일 수 있기 때문에, λ주형 및 λ비드에 대한 최적 값은 비용을 최소화하고 효율을 증가시키도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 파티션 및 비드는 저 비용에서 가중될 수 있고 주형 및 양성 비드는 고비용에서 가중될 수 있다. 이러한 최적화는 상이한 실패 사건, 예컨대 액적 및 비드의 비용을 산출하게 되는 주형으로 액적의 로딩 실패의 비용을 차지할 것이다. 그러나, 이러한 경우에, 비드는 음성 비드 (임의 주형없는 파티션의 비드)이기 때문에, 음성 비드를 세척해 버리는 농축 단계 이후에 추가 비용을 평가하지 않는다. 다른 실패 사건에서, 파티션은 2 이상의 주형 및 하나 이상의 비드가 로딩되고, 이것은 주형 및 비드의 비용을 산출할 뿐만 아니라, 추가 하류 처리 비용을 발생시킬 수 있는 다클론 (혼합 주형 존재)인 하나 이상의 양성 비드를 생성시킨다.
본 명세서에 제공된 방법에 따라서 사용을 위한 생물학적 샘플은 고형 생물학적 샘플 (예를 들어, 조직 샘플 예컨대 생검 샘플) 또는 액상 생물학적 샘플 (예를 들어, 체액 예컨대 혈액 유래)일 수 있다. 생물학적 샘플은 다수의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 다수의 핵산 분자를 포함하는 다수의 세포를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 생물학적 샘플은 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 세포-무함유 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 세포 물질 및/또는 다른 찌꺼기를 제거하거나, 세포를 단리 및/또는 용해시키거나, 시약을 첨가 또는 제거하거나, 또는 달리 후속 처리를 위해 생물학적 샘플을 제조하기 위해 처리될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 세포-무함유 생물학적 샘플을 제공하기 위해 처리될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 분석될 수 있는 핵산 분자는 세포-무함유 핵산 분자 (예를 들어, cfDNA 또는 ctDNA)일 수 있다. 세포-무함유 핵산 분자는 유기체 또는 대상체의 일정 조직 또는 장기, 예를 들어, 암성 조직으로부터 기원할 수 있고, 샘플에 낮은 농도 내지 매우 낮은 농도 (예를 들어, <10 ng/mL)로 존재할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 생물학적 샘플을 분석하는 방법은 동일하거나 또는 상이한 물리화학적 성질 예컨대 극성 및 점도를 갖는 2 이상의 용매, 액체 또는 유체를 접촉(예를 들어, 혼합 또는 조합)시키는 단계를 포함할 수 있다. 2 이상의 물질의 접촉은 다수의 액적을 포함하는 에멀션 (예를 들어, 유중수 또는 수중유 에멀션)의 생성을 일으킬 수 있다. 2 이상의 물질 (예를 들어, 액체)은 비혼화성일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 제1 극성 (예를 들어, 일정 제1 친수성 또는 친지성을 가짐)을 갖는 제1 물질 (예를 들어, 용매 또는 용액)을 제2 극성 (예를 들어, 일정 제2 친수성 또는 친지성을 가짐)을 갖는 제2 물질 (예를 들어, 용매 또는 용액)과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 제1 물질 (예를 들어, 수용액)의 극성은 제2 물질 (예를 들어, 비극성 유체 예컨대 오일)의 극성과 동일할 수 있거나, 유사할 수 있거나, 또는 상이할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 제1 물질은 수용액일 수 있고 제2 물질은 오일일 수 있다. 오일과 수용액의 접촉 시에, 에멀션이 형성될 수 있다 (예를 들어, 액적 생성 접합부에서). 에멀션은 분산상 및 연속층을 가질 수 있다.
일반적으로, 본 개시의 방법은 수성 분산상 및 연속 오일층을 포함하는 에멀션을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 다수의 핵산 분자, 다수의 비드, 및 다수의 시약을 포함하는 수용액 및 오일을 접촉시켜서 다수의 핵산 분자의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자), 다수의 비드의 비드, 및 다수의 시약의 시약을 포함하는 다수의 수성 액적을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 다수의 핵산 분자는 다수의 세포에 포함될 수 있어서, 다수의 수성 액적은 다수의 세포를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 액적은 하나 이하의 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 동일한 층의 하나 이상의 액적이 조합될 수 있다. 예를 들어, 다수의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)를 포함하는 다수의 제1 액적 (예를 들어, 수성 액적)은 다수의 비드 및/또는 시약을 포함하는 다수의 제2 액적 (예를 들어, 수성 액적)과 조합 (예를 들어, 병합 또는 융합)하여 다수의 핵산 분자 및 다수의 비드 및/또는 시약을 포함하는 다수의 제3 액적 (예를 들어, 수성 액적)을 제공할 수 있다. 제1 및 제2의 다수의 액적은 동일한 물질 (예를 들어, 동일한 성질 예컨대 극성을 가짐)을 포함할 수 있거나 또는 상이한 물질 (상이한 성질 예컨대 상이한 극성을 가짐)일 수 있다. 다른 경우에서, 다수의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)를 포함하는 제1 물질 (예를 들어, 수성 용액)은 다수의 비드 및/또는 시약을 포함하는 제2 물질 (예를 들어, 수성 용액)과 조합하여 다수의 핵산 분자 및 다수의 비드 및/또는 시약을 포함하는 제3 물질을 제공할 수 있다. 다음으로 제3 물질은 제1 및/또는 제2 용액 (예를 들어, 오일)과 비혼화성일 수 있는 액체 또는 유체와 접촉되어 (또는 접촉시켜) 다수의 액적 (예를 들어, 수성 액적)을 생성시킬 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 용액은 수용액일 수 있고 제1 및 제2 용액과 비혼화성일 수 있는 제3 액체 또는 유체는 오일 (또는 이의 임의 유도체)일 수 있다.
액적은 임의의 유용한 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 에어로졸 또는 공기 나이프 액적 생성기는 전구체 유체의 액적 (예를 들어, 제1 물질 예컨대 수용액)을 다른 용액에 분배하여서 액적을 생성하는데 사용될 수 있다. 미세유체 액적 생성 방법이 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, 제1 물질 (예를 들어, 수성 용액)은 액적이 형성될 수 있는 액적 생성 접합부를 향해서 제2 채널에서 흐르는 제2 물질 (예를 들어, 오일)과 접촉되는 액적 생성 접합부를 향해서 제1 채널에서 흐를 수 있다. 일부 경우에, 제1 물질의 액적은 제1 물질이 노즐을 통해서 제2 물질을 포함하는 영역으로 가도록 강제하여 형성될 수 있다. 제1 물질은 수용액일 수 있고 하나 이상의 구성요소, 예컨대 다수의 핵산 분자, 다수의 비드, 및/또는 다수의 시약을 포함할 수 있어서, 형성된 액적은 핵산 분자, 비드, 및/또는 시약을 포함할 수 있다. 다양한 다른 구성을 사용하여 액적을 생성시킬 수 있다. 이러한 구성의 예 및 액적 생성 방법의 상세 사항은 예를 들어, 미국 특허 제9,694,361호 및 미국 공개 특허 출원 제2018/0334670호에서 확인할 수 있고, 이들은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
일부 경우에, 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)의 생성은 다수의 핵산 분자를 포함하는 제1 수성 용액 및 다수의 입자 예컨대 비드 (그들 표면에 부착된 프라이머 서열을 갖는 비드)를 포함하는 제2 수성 용액의 사용을 포함할 수 있다. 다음으로, 제1 수성 용액 및 제2 수성 용액은 제1 및/또는 제2 용액과 비혼화성일 수 있는 제3 액체 또는 유체 (예를 들어, 오일)와 접촉될 수 있다 (예를 들어, 액적 생성 접합부에서). 이러한 비혼화성 또는 극성 차이는 에멀션 (예를 들어, 유성 에멀션 중 수성)의 형성을 일으킬 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 에멀션은 다수의 파티션 예컨대 액적 (예를 들어, 수성 액적)을 포함할 수 있다. 이들 액적은 비드, 핵산 분자, 및 추가 성분 예컨대 시약을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 방법에 따라서 생성된 다수의 액적의 액적은 각각이 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자), 2 이상의 비드, 및 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 하나 이상의 핵산 분자에 상응하는 증폭 산물이 액적 내에서 생성될 수 있는 반응 용기로서 제공될 수 있다. 각각이 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 경우에, 시약은 그 안의 하나 이상의 핵산 분자에 대한 접근성을 제공하기 위해 세포를 용해 및/또는 투과하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
다수의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)는 제1 용액 (예를 들어, 수성 용액)으로 제공될 수 있고, 다수의 비드는 제2 용액 (예를 들어, 수성 용액)으로 제공될 수 있다. 제1 및 제2 용액는 동일한 용액 (예를 들어, 양쪽 수성 용액)일 수 있거나 또는 상이한 용액일 수 있다. 다수의 핵산 분자를 포함하는 제1 용액 및 다수의 비드를 포함하는 제2 용액은 제3 액체 또는 유체 (예를 들어, 오일)와 접촉될 수 있다. 제3 액체 또는 유체는 제1 및 제2 용액 둘 모두와 비혼화성일 수 있고 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은) 제1 및 제2 용액과 접촉시 에멀션을 형성할 수 있다. 하나 이상의 용액을 하나 이상의 비혼화성 유체와 접촉시켜 생성되는 에멀션은 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)을 형성하거나 또는 생성시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은, 파티션은 수성 분산상으로부터 형성되고 연속층 (예를 들어, 오일)에 의해 밀봉될 수 있는 액적일 수 있다. 에멀션은 연속층 내에서 분산상 입자 (예를 들어, 파티션 예컨대 액적)의 크기에 의존하여 마이크로-에멀션 또는 나노-에멀션일 수 있다. 일부 예에서, 파티션은 제1 파티션을 제2 파티션으로부터 분리시키거나 또는 파티션의 내부 부피를 파티션 외부의 부피로부터 분리시키도록 구성된 임의 유닛을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 파티션은 웰, 마이크로웰, 컨테이너, 튜브, 저장소, 리셉터클 또는 다른 용기일 수 있다.
따라서, 분할은 다수의 액적 (예를 들어, 에멀션 중 수성 액적) 또는 웰의 제공으로서 본 명세서에 기술될 수 있다. 다수의 파티션의 파티션 예컨대 다수의 액적의 액적은 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 하나 이상의 (예를 들어, 2 이상의) 비드를 포함하는 수용액을 함유할 수 있다. 파티션은 또한 하나 이상의 시약, 예컨대 세포를 용해 또는 투과하기 위한 하나 이상의 시약 또는 증폭 반응을 수행하기 위한 하나 이상의 시약 (예를 들어, 뉴클레오티드, 중합 효소 등)을 포함할 수 있다. 다수의 파티션의 파티션은 상이한 성분 또는 이의 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다수의 파티션의 제1 파티션은 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있고 비드를 포함하지 않을 수 있는 한편, 다수의 파티션의 제2 파티션은 하나 이상의 핵산 분자 및 2 이상의 비드를 포함할 수 있다. 또한, 다수의 파티션의 제3 파티션은 하나 이상의 핵산 분자 및 하나의 비드를 포함할 수 있는 한편, 다수의 파티션의 제4 파티션은 하나 이상의 비드를 포함할 수 있고 임의의 핵산 분자를 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 다수의 파티션의 하나 이상의 파티션은 비점유될 수 있다 (예를 들어, 핵산 분자, 비드, 또는 시약을 함유하지 않음). 파티션 내 물질의 분포는 적어도 부분적으로 포아송 분포에 의해 제어될 수 있다. 일부 경우에, 액적 내부에 제공된 물질 (예를 들어, 핵산 분자, 비드, 및 시약)의 양은 다양한 용액 중에 제공된 물질의 양 및 미세유체 채널을 통한 용액 및 유체의 유속을 최적화하여 조율될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널을 통한 유체 또는 용액의 유속은 적어도 부분적으로 특정 압력 또는 진공의 적용, 및/또는 채널의 길이 및 너비의 신중한 선택을 통해서 제어될 수 있다. 구성요소 예컨대 여과 구조, 테이퍼드 영역, 흐름 조절기, 및 공기 트랩은 또한 액적 생성 시스템을 사용하여 생성된 액적의 점유를 제어할 수 있다. 일례에서, 과량의 비드는 포아송 통계를 무효화시키고자 시도하고 달리 생성될 수 있는 적어도 2개 비드를 포함하는 더 많은 파티션을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 액적 생성 시스템은 적어도 2개 비드를 포함하는 다수의 파티션의 더 많은 비율의 파티션의 생성을 촉진하기 위해 비드가 과로딩될 수 있다.
일부 경우에, 생성된 파티션의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하가 비점유될 수 있다. 일부 경우에, 생성된 파티션의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하는 비드를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 생성된 파티션의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하는 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 생성된 파티션의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하는 시약을 포함하지 않는다. 생성된 파티션의 적어도 서브세트는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은) 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자), 하나 이상의 비드, 및 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 생성된 파티션의 적어도 서브세트는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은) 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자), 2 이상의 비드 (예를 들어, 적어도 2개 비드), 및 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 파티션 예컨대 액적은 적어도 하나, 적어도 2, 또는 적어도 5 핵산 분자 및 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 또는 적어도 10 비드를 포함할 수 있다.
파티션 예컨대 액적은 동일하거나 또는 상이한, 예컨대 그들 뉴클레오티드 서열의 관점 및/또는 핵산 분자가 연결된 하나 이상의 어댑터 서열의 관점에서 동일하거나 또는 상이한 적어도 2개 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 개시의 파티션은 상기 파티션에 존재하는 핵산 분자의 수와 비교하여 과량의 비드를 포함할 수 있다. 파티션은 핵산 분자의 적어도 2배 만큼 많은 비드를 포함할 수 있다. 파티션 예컨대 액적의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 그 이상의 비드는 같은 (예를 들어, 동일한) 비드일 수 있거나 또는 상이한 비드일 수 있다. 상이한 비드는 상이한 성질 예컨대 크기, 직경, 유동성, 강직성, 다공성, 또는 압축성을 포함할 수 있다. 상이한 비드는 상이한 물질 (예를 들어, 상이한 히드로겔)로 형성될 수 있다. 일부 경우에, 파티션은 히드로겔 비드인 적어도 하나의 비드 및 상자성인 적어도 하나의 비드를 포함할 수 있다. 게다가, 제1 파티션 예컨대 제1 액적의 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 또는 적어도 10 비드는 제2 파티션 예컨대 제2 액적의 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 또는 적어도 10 비드가 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 비드는 이에 커플링 (예를 들어, 비드의 성분의 표면에 결합 또는 연결)된 다수의 물질 (예를 들어, 핵산 바코드 분자 또는 프라이머 분자)을 포함할 수 있다.
다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)의 각각의 파티션 (예를 들어, 각각의 액적)은 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)의 임의의 다른 파티션 (예를 들어, 다른 액적)과 비교하여 동일하거나 또는 상이한 핵산 분자 및/또는 동일하거나 또는 상이한 비드, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)의 제1 파티션 (예를 들어, 제1 액적)은 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)의 제2 파티션 (예를 들어, 제1 액적)과 비교하여 동일하거나 또는 상이한 핵산 분자 (예를 들어, 상이한 뉴클레오티드 서열을 가짐)를 포함할 수 있다. 유사하게, 제1 파티션 (예를 들어, 제1 액적)은 제2 파티션 (예를 들어, 제1 액적)과 비교하여 동일하거나 또는 상이한 비드 (예를 들어, 상이한 프라이머 가짐)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 입자 (예를 들어, 비드) (예를 들어, 파티션 예컨대 에멀션 액적 내부에 위치된 비드)는 다수의 프라이머 분자 (예를 들어, 핵산 바코드 분자)를 포함할 수 있다. 다수의 프라이머 분자는 비드에 부착 (예를 들어, 화학적으로 연결)될 수 있고, 하나 이상의 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 비드에 부착될 수 있는 하나 이상의 프라이머 분자는 동일하거나 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다수의 프라이머 분자는 비드에 부착 (예를 들어, 화학적으로 연결)될 수 있어서 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)는 비드에 커플링된 다수의 프라이머 분자의 적어도 하나의 프라이머 분자에 결합 (예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로) 또는 혼성화될 수 있고, 그리하여 핵산 분자를 비드에 연결 (예를 들어, 고정화)된다. 다수의 프라이머 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응 (예를 들어, PCR)을 수행하여 파티션 예컨대 액적 내부에서 다수의 증폭 산물을 생성시킬 수 있다. 하나 이상의 증폭 반응은 하나 이상의 프라이머 연장 반응을 포함할 수 있고, 이러한 반응은 표적 핵산 분자에 프라이머의 혼성화 및 (예를 들어, 중합 효소를 통해) 프라이머 분자의 후속 연장을 포함하여서 표적 핵산 분자의 서열의 상보체를 생성시킬 수 있다. 각각의 파티션 (예를 들어, 액적)에서 생성된 증폭 산물은 파티션 (예를 들어, 동일한 뉴클레오티드 서열을 가짐) 내에 포함된 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자) 또는 이의 유도체 또는 단편 (예를 들어, 상이한 뉴클레오티드 서열을 가짐)의 동일한 카피일 수 있다. 이러한 유도체 및 단편은 그들 뉴클레오티드 서열의 길이 및/또는 서열이 다양할 수 있고 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 동안 생성될 수 있다. 일부 경우에, 증폭 반응은 하나 이상의 서열을 증폭 산물에 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 바코드 서열, 고유 분자 식별자, 어댑터 서열, 플로우 셀 어댑터, 또는 다른 서열을 증폭 산물에 도입시킬 수 있다. 이러한 서열은 (예를 들어, 핵산 시퀀싱 어세이를 통해) 후속 처리를 촉진할 수 있다.
예를 들어, 제1 비드는 이에 커플링된 핵산 바코드 분자의 제1 세트를 포함할 수 있고, 제2 비드는 이에 커플링된 핵산 바코드 분자의 제2 세트를 포함할 수 있다. 핵산 바코드 분자의 제1 세트의 핵산 바코드 분자는 각각이 제1 바코드 서열 및 제1 프라이머 서열을 포함할 수 있는 한편, 핵산 바코드 분자의 제2 세트의 핵산 바코드 분자는 각각이 제2 바코드 서열 및 제2 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 제1 바코드 서열은 제2 바코드 서열과 상이할 수 있다. 제1 프라이머 서열은 제2 프라이머 서열과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 소정 파티션의 제1 및 제2 비드는 함께 연결 (예를 들어, 속박)될 수 있다. 바코드 서열은 비드가 동일한 바코드 서열을 포함하지 않도록 고유할 수 있다. 대안적으로, 바코드 서열은 유의하게 희석 (예를 들어, 많은 수로 존재, 예컨대 적어도 1백만, 적어도 천만, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열이 사용)될 수 있어서, 바코드 서열은 상이한 파티션 사이에서 반복될 것으로 예상되지 않는다. 일례에서, 다수의 파티션의 제1 파티션은 (i) 핵산 바코드 분자 각각이 제1 바코드 서열 및 제1 프라이머 서열을 포함하는, 그에 커플링된 핵산 바코드 분자의 제1 세트를 포함하는 제1 비드, 및 (ii) 핵산 바코드 분자 각각이 제2 바코드 서열 및 제2 프라이머 서열을 포함하는, 그에 커플링된 핵산 바코드 분자의 제2 세트를 포함하는 제2 비드를 포함할 수 있다. 다수의 파티션의 제2 파티션은 (i) 핵산 바코드 분자 각각이 제3 바코드 서열 및 제3 프라이머 서열을 포함하는, 그에 커플링된 핵산 바코드 분자의 제3 세트를 포함하는 제3 비드, 및 (ii) 핵산 바코드 분자 각각이 제4 바코드 서열 및 제4 프라이머 서열을 포함하는, 그에 커플링된 핵산 바코드 분자의 제4 세트를 포함하는 제4 비드를 포함할 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 바코드 서열은 서로 모두 상이할 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 프라이머 서열은 모두 동일할 수 있다. 예를 들어, 다양한 프라이머 서열은 하나 이상의 표적 핵산 분자에 커플링된 어댑터, 또는 소정 표적 핵산 분자에 혼성화 및/또는 포획되도록 구성된 표적화된 프라이머 서열일 수 있다. 일례에서, 다양한 프라이머 서열은 폴리 (T) 서열을 포함할 수 있고 리보핵산 (RNA) 분자 예컨대 메신저 RNA (mRNA) 분자의 폴리 (A) 서열에 혼성화되도록 구성될 수 있다.
도 4는 주형 핵산 분자에 커플링될 수 있는 기능성 서열의 예를 도시한다. 예를 들어, 기능성 서열은 증폭 프라이머 서열, 시퀀싱 프라이머 서열, 이의 상보체 및/또는 이의 조합이다. 증폭 프라이머 서열은 용액 증폭 프라이머 서열일 수 있다. 증폭 프라이머 서열은 기재 고정화 프라이머 서열일 수 있다. 시퀀싱 프라이머 서열는 코딩 가닥의 시퀀싱을 촉진하기 위해 구성될 수 있다. 시퀀싱 프라이머 서열은 주형 가닥의 역방향 상보체의 시퀀싱을 촉진하기 위해 구성될 수 있다. 좌측 패널의 좌측 부분은 주형 핵산 분자의 제1 가닥(420)에 커플링된 기재 고정화 프라이머 분자(403)를 통해서 표면(450)에 고정화된 주형 핵산 분자를 도시한다. 주형 핵산 분자의 제2 가닥(430)은 코딩 가닥의 시퀀싱을 위한 어댑터(406)를 비롯하여 용액 증폭 프라이머 분자(407)를 포함한다. 좌측 패널의 우측 부분은 주형 핵산 분자의 제2 가닥(430)에 커플링된 기재 고정화 프라이머 분자(403)를 통해서 표면(450)에 고정화된 주형 핵산 분자의 동일한 카피를 도시한다. 핵산 분자의 제1 가닥(420)은 용액 증폭 프라이머 분자(407) 및 역방향 상보성 가닥의 시퀀싱을 위한 어댑터(408)를 포함한다. 기재 고정화 프라이머 (예를 들어, 403)는 제2 어댑터(402) ("어댑터 2")로 간주되는 한편 주형 핵산 분자의 소정 가닥에 커플링된 증폭 및 시퀀싱 프라이머 (예를 들어, 406 및 407, 408 및 407)는 함께 제1 어댑터(401) ("어댑터 1")를 구성할 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 제1 어댑터(401)는 다양한 서열이 상이한 용융 온도를 가질 수 있고 그러므로 예를 들어 소정 온도 범위로 어댑터를 포함하는 분자를 가열하여, 부분적으로 변성시킬 수 있도록 구성될 수 있다. 도 4의 우측 패널은 시퀀싱 어댑터(475) (예를 들어, 시퀀싱 프라이머)를 통해서 제2 주형 핵산 분자(480)에 연결된 제1 주형 핵산 분자(470)를 도시하고, 여기서 복합체는 기재(460)에 기재 고정화 프라이머 분자(465)를 통해서 고정화된다. 시퀀싱 어댑터(475)는 스템 루프 구성(403)("어댑터 1")으로 제공될 수 있는 한편 복합체의 유리 말단에 첨부된 어댑터(485)는 Y-형상 구성(404)("어댑터 2")으로 제공될 수 있다. 어댑터(485)는 시퀀싱 프라이머 및 용액 증폭 프라이머를 포함할 수 있다.
하나 이상의 상이한 프라이머 분자가 하나의 비드에 연결(예를 들어, 화학적으로 연결)될 수 있는 만큼, 본 명세서에 기술된 바와 같은 파티션 또는 액적은 다수의 비드를 포함할 수 있고, 각각의 비드는 하나 이상의 프라이머 분자에 연결되고, 하나 이상의 프라이머 분자는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다 (예를 들어, 동일하거나 또는 상이한 뉴클레오티드 서열 포함). 다시 말해서, 단일 파티션 또는 액적 내 다수의 비드는 다수의 동일하거나 또는 상이한 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)에 결합할 수 있는 다수의 동일하거나 또는 상이한 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 다수의 핵산 분자는 다수의 프라이머 분자 (예를 들어, 핵산 바코드 분자)를 사용하여 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 파티션에서 증폭될 수 있다. 본 개시의 방법은 또한 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 링커 또는 하나 이상의 스플린트 올리고뉴클레오티드를 통해) 제1 비드를 제2 비드에 연결하여 형성될 수 있는 비드쌍의 사용을 포함할 수 있고, 비드쌍의 제1 비드 및 제2 비드는 상이한 프라이머 분자 (예를 들어, 핵산 바코드 분자)를 포함한다.
비드는 하나 이상의 링커를 통해 연결될 수 있다. 링커는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 링커는 하나 이상의 탄수화물 분자를 포함할 수 있다. 링커는 친화성 결합 단백질을 포함할 수 있다. 링커는 친수성일 수 있다. 링커는 소수성일 수 있다. 링커는 정전기적일 수 있다. 링커는 표지될 수 있다. 링커는 절단성 링커 또는 비-절단성 링커일 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 링커 모이어티는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 염료, 형광단, 또는 퀀텀 도트로 표지될 수 있다.
다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)의 각각의 파티션 (예를 들어, 액적)은 하나 이상의 표적 핵산 분자 및 하나 이상의 비드 이외에도, 하나 이상의 시약을 더 포함할 수 있다. 각 파티션 내부에 존재할 수 있는 시약은 완충액 (예를 들어, 일정 농도의 다양한 이온), 단백질 (예를 들어, 효소 예컨대 중합 효소), 단량체 분자 (예를 들어, 뉴클레오티드 예컨대 dNTP), 올리고머 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드), 및 중합체 분자 (예를 들어, 핵산 예컨대 합성 핵산 분자)를 포함할 수 있다. 시약은 그 안의 핵산 분자에 대한 접근성을 제공하기 위해서 세포를 용해 또는 투과시키는데 유용할 수 있다. 시약은 증폭 및/또는 프라이머 연장 반응에서 유용할 수 있다. "시약" 핵산 분자 (생물학적 샘플의 "샘플" 또는 "표적" 핵산 분자와 반대로)는 프라이밍 서열 및/또는 고유 분자 식별자 (예를 들어, 무작위적 식별자 또는 바코드)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술되고 사용되는 프라이밍 서열은 표적-특이적 또는 비-표적-특이적 (예를 들어, 무작위 N-량체)일 수 있다. 게다가, 시약 핵산 분자는 기능성 서열 예컨대 시퀀싱 어댑터 및 플로우 셀 서열을 포함할 수 있다. 이러한 "시약" 핵산 분자는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 비드에 커플링될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 중합 효소는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 폴리머라제의 효소일 수 있다. 폴리머라제의 효소는 내생성 폴리머라제의 효소 또는 변형된 (예를 들어, 조작된) 폴리머라제의 효소일 수 있다. 폴리머라제의 효소는 다수의 증폭 산물을 생성시키도록 증폭 반응 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)을 수행하는데 사용될 수 있다.
파티션의 추가 성분은 합성 핵산 분자일 수 있다. 합성 핵산 분자는 이중 가닥일 수 있다. 합성 핵산 분자는 절단성 구성요소를 포함할 수 있다. 절단성 구성요소는 합성 핵산 분자의 성분의 분리를 가능하게 할 것이다. 분리는 화학, 광, 열, 또는 다른 접근법으로 수행될 수 있다. 합성 핵산 분자는 또한 결찰 및/또는 원형화가 수행될 수 있다. 결찰 및/또는 원형화 시에, 합성 핵산 분자는 절단되어 절단된 합성 핵산 분자를 제공할 수 있다. 다음으로 절단된 합성 핵산 분자는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 증폭 반응을 통해서 갭 충전이 수행될 수 있다.
생물학적 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)는 다수의 파티션 사이에 분할되기 전에 처리될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 샘플의 핵산 분자는 다수의 파티션 사이에 분할된 후에 처리될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 (예를 들어, 혼성화 또는 결찰 과정을 통해서) 하나 이상의 어댑터로 작용화될 수 있다. 어댑터는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 데이터 분석 (예를 들어, 시퀀싱 및 서열의 분석) 동안 본래 샘플 핵산 분자 및 상응하는 증폭 산물의 확인을 허용할 수 있는 무작위적 식별자 서열 (예를 들어, 바코드 또는 고유 분자 식별자 (UMI) 서열)을 포함할 수 있다. 어댑터 (또는 다수 어댑터)에 대한 핵산 분자의 결찰 반응은 용액 (예를 들어, 다수의 파티션 사이에 분할 전) 또는 에멀션 (예를 들어, 다수의 파티션에 분할 이후)에서 발생될 수 있다. 따라서, 결찰 반응은 핵산 분자 및 어댑터 둘 모두가 수용액 중에 있을 때 발생될 수 있고, 수성 용액은 파티션 예컨대 에멀션 액적 내부의 수용액일 수 있다. 핵산 분자 (예를 들어, 단일 핵산 가닥)에 부착 (예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로 연결)된 어댑터의 서열은 프라이머 분자 또는 이의 서열에 대한 핵산 분자의 결합을 촉진할 수 있다. 이러한 프라이머 분자는 비드에 부착될 수 있어서, 프라이머와 이의 어댑터 서열을 통한 핵산 분자의 상호작용 (예를 들어, 결합 예컨대 공유적 또는 비공유적)은 파티션 예컨대 에멀션 액적 또는 웰 내 비드에 핵산 분자를 부착시킬 수 있다. 핵산 분자를 비드에 연결 시, 하나 이상의 증폭 반응 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)은 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 수행되어서 상기 핵산 분자의 다수의 증폭 산물을 생성시킬 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 어댑터는 페어드-엔드 서열 리드의 생산이 가능할 수 있다. 따라서, 핵산 분자에 대한 비드의 더 높은 분량 비율 및 페어드-엔드 어댑터의 조합은 생물학적 샘플 (예를 들어, 표적 핵산 분자)을 분석하기 위한 정확도 및 감도가 증가된 방법을 제공할 수 있다.
본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 하나 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 2 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 3 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 넷이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 5 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 6 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 7 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 8 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 9 이상의 비드를 포함한다. 본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%는 10 이상의 비드를 포함한다.
본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 75%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 80%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 85%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 90%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 95%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 97%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 99%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 약 다수의 파티션의 100%는 약 1 내지 3 비드를 포함한다.
본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 75%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 80%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 85%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 90%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 95%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 97%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 99%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 100%는 약 2 내지 5 비드를 포함한다.
본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 75%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 80%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 85%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 90%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 95%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 97%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 99%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 100%는 약 3 내지 7 비드를 포함한다.
본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 75%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 80%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 85%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 90%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 95%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 97%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 99%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 100%는 약 5 내지 10 비드를 포함한다.
본 개시의 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 75%는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 10 이상의 비드 대 핵산 분자 비율을 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 85%는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 10 이상의 비드 대 핵산 분자 비율을 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 95%는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 10 이상의 비드 대 핵산 분자 비율을 포함한다. 방법은 다수의 파티션 (예를 들어, 액적)을 제공할 수 있고, 다수의 파티션의 적어도 99%는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 10 이상의 비드 대 핵산 분자 비율을 포함한다.
본 개시의 방법은 비드의 다수의 상이한 세트의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트의 사용을 포함할 수 있다. 제1 비드 세트 (또는 다수)의 제1 비드는 생물학적 샘플의 제1 핵산 가닥 (예를 들어, 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 하나 이상의 DNA 또는 RNA 분자)에 커플링 (예를 들어, 공유적 또는 비공유적 연결)된 제1 어댑터 (예를 들어, 제2 페어드-엔드 어댑터 서열)와 적어도 부분적 서열 상보성을 갖는 제1 프라이머를 포함할 수 있다. 제2 비드 세트의 제2 비드는 생물학적 샘플의 제2 핵산 가닥에 커플링된 제2 어댑터 (예를 들어, 제2 페어드-엔드 어댑터 서열)와 서열 상보성을 갖는 제2 프라이머를 포함할 수 있다. 제1 프라이머는 제2 프라이머와 상이할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 (i) 제1 비드 세트의 제1 비드, (ii) 제2 비드 세트의 제2 비드, 및 (iii) 이에 커플링된 제1 또는 제2 어댑터를 포함하는 핵산 분자를 파티션에서 분할 (예를 들어, 공-분할)하는 단계를 포함할 수 있다. 분할은 예를 들어 하나 이상의 액적 (예를 들어, 에멀션) 또는 웰을 사용하여 획득될 수 있다. 제1 및 제2 세트의 비드를 포함하는 비드쌍이 사용될 수 있어서 소정 비드 쌍은 제1 세트의 비드 및 제2 세트의 비드를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 비드쌍을 포함하는 소정 파티션으로 제1 및 제2 프라이머 둘 모두의 전달을 촉진할 수 있다.
일례에서, 적어도 2개 비드 (임의로 비드쌍으로 구성된, 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드로서, 제1 비드는 제1 프라이머 분자를 포함하고 제2 비드는 제2 프라이머 분자를 포함함) 및 하나 이상의 어댑터 서열 (제1 비드의 프라이머 서열과 상호작용하도록 구성된 제1 어댑터 및/또는 제2 비드의 프라이머 서열과 상호작용하도록 구성된 제2 어댑터)을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적)의 파티션 (예를 들어, 액적)은 제1 및/또는 제2 어댑터, 또는 이의 상보체 (또는 단편)에 커플링된 핵산 분자 또는 이의 가닥 (예를 들어, 단일-가닥 (ss) DNA 또는 RNA)의 하나 이상의 카피의 생성을 가능하게 하는 조건이 가해질 수 있다. 핵산 분자가 이중 가닥 핵산 분자 (예를 들어, 이중 가닥 (ds) DNA)인 경우에, 핵산 분자의 양쪽 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체 또는 단편이 생성될 수 있다. 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 생성은 제1 및 제2 비드 및 핵산 분자에 대해서 프라이머 연장 반응 및/또는 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)을 수행하기에 충분한 조건을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 비드의 제1 프라이머 분자 및/또는 제2 비드의 제2 프라이머 분자는 제1 및/또는 제2 어댑터 서열을 포함하는 핵산 분자의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제1 또는 제2 비드에 커플링될 수 있고 따라서 추가 증폭 반응에 사용될 수 있다. 특정 예에서, 핵산 분자는 제1 어댑터에 커플링된 제1 가닥 및 제2 어댑터에 커플링된 제2 가닥을 포함할 수 있고, 제1 어댑터는 제1 비드의 제1 프라이머 분자와 상호작용하도록 구성되고 제2 어댑터는 제2 비드의 제2 프라이머 분자와 상호작용하도록 구성된다. 제1 프라이머 분자는 핵산 분자의 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있고, 제2 프라이머 분자는 핵산 분자의 제2 가닥의 하나 이상의 카피 및/또는 이의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자의 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제1 비드에 커플링될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제2 비드에 커플링될 수 있다. 이들 커플링된 카피 및/또는 상보체는 추가 증폭 반응에 사용될 수 있다. 제1 가닥의 하나 이상의 카피의 서열, 또는 이의 상보체는 제2 가닥의 하나 이상의 카피의 서열, 또는 이의 상보체와 적어도 부분적으로 중복될 수 있다.
이중 가닥 주형 분자를 설명하는 예는 또한 단일 가닥 주형 분자에 적용될 것임을 당업자는 이해할 것이다. 특정 예에서, 주형 단일 가닥은 제1 어댑터에 커플링될 수 있고 제2 어댑터에 상보성인 영역을 포함할 수 있으며, 제1 어댑터는 제1 비드의 제1 프라이머 분자와 상호작용하도록 구성되고 제2 어댑터는 제2 비드의 제2 프라이머 분자와 상호작용하도록 구성된다. 제2 어댑터가 주형에 존재하지 않지만, 상보성 가닥의 합성 이후에, 새로운 가닥은 제2 어댑터를 포함한다. 제1 프라이머 분자는 주형의 하나 이상의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있고 제2 프라이머 분자는 주형의 상보체의 하나 이상의 상보체 또는 카피를 생성하는데 사용될 수 있다. 주형 단일 가닥 분자의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제1 비드에 커플링될 수 있다. 주형 단일 가닥 분자에 대한 상보체의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제2 비드에 커플링될 수 있다. 일반적으로, 전술한 예 전반에서 이중 가닥 주형이 기술되었지만, 제2 가닥에 설명된 영역에 상보성인 영역을 포함하는 단일 가닥 주형이 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
증폭 과정 완료 시, 다수 파티션 중에 분포된 다수의 비드 (예를 들어, 다수의 비드-핵산 분자 복합체)는 다수의 파티션 (예를 들어, 액적 또는 웰)으로부터 회수될 수 있고, 비드 (예를 들어, 다수의 비드-핵산 분자 복합체)는 에멀션 또는 혼합물로부터 분리 (예를 들어, 자성으로 분리)될 수 있다. 후속하여, 임의의 이전 증폭 및/또는 처리 과정 동안 형성될 수 있는 핵산 분자 또는 이의 임의 유도체가 어세이 또는 분석 (예를 들어, 시퀀싱기에서 뉴클레오티드 서열을 결정하여)될 수 있다.
일부 경우에, 상이한 비드 개수를 포함하는 파티션 (예를 들어, 액적)은 서로 분리될 수 있다. 예를 들어, 제1 비드 개수를 포함하는 제1 파티션 (예를 들어, 액적)은 제2 비드 개수를 포함하는 제2 파티션 (예를 들어, 액적)으로부터 분리될 수 있다. 제1 비드 개수 및 제2 비드 개수는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 파티션은 단일 비드를 포함할 수 있고 제2 파티션는 2개 비드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 소정 비드 개수를 포함하는 파티션의 전부 또는 대부분은 상이한 비드 개수를 포함하는 파티션의 전부 또는 대부분으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 단일 비드를 포함하는 파티션의 전부 또는 대부분은 0 비드를 포함하는 파티션 및/또는 2 이상의 비드를 포함하는 파티션으로부터 분리될 수 있다. 다른 예에서, 2개 비드를 포함하는 파티션의 전부 또는 대부분은 다른 개수의 비드를 포함하는 파티션으로부터 분리될 수 있다. 상이한 비드 개수를 포함하는 파티션의 분리는 예를 들어, 상이한 비드 개수를 포함하는 파티션을 광학적으로 검출하고, 적어도 부분적으로 이러한 광학 검출을 기반으로, 제1 비드 개수를 포함하는 파티션 (예를 들어, 액적)을 제1 방향 (예를 들어, 제1 채널을 따라)으로 그리고 제2 비드 개수를 포함하는 파티션 (예를 들어, 액적)을 제2 방향 (예를 들어, 제2 채널을 따라)으로 보내도록 (예를 들어, 미세유체 채널 시스템 내) 흐름의 방향을 조절하여 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 광학 및 비광학 전략을 포함하여, 다른 분리 전략이 사용될 수 있다. 예를 들어, 물리적 성질, 예컨대 파티션의 질량 또는 밀도는 파티션을 분리하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 다수의 파티션은 이러한 분리를 촉진시키도록 하나 이상의 힘 또는 전계가 가해질 수 있다.
일부 경우에, 비드에 부착된 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)는 시퀀싱된다. 다른 경우에, 비드에 부착되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)가 시퀀싱된다. 예를 들어, 비드에 부착된 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)는 (예를 들어, 핵산 분자 및 비드를 탈커플링하여) 비드로부터 제거될 수 있고 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이) 시퀀싱을 위한 시퀀싱 시스템에 제공될 수 있다. 핵산 분자는 예를 들어 이를 포함하는 비드 또는 파티션에 자극을 인가하여 비드로부터 제거될 수 있다. 이러한 자극은 예를 들어, 열 자극, 빛 자극, 또는 화학 자극 (예를 들어, 환원제)일 수 있다. 비드로부터 제거된 핵산 분자는 후속하여 플로우 셀의 표면 (예를 들어, 플로우 셀 내 하나 이상의 웰)에 부착될 수 있고, 여기서 그들은 하나 이상의 시퀀싱 반응 및/또는 하나 이상의 추가 증폭 반응을 겪을 수 있다.
일부 경우에, 다수의 상이한 비드 세트를 사용하여 시퀀싱을 위한 핵산 샘플을 제조할 수 있다. 예를 들어, 제1 비드 세트의 제1 비드는 제1 기능을 수행하는데 사용될 수 있고 제2 비드 세트의 제2 비드는 제2 기능을 수행하는데 사용될 수 있다. 상이한 비드 세트는 동일하거나 또는 상이한 물질을 포함할 수 있고 임의 수의 공유 또는 상이한 성질 (예를 들어, 형상, 크기, 상자성 상태 등)을 갖는다. 예를 들어, 제1 비드 세트의 제1 비드는 제2 비드 세트의 제2 비드에 비해 작을 수 있다. 제1 비드 세트의 제1 비드는 약 1-100 나노미터 (nm), 예컨대 약 50 nm의 직경을 갖는 나노비드일 수 있는 한편, 제2 비드 세트의 제2 비드는 약 100 nm 보다 큰 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 비드 세트의 제2 비드는 약 1-100 마이크로미터 (㎛)의 직경을 갖는 미세비드일 수 있다. 제1 비드는 또한 자성일 수 있지만, 제2 비드는 자성이 아닐 수 있다. 상이한 비드 세트에 의해 수행되는 상이한 기능은 예를 들어, 주형 로딩, 증폭, 및 시퀀싱을 포함할 수 있다. 일례에서, 제1 비드 세트의 제1 비드는 후속 처리를 위해 다수의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제조하는데 사용될 수 있다. 제1 비드는 이에 커플링된 다수의 프라이머 분자를 포함할 수 있고, 프라이머 분자는 다수의 핵산 분자의 핵산 분자 서열에 상보성일 수 있다. 예를 들어, 제1 비드 세트의 제1 서브세트는 다수의 핵산 분자의 핵산 분자의 제1 서열에 상보성인 제1 프라이머 분자를 포함할 수 있고 제1 비드 세트의 제2 서브세트는 다수의 핵산 분자의 핵산 분자의 제2 서열에 상보성인 제2 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 제1 서열은 다수의 핵산 분자의 핵산 분자에 커플링된 제1 어댑터의 서열일 수 있고 제2 서열은 다수의 핵산 분자의 핵산 분자 (예를 들어, 동일하거나 또는 상이한 핵산 분자)에 커플링된 제2 어댑터의 서열일 수 있다. 제1 서열은 다수의 핵산 분자의 핵상 분자의 제1 가닥에 커플링될 수 있고 제2 서열은 다수의 핵산 분자의 핵산 분자의 제2 가닥에 커플링될 수 있다. 제1 비드 세트 및 다수의 핵산 분자은 대량 용액으로 조합될 수 있고 다수의 핵산 분자의 핵산 분자의 서열에 제1 비드 세트의 제1 비드에 커플링된 프라이머 분자를 혼성화하는데 충분한 조건이 가해질 수 있다. 다음으로 프라이머 분자는 다수의 핵산 분자의 가닥에 상보성인 가닥을 생성시키도록 연장될 수 있다. 최종 이중 가닥 핵산 분자는 제1 비드 세트의 제1 비드에 커플링될 수 있다. 비드에 커플링된 이중 가닥 핵산 분자는 예를 들어 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 말단-차단될 수 있다. 일부 경우에, 단일 이중 가닥 핵산 분자는 소정 제1 비드에 커플링될 수 있다. 다른 경우에, 다중 이중 가닥 핵산 분자는 소정 비드에 커플링될 수 있다. 다음으로 대량 용액을 세척할 수 있고 제1 비드 세트는 다수의 핵산 분자의 유리 핵산 분자를 포함하는 용액에서 (예를 들어, 자성 분리를 통해서) 다른 물질로부터 분리될 수 있다.
제1 비드 세트는 다음으로 다수의 파티션 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 액적)에 분할될 수 있다. 다수의 파티션의 파티션은 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자 (예를 들어, 주형 핵산 분자)에 커플링된 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드를 포함할 수 있다. 다수의 파티션의 다른 파티션은 이중 가닥 핵산 분자에 커플링되지 않은 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드를 포함할 수 있다. 다수의 파티션의 또 다른 파티션은 제1 비드 세트의 제1 비드를 포함하지 않을 수 있다.
제1 비드 세트는 하나 이상의 시약 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음) 및 제2 비드 세트와 공분할될 수 있다. 제2 비드 세트는 시퀀싱을 위한 제조에서 주형 핵산 분자를 포획 및 증폭하는데 적합한 프라이머 분자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 제2 비드 세트는 본 명세서에서 "시퀀싱 비드"라고 할 수 있다. 따라서, 다수의 파티션은 (i) 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자에 커플링된 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 적어도 2개 제2 비드를 포함하는 파티션의 제1 서브세트; (ii) 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자에 커플링된 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 오직 하나의 제2 비드를 포함하는 파티션의 제2 서브세트; (iii) 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자에 커플링된 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드를 포함하나 제2 비드 세트의 제2 비드는 없는 파티션의 제3 서브세트; (iv) 이중 가닥 핵산 분자에 커플링되지 않은 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 적어도 2개 제2 비드를 포함하는 파티션의 제4 서브세트; (v) 이중 가닥 핵산 분자에 커플링되지 않은 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 오직 하나의 제2 비드를 포함하는 파티션의 제5 서브세트; (vi) 이중 가닥 핵산 분자에 커플링되지 않은 제1 비드 세트의 하나 이상의 제1 비드를 포함하나 제2 비드 세트의 제2 비드는 없는 파티션의 제6 서브세트; (vii) 제1 비드 세트의 제1 비드를 포함하지 않고 제2 비드 세트의 적어도 2개 제2 비드를 포함하는 파티션의 제7 서브세트; (viii) 제1 비드 세트의 제1 비드를 포함하지 않고 제2 비드 세트의 오직 하나의 제2 비드를 포함하는 파티션의 제8 서브세트; 및 (ix) 제1 비드 세트의 제1 비드 또는 제2 비드 세트의 제2 비드를 포함하지 않는 파티션의 제9 서브세트 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 다수의 파티션의 오직 일정 서브세트는 주형 핵산 분자 및 제2 비드 세트의 적어도 하나의 제2 비드 둘 모두를 포함할 수 있다. 상기 기술된 파티션의 제3 서브세트의 파티션은 제1 비드 세트의 제1 비드에 커플링된 적어도 하나의 주형 핵산 분자를 포함하지만 제2 비드 세트의 제2 비드 (예를 들어, 시퀀싱 비드)는 포함하지 않는다. 이들 파티션이 시퀀싱 비드를 포함하지 않기 때문에 시퀀싱을 위해 물질이 제조되지 않을 것이다. 제3 파티션 세트의 파티션의 내용물의 회수 시, 자성 포획을 사용하여 제1 비드를 제거할 수 있다. 따라서, 제3 파티션 세트의 파티션에 상응하는 시퀀싱 산물이 검출되지 않을 것이다. 상기 기술된 파티션의 제7 서브세트의 파티션은 주형 핵산 분자를 보유하는 제1 비드를 포함하지 않지만 제2 비드 세트의 적어도 2개 제2 비드를 포함한다. 이들 파티션은 주형 핵산 분자를 포함하지 않기 때문에, 주형 핵산 분자에 상응하는 증폭 산물이 생성되지 않을 것이고 시퀀싱 리드가 수득되지 않을 것이다. 자성 분리를 사용하여 주형 핵산 분자에 연결되지 않은 임의의 제1 비드를 제거할 수 있다. 상기 기술된 파티션의 제1 서브세트의 파티션은 주형 핵산 분자에 커플링된 적어도 하나의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 적어도 2개 제2 비드를 포함한다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 따라서, 증폭 및 시퀀싱이 본 명세서에 기술된 바와 같이, 적어도 2개 제2 비드 상에서 일어날 수 있다. 증폭 후 자성 포획은 주형 로딩된 나노 비드 (예를 들어, 제1 비드)를 제거할 수 있어서 이들 비드는 시퀀싱 어세이를 통해 검출되지 않을 것이다. 도 9는 제1 및 제2 비드 세트를 포함한 이러한 방법을 예시한다. 시퀀싱 비드의 세트(901) 및 주형 로딩 나노비드의 세트(902)가 제공된다. 일례에서, 주형 로딩 나노비드는 약 50 나노미터 직경이다. 주형 로딩 나노비드는 자성일 수 있고/있거나 다른 포획 기전을 포함할 수 있다. 주형 로딩 나노비드는 프라이머로 코팅될 수 있다. 제1 주형 제조 작업(910)에서, 주형 로딩 나노비드 (프라이머-코팅) 및 주형 핵산 분자는 대량 혼합물로 조합될 수 있다. 나노비드는 과량으로 제공될 수 있다. 제2 주형 제조 작업(920)에서, 주형은 (i) 나노비드에 주형 어닐링 및 (ii) 연장에 충분한 조건이 가해질 수 있다. 비결합 주형은 예를 들어 고정화 또는 달리 나노비드의 포획 및 세척 용액 도포를 통해 세척해버릴 수 있다. 임의로, 말단은 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 차단된다. 이러한 주형 제조 작업은 나노비드-결합 주형을 생성시킬 수 있다. 에멀션 작업(930)에서, 나노비드-결합 주형은 시퀀싱 비드 및 다른 시약 (예를 들어, 용액 프라이머 분자)과 함께 액적에 분할되어서, 다양하게 점유된 액적 및 일부 경우에 비점유 액적을 생성시킬 수 있다 (940). 일부 액적 (i)은 시퀀싱 비드없이 나노비드-결합 주형을 포함할 수 있다. 일부 액적 (ii)은 나노비드-결합 주형없이 시퀀싱 비드를 포함할 수 있다. 일부 액적 (iii)은 나노비드-결합 주형 및 시퀀싱 비드 둘 모두를 포함할 수 있다. 주형 양성 시퀀싱 비드를 획득하기 위해서, 나노비드는 존재해야한다. 액적은 증폭(940)이 가해질 수 있다. 에멀션은 파괴되어 액적의 내용물을 풀링할 수 있다. 시퀀싱 비드가 (i) 경우처럼 존재하지 않는 경우에, 증폭 후 나노비드 포획 (예를 들어, 자석 사용)은 나노비드-결합 주형을 제거할 수 있고, 나노비드의 포획 및 소형 크기로 인해, 시퀀싱기가 나노비드 (또는 이러한 나노비드에 결합된 주형)를 검출할 수 없어서, 이들 액적으로부터 시퀀싱 리드가 생성되지 않는다. (ii) 경우처럼 주형이 존재하지 않는 경우, 증폭은 주형이 존재하지 않으므로 진행되지 않을 것이다. 증폭 후 나노비드 포획은 비어있는 나노비드 (그들에 결합된 주형을 갖지 않음)를 제거할 수 있다. 이들 액적으로부터 시퀀싱 리드는 생성되지 않는다. (iii) 경우처럼, 시퀀싱 및 및 나노비드-결합 주형이 존재하는 경우, 증폭 산물이 시퀀싱 비드에 고정화될 수 있다. 증폭 후 나노비드 포획은 나노비드-결합 주형 및 다른 나노비드를 제거할 수 있다. 나노비드의 포획 및 소형 크기로 인해, 시퀀싱기는 나노비드 (또는 이러한 나노비드에 결합된 주형)를 검출할 수 없고, 이들 액적 내 시퀀싱 비드 상의 핵산 분자의 시퀀싱으로 시퀀싱 리드가 생성될 것이다.
증폭 반응
본 명세서에 개시된 생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법은 표적 핵산 분자 (예를 들어, 증폭된 핵산 분자 또는 증폭된 산물)의 하나 이상의 카피 또는 상보체를 생성하기 위해서 표적 핵산 분자를 분석 및/또는 처리하기 위한 임의의 유용한 유형의 반응 (예를 들어, 임의의 핵산 증폭 반응)을 포함할 수 있다. 핵산 분자의 증폭 산물 (예를 들어, 카피 또는 상보체)은 핵산 분자에 대해 적어도 부분적인 서열 상보성 (예를 들어, >90%)을 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 반응은 예를 들어, 핵산 증폭이 수행될 때, 단일 프라이머 연장 반응을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭은 선형, 기하급수적, 또는 이의 조합일 수 있다. 증폭은 에멀션 기반일 수 있거나 또는 비-에멀션 기반일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법과 조합하여 사용될 수 있는 핵산 증폭 반응의 비제한적인 예는 역전사, 프라이머 연장, 중합효소 연쇄 반응 (예를 들어, PCR), 리가제 연쇄 반응, 헬리카제-의존적 증폭, 비대칭 증폭, 롤링 써클 증폭, 및 다중 치환 증폭 (MDA)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있는 증폭된 산물은 DNA일 수 있다. 표적 RNA가 증폭되는 경우에, DNA (예를 들어, 상보성 DNA (cDNA))는 RNA의 역전사를 통해 수득될 수 있고 DNA의 후속 증폭은 증폭된 DNA 산물을 생성하는데 사용될 수 있다. 증폭된 DNA 산물은 생물학적 샘플 중 표적 RNA의 존재를 의미할 수 있다. DNA가 증폭되는 경우에, 임의의 DNA 증폭 방법이 적용될 수 있다. DNA 증폭 방법의 비제한적인 예는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), PCR의 별형 (예를 들어, 실시간 PCR, 대립유전자-특이적 PCR, 조립 PCR, 비대칭 PCR, 디지탈 PCR, 에멀션 PCR (예를 들어, ePCR), 다이알-아웃 PCR, 헬리카제-의존적 PCR, 네스티드 PCR,핫 스타트 PCR, 인버스 PCR, 메틸화-특이적 PCR, 미니프라이머 PCR, 다중x PCR, 네스티드 PCR, 중복-연장 PCR, 열 비대칭 인터레이스드 PCR, 터치다운 PCR), 및 리가제 연쇄 반응 (LCR)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법은 선형 DNA 증폭을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법은 기하급수적 DNA 증폭을 포함할 수 있다. DNA 증폭은 증폭된 DNA 산물을 검출하는 감도를 개선시킬 수 있는, 네스티드 PCR로 획득될 수 있다. 게다가, 페어드-엔드 어댑터는 생물학적 샘플을 분석하기 위해 정확도 및/또는 감도를 (예를 들어, 신호 대 노이즈 비율을 증가시켜) 증가시키도록 PCR 증폭에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 다양한 기간 (예를 들어, 수 분 내지 수 시간) 동안 증폭 반응을 적용할 수 있다. 증폭이 생물학적 샘플 중 표적 핵산 분자의 존재를 의미하는 검출가능한 양의 증폭된 산물을 산출하는 기간은 표적 핵산 분자가 수득될 수 있는 생물학적 샘플, 수행할 수 있는 특정 핵산 증폭 반응, 수행할 수 있는 증폭 반응의 특정 주기수, 및 다수의 액적 생성같이 수행되는 분할 과정에 의존하여 다양할 수 있다. 다양한 검출 및 시퀀싱 계획은 또한 다양한 검출 한계를 허용할 수 있다. 표적 핵산 분자의 증폭은 240분 이하; 120분 이하; 90분 이하; 60분 이하; 50분 이하; 45분 이하; 40분 이하; 35분 이하; 30분 이하; 25분 이하; 20분 이하; 15분 이하; 10분 이하; 또는 5분 이하의 기간 동안 표적 핵산의 존재를 의미하는 증폭 산물의 검출가능한 양을 산출할 수 있다. 일부 경우에, (예를 들어, 핵산 시퀀싱 어세이를 사용하여) 핵산 분자의 단일 카피 또는 상보체가 검출가능할 수 있다. 이러한 낮은 검출 한계는 페어드 엔드 시퀀싱을 통해 가능하게 만들 수 있다.
본 명세서에 제공된 임의의 방법에서, 핵산 시퀀싱은 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)의 카피 및/또는 상보체의 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 시퀀싱 리드로서 핵산 시퀀싱 어세이에서 수득되는, 핵산 분자의 카피 및/또는 상보체의 서열은 그들이 바코드 서열 또는 다른 샘플 지표 또는 표지를 사용하여 기원하는 핵산 분자와 회합될 수 있다. 예를 들어, 소정 세포 또는 소정 샘플의 핵산 분자에 상응하는 시퀀싱 리드는 바코드 서열 등을 사용하여 소정 세포 또는 샘플에서 확인할 수 있다. 일부 경우에, 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)의 제1 가닥의 하나 이상의 카피 및 핵산 분자의 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체는 핵산 시퀀싱을 겪을 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 상기 기술된 바와 같이, 핵산 시퀀싱은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 합성에 의한 시퀀싱을 포함할 수 있는 핵산 처리 반응의 일 유형이다. 일부 방법에서, 핵산 시퀀싱은 에멀션 중합효소 연쇄 반응 (ePCR)을 포함할 수 있다.
다수의 파티션의 적어도 하나 파티션은 적어도 제1 비드, 제2 비드, 및 제1 및 제2 샘플 핵산 분자 이외에도, 물질 또는 성분을 포함할 수 있다. 파티션의 추가 성분은 합성 핵산 분자일 수 있다. 합성 핵산 분자는 이중 가닥일 수 있다. 합성 핵산 분자는 절단성 구성요소를 포함할 수 있다. 절단성 구성요소는 합성 핵산 분자의 성분의 분리를 허용할 수 있다. 분리는 화학, 광, 열, 또는 다른 접근법을 통해 수행될 수 있다. 합성 핵산 분자는 또한 결찰 및/또는 원형화를 수행할 수 있다. 결찰 및/또는 원형화 시, 합성 핵산 분자는 절단되어서 절단된 합성 핵산 분자를 제공할 수 있다. 다음으로 절단된 합성 핵산 분자에 대해서 증폭 반응을 통해 갭 충전을 겪을 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음).
증폭 과정의 완료 이후 (예를 들어, 일정 기간 및/또는 증폭 주기수 이후)에, 다수의 파티션 중에 분포된 다수의 비드 (예를 들어, 다수의 비드-핵산 분자 복합체)는 다수의 파티션 (예를 들어, 액적 또는 웰)으로부터 회수될 수 있고, 비드 (예를 들어, 다수의 비드-핵산 분자 복합체)는 에멀션 또는 혼합물로부터 분리 (예를 들어, 자성 분리)될 수 있다. 후속하여, 임의의 이전 증폭 및/또는 처리 단계 동안 형성될 수 있는 핵산 분자 또는 이의 임의 유도체는 (예를 들어, 시퀀싱기에서 뉴클레오티드 서열을 결정하여) 어세이 또는 분석될 수 있다. 일부 경우에, 비드에 커플링된 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체) 만이 시퀀싱된다. 다른 경우에, 비드에 커플링되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체) 만이 시퀀싱된다. 일부 경우에, 비드에 커플링된 핵산 분자 및 비드에 커플링되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)는 (예를 들어, 동시에 또는 별도로) 시퀀싱된다.
본 개시의 방법의 장점은 파티션 (예를 들어, 액적) 내부에서 핵산 분자에 대한 비드의 증가된 비율 (예를 들어, >2)일 수 있고, 그 결과로 적어도 부분적으로, 소정 핵산 분자의 더 높은 클론 카피수 및 감소된 샘플 또는 주형 손실에 기인하여, 샘플 분석 동안 증가된 정확도 및 감도를 일으킬 수 있다. 주형은 있지만 비드는 없는 파티션의 백분율은 충분히 높은 수의 비드를 첨가하여 상당히 감소시킬 수 있다. 이것은 단일 포아송 분포 계획에 대한 이중 포아송 분포 계획을 감소시킨다. 이것은 생물학적 샘플이 종양 진단 및 병기 분석에서 오직 미량의 핵산 예컨대 cfDNA를 함유할 수 있는 영역에서 고도로 중요할 수 있다. 게다가,핵산 분자에 대한 비드의 더 높은 분량 비율 및 페어드-엔드 어댑터의 사용의 조합은 증가된 정확도 및 감도로 생물학적 샘플 (예를 들어, 샘플 핵산 분자)을 분석하는 방법을 제공할 수 있다.
비드 조성
생물학적 샘플을 분석하기 위해 본 명세서에 개시된 방법은 하나 이상의 (예를 들어, 다수의) 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)의 증폭을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 증폭은 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 단일 가닥 핵산 분자)가 결합될 수 있는 하나 이상의 비드 또는 비드 입자 (예를 들어, 하나 이상의 비드 세트)를 사용하여 수행될 수 있다. 제1 비드 세트 및/또는 제2 비드 세트는 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 제1 비드 세트 및/또는 제2 비드 세트는 하나 이상의 물질 및/또는 성분을 포함할 수 있다. 제1 비드 세트 및/또는 제2 비드 세트는 예를 들어, 중합체 비드 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)일 수 있다. 제1 및/또는 제2 비드 세트는 코팅부 예컨대 PEG 층 또는 히드로겔 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)을 가질 수 있다. 제1 및/또는 제2 비드 세트는 동일한 코어 비드 또는 상이한 코어 비드 (예를 들어, 동일하거나 또는 상이한 물질 포함)를 함유할 수 있다. 제1 비드 세트의 비드는 제1 물질로 제조될 수 있고 제2 비드 세트의 비드는 제2 물질로 제조될 수 있으며, 제1 물질은 제2 물질과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 제1 비드 세트의 비드는 이에 커플링된 제1 프라이머 분자를 포함할 수 있는 한편, 제2 비드 세트의 비드는 이에 커플링된 제2 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 프라이머 분자는 제1 및 제2 비드 세트의 제조 (예를 들어, 합성) 동안, 각각 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트에 제공될 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 프라이머 분자는 제1 및 제2 비드 세트의 제조 이후에, 각각 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트에 제공될 수 있다 (예를 들어, 아직 프라이머 분자를 포함하지 않는 "코어 비드" 및/또는 사전-작용화 비드에). 프라이머 분자가 후속 과정에서 비드에 고정화되는 경우에, 제1 및 제2 비드 세트의 비드는 별도로 더욱 처리될 수 있다. 각 비드 세트에 대한 프라이머 분자는 다양한 화학을 사용하여 비드에 고정화될 수 있다. 커플링은 예를 들어 아미드, 에스테르, 또는 디술피드 작용기를 통해서 일어날 수 있다. 클릭 화학 (예를 들어, 슈타우딩어 (Staudinger) 결찰 또는 딜스-알더 (Diels-Alder) 화학)이 비드 상에 프라이머 분자의 고정화를 위해 사용될 수 있다. 고정화된 프라이머 분자는 추가의 하류 화학을 사용하여 더욱 변형될 수 있다.
생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하기 위해 본 명세서에 개시된 방법은 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트의 제조 (예를 들어, 합성)를 포함할 수 있어서 방출가능 (예를 들어, 열적 또는 화학적으로 방출가능)하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 세트가 생산된다. 예를 들어, 제1 비드는 제2 비드에 방출가능하게 커플링될 수 있어서, 비드는 자극 (예를 들어, 열, 화학, 또는 광 자극)의 인가 시에 다른 것으로부터 방출가능할 수 있다. 유사하게, 제1 및/또는 제2 비드 세트의 비드에 커플링된 프라이머 분자는 자극, 예컨대 열, 화학, 또는 광 자극의 인가 시에 비드로부터 방출가능할 수 있다.
방출가능하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드는 비-공유적 상호작용 또는 결합 (예를 들어, 단백질 상호작용) 또는 공유 결합을 통해서 커플링될 수 있다. 제1 비드는 하나 이상의 화학적 링커 및/또는 하나 이상의 스플린트 올리고뉴클레오티드를 통해서 제2 비드에 연결될 수 있다. 비-공유 상호작용 예컨대 단백질 상호작용은 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 공유 결합은 다양한 화학 예컨대 커플링 반응 (예를 들어, 아미드 결합 형성) 또는 클릭 화학 (예를 들어, 슈타우딩어 결찰 또는 딜스-알더 반응)을 사용하여 비드 간에 형성 (예를 들어, 합성적으로 형성)될 수 있다.
제2 비드에 방출가능하게 커플링된 제1 비드를 포함하는 방출가능하게 커플링된 비드쌍은 제2 비드로부터 제1 비드의 방출을 자극하는 자극 (예를 들어, 열 또는 화학)을 가할 수 있다. 자극은 온도 변화 및/또는 화학 자극 (예를 들어, pH 및/또는 이온 농도의 변화)을 포함할 수 있다.
대안적으로, 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트는 또한 비가역적으로 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 세트 (예를 들어, 각각이 제2 비드에 비가역적으로 커플링된 제1 비드를 포함하는 비드쌍의 세트)를 생산할 수 있도록 제조 (예를 들어, 합성)될 수 있다. 제1 비드 세트의 제1 비드는 제2 비드 세트의 제2 비드에 제거불가능하게 커플링될 수도 있다. 이러한 제거불가능한 커플링은 공유적 화학 결합을 통해서 제1 비드 및 제2 비드 간 가교를 포함할 수 있다.
제1 및 제2 비드 세트의 비드의 초기 제조 (예를 들어, 합성) 이후에, 크기 선택 과정은 제1 비드 및/또는 제2 비드의 다양한 조합을 구별할 수 있게 수행될 수 있다. 예를 들어, 크기 선택 과정은 제2 비드에 커플링된 제1 비드를 포함하는 비드쌍 및 2개 제1 비드를 포함하는 비드쌍 또는 2개 제2 비드를 포함하는 비드쌍을 구별할 수 있다. 크기 선택 과정 예컨대 여과 과정을 또한 사용하여 비드의 덩어리 또는 응집체를 분리하고/하거나 다수의 비드를 포함하는 용액으로부터 찌꺼기를 제거할 수 있다.
페어드-엔드 서열 리드의 생성 방법
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 개시의 방법은 증폭 및/또는 시퀀싱 과정을 수행할 때 파티션 (예를 들어, 액적) 내부에서 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)에 대한 비드의 증가된 비율 (예를 들어, >2)을 이용할 수 있다. 이러한 결과로 적어도 부분적으로 샘플 또는 주형 손실을 감소하면서 소정 핵산 분자의 더 높은 클론 카피수를 생성하는 능력에 기인하여 샘플 분석 동안 정확도 및 감도를 증가시킨다. 페어드-엔드 어댑터의 사용과 더 높은 비드 대 핵산 분자 비율의 사용의 조합은 생물학적 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)를 분석하기 위한 보다 더 높은 정확도 및 감도의 방법을 제공할 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 제공된 방법은 생물학적 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)의 서열과 회합될 수 있는 페어드-엔드 시퀀싱 리드를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 페어드-엔드 시퀀싱 리드의 생성은 본 명세서에 제공된 방법의 감도 및 정확도를 증가시킬 수 있다.
페어드-엔드 시퀀싱 리드를 생성하기 위한 하나 이상의 단계를 포함하는 본 명세서에 기술된 방법은 제1 입자 세트 (예를 들어, 비드) 및 제2 입자 세트 (예를 들어, 비드) (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 비드 세트의 제1 비드는 생물학적 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자, 예컨대 DNA 또는 RNA 분자)의 제1 핵산 가닥에 커플링된 제1 어댑터에 상보성인 적어도 부분 서열을 갖는 (예를 들어, 제1 비드에 커플링된) 제1 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 제2 비드 세트의 제2 비드는 표적 핵산 분자의 제2 핵산 가닥에 커플링된 제2 어댑터에 상보성인 서열을 갖는 (예를 들어, 제2 비드에 커플링된) 제2 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 제1 프라이머 분자는 제2 프라이머 분자와 상이할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 프라이머 분자는 동일 (예를 들어, 동일한 핵산 서열 포함)할 수 있거나 또는 서로 상보성일 수 있다.
페어드-엔드 시퀀싱 리드를 생성하는 단계를 포함하는 방법은 (i) 제1 비드 세트의 제1 비드, (ii) 제2 비드 세트의 제1 비드, 및 (iii) 생물학적 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)로서, 핵산 분자의 제1 가닥에 커플링된 제1 어댑터 및 핵산 분자의 제2 가닥에 커플링된 제2 어댑터를 포함하는 것인 핵산 분자를, 파티션(예를 들어, 액적, 예컨대 에멀션 중 수성 액적)에 분할(예를 들어, 공-분할)하는 단계를 포함할 수 있다. 분할 단계는 본 명세서에 제공된 방법에 따라서 획득될 수 있고 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적 또는 웰)을 제공할 수 있으며, 적어도 이의 서브세트는 각각이 적어도 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제1 비드 및 다수의 핵산 분자의 핵산 분자를 포함할 수 있고, 핵산 분자는 제1 어댑터 서열을 포함하는 제1 가닥 및 제2 어댑터 서열을 포함하는 제2 가닥을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 어댑터 서열은 페어드-엔드 어댑터 서열일 수 있다. 다수의 핵산 분자의 소정 핵산 분자의 각 가닥은 또한 주형 핵산 서열을 포함할 수 있다.
페어드-엔드 시퀀싱 리드를 생성하는 단계를 포함하는 방법은 (i) 제1 비드 세트의 제1 비드, (ii) 제2 비드 세트의 제1 비드, 및 (iii) 생물학적 샘플의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 단일-가닥 핵산 분자)로서, 그에 커플링된 제1 어댑터 및 제2 어댑터에 상보성인 영역 (예를 들어, 서열)을 포함하는 것인 핵산 분자를 파티션 (예를 들어, 액적, 예컨대 에멀션 중 수성 액적)에 분할(예를 들어, 공-분살)하는 단계를 포함할 수 있다. 분할 단계는 본 명세서에 제공된 방법에 따라 획득될 수 있고 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적 또는 웰)을 제공할 수 있으며, 적어도 이의 서브세트는 각각이 적어도 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제1 비드 및 다수의 핵산 분자의 핵산 분자를 포함할 수 있고, 핵산 분자는 그에 커플링된 제1 어댑터 서열 및 제2 어댑터 서열에 상보성인 영역 (예를 들어, 서열)을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 어댑터 서열은 페어드-엔드 어댑터 서열일 수 있다.
적어도 제1 비드 세트의 제1 비드, 제2 비드 세트의 제1 비드, 및 핵산 분자의 제1 가닥에 커플링된 제1 어댑터 및 핵산 분자의 제2 가닥에 커플링된 제2 어댑터를 포함하는 다수의 핵산 분자의 핵산 분자를 포함하는 파티션은 제1 핵산 분자의 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체, 및/또는 제2 어댑터에 커플링된 제2 핵산 분자의 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체를 생성하기에 충분한 조건이 가해질 수 있다. 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 생성 단계는 제1 및 제2 비드 및 핵산 분자를 포함하는 파티션에 대해서 프라이머 연장 반응 및/또는 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)을 수행하기에 충분한 조건을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 반응은 하나 이상의 시약의 사용을 포함할 수 있고, 하나 이상의 시약은 파티션 내에 포함될 수 있다. 제1 비드의 제1 프라이머 분자는 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있다. 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제1 비드에 커플링될 수 있고, 따라서 추가 증폭 반응 (예를 들어, 기하급수적 증폭)을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 제2 비드의 제2 프라이머 분자는 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제2 비드에 커플링될 수 있고, 따라서 추가 증폭 반응 (예를 들어, 기하급수적 증폭)을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 서열은 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 서열과 적어도 부분적으로 중복될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 생물학적 샘플을 분석하기 위해서, 임의의 유용한 유형의 반응 (예를 들어, 임의의 핵산 증폭 반응)은 표적 핵산 분자의 하나 이상의 카피 또는 이의 상보체 (예를 들어, 증폭된 산물)를 생성하기 위해 표적 핵산 분자를 처리하는데 사용될 수 있다. 증폭은 에멀션 기반일 수 있거나 또는 비-에멀션 기반일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법과 조합하여 사용될 수 있는 핵산 증폭 반응의 비제한적인 예는 역전사, 프라이머 연장, 중합효소 연쇄 반응 (예를 들어, PCR), 리가제 연쇄 반응, 헬리카제-의존적 증폭, 비대칭 증폭, 롤링 써클 증폭, 및 다중 치환 증폭 (MDA)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있는 증폭된 산물은 DNA일 수 있다. 표적 RNA가 증폭되는 경우에, DNA (예를 들어, 상보성 DNA (cDNA))는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있고 DNA의 후속 증폭을 사용하여 증폭된 DNA 산물을 생성시킬 수 있다. 증폭된 DNA 산물은 생물학적 샘플 중 표적 RNA의 존재를 의미할 수 있다. DNA가 증폭되는 경우에, 임의의 DNA 증폭 방법이 적용될 수 있다. DNA 증폭 방법의 비제한적인 예는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), PCR의 별형 (예를 들어, 실시간 PCR, 대립유전자-특이적 PCR, 조립 PCR, 비대칭 PCR, 디지탈 PCR, 에멀션 PCR (예를 들어, ePCR), 다이알-아웃 PCR, 헬리카제-의존적 PCR, 네스티드 PCR, 핫 스타트 PCR, 인버스 PCR, 메틸화-특이적 PCR, 미니프라이머 PCR, 다중x PCR, 네스티드 PCR, 중복-연장 PCR, 열 비대칭 인터레이스드 PCR, 터치다운 PCR), 및 리가제 연쇄 반응 (LCR)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법은 선형 DNA 증폭을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법은 기하급수적 DNA 증폭을 포함할 수 있다. DNA 증폭은 증폭된 DNA 산물을 검출하는 감도를 개선시킬 수 있는 네스티드 PCR을 사용하여 획득될 수 있다. 게다가, 페어드-엔드 어댑터는 생물학적 샘플을 분석하기 위해 정확도 및/또는 감도를 (예를 들어, 신호 대 노이즈 비율을 증가시켜) 증가시키도록 PCR 증폭에 사용될 수 있다.
증폭이 증폭된 표적 핵산의 존재를 의미하는 검출가능한 양의 증폭된 산물을 산출하는 기간은 표적 핵산을 수득할 수 있는 생물학적 샘플, 수행하려는 특정 핵산 증폭 반응, 증폭 반응의 특정 주기 수 (예를 들어, 최대 120분), 및 다수의 액적의 생성같이 수행되는 분할 과정에 의존하여 다양할 수 있다. 표적 핵산 분자의 증폭은 240분 이하; 120분 이하; 90분 이하; 60분 이하; 50분 이하; 45분 이하; 40분 이하; 35분 이하; 30분 이하; 25분 이하; 20분 이하; 15분 이하; 10분 이하; 또는 5분 이하의 기간 동안 표적 핵산의 존재를 의미하는 검출가능한 양의 증폭된 산물을 산출할 수 있다.
제1 비드 세트 (예를 들어, 다수)로부터의 제1 비드는 제2 비드 세트 (예를 들어, 다수)의 제2 비드에 방출가능 (예를 들어, 열적 및/또는 화학적으로 방출가능)하게 커플링될 수 있다. 유사하게, 추가 제1 비드 세트의 비드는 추가 제2 비드 세트의 비드에 방출가능하게 커플링될 수 있어서, 방출가능하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 세트가 존재할 수 있다. 예를 들어, 제1 비드는 제2 비드에 방출가능하게 커플링될 수 있어서, 비드는 자극 (예를 들어, 열, 화학, 또는 광 자극)의 인가 시에 다른 것으로부터 방출가능할 수 있다. 유사하게, 제1 및/또는 제2 비드 세트의 비드에 커플링된 프라이머 분자는 자극, 예컨대 열, 화학, 또는 광 자극의 인가 시에 비드로부터 방출가능할 수 있다.
방출가능하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드는 비-공유 상호작용 또는 결합 (예를 들어, 단백질 상호작용) 또는 공유 결합을 통해서 커플링될 수 있다. 제1 비드는 하나 이상의 화학적 링커 및/또는 하나 이상의 스플린트 올리고뉴클레오티드를 통해서 제2 비드에 연결될 수 있다. 비-공유 상호작용 예컨대 단백질 상호작용은 수호 결합, 반 데르 발스 힘, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 공유 결합은 다양한 화학 예컨대 커플링 반응 (예를 들어, 아미드 결합 형성) 또는 클릭 화학 (예를 들어, 슈타우딩어 결찰 또는 딜스-알더 반응)을 사용하여 비드 간에 형성 (예를 들어, 합성적으로 형성)될 수 있다.
제2 비드에 방출가능하게 커플링된 제1 비드를 포함하는 방출가능하게 커플링된 비드쌍은 제2 비드로부터 제1 비드의 방출을 자극하는 자극 (예를 들어, 열 또는 화학)이 가해질 수 있다. 자극은 온도 변화 및/또는 화학 자극 (예를 들어, pH 및/또는 이온 농도의 변화)을 포함할 수 있다.
대안적으로, 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트는 비가역적으로 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 세트 (예를 들어, 각각이 제2 비드에 비가역적으로 커플링된 제1 비드를 포함하는 비드쌍 세트)를 생산할 수 있도록 제조 (예를 들어, 합성)될 수 있다. 제1 비드 세트의 제1 비드는 또한 제2 비드 세트의 제2 비드에 제거불가능하게 커플링될 수 있다. 이러한 제거불가능한 커플링은 공유 화학 결합을 통해 제1 비드 및 제2 비드 사이에 가교를 포함할 수 있다.
제1 및 제2 비드 세트의 비드의 초기 제조 (예를 들어, 합성) 후에, 제1 비드 및/또는 제2 비드의 다양한 조합을 구별할 수 있는 크기 선택 과정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 선택 과정은 제2 비드에 커플링된 제1 비드를 포함하는 비드쌍 및 2개 제1 비드를 포함하는 비드쌍 및 2개 제2 비드를 포함하는 비드쌍을 구별할 수 있다. 크기 선택 과정 예컨대 여과 과정을 또한 사용하여 비드의 덩어리 또는 응집체를 분리하고/하거나 다수의 비드를 포함하는 용액으로부터 찌꺼기를 제거할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 가닥 (예를 들어, 제1 생물학적 샘플의 핵산 분자)은 제1 어댑터 (예를 들어, 제1 페어드-엔드 어댑터)에 커플링될 수 있고 제2 가닥 (예를 들어, 생물학적 샘플의 제2 핵산 분자)은 제2 어댑터 (예를 들어, 제1 페어드-엔드 어댑터)에 커플링될 수 있다. 제1 및/또는 제2 어댑터는 핵산 시퀀싱 과정 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)에 관여할 수 있다. 제1 어댑터는 제1 하위-부분 및 제2 하위-부분을 포함할 수 있고, 제1 하위-부분는 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다. 서열 상보성은 일반적으로 쌍형성되는 서열에 상보성인 서열을 의미한다. 유사하게, 제2 어댑터는 제1 하위-부분 및 제2 하위-부분을 포함할 수 있고, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다. 어댑터의 하나 이상의 부분은 상이한 용융 온도를 가질 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 제1 용융 온도를 갖는 제1 부분 및 제2 용융 온도를 갖는 제2 부분을 포함할 수 있고, 제1 용융 온도는 제2 용융 온도에 비해 더 높다. 상이한 용융 온도는 예를 들어 아데닌, 티민, 및 이노신으로 농축된 서열을 포함하는 어댑터를 사용하여 부여될 수 있다. 이러한 어댑터는 그들이 커플링되는 핵산 분자의 후속 처리를 위해 접근성을 제공하도록 어댑터의 부분 변성을 촉진할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 핵산 시퀀싱 (예를 들어, NGS)은 다수의 파티션 (예를 들어, 다수의 액적 또는 웰)의 파티션에서 발생될 수 있다. (예를 들어, 다수의 파티션의)의 이러한 파티션은 (i) 제1 비드 세트로부터의 적어도 하나의 제1 비드, (ii) 제2 비드 세트로부터의 적어도 하나의 제2 비드, 및 (iii) 제1 가닥 (예를 들어, 제1 핵산 분자)에 커플링된 제1 어댑터 및 제2 가닥 (예를 들어, 제2 핵산 분자)에 커플링된 제2 어댑터를 포함하는 생물학적 샘플 (또는 이의 부피의 일정 분획) (예를 들어, 핵산 분자)을 포함할 수 있다. 파티션은 액적일 수 있거나, 또는 파티션은 웰일 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 페어드-엔드 서열 리드를 포함하는 방법은 제1 어댑터와 상보성인 서열을 갖는 제1 프라이머 분자를 갖는 제1 비드 세트로부터의 제1 비드 (예를 들어, 도 8의 파트(1-8) 및 제2 어댑터와 상보성인 서열을 갖는 제2 프라이머 분자를 갖는 제2 비드 세트로부터의 제2 비드 (예를 들어, 도 8의 파트(4-8)를 제공하는 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 8 참조). 다음으로 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트는 다수의 파티션의 소정 파티션이 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드를 포함하도록 다수의 파티션 중에 분포 (예를 들어, 무작위 분포)될 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 도 7에 도시된 바와 같이, 핵산 분자(705)는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함할 수 있고, 제1 가닥은 제2 가닥에 상보성인 서열을 갖는다. 어댑터(1-7 및 4-7)는 양쪽 말단으로부터의 핵산 증폭이 중복 영역을 생성하도록 선택될 수 있다. 어댑터(1-7)는 상보성 서열(703)에 상응하고, 어댑터(4-7)는 상보성 서열(702)에 상응한다. 중복은 생물학적 샘플의 제1 가닥의 카피, 또는 이의 상보체와, 생물학적 샘플의 제2 가닥의 카피, 또는 이의 상보체의 매칭을 가능하게 할 수 있다. 중복은 예를 들어 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 이상의 염기쌍 (예를 들어, 각 가닥의 카피, 또는 이의 상보체의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350 이상의 뉴클레오티드)을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 가닥, 또는 이의 카피 또는 상보체의 핵산 시퀀싱 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)은 중복부의 전부 또는 일부를 포함하는 서열 리드를 제공할 수 있다. 중복 영역은 2개 어댑터 사이에 위치될 수 있다. 예를 들어, 제1 가닥은 제1 어댑터 및 제3 어댑터를 포함할 수 있고 제1 및 제3 어댑터는 제1 주형 서열에 측접하고, 제2 가닥은 제2 어댑터 및 제4 어댑터를 포함하고 제2 및 제4 어댑터는 제2 주형 서열에 측접하며, 제1 주형 서열은 제2 주형 서열에 상보성인 서열을 가질 수 있다. 이들 어댑터는 단일-가닥 어댑터일 수 있다. 제3 및 제4 어댑터는 각각 제2 및 제1 어댑터의 상보체일 수 있다. 대안적으로, 이중 가닥 어댑터가 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 도 7에 도시되어 있으며, 여기서 제1 어댑터는 제1 하위-부분(예를 들어, 도 7의 파트(1-7)) 및 제2 하위-부분(예를 들어, 도 7의 서열(703))을 포함하고, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다. 제2 어댑터는 제1 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 파트(4-7)) 및 제2 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 서열(702))을 가지며, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다. 제1 및 제2 가닥을 포함하는 생물학적 샘플 (예를 들어, 핵산 분자)은 제1 비드 세트로부터의 제1 비드 및 제2 비드 세트로부터의 제2 비드 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)를 갖게, 파티션 (예를 들어, 하나 이상의 액적 또는 웰)에 분할될 수 있다. 파티션에 포함된 물질은 후속하여 핵산 증폭 반응 및/또는 핵산 시퀀싱을 가할 수 있다. 생물학적 샘플은 도 7에 도시된 것같은 핵산 분자일 수 있다. 핵산 분자는 다수의 염기쌍을 포함하는 중복 영역을 포함한다 (예를 들어, 흰색으로 도시된, 도 7의 핵산 분자(705)). 제1 및 제2 비드와 파티션에 분할된 후에, 파티션 중 물질은 핵산 분자의 제1 및 제2 가닥에 상응하는 서열 리드를 제공하도록 핵산 시퀀싱될 수 있다. 예로서, 시스템 리드 길이가 약 1000 뉴클레오티드이고 생물학적 샘플의 길이가 약 1800 뉴클레오티드이면, 제1 가닥에 상응하는 약 1000 뉴클레오티드의 서열 리드 및 제2 가닥에 상응하는 1000 뉴클레오티드의 서열 리드를 생성할 수 있고, 제1 및 제2 서열 리드는 약 200 뉴클레오티드의 중복부를 가질 것이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법은 제1 어댑터와 상보성인 서열을 갖는 제1 프라이머 분자 (예를 들어, 도 8의 파트(1-8))를 갖는 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 어댑터에 상보성인 서열을 갖는 제2 프라이머 분자 (예를 들어, 도 8의 파트(4-8))를 갖는 제2 비드 세트의 제1 비드를 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 8 참조). 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드는 방출가능하게 커플링될 수 있다. 따라서, 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드를 포함하는 방출가능하게 커플링된 비드쌍을 형성할 수 있다. 제1 비드 및 제2 비드의 커플링은 본 명세서에 기술된 바와 같이 단백질 상호작용 또는 공유 결합을 통해 수행될 수 있다. 이러한 방출가능하게 커플링된 비드쌍의 세트가 제조될 수 있고, 각각의 비드쌍은 제2 비드 세트의 비드에 방출가능하게 커플링된 제1 비드 세트의 비드를 포함한다. 방출가능하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 세트의 제조 동안, 크기 선택 과정은 제1 비드 및/또는 제2 비드의 다른 조합으로부터 분리된 방출가능하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 쌍 (예를 들어, 제1 비드 세트의 2개 비드 또는 제2 비드 세트의 2개 비드를 포함한 쌍)을 구별하거나 또는 선택하기 위해서 수행될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 비드에 방출가능하게 커플링된 제1 비드를 포함하는 방출가능하게 커플링된 비드쌍은 자극 (예를 들어, 열 또는 화학 자극)이 가해질 수 있다. 자극의 인가는 제2 비드로부터 제1 비드를 방출할 수 있다.
생물학적 샘플의 제1 및 제2 가닥은 2개의 별도 어댑터, 제1 어댑터 및 제2 어댑터가 측접될 수 있고, 이들 각각은 이중 가닥 어댑터일 수 있다. 제1 어댑터는 제1 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 파트(1-7)) 및 제2 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 서열(703))을 포함하고, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 도 7 참조). 제2 어댑터는 제1 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 파트(4-7)) 및 제2 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 서열(702))을 가지며, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 도 7 참조). 다음으로 생물학적 샘플은 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드를 갖게 파티션 (예를 들어, 에멀션 또는 웰 중 하나 이상의 액적)으로 분할된다. 파티션 (예를 들어, 액적)에 존재하거나 또는 위치되는 물질 및/또는 성분은 이후에 후속 처리 예컨대 핵산 증폭 및 핵산 시퀀싱 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)이 수행될 수 있다.
여기에 개시된 방법은 제1 어댑터와 상보성인 서열을 갖는 제1 프라이머 분자 (예를 들어, 도 8의 파트(1-8)에 도시된 바와 같음)를 포함하는 제1 비드 세트의 제1 비드를 포함할 수 있고 제2 어댑터에 상보성인 서열을 갖는 제2 프라이머 분자 (예를 들어, 도 8의 파트(4-8)에 도시된 바와 같음)를 포함하는 제2 비드 세트의 제1 비드가 제공된다 (예를 들어, 도 8 참조). 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드는 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드를 포함한 비드쌍을 형성하도록 방출불가하게 (예를 들어, 비가역적으로) 커플링될 수 있다. 제1 비드 및 제2 비드의 커플링은 단백질 상호작용, 공유 결합, 하나 이상의 화학적 링커, 및/또는 하나 이상의 스플린트 올리고뉴클레오티드를 통해서 수행될 수 있다. 이러한 방출불가하게 커플링된 비드쌍의 세트를 제조할 수 있고, 각각의 비드쌍은 제2 비드 세트의 비드에 방출불가하게 커플링된 제1 비드 세트의 비드를 포함한다. 방출불가하게 커플링된 제1 비드 및 제2 비드의 세트의 제조 동안, 크기 선택 과정은 제1 비드 및/또는 제2 비드의 다른 조합과 분리된 제1 비드 및 제2 비드의 쌍 (예를 들어, 제1 비드 세트의 2개 비드 또는 제2 비드 세트의 2개 비드를 포함한 쌍)을 구별하고/하거나 선택하기 위해 수행될 수 있다.
생물학적 샘플 (제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 도 7의 핵산 분자(705)로 도시)은 양쪽 말단으로부터의 핵산 증폭이 중복부를 생성하도록 선택될 수 있다 (예를 들어, 도 7 참조). 중복부는 생물학적 샘플의 제1 가닥의 카피와 생물학적 샘플의 제2 가닥의 카피의 매칭을 허용한다. 생물학적 샘플은 2개의 별도 어댑터, 제1 어댑터 및 제2 어댑터가 측접될 수 있고, 이들 각각은 이중 가닥 어댑터일 수 있다. 제1 어댑터는 제1 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 파트(1-7)로 도시) 및 제2 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 서열(703)로 도시)을 포함할 수 있고, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 도 7 참조). 제2 어댑터는 제1 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 파트(4-7)로 도시) 및 제2 하위-부분 (예를 들어, 도 7의 서열(702)로 도시)을 포함하고, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 도 7 참조). 다음으로 생물학적 샘플은 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드와 파티션 (예를 들어, 하나 이상의 액적 또는 웰)에 분할될 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 액적으로). 다음으로 파티션 중 물질은 후속 처리 예컨대 핵산 증폭 및/또는 핵산 시퀀싱을 수행한다.
본 개시는 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트를 제공하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 (예를 들어, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 핵산 분자)을 처리하는 방법을 더 제공한다. 제1 비드 세트의 제1 비드는 생물학적 샘플의 제1 가닥에 커플링된 제1 어댑터에 상보성인 서열을 갖는 제1 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 제2 비드 세트의 제2 비드는 생물학적 샘플의 제2 가닥에 커플링된 제2 어댑터에 상보성인 서열을 갖는 제2 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 제1 프라이머 분자는 제2 프라이머 분자와 상이할 수 있다.
방법은 (i) 제1 비드 세트의 제1 비드, (ii) 제2 비드 세트의 제2 비드, 및 (iii) 제1 가닥에 커플링된 제1 어댑터 및 제2 가닥에 커플링된 제2 어댑터를 포함하는 생물학적 샘플을 파티션에 분할 (예를 들어, 하나 이상의 액적의 생성)하는 단계를 포함한다. 분할 단계는 예를 들어, 에멀션 또는 웰 중 액적을 사용하여 성취될 수 있다.
제1 및 제2 비드 및 생물학적 샘플을 포함하는 파티션은 제1 어댑터에 커플링된 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체, 및/또는 제2 어댑터에 커플링된 제2 가닥의 하나 이상의 카피 또는 이의 상보체를 생성하는데 충분한 조건을 가할 수 있다. 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 생성은 제1 및 제2 비드 및 생물학적 샘플에 대해서 프라이머 연장 반응 및/또는 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR 예컨대 ePCR)을 수행하기에 충분한 조건을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 비드의 제1 프라이머는 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있다. 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제1 비드에 커플링될 수 있고 증폭 반응 (예를 들어, 선형 또는 기하급수적 증폭)에 사용될 수 있다. 제2 비드의 제2 프라이머는 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체를 생성하는데 사용될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 및/또는 이의 상보체는 제2 비드에 커플링될 수 있고, 증폭 반응 (예를 들어, 선형 또는 기하급수적 증폭)에 사용될 수 있다. 제1 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 서열은 제2 가닥의 하나 이상의 카피, 또는 이의 상보체의 서열이 적어도 부분적으로 중복될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 임의 유형의 핵산 증폭 반응은 증폭된 산물 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 가닥의 하나 이상의 카피 또는 이의 상보체)을 생성하는데 사용될 수 있다. 제1 가닥의 하나 이상의 카피는 제2 가닥의 하나 이상의 카피와 중복부를 갖지 않을 것이다.
다수의 파티션의 적어도 하나의 파티션은 적어도 제1 비드, 제2 비드, 및 제1 및 제2 샘플 핵산 분자 이외에, 물질 또는 성분을 포함할 수 있다. 파티션의 추가 성분은 합성 핵산 분자일 수 있다. 합성 핵산 분자는 이중 가닥일 수 있다. 합성 핵산 분자는 절단성 구성요소를 포함할 수 있다. 절단성 구성요소는 합성 핵산 분자의 성분의 분리를 허용할 수 있다. 분리는 화학, 광, 열, 또는 다른 접근법으로 수행할 수 있다. 합성 핵산 분자는 또한 결찰 및/또는 원형화를 겪을 수 있다. 결찰 및/또는 원형화 시에, 합성 핵산 분자는 절단되어서 절단된 합성 핵산 분자를 제공할 수 있다. 다음으로 절단된 합성 핵산 분자는 증폭 반응을 통해 갭 충전이 가해질 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 대안적으로 또는 추가로, 파티션은 하나 이상의 시약, 예컨대 세포의 용해 또는 투과를 위하거나 또는 프라이머 연장 또는 증폭 반응에서 사용을 위한 (예를 들어, 뉴클레오티드 및 중합 효소) 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하는 방법은 제1 비드 세트의 제1 비드를 포함할 수 있고 제2 비드 세트의 제1 비드에 방출가능하게 커플링될 수 있다. 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제2 비드는 단백질 상호작용 또는 공유 결합을 통해서 방출가능하게 커플링될 수 있다. 단백질 상호작용은 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 또는 이의 임의 조합을 의미할 수 있다. 공유 결합은 다양한 화학 반응 예컨대 커플링 반응 및/또는 클릭 반응을 사용하여 비드 간에 형성 (예를 들어, 합성적으로 형성)될 수 있다.
제2 비드에 방출가능하게 커플링된 제1 비드에 대해서 자극을 가할 수 있다. 자극은 제2 비드로부터 제1 비드의 방출을 야기한다. 자극은 온도 변화 또는 화학 자극일 수 있다. 대안적으로, 제1 비드 세트의 제1 비드는 제2 비드 세트의 제2 비드에 제거불가능하게 커플링될 수 있다. 이러한 제거불가능한 커플링은 제1 비드 및 제2 비드 사이에 가교 (예를 들어, 공유 연결)를 포함할 수 있다.
생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하기 위해 본 명세서에 개시된 방법에서, 방법은 제1 비드 세트 및/또는 제2 비드 세트를 포함한 다수의 비드를 제조 (예를 들어, 합성)하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 비드 세트 또는 제2 비드 세트는 예를 들어 중합체 비드일 수 있다. 비드는 히드로겔 비드일 수 있다. 비드는 코팅부 예컨대 PEG 층 또는 히드로겔을 가질 수 있다. 다수 비드 세트가 사용되는 경우에, 다수 비드 세트는 동일한 코어 비드 또는 상이한 코어 비드를 함유 (예를 들어, 동일하거나 또는 상이한 물질을 포함)할 수 있다. 예를 들어, 제1 비드 세트의 비드는 제1 물질로부터 제조될 수 있고 제2 비드 세트의 비드는 제2 물질로부터 제조될 수 있고, 제1 물질은 제2 물질과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 제1 및 제2 프라이머 분자는 제1 및 제2 비드 세트의 제조 (예를 들어, 합성) 동안, 각각 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트에 제공될 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 프라이머 분자는 제1 및 제2 비드 세트의 제조 이후, 각각 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트 (예를 들어, 아직 프라이머 분자를 포함하지 않는 "코어 비드")에 제공될 수 있다. 프라이머 분자가 후속 과정에서 비드에 고정화되는 경우에, 제1 및 제2 비드 세트의 비드는 별도로 더욱 처리될 수 있다. 각 비드 세트에 대한 프라이머 분자는 다양한 화학을 사용하여 비드에 고정화될 수 있다. 커플링은 예를 들어, 아미드, 에스테르, 또는 디술피드 작용기를 통해서 발생될 수 있다. 클릭 화학 (예를 들어, 슈타우딩어 결찰, 또는 딜스-알더 화학)은 비드 상에 프라이머의 고정화를 위해 사용될 수 있다. 고정화된 프라이머 분자는 추가의 하류 화학을 사용하여 더욱 변형될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 비드는 비드쌍으로 제공될 수 있다. 비드쌍의 비드는 서로에게 방출가능하게 또는 방출불가능하게 (예를 들어, 비가역적으로) 커플링될 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 비드쌍은 제1 비드 세트의 제1 비드 및 제2 비드 세트의 제1 비드를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음).
생물학적 샘플을 분석 및/또는 처리하기 위해 본 명세서에 개시된 방법은 핵산 시퀀싱 (예를 들어, NGS)을 겪을 수 있는 제1 가닥의 하나 이상의 카피 및 제2 가닥의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 핵산 시퀀싱은 합성 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 시퀀싱을 포함할 수 있는 핵산 증폭 반응의 한 유형이다. 핵산 증폭 및/또는 시퀀싱은 에멀션 중합효소 연쇄 반응 (ePCR)을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, PCR 예컨대 ePCR은 파티션 예컨대 에멀션 액적에서 수행될 수 있고, 적어도 이의 서브세트는 각각이 제1 프라이머 분자를 포함하는 적어도 제1 비드, 제2 프라이머 분자를 포함하는 제2 비드, 및 각각 제1 및 제2 어댑터를 포함하는 제1 및 제2 핵산 가닥을 포함할 수 있고, 제1 및 제2 어댑터 (예를 들어, 페어드-엔드 어댑터)는 각각 제1 및 제2 프라이머 분자에 상보성인 적어도 부분 서열을 가질 수 있다.
제1 어댑터는 제1 하위-부분 및 제2 하위-부분을 포함할 수 있고, 제1 하위-부분은 제2 하위-부분에 상보성인 서열을 갖는다 (예를 들어, 도 7에 도시된 바와 같음). 서열 상보성은 일반적으로 쌍형성하는 서열에 상보성인 서열을 의미한다.
다수의 파티션의 각각의 파티션 (예를 들어, 각각의 액적 또는 웰)은 제1 비드 세트의 적어도 하나의 제1 비드, 제2 비드 세트의 적어도 하나의 제2 비드, 및 제1 가닥에 커플링된 제1 어댑터 및 제2 가닥에 커플링된 제2 어댑터를 포함하는 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 파티션은 액적 또는 웰일 수 있다.
생물학적 샘플을 분석하기 위해 본 명세서에 기술된 방법은 각각 특이적 어댑터에 상응하는 프라이머 서열을 포함하는 2개 유형의 비드 (예를 들어, 제1 비드 및 제2 비드)를 포함할 수 있고, 어댑터는 하나 이상의 주형 서열을 포함하는 생물학적 샘플의 핵산 분자에 커플링될 수 있다. 핵산 분자의 주형 서열은 어댑터에 포함되는 하나 이상의 바코드 서열에 의해 식별가능할 수 있다. 표적 핵산 라이브러리 삽입물 (예를 들어, 도 7의 핵산 분자(705)로 도시) 길이는 양쪽 말단으로부터 핵산 시퀀싱이 중복부가 전혀 없거나 또는 매우 최소로 갖는 서열 리드를 제공하도록 선택될 수 있다. 삽입부는 말단-복구될 수 있거나 또는 A-꼬리 첨가될 수 있다. 합성 이중 가닥 핵산 분자는 삽입부와 루프형성되고 결찰될 수 있어서, 합성 이중 가닥이 바람직하게 말단 포스페이트가 없는 T 오버행을 함유할 수 있게 디자인될 수 있다. 합성 이중 가닥 핵산 분자의 서열은 다음과 같을 수 있다: 바코드 2', PB' 절단성 구성요소, PA, 바코드 1. 바코드 1 및 바코드 2'은 상업적으로 입수가능할 수 있고, 바코드 1 및 바코드 2'은 상이한 서열일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 바코드 서열은 서로에게 배당되기 위해서 충분히 정의될 수 있다. 절단성 구성요소는 화학, 광, 열, 또는 다른 기전에 의해서 합성 이중 가닥 핵산 분자의 가닥의 분리를 허용할 수 있다. 결찰 및 원형화 이후에, 합성 이중 가닥 핵산 분자는 절단될 수 있고 폴리머라제-기반 연장을 통해서 갭 충전될 수 있다. 2개 유형의 비드 (예를 들어, 도 8의 파트(806))는 클론 증폭에 이용가능할 수 있는데, 하나는 고정화된 PA(1-2) 올리고뉴클레오티드 또는 최소로 PA의 하위-부분을 갖고, 다른 것은 PB(4-2) 올리고뉴클레오티드 또는 최소로 PB의 하위-부분이 고정화된다.
증폭 과정의 완료 시에, 다수의 파티션 중에 분포된 다수의 비드 (예를 들어, 다수의 비드-핵산 분자 복합체)는 다수의 파티션 (예를 들어, 액적 또는 웰)으로부터 회수될 수 있고, 비드 (예를 들어, 다수의 비드-핵산 분자 복합체)는 에멀션 또는 혼합물로부터 분리 (예를 들어, 자성 분리)될 수 있다. 후속하여, 임의의 이전 증폭 및/또는 처리 단계 동안 형성될 수 있는 핵산 분자 또는 이의 임의 유도체는 (예를 들어, 시퀀싱기에서 뉴클레오티드 서열을 결정하여) 어세이 또는 분석될 수 있다. 일부 경우에, 비드에 커플링된 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)만이 시퀀싱된다. 다른 경우에, 비드에 커플링되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)만이 시퀀싱된다. 일부 경우에, 비드에 커플링된 핵산 분자 및 비드에 커플링되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 증폭 산물 또는 이의 유도체)는 (예를 들어, 동시에 또는 별도로) 시퀀싱된다.
그러한 이유로, 본 명세서에 개시된 방법의 장점은 생물학적 샘플이 적은 양 및/또는 적은 농도의 핵산 분자 (예를 들어, cfDNA)를 함유할 때 특히 중요할 수 있다. 유사하게, 본 개시의 방법의 정확도 및 감도는 희귀 대립유전자를 검출하기 위해 샘플을 분석할때 (예를 들어, 암 진단 및 검출에서) 특히 중요할 수 있다.
클론 증폭 방법 및 시스템
증폭 이후에 단일클론 비드를 보장하기 위해 액적에 단일 비드 및 단일 주형이 로딩되는, 프라이머 비드의 클론 증폭을 위한 에멀션 PCR의 이전 방법은 이중 포아송 분포로 인해 대량의 시약이 비효율적으로 이용될 수 있다. 도 10a는 단일 비드 및 단일 주형을 포함하는 액적을 획득하기 위한 예시적인 계획을 도시한다. 액적은 포아송 분포에 따라서, 예컨대 액적이 많아야 단일 비드 및/또는 많아야 단일 주형을 갖는 것을 보장하기 위해서, 시약 (예를 들어, 주형(1010) 및 비드(1008))이 로딩될 수 있다. 그러나, 도 10a에 도시된 바와 같이, 이것은 그 결과로 비드(1002) 및 주형(1004)을 갖는 오직 소수의 액적 (예를 들어, 액적(1000))을 생성시킬 수 있다. 이것은 분할을 위한 투입물인 비드(1008) 및 주형(1010)의 초기 분량에 대해서 오직 소수의 증폭된 비드(1006)를 생성시킬 수 있다. 이러한 절차는 또한 비드 (예를 들어, 액적(1012))이 결여되거나, 주형 (예를 들어, 액적(1014))이 결여되거나, 또는 비드 및 주형 둘 모두가 결여 (예를 들어, 액적(1016))되기 때문에 증폭 시약을 비효율적으로 사용할 수 있다. 일부 프로토콜은 전체 액적의 오직 대략 20 내지 30%에 주형의 로딩을 제안한다. 주형은 포아송 분포에 따라서 분포될 수 있다. 30% 로딩 시에, 모든 증폭 비드의 15% 미만이 아미도 다클론 비드 (파티션 중 2 이상의 주형)일 것이다. 그러나, 주형이 없는 모든 액적 (예를 들어, 남은 70%)은 하류 처리에서 기능하지 않고, 시약 예컨대 폴리머라제, dNTP, 프라이머 비드, 및 프라이머가 그들 액적에서 낭비된다. 일부 예에서, 비드는 또한 포아송 분포에 따라서 로딩되고, 추가로 '기능성' 액적 (예를 들어, 단일 비드 및 적어도 하나의 비드를 가짐)의 수를 희석시킨다. 두번째 단점은 오직 증폭된 프라이머 비드에만 관심이 있으면, 미증폭된 비드 (예를 들어, 주형없는 파티션에서 유래된 비드)로부터 증폭된 비드를 분류하기 위해 추가의 농축 단계가 필요하다는 것이다.
대조적으로, 도 10b를 참조하면, 본 명세서에 개시된 방법, 시스템, 및 조성물은 실질적으로 더 많은 주형(1018)을 에멀션에 로딩하여 많은 액적(1020)이 하나 초과의 주형을 함유하고, 여전히 하류 처리 동안 살아있는 단일클론 비드(1022)를 생산하게 된다. 본 명세서에 기술된 특성없이, 이러한 주형의 과-로딩 (예를 들어, 하나 초과 로딩)은 증폭 이후에 큰 비율의 다클론 비드 (예를 들어, 다수 주형에서 유래된 카피를 포함하는 비드)를 생성시킬 것으로 예상된다. 그러나, 본 명세서에 기술된 방법, 시스템 및 조성물을 사용하여, 최종 비드 (예를 들어, 증폭된 비드)는 실질적으로 단일클론 (예를 들어, 단일클론 비드(1022))로 남아있는다. 따라서, 본 명세서는 다수 주형 및 비드 (또는 다른 지지체, 예를 들어 표면)를 포함하는 파티션을 포함하는 방법, 시스템, 및 조성물, 및 다수 주형을 포함하는 이러한 파티션으로부터 단일클론 비드 (또는 다른 지지체, 예를 들어, 표면)를 획득하기 위한 방법, 시스템, 및 조성물을 제공한다.
유리하게, 비드는 또한 보다 효율적으로 사용되고, 일부 경우에, 후속 방법 (예를 들어, DNA 시퀀싱)에서 사용되기 이전에 증폭된 비드에 대한 별도의 농축 절차를 요구하지 않을 것이다. 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 비드의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97%가 증폭되게 된다. 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 비드의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 또는 약 97%가 증폭되게 한다.
유리하게, 또한 희귀 또는 귀중 샘플에 특히 중요한 주형이 보다 효율적으로 사용된다. 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 주형 분자의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97%가 증폭되게 된다. 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 주형 분자의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 또는 약 97%가 증폭되게 된다.
도 10b에 기술된 실시형태는 도 10a의 실시형태에 비해 더 효율적일 수 있는데, 10a의 실시형태에서, 단일클론 비드는 단일 비드 및 단일 주형을 갖는 액적으로부터 생성될 수 있지만, 도 10b에서, 주형의 수와 무관하게, 비드 및 적어도 하나의 주형을 함유하는 액적의 대부분은 단일클론 비드를 생성시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 이러한 실시형태에서, 비드가 결여된 액적은 여전히 증폭 시약을 낭비한다. 그러므로, 본 개시는 상대적으로 많은 수의 주형(1024) 및 상대적으로 많은 개수의 비드(1026)가 액적의 수에 대해 로딩되어서 액적(1028)의 대부분이 적어도 하나의 비드 및 적어도 하나의 주형을 함유하게 되는 도 10c에 도시된 바와 같은 실시형태를 제공한다. 이러한 실시형태는 단일클론 비드가 적어도 하나의 주형 및 적어도 하나의 비드를 갖는 액적으로부터 야기될 수 있으므로 시약의 효율적인 사용, 비드의 효율적인 사용, 및/또는 핵산 주형의 효율적인 사용을 야기시킬 수 있다. 따라서, 본 명세서는 적어도 하나의 주형 및 적어도 하나의 비드 (또는 다른 지지체, 예를 들어, 표면)를 포함하는 파티션을 포함하는 방법, 시스템, 및 조성물, 및 적어도 하나의 주형 및 적어도 하나의 비드 (또는 다른 지지체, 예를 들어, 표면)를 포함하는 이러한 파티션으로부터 단일클론 비드 (또는 다른 지지체, 예를 들어, 표면)을 획득하기 위한 방법, 시스템, 및 조성물을 제공한다.
본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 비드(1026)의 초기량 및/또는 핵산 주형(1024)의 초기 개수에 비해서 많은 수의 단일클론 증폭된 비드(1030)를 생성시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 주형 핵산 분자의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97%가 증폭되고 비드에 부착되게 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 분할을 위한 투입물인 주형 핵산 분자의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 또는 약 97%가 증폭되고 비드에 부착되게 한다.
일부 경우에, 분할 이후에, 액적의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97%는 적어도 하나의 비드 및 적어도 하나의 핵산 주형을 함유한다. 일부 경우에, 분할 이후에, 본 명세서에 기술된 방법은 액적의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 또는 약 97%가 적어도 하나의 비드 및 적어도 하나의 핵산 주형을 함유하게 한다.
증폭되는 비드의 임의의 적합한 비율이 단일클론일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법은 증폭된 비드의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97%가 단일클론이게 한다. 일부 예에서, 증폭된 비드의 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%가 단일클론이다.
핵산 주형은 표면에 부착될 수 있고 증폭될 수 있다. 예를 들어, 도 11을 참조하여, 증폭은 액적 내, 에멀션에서 수행될 수 있다. 에멀션 (예를 들어, 오일)의 연속층(1100)은 분산상(1102) (예를 들어, 수성 용액)을 둘러싼다. 연속층은 분산상을 다수의 파티션으로 나눌 수 있다. 다수의 파티션의 일부는 비드의 표면에 부착된 표면 프라이머(1106)(제1 프라이머)의 다수 카피를 갖는 하나 이상의 비드(1104)를 포함할 수 있다. 다수의 제1 프라이머는 제1 서열에 상동성인 서열을 가질 수 있다. 핵산 주형(1108)은 또한 분산상의 파티션에 있을 수 있다. 주형의 한쪽 말단(1110)은 표면 프라이머(1106)에 어닐링될 수 있고/있거나 그에 의해 증폭될 수 있다. 다른 말단(1112)은 제2 프라이머(1114)에 어닐링될 수 있고/있거나 그에 의해 증폭될 수 있다. 일부 경우에, 제2 프라이머(1114)는 파티션 내 분산상에 있을 수 있다. 증폭(1116) 이후에, 이러한 시스템은 비드에 부착된 주형 핵산의 다수 (클론) 카피 (또는 이의 역방향 상보체)를 갖는 비드를 생성시킬 수 있다. 주형의 클론 카피를 갖는 이러한 비드는 예를 들어, 주형의 단일 카피로부터 발생될 수 있는 신호와 비교하여 시퀀싱 신호를 증폭시키기 위해서, DNA 시퀀싱 방법에서 사용될 수 있다.
이전 방법에서, 분산상이 2 이상의 상이한 주형 핵산을 포함할 때, 문제가 발생할 수 있다. 상이한 주형은 핵산 라이브러리의 비-클론 구성원일 수 있다. 예를 들어, 도 12를 참조하면, 다수의 파티션의 파티션(1200)은 제1 핵산 주형(1202) 및 제1 핵산 주형(1202)과 상이한 제2 핵산 주형(1204)을 포함한다. 주형 라이브러리의 제조 과정에서, 공통 제1 말단(1206) 및 공통 제2 말단(1208)은 개별 주형 각각에 첨가될 수 있다 (예를 들어, 단일 프로토콜을 사용하여 비드에 라이브러리 구성원의 부착 및 증폭을 촉진하기 위함). 증폭(1210) 이후에, 이러한 시스템은 비클론 (즉, 적어도 제1 주형의 카피 및 적어도 비드에 부착된 제2 주형의 카피를 가짐)인 비드를 생성시킬 수 있다. 비클론 비드가 DNA 시퀀싱 방법에서 사용되면, 예를 들어, 시퀀싱 데이터는 클론 비드와 비교하여 불충분할 수 있다. 양쪽 주형으로부터 온 비-클론 비드의 신호는 단일 바드의 해상도에서 분리하는 것이 어렵거나 또는 불가능할 수 있다.
하나 초과의 핵산 주형이 파티션 (예를 들어, 액적에 로딩되지만 또한 주형 중 하나가 비드 (또는 다른 지지체)에 부착되어 증폭되는 방법에 대한 필요성을 본 명세서에서 인지한다. 본 명세서에서는 적어도 상기 언급된 필요성(들)을 해결한 방법, 시스템, 및 조성물을 제공한다. 본 개시의 시스템, 방법, 및 조성물은 단일클론인 비드의 비율을 희생시키지 않고 단일-주형-파티션에 제한된 이전 방법에 비해 시약을 덜 낭비할 수 있다 (즉, 본 발명의 방법의 사용이 증폭될 수 있는 적어도 하나의 핵산 주형 분자를 함유하는 더 많은 액적을 가능하게 하기 때문임).
본 개시의 방법은 먼저 주형 핵산, 또는 이의 유도체의 제1 부착, 및 후속하여 표면 상에서 이러한 부착된 주형의 증폭의, 2개 핵심 단계에서 분할부터 클론 증폭까지의 전체 과정을 제어하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법은 전자 (즉, 부착)의 속도를 감소시키는 단계 및/또는 후자 (즉, 증폭)의 속도를 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. 결과는 다수의 상이한 주형의 존재 하에서도, 대부분의 비드가 오직 단일 주형의 클론 카피를 갖는 것이다. 예를 들어, 부착이 증폭과 비교하여 느리고/느리거나 드문 사건이라면, 표면에 부착하기 위한 제1 주형은 제2 주형이 표면에 부착할 수 있기 전에 신속하게 증폭되고 실질적으로 모든 표면 프라이머가 소비될 것이다.
도 13을 참조하면, 에멀션 액적(1300)은 비드(1302), 주형 핵산 분자(1304), 비드(1306)에 부착된 제1 프라이머, 및 제2 프라이머(1308)를 포함할 수 있다. 비드는 제1 서열에 상동성인 서열을 갖는 다수의 제1 프라이머를 포함할 수 있다. 액적은 용액 중에 제3 프라이머(1310)를 포함할 수 있다. 주형은 제1 말단(1316) 및 제2 말단(1318)을 포함할 수 있다. 주형의 어떠한 말단도 일부 경우에 제2 프라이머(1308)에 의해 연장되기 전에 비드 상의 제1 프라이머(1306)에 어닐링될 수 없다. 예를 들어, 주형의 말단 서열은 제1 서열에 상보성이 아닐 수 있다. 제2 프라이머(1308)는 제1 부분(1312) 및 제2 부분(1314)을 갖는다. 제2 부분은 연장 서열을 포함할 수 있다. 제1 부분(1312)은 주형의 제1 말단(1316)에 어닐링될 수 있고, 복합체에 대해서 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 연장 산물(1320)을 생성시키도록 핵산 연장 반응이 가해질 수 있다. 연장 산물(1320)은 연장 서열 또는 이의 상보체를 사용하여 비드 상에서 제1 프라이머(1306)에 어닐링될 수 있다. 제3 프라이머(1310)는 연장 반응을 개시하기 위해서, 핵산 주형, 또는 이의 상보체의 제2 말단(1318)에 어닐링될 수 있다. 비드(1322)에 부착된 클론 증폭 주형을 생성하기 위해서 연장 산물(1320)을 증폭시키는데 사용될 수 있는 비드(1302) 상의 제1 프라이머(1306)의 많은 카피가 존재할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 클론 증폭 비드 (즉, 다클론이 아닌 비드)를 생산하는데 사용될 수 있다. 도 14를 참조하여, 에멀션 액적(1400)은 하나 초과의 핵산 주형 분자를 가질 수 있다. 도면은 제1 주형(1402) 및 제2 주형(1404)을 도시하지만, 2개 초과의 주형이 존재할 수 있다. 양쪽 주형은 제2 프라이머(1406)에 의해 연장될 수 있다. 그러나, 이러한 과정은 제1 프라이머를 사용한 비드 상의 기하급수적 증폭 및/또는 비드(1408)에 부착된 제1 프라이머와 연장 산물의 어닐링에 비해서 더 느리도록 (예를 들어, 더 드물게 발생되도록) 조작된다. 그러므로, 연장 산물은 적어도 제1 핵산 주형의 연장 산물로부터 제1 핵산 주형의 후속 증폭 이전에, 제2 주형이 아닌 제1 핵산 주형(1410)으로부터 생성될 가능성이 높다. 증폭이 연장 및/또는 부착에 비해서 빠르기 때문에, 비드는, 다수의 주형이 본래 액적에 로딩되었지만, 제1 핵산 주형(1415)에 상응하는 단일클론 증폭 산물을 갖게 생성될 수 있다. 비드는 회수될 수 있고/있거나 비증폭 주형은 비드로부터 세척해 버릴 수 있다.
핵산 주형은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 도 10-14는 이들 도면이 핵산 주형을 나타내기 위해서 단일 선으로 도시되었지만, 주형의 단일 또는 이죽 가닥을 구별하지 않는다. 도 15a는 특히 제1 주형(1500) 및 제2 주형(1502)이 초기에 단일 가닥인 실시형태가 도시된다. 명확함을 위해서, 단일 가닥 주형의 5' 및 3' 말단이 도시된다. 제2 프라이머의 제1 부분(1504)은 주형 핵산 분자의 3' 말단과 혼성화될 수 있다. 다음으로 제2 프라이머 및 제1 핵산 주형은 이중 가닥 연장 산물(1506)을 생성하기 위해서 그들 각각의 3' 말단으로부터 연장될 수 있다. 단일 가닥인 주형의 일 장점은 제3 프라이머(제3 프라이머)(1508)가 연장 산물이 생성될 때까지 주형(심지어 선형으로)을 증폭시키지 않는 것이다.
일부 경우에, 제2 프라이머 (즉, 연장 프라이머)는 제한 농도를 갖는다. 일부 경우에, 에멀션 액적은 연장 프라이머의 오직 하나의 카피(1510)를 갖는다. 이러한 경우에, 연장 프라이머는 소비되어서 제2 핵산 주형을 연장하는데 이용가능하지 않다. 제2 주형이 연장되지 않으면, 비드에 부착된 프라이머와 혼성화될 수 없고 (액적이 많은 상이한 주형을 초기에 함유했을 경우더라도) 증폭된 비드는 아마도 단일클론일 것이다. 연장 프라이머의 농도의 제한(저하)은 액적 중 연장 프라이머의 몇몇 카피가 존재하더라도 유리할 수 있다. 저농도의 연장 프라이머는 연장 이후에 비드 상의 증폭 속도에 비해서 연장 반응이 덜 발생할 수 있게 한다 (즉, 둔화시킨다). 이들 과정의 속도에서 이러한 편차는 높은 비율의 단일클론 비드를 생성시킬 수 있다. 일부 경우에, 제1 프라이머의 농도에 대한 연장 프라이머의 농도의 비율은 약 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하의 순이다. 일부 경우에, 제3 프라이머의 농도에 대한 연장 프라이머의 농도의 비율은 약 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하의 순이다.
도 15b에서 계속하여, 이중 가닥 연장 산물(1506)에서 2개 가닥이 (예를 들어, 변성에 의해) 해리될 수 있고 연장 산물(1512)의 가닥 중 하나는 비드(표면 프라이머)(1514)에 부착된 제1 프라이머와 (예를 들어, 이의 3' 말단에서) 어닐링될 수 있다. 표면 프라이머는 연장될 수 있어서 (1516), 비드에 부착된 한 가닥을 갖는 이중 가닥 구성체(1518)가 생성될 수 있다. 도 15c에서 계속하여, 비드(1520)에 부착되지 않은 이중 가닥 구성체의 가닥은 해리되어서 표면 프라이머(1522)의 제2 카피와 혼성화될 수 있다. 방법의 이러한 증폭 과정 (즉, 도 15c)은 연장 및 어닐링에 비해서 더 빠를 수 있다 (즉, 도 15a-15b). 일부 경우에, 증폭 은 기하급수적이다. 표면 프라이머의 제2 카피는 연장될 수 있다 (1524). 제1 표면 프라이머의 연장된 카피는 또한 더 많은 표면 프라이머를 연장시킬 수 있는 다른 주형을 생성하기 위해서 용액 프라이머(제3 프라이머)(1526)와 함께 사용될 수 있다.
일부 예에서, 에멀션 액적은 증폭 속도를 촉진하기 위해서 표면에 부착되지 않은 제1 프라이머의 추가 카피를 더 포함할 수 있다. 도 16a를 참조하면, 이중 가닥 연장 산물(1600)을 생성하기 위해서 (제2 프라이머를 사용한) 주형 핵산 분자의 초기 연장 이후에, 용액(1602) 중 일부 추가 제1 프라이머는 용액 중에서 연장 산물을 기하급수적으로 증폭시키기 위해 용액 (제3) 프라이머(1604)와 함께 사용될 수 있다. 이러한 용액-기반 증폭의 장점은 연장 산물(1606)의 추가 용액 카피를 사용하여, 연장 산물(들)이 추가의 기하급수적 증폭을 위해 비드에 보다 빠르게 어닐링될 수 있다는 것이다. 느린 연장 단계 이후에, 방법의 나머지는 제2 주형 분자가 연장되기 전에 빨리 진행될 수 있다.
용액 중에서 또한 제1 프라이머를 갖는 추가 장점이 존재할 수 있다. 도 16b를 참조하여, 제2 (연장) 프라이머(1608)의 추가 카피는 제1 주형의 연장 이후에 신속하게 소비될 수 있어서 그들이 제2 주형을 연장하는데 이용될 수 없다. 제1 프라이머의 용액 카피는 (용액-기반 증폭에 비해서) 더 느린 표면-기반 증폭에 의존하지 않고 연장 산물(1610)의 추가 카피를 신속하게 생성시킬 수 있다. 연장 산물의 추가 카피는 제2 프라이머(1612)의 추가 카피를 혼성화하여 소모하기 위한 기재일 수 있다. 제2 프라이머의 모든 카피는 그들이 제2 핵산 주형을 연장하는데 사용되기 전에 제1 핵산 주형 (또는 이의 유도 카피)을 사용하여 신속하게 연장될 수 있다.
본 명세서에 기술된 시스템 및 방법은 비드 상에서 주형의 클론 증폭 및/또는 에멀션 중 증폭에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 도 17a를 참조하면, 방법은 표면(1700) 예컨대 유리, 플라스틱, 실리콘 웨이퍼, 또는 임의의 다른 적합한 표면 상에서 수행될 수 있다. 표면은 분리된 영역(1702, 1704)을 가질 수 있고, 각각의 영역은 표면의 영역 내에서 부착된 다수의 제1 프라이머(1706)를 갖는다. 예를 들어, 각각의 영역은 (제1 프라이머가 결여된) 충분한 갭 영역에 의해 이 격될 수 있다. 일부 예에서, 제1 영역 중 임의의 제1 프라이머 및 제2 영역 중 임의의 제1 프라이머 간 최소 거리는 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 m 이하의 순일 수 있다. 주형 핵산 분자의 라이브러리(1708, 1710)는 다수의 분리된 영역과 유체 접촉될 수 있다. 즉, 본 명세서에 기술된 방법은 다수의 에멀션 액적 중에서 수행될 필요는 없지만, 그럴 수도 있다.
모든 성분이 제1 프라이머의 다수의 클러스터에 대한 유체적 접근성을 갖는 개방 표면 상의 주된 기전은 에멀션에서 수행될 때와 유사할 수 있다. 도 17b를 참조하면, 제2 프라이머(1712)는 제1 핵산 주형을 연장시킬 수 있다. 도 17c에서, 연장 산물(1714)은 연장될 수 있는 (1716), 개방 표면 상의 제1 클러스터의 제1 프라이머의 카피 중 하나에 혼성화할 수 있다. 연장 산물을 생성하는 느린 과정 이후에, 표면 상의 증폭은 클러스터 위치에서 제1 프라이머의 실질적으로 모든 카피가 제2 주형으로부터 유래된 연장 산물이 동일한 클러스터 위치에서 어닐링되기 전에 소비 (그리고 클론)될 수 있도록 더 빠를 수 있다. 도 17d를 참조하면, 제1 핵산 주형(1718)에 상응하는 클론 클러스터가 생성될 수 있다. 다른 클러스터 위치(1720)는 다른 핵산 주형(들)의 클론 증폭에 이용가능할 수 있다.
일부 경우에, 제2 프라이머는 또한 표면에 부착된다 (대안적으로 용액에 존재하는 것 외에도). 제2 프라이머의 농도는 클러스터 (또는 비드)에 부착된 제1 프라이머의 수에 비해서, 예를 들어, 낮게 제한될 수 있다. 이들 실시형태의 장점은 제1 프라이머의 국소 카피를 신속하게 소비하는 이후 증폭 과정과 비교하여 방법의 초기 과정을 더 둔화시킬 수 있다는 것일 수 있다. 도 18a를 참조하면, 표면(1800)은 다수의 클러스터를 가질 수 있다. 클러스터는 (예를 들어, 별개 클러스터의 이미지화를 통한 DNA 시퀀싱을 위해) 어레이를 형성할 수 있다. 클러스터는 제1 프라이머(1802)의 몇개 카피 및 제2 프라이머(1804)의 소수 카피를 가질 수 있다. 일부 경우에, 제1 프라이머의 농도에 대한 제2 프라이머의 농도의 비는 약 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하의 순이다. 클러스터는 제1 주형(1806) 및 제2 주형(1808)을 포함하는 핵산 라이브러리와 유체 접촉할 수 있다. 도 18b에서 계속하여, 제1 핵산 주형(1806)은 클론 클러스터를 생성하기 위해서 제1 프라이머(1802)에 의해 후속하여 증폭될 수 있는 연장 산물을 생성하기 위해 제2 프라이머를 사용하여 연장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머의 개별 서열은 표면 (또는 상이한 비드)의 상이한 클러스터 위치에서 상이하다. 도 18c를 참조하면, 제1 클러스터 위치(1812)(또는 제1 비드)에서 다수의 제1 프라이머(1810)는 제2 클러스터 위치(1816)(또는 제2 비드)에서 다수의 제1 프라이머(1814)와 상이한 서열을 갖는다. 제2 프라이머는 또한 상이한 클러스터 또는 비드 위치에서 상이할 수 있다. 일부 경우에, 제2 프라이머는 공통 제1 부분 및 상이한 제2 부분을 갖는다. 도 18c에 도시된 바와 같이, 제1 클러스터 위치(1812)(또는 제1 비드)에 위치되는 제1 제2 프라이머의 제1 부분(1818)은 제2 클러스터 위치(1816)(또는 제2 비드)에 위치되는 제2 제2 프라이머의 제1 부분(1820)과 동일하다. 그러나, 개별 제2 프라이머의 제2 부분은 상이할 수 있다. 일부 예에서, 제1 제2 프라이머의 제2 부분(1822)은 제1 제1 프라이머(1810)와 동일할 수 있다. 일부 예에서, 제2 제2 프라이머의 제2 부분(1824)은 제2 제1 프라이머(1814)와 동일할 수 있다.
상이한 클러스터 위치 (또는 상이한 비드)에서 제1 프라이머가 상이한 결과로 (다른 클러스터 위치에 대한 추가 친화성없이) 그 클러스터 위치에 대한 추가 친화성을 전개시키는 클러스터 위치에서 초기에 연장되는 주형을 생성시킬 수 있다. 소정 클러스터 위치로부터의 연장 영역은 비연장 주형 및 제2 프라이머 간 혼성화의 친화성과 비교하여 소정 클러스터 위치에 대한 증가된 친화성 및 상동성의 추가 염기쌍을 제공한다. 어닐링 반응, 연장 반응, 및/또는 에멀션의 인큐베이션은 연장없이, 어닐링 및/또는 연장이 드물고/드물거나 느린 사건이게 하는 조건 (예를 들어, 온도)에서 수행될 수 있다.
도 18d를 참조하면, 제1 주형(1806)은 제1 클러스터 위치(또는 비드)(1812)에서 연장되어서 제1 제1 프라이머(1810)에 상보성인 영역을 포함하는 제1 연장 산물을 산출할 수 있다. 제2 주형(1808)은 제2 클러스터 위치(또는 비드)(1816)에서 연장되어서 제2 제1 프라이머(1814)에 상보성인 영역을 포함하는 제2 연장 산물을 산출할 수 있다. 도 18e를 참조하면, 제1 연장 산물(1826)은 그와 상동성의 영역을 갖고, 어닐링될 수 있어서, 제2 클러스터 위치(1816)가 아닌 제1 클러스터 위치(1812)에서 제1 프라이머의 연장을 위한 주형을 제공할 수 있는데, 즉, 제1 주형이 본래 제1 클러스터 위치에서 연장되었기 때문이다. 유사하게, 제2 연장 산물(1828)은 그와 상동성의 영역을 갖고, 어닐링될 수 있어서, 제2 클러스터 위치(1812)가 아닌 제2 클러스터 위치(1816)에서 제1 프라이머의 연장을 위한 주형을 제공하는데, 즉, 제1 주형이 본래 제2 클러스터 위치에서 연장되었기 때문이다. 클러스터 위치 간에 연장 산물의 이동은 특히 온도가 제2 프라이머 및 핵산 주형 간 어닐링 온도와 비슷하거나 또는 더 큰 온도가 사용되면, 바람직하지 않다. 본 명세서에 기술된 임의 용액은 대량 용액 또는 액적 내 환경 (예를 들어, 표면, 예를 들어, 비드 또는 다른 지지체의 표면 포함)을 의미할 수 있다.
본 개시는 표면에 주형의 초기의 느리거나 또는 드문 부착에 이어서 표면 프라이머를 써버리도록 표면-부착 주형 (또는 이의 유도체)의 신속한 증폭으로, 클론 증폭 주형 (또는 이의 유도체)을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이것은 부착을 허용하도록 주형의 연장을 사용하여 수행될 수 있다. 더 나아가서, 증폭 전에 다른 느리거나 또는 드문 단계가 본 명세서에 기술된 방법에 첨가될 수 있다. 추가의 느린 단계는 또한 이번에는 표면에 부착된 주형의 말단으로부터 원위 말단에서, 주형의 연장을 포함할 수 있다.
도 19a를 참조하면, 시스템, 방법, 및 조성물은 제2 프라이머(1902)(표면에 고정화)에 어닐링되고 연장되어 연장 산물을 생성하는 주형(1900)을 포함할 수 있다. 제2 프라이머는 주형으로서 핵산 주형 분자를 사용하여 연장될 수 있어서, 시퀀싱하려는 핵산 분자의 궁극적 콜로니의 제1 카피를 생성시킬 수 있다. 도 19b에서 계속하여, 연장 산물(1904)은 제2 프라이버로부터 멀리 확산되어서, 표면에 부착된 제1 프라이머의 카피(1906)에 혼성화되고, 제1 프라이머의 연장을 위한 주형(1908)으로서 제공된다. 그러나, 이러한 연장은 기하급수적이라기 보다는 선형인데, 즉, 제1 (표면) 프라이머의 오직 하나의 카피가 각 주기에서 연장된다. 이것은 연장 산물(1904) 및/또는 주형의 원위 말단(1910)(표면-고정화 프라이머에 커플링된 말단으로부터 반대 말단)이 제3 프라이머(1912)와 초기에 상보성이 아니기 때문이다. 시스템은 제1 부분(1916) 및 제2 부분(1918)을 갖는 제3 프라이머(1914)를 더 포함할 수 있다. 제1 부분이 핵산 주형에 어닐링될 수 있고 제2 부분은 핵산 주형을 연장시킬 수 있어서 연장 산물은 제3 프라이머와 혼성화될 수 있다.
도 19c에서 계속하여, 제4 프라이머(1914)는 표면(1920)에 고정화된 (제1 또는 제2 프라이머로부터) 이전에 연장된 카피를 더 연장시킬 수 있다. 제4 프라이머는 또한 일부 경우에, 예를 들어, 라이브러리 주형이 이중 가닥일 때 용액에서 주형 핵산 (또는 이의 산물)을 연장시킬 수 있다. 일부 경우에, 라이브러리 주형은 단일 가닥이고 제4 프라이머는 제1 또는 제2 프라이머와 먼저 연장될 때까지 라이브러리 주형과 혼성화되지 않는다.
이러한 연장 이후에, 도 19d에서 계속하여, 제3 프라이머(1912)는 이제 제1 프라이머(1906)의 추가 카피의 연장을 위한 주형으로서 제공될 수 있는 추가 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 연장될 수 있다. (제2 및 제4 프라이머를 사용한) 각 말단에서 본래 라이브러리 주형의 초기 연장은 (제1 및 제3 프라이머를 사용한) 기하급수적 증폭과 비교하여 비교적 느리고 드문 사건일 수 있다. 일부 경우에, 양쪽 연장은 기하급수적 증폭이 표면에 부착된 제1 프라이머의 클러스터에 의해 정의된 콜로니 위치를 채울 수 있기 전에 완료될 필요가 있다.
다른 양태에서, 본 명세서는 핵산 샘플을 클론적으로 증폭시키는 방법을 제공한다. 방법은 다수의 파티션을 갖는 에멀션을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 다수의 파티션의 파티션은 주형 핵산, 비드에 부착된 제1 프라이머의 다수 카피를 갖는 비드, 및 주형 핵산 또는 이의 유도체를 비드에 부착시킬 수 있는 부착 반응 및 제1 프라이머의 다수 카피를 사용하는 증폭 반응을 수행할 수 있는 시약 혼합물을 포함할 수 있다. 방법은 에멀션을 인큐베이션시켜서, 비드에 주형 핵산 또는 이의 유도체를 부착시키기 위한 부착 반응을 수행하고 비드에 부착된 주형 핵산 또는 이의 유도체를 증폭시키기 위한 증폭 반응을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 경우에, 제1 기간 (이 기간은 하기에 기술됨)은 제2 기간 (이 기간은 하기에 기술됨) 보다 크다. 제1 기간은 에멀션이 인큐베이션을 시작할 때 시작되고 주형 핵산 또는 이의 유도체가 비드에 부착될 때 종료될 수 있다. 일부 경우에, 제2 기간은 주형 핵산 또는 이의 유도체가 비드에 부착될 때 시작될 수 있고 증폭 반응이 종료될 때 종료된다. 일부 경우에, 제2 기간을 정의하기 위한 목적을 위해서, 증폭 반응은 비드 상의 제1 프라이머 또는 표면 상의 클러스터 위치의 제1 프라이머의 클러스터가 완전하게 연장될 때 종료되는 것으로 간주될 수 있다. 일부 경우에, 제2 기간을 정의하기 위한 목적을 위해서, 증폭 반응은 비드 상의 제1 프라이머 또는 표면 상의 클러스터 위치의 제1 프라이머의 클러스터의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 이상이 연장되었을 때 종료되는 것으로 간주될 수 있다.
제1 기간은 임의의 적합한 인자만큼 제2 기간에 비해 클 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 기간은 제2 기간에 비해서 약 5, 약 10, 약 20, 약 50, 또는 약 100배가 크다. 일부 실시형태에서, 제1 기간은 제2 기간에 비해서 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 50, 또는 적어도 약 100배가 크다.
지지체를 제공하는 방법
본 명세서에 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은, 연장된 프라이머 (예를 들어, 제2 프라이머)를 포함하는 지지체를 생성 및/또는 제공하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 임의의 지지체는 이후에, 예컨대 ePCR 작업 동안 분할될 수 있다. 적어도 하나 연장된 프라이머 분자 (예를 들어, 제2 프라이머) 및/또는 적어도 하나 주형 핵산 분자를 포함하는 지지체는 일반적으로 본 명세서에서 연장된 지지체라고 지칭할 수 있다. 예를 들어, 연장된 지지체는 도 18a를 참조하여, 표면(1800)을 포함하고, 표면은 프라이머의 클러스터 또는 다수의 이러한 클러스터를 포함하고, 클러스터는 제1 프라이머의 제1 개수 (예를 들어, 1802) 및 제2 프라이머의 제2 개수 (예를 들어, 1804)를 포함한다. 일부 경우에, 제2 개수는 제1 개수에 비해서 더 낮을 수 있다. 예를 들어, 표면 상에서 제1 프라이머의 농도에 대한 제2 프라이머의 농도의 비율은 약 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하의 순이다. 예시적 작업에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 핵산 주형은 표면에 부착된 제2 프라이머에 커플링 (예를 들어, 어닐링)되고 핵산 연장 반응이 가해져서 연장 산물을 생성시키며, 연장 산물, 또는 이의 유도체는 후속하여 표면에 부착된 제1 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 일부 경우에, 핵산 주형은 제1 프라이머에 어닐링되지 않을 수 있다. 다른 예에서, 연장된 지지체는 표면을 포함하고, 표면은 프라이머의 클러스터 또는 다수의 프라이머를 포함하고, 주형 핵산 분자는 클러스터의 프라이머에 커플링된다.
본 명세서는 비-연장된 지지체(들) 및 연장된 지지체(들)의 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 지지체는 다른 지지체와 개별적으로 또는 집합적으로, 제1 위치에서 제2 위치로 수송할 수 있는 이동식 지지체 (예를 들어, 비드, 입자 등)일 수 있다.지지체는 본 명세서의 다른 곳에 기술한 임의의 지지체일 수 있다. 단리된 연장된 지지체의 조성물, 혼합물, 또는 용액은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 액적으로의 후속 분할같은, 하류 작업에 특히 유리할 수 있고, 이러한 액적의 점유는 일반적으로 단일하게 점유된 액적의 유효 농도의 생성을 보장하기 위해서 미점유 또는 단일하게 점유된 대부분의 액적의 생성을 유도하는 포아송 분포를 따른다. 유리하게, 오직 연장된 지지체만이 분할되면, 지지체에 의해 점유된 액적의 개체군은 사용불가하지 않으면 하류 작업 (예를 들어, 라이브러리의 클론 증폭)에 대해서, 연장된 지지체에 비해서 더 비효율적인 비연장된 지지체를 함유하는 액적에 의해 희석되지 않을 것이다. 연장된 지지체가 이에 커플링된 주형 핵산 분자를 포함하는 경우에, 이중 포아송 분포 (액적 내 지지체 점유 및 주형 점유의 각각에 대해)는 단일 포아송 분포 (액적 중 단일 주형-지지체 조립 점유에 대해)로 감소될 수 있다. 연장된 지지체는 또한 유리하게, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 액적의 과로딩 (액적 중 하나 초과)을 허용할 수 있다. 웰 또는 다른 컨테이터같은, 액적 이외의 파티션이 사용될 수 있다. 연장된 지지체는 또한 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 대량 용액에서 사용을 위해 유리할 수 있다.
도 21은 연장된 지지체(2100)를 생성 및/또는 제공하기 위한 예시적인 방법을 예시하고, 연장된 지지체(2100)는 지지체 (예를 들어, 비드)의 표면에 부착된 다수의 프라이머를 포함한다. 다수의 프라이머는 하나 이상의 제1 프라이머(2102) 및 하나 이상의 제2 프라이머(2103)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제1 프라이머(2102)의 것과 비교하여 비교적 적은 개수의 제2 프라이머(2103)를 포함하는 클러스터를 포함하는 연장된 지지체(2100)를 생성하는 것에 특히 관심있을 수 있다. 일부 경우에, 연장된 지지체는 이에 부착된 제2 프라이머(2103)의 한 카피를 갖는다. 다른 경우에, 연장된 지지체는 제2 프라이머(2103)의 하나 초과의 카피, 예컨대 제2 프라이머(2103)의 소수 카피 또는 몇개 카피를 갖는다 (예시되지 않음). 대안적으로 또는 추가로, 지지체의 표면에 부착된 제2 프라이머(2103)의 것에 비해서 더 높은 수 또는 농도의 제1 프라이머(2102)가 존재할 수 있다. 일례에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 연장된 지지체가 샘플 제조 (예를 들어, 핵산 주형의 증폭을 위함)에 사용되는 경우에, 핵산 주형은 드문 경우로 그리하여 속도-제한 작업으로서, 제2 프라이머에 의해 연장되어서, 제1 프라이머로 이후에 증폭될 수 있는 연장 산물을 생성시킬 수 있고, 증폭은 지지체 상에 제공된 제2 프라이머에 비해서 더 많은 카피의 제1 프라이머가 존재하므로 초기 연장 산물 생성 반응에 비해서 유의하게 더 빠른 속도로 발생될 수 있다. 일부 경우에, 증폭 반응은 다른 핵산 주형이 (있다면) 반응 혼합물 중 다른 제2 프라이머로 연장될 수 있기 전에 연장된 지지체 상의 제1 프라이머의 카피를 (예를 들어, 그에 커플링되어) 고갈시킬 수 있고, 그리하여 지지체 상에서 (또는 지지체 상의 클러스터 내에서) 단일클론 개체군을 촉진시킬 수 있다.
출발 지지체(2101)(또는 비-연장된 지지체)는 제1 프라이머(2102)를 포함할 수 있다. 출발 지지체는 다수의 제1 프라이머, 예컨대 제1 프라이머의 클러스터를 포함할 수 있다. 제1 프라이머는 예를 들어, 상보성 서열의 혼성화를 통해서 연장 프라이머(2104)에 부착될 수 있고, 후속하여 연장되어 지지체에 고정화된, 연장된 프라이머, 제2 프라이머(2103)를 생성시킬 수 있다. 부착 반응 (예를 들어, 혼성화)은 용액, 예컨대 다수의 비-연장된 지지체를 포함하는 대량 용액 및/또는 비-연장된 지지체를 포함하는 파티션을 포함하는 에멀션에서 수행될 수 있다. 부착 과정 (예컨대 혼성화)은 단일 주기 연장 과정을 포함할 수 있다. 제2 프라이머가 생성된 후에, 세척 및/또는 용융 작업을 수행하여 연장 프라이머를 해리시켜서 연장된 지지체(2100)를 생성시킬 수 있다.
일부 예에서, 반응 혼합물 중 비-연장된 지지체 (예를 들어, 2101) 및 연장 프라이머 (예를 들어, 2104)의 각각의 농도는 최소 개수 (예를 들어, 하나, 소수, 몇개 등)의 제2 프라이머를 포함하는 연장된 지지체의 생성을 촉진하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 연장된 지지체는 (제1 프라이머 및 제2 프라이머 개체군 전체 중에서) 제1 프라이머의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999% 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 반응 혼합물은 (예를 들어, 비-연장된 지지체에 부착을 통해서) 존재하는 제1 프라이머의 개수 또는 농도에 비해서 더 적은 개수 또는 낮은 농도의 연장 프라이머를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 용액 중 연장 프라이머의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 비율은 많아야 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000 이하이다. 대안적으로 또는 추가로, 용액 중 연장 프라이머의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도는 적어도 약 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:29, 1:18, 1:17, 1:16, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10 이상이다. 일부 예에서, 용액 중 연장 프라이머의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 백분율은 많아야 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 이하이다. 대안적으로 또는 추가로, 연장 프라이머의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 백분율은 적어도 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상이다. 최종 혼합물은 비연장된 채로 남아있는 비-연장된 지지체(들) 및 연장된 지지체(들)의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 명세서는 비-연장된 지지체(들) 및 연장된 지지체(들)의 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는 방법을 제공한다.
도 22a는 연장된 지지체를 단리하기 위한 예시적인 방법을 예시한다. 출발 지지체(2201)(또는 비-연장된 지지체)는 제1 프라이머(2202)를 포함할 수 있다. 출발 지지체는 다수의 제1 프라이머, 예컨대 제1 프라이머의 클러스터를 포함할 수 있다. 출발 지지체는 연장 기(2204)와 접촉될 수 있다. 제1 프라이머는 연장 기에 부착될 수 있다. 연장 기는 포획 실체(2205)를 포함하는 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 비오틴(B)을 포함할 수 있어서, 프라이머 분자가 비오틴화된다. 일부 예에서, 포획 실체는 포획 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 프라이머 분자의 서열은 포획 서열로서 기능할 수 있다. 다른 예에서, 포획 실체는 포획 서열을 포함하는 다른 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 자기장의 인가에 의해서 포획할 수 있는 자성 입자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 전기장의 인가에 의해 포획할 수 있는 하전 입자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 포획성 실체에 의해 포획될 수 있거나, 또는 포획을 위해 구성된 하나 이상의 다른 기전을 포함할 수 있다.
제1 프라이머(2202)는 (예를 들어, 제1 프라이머(2202)의 서열 및 프라이머 분자의 서열 간에) 예를 들어, 상보성 서열의 혼성화를 통해서, 연장 기(2204)에 부착될 수 있고, 후속하여 연장되어서 지지체에 고정화된, 연장된 프라이머, 제2 프라이머(2203)를 생성시킨다. 부착 반응 (예를 들어, 혼성화)은 용액, 예컨대 다수의 비-연장된 지지체를 포함하는 대량 용액 및/또는 비-연장된 지지체를 포함하는 파티션을 포함하는 에멀션에서 수행될 수 있다. 부착 과정 (예컨대 혼성화)은 단일 주기 연장 과정을 포함할 수 있다. 제2 프라이머가 생성된 후에, 연장 기(2204)는 제1 프라이머(2202)와 회합되고 지지체에 고정화된 채로 남아있을 수 있다.
대안적으로, 도 22b를 참조하여, 출발 지지체(2201)(또는 비-연장된 지지체)는 제1 프라이머(2202)를 포함할 수 있다. 출발 지지체는 다수의 제1 프라이머, 예컨대 제1 프라이머의 클러스터를 포함할 수 있다. 출발 지지체는 연장 기(2204)와 접촉될 수 있다. 제1 프라이머는 연장 기에 부착될 수 있다. 이러한 예에서 연장 기는 포획 실체(2205)가 결여된다. 제1 프라이머(2202)는 (예를 들어, 제1 프라이머(2202)의 서열 및 프라이머의 서열 간에) 예를 들어 상보성 서열의 혼성화를 통해서, 연장 기(2204)에 부착될 수 있고, 후속하여 연장되어서, 지지체에 고정화된, 연장된 프라이머, 제2 프라이머(2203)를 생성시킬 수 있다. 연장 반응을 위해서, 포획 실체를 포함하는 시약 (예를 들어, 포획 실체를 포함하는 뉴클레오티드, 예컨대 비오틴)을 사용하여 포획 실체(2205)를 포함하는 제2 프라이머(2203)를 생성시킬 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 비오틴 (B)일 수 있어서, 비오틴 표지된 뉴클레오티드는 연장 반응에 사용된다. 단일 표지된 염기, 예컨대 표지된 아데닌, 표지된 티민, 표지된 구아닌, 또는 표지된 시토신, 또는 이의 유도체가 적용될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 연장 기(2204)의 서열을 기반으로 선택될 수 있다. 일례에서, 오직 단일 표지된 뉴클레오티드가 첨가된다. 이것은 특정 염기의 오직 한 잔기를 포함하는 연장 기(2204)에 대한 서열을 선택하여 획득될 수 있다. 대안적으로, 연장은 2개 작업으로 수행될 수 있다. 제1 작업에서, 오직 제1 뉴클레오티드가 첨가되고 이 뉴클레오티드는 포획 실체(2205)로 표지된다. 제2 연장 반응은 모든 염기로 수행되고, 표지된 염기는 사용되지 않는다. 그 결과로 오직 하나의 포획 실체(2205)를 포함하는 제2 프라이머(2203)를 생성시킨다. 대안적으로, 단계식 단일 표지된 뉴클레오티드 첨가는 임의의 다른 연장 위치 (예를 들어, 제2 위치, 제3 위치, 제4 위치 등)에서 수행할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 포획 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 연장 기(2204)의 상보체는 포획 서열이어서, 제2 프라이머(2203)는 포획 서열을 포함한다.
도 22a를 다시 참조하면, 이에 부착된 연장 기(2204)를 포함하는 지지체는 포획성 기(2220)와 접촉될 수 있거나 또는 달리 그에 의해 포획될 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기는 포획 실체(2205)를 포획하도록 구성된 포획성 실체(2207)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 포획성 실체는 포획 실체를 표적화하도록 구성될 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 모이어티가 비오틴을 포함할 때 스트렙트아비딘 (SA)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체가 (예를 들어, 상보성 포획 서열에 상보성인) 포획 서열을 포함할 때 상보성 포획 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체가 자성 입자를 포함할 때 자기장을 인가하도록 구성된 장비, 시스템, 또는 장치를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체가 하전 입자를 포함할 때 전기장을 인가하도록 구성된 장비, 시스템, 또는 장치를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체를 포획하도록 구성된 하나 이상의 다른 기전을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기는 예를 들어, 2차 포획성 실체(2208)에 의한 후속 포획을 위해서, 2차 포획 실체(2206)를 포함할 수 있다. 2차 포획 실체 및 2차 포획성 실체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 임의의 하나 이상의 포획성 기전 (예를 들어, 비오틴 및 스트렙트아비딘, 상보성 포획 서열 등)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획 실체는 자성 입자 (예를 들어, 자성 비드)를 포함할 수 있고 2차 포획성 실체는 자성 시스템 (예를 들어, 자기장을 인가하도록 구성된 자석, 장비, 시스템, 또는 장치 등)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획 실체는 하전 입자 (예를 들어, 전하 운반 하전 비드)를 포함할 수 있고 2차 포획성 실체는 전기 시스템 (예를 들어, 전기장을 인가하도록 구성된 자석, 장비, 시스템, 또는 장치 등)을 포함할 수 있다.
그에 부착된 연장 기(2204)를 포함하는 지지체는 포획성 기(2220)와 접촉되거나, 또는 달리 포획을 겪을 수 있고, 포획성 기의 포획성 실체(2207)는 지지체에 고정화된 포획 실체(2205)에 결합될 수 있거나, 커플링될 수 있거나, 혼성화될 수 있거나, 또는 달리 회합될 수 있다. 포획 실체 및 포획성 실체 간 회합은 비-공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 예를 들어, 자극의 인가 시에, 방출가능한 결합의 형성을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 회합은 임의 결합을 형성하지 않을 수 있다. 예를 들어, 회합은 포획성 실체 및 포획 실체 간 물리적 근접성을 증가시킬 수 있다 (또는 물리적 거리를 감소시킬 수 있다). 일부 예에서, 단일 포획 실체는 단일 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로, 단일 포획 실체는 다수 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단일 포획성 실체는 다수 포획 실체와 회합될 수 있다. 포획 실체/포획성 실체 쌍은 임의 조합일 수 있다. 쌍은 제한없이, 비오틴/스트렙트아비딘, 아지드/시클로옥틴, 및 티올/말레이미드를 포함할 수 있다. 쌍의 양쪽 분자는 포획 실체 또는 포획성 실체로서 사용될 수 있고, 포획 실체는 뉴클레오티드에 연결될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 비오틴, 아지드, 시클로옥틴, 테트라졸, 및 티올, 및 많은 다른 것들을 포함하는 화학적으로 변형된 염기는 포획 실체로서 적합하다.
다수의 비-연장된 지지체 및 다수의 연장 기에 대해 다량 용액에서 본 명세서에 기술된 작업을 수행할 수 있다. 일부 예에서, 반응 혼합물 중 비-연장된 지지체 및 연장 기의 개별 농도는 제2 프라이머의 소수 개수 (예를 들어, 하나, 소수, 몇개 등)를 포함하는 연장된 지지체의 생성을 촉진하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물은 (예를 들어, 비-연장된 지지체에 부착을 통해서) 존재하는 제1 프라이머의 개수 또는 농도에 비해 더 적은 개수 또는 더 낮은 농도의 연장 프라이머 (예를 들어, 프라이머 분자)를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 용액 중 연장 기의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 비율은 많아야 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000 이하이다. 대안적으로 또는 추가로, 용액 중 연장 기의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 비율은 적어도 약 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:29, 1:18, 1:17, 1:16, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10 이상이다. 일부 예에서, 용액 중 연장 기의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 백분율은 많아야 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 이하이다. 대안적으로 또는 추가로, 연장 기의 농도 대 비-연장된 지지체의 농도의 백분율은 적어도 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 이상이다. 최종 혼합물은 비연장된 채로 남아있는 비-연장된 지지체(들) 및 연장된 지지체(들)의 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 포획성 기는 그에 부착된 연장 기를 표적화하여 연장된 지지체(들) (각각이 그에 부착된 연장 기를 포함) 및 비-연장된 지지체(들) (연장 기에 부착되지 않음)의 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기는 그에 부착된 개별 연장 기를 표적화하여 연장된 지지체(들) (각각이 그에 부착된 연장 기를 포함) 및 비-연장된 지지체(들) (연장 기에 부착되지 않음)의 혼합물로부터 다수의 연장된 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 다수의 포획성 기는 그에 부착된 연장 기를 표적화하여 연장된 지지체(들) (각각이 그에 부착된 연장 기 포함) 및 비-연장된 지지체(들) (연장 기에 부착되지 않음)의 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는데 사용될 수 있다.
단리되면, 세척 및/또는 용융 작업은 연장된 지지체(2200)를 제공하기 위해서 지지체로부터 연장 기를 해리시키기 위해 수행될 수 있다.
일부 예에서, 포획성 기(2220)는 혼합물로부터 연장된 지지체의 단리없이 연장된 지지체와 회합될 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기가 2차 포획 실체(2206)를 더 포함하는 경우에, 지지체는 혼합물 중 2차 포획 실체와 회합된 채로 남아있을 수 있다. 지지체는 2차 포획성 실체(2208)와 접촉될 수 있거나, 또는 달리 포획을 겪을 수 있다. 2차 포획성 실체는 포획성 기의 2차 포획 실체에 결합할 수 있거나, 커플링될 수 있거나, 혼성화될 수 있거나, 또는 달리 회합될 수 있다. 2차 포획 실체 및 2차 포획성 실체 간 회합은 비-공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 예를 들어, 자극의 인가 시에, 방출가능한 결합의 형성을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 회합은 임의 결합을 형성할 수 없다. 예를 들어, 회합은 2차 포획성 실체 및 2차 포획 실체의 물리적 근접성을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 물리적 거리를 감소시킬 수 있다). 일부 예에서, 단일 2차 포획 실체는 단일 2차 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로, 단일 2차 포획 실체는 다수 2차 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단일 2차 포획성 실체는 다수 2차 포획 실체와 회합될 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획성 기는 그에 부착된 포획 기를 표적화하여 연장된 지지체(들) (각각이 그에 부착된 포획 기를 포함) 및 비-연장된 지지체(들) (포획 기에 부착되지 않음)의 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획성 기는 그에 부착된 개별 포획 기를 표적화하여 연장된 지지체(들) (각각이 그에 부착된 포획 기를 포함) 및 비-연장된 지지체(들) (포획 기에 부착되지 않음)의 혼합물로부터 다수 연장된 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 다수의 2차 포획성 기는 그에 부착된 포획 기를 표적화하여 연장된 지지체(들) (각각이 그에 부착된 포획 기를 포함) 및 비-연장된 지지체(들) (포획 기에 부착되지 않음)의 혼합물로부터 연장된 지지체를 단리하는데 사용될 수 있다.
단리되면, 세척 및/또는 용융 작업은 연장된 지지체(2200)를 제공하기 위해서 지지체로부터 연장 기 및 포획 기 (및 일부 경우에 또한 2차 포획성 실체)를 해리하기 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, 2차 포획성 실체(2208)는 혼합물로부터 연장된 지지체의 단리없이 연장된 지지체와 회합될 수 있다. 일부 경우에, 2차 포획성 실체는 제3 포획성 실체에 의한 후속 포획을 위해 구성된 제3 포획 실체를 포함할 수 있다 (예시되지 않음). 혼합물로부터의 단리 및/또는 다음 정도의 포획성 실체에 의한 회합을 위해서, 다음 정도의 포획성 실체에 의해 포획될 수 있는 다른 포획 기를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 단리되면, 세척 및/또는 용융 작업은 연장된 지지체(2200)를 제공하기 위해서 지지체로부터 연장 기 (및 임의 개수의 포획 실체 및/또는 포획성 실체)를 해리시키기 위해 수행될 수 있다.
일례의 작업에서, 각각이 다수의 제1 프라이머를 포함하는 다수의 지지체는 각각이 비오틴화된 프라이머 분자를 포함하는 다수의 연장 기와 접촉된다. 일부 예에서, 프라이머 분자는 제1 프라이머에 부착되고 지지체에 고정화된 제2 프라이머를 생성하기 위해 핵산 연장이 가해진다. 지지체는 비오틴화된 프라이머 분자와 회합된 채로 남아있고 자성 비드에 커플링된 스트렙트아비딘을 포함하는 포획 기와 접촉된다. 스트렙트아비딘은 비오틴에 결합되어서, 자성 비드를 지지체와 회합시킨다. 일부 예에서, 지지체는 연장 기와 접촉되지 않고 자성 비드와 회합되지 않는다. 예를 들어, 혼합물은 자성 비드(들)와 회합된 연장된 지지체(들) 및 자성 비드와 회합되지 않은 비-연장된 지지체(들)를 포함할 수 있다. 자석이 사용되거나, 또는 다른 자기장이 인가되어서, 자성 비드(들)를 표적화하고 혼합물로부터 자성 비드(들)와 회합된 연장된 지지체(들)를 단리한다. 최종 단리된 조성물은 오직 연장된 지지체(들) 또는 대부분의 연장된 지지체(들)를 포함한다. 단리된 조성물에 일부 오염이 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 세척 작업은 연장된 지지체(들)로부터 연장 기(들) 및/또는 포획 기(들)를 해리시키기 위해 수행된다.
도 23은 연장된 지지체를 단리하기 위한 다른 예시적인 방법을 예시한다. 제2 프라이머(2302)를 포함하는 연장된 지지체(2300)는 예컨대 도 21에 대해 기술된 방법에 따라서 제공될 수 있다. 포획 기는 포획 실체(2305)(예를 들어, 자성 비드) 및 그에 부착된 핵산 서열(2303)을 포함하는 것이 제공될 수 있다. 포획 실체에 부착된 핵산 서열은 연장된 지지체에 부착된 제2 프라이머의 서열과 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 포획 기는 예컨대 핵산 서열 및 제2 프라이머의 서열의 혼성화를 통해서 연장된 지지체와 회?d될 수 있고, 그리하여 포획 실체를 연장된 지지체와 회합시킨다. 포획 기-회합된 지지체는 포획성 실체(2306)(예를 들어, 자석)와 접촉될 수 있거나, 또는 달리 그에 의해 포획될 수 있다. 포획 기, 및/또는 포획 실체는 회합 이후에 연장된 지지체로부터 해리될 수 있다. 일부 예에서, 포획 기는 재사용될 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 재사용될 수 있다. 일부 예에서, 핵산 서열(2303)을 포함하는 핵산 분자는 재사용될 수 있다. 상이한 시약의 재사용은 연장된 지지체의 단리를 위한 비용-효율적인 접근법일 수 있다. 포획 실체 및 포획성 실체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 임의의 하나 이상의 포획성 기전 (예를 들어, 비오틴 및 스트렙트아비딘, 상보성 포획 서열, 자성 입자 및 자기장, 하전 입자 및 전기장 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포획 실체는 자성 성질을 갖는 입자를 포함할 수 있고 포획성 실체는 자기장을 인가하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 포획 실체는 전하를 보유하는 하전 입자를 포함할 수 있고 포획성 실체는 전기장을 인가하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 포획 실체는 핵산 포획 서열을 포함할 수 있고 포획성 실체는 상보성 핵산 포획 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열(2303)이 포획 실체(2305)를 직접적으로 제2 프라이머(2302)에 부착시키는데 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 도 22b에 기술된 바와 같이, 연장 반응은 지지체 상의 프라이머에 직접적으로 포획 실체(2305)를 포함하는 포획 서열 또는 변형된 뉴클레오티드를 첨가하는데 사용될 수 있다. 도 22b에서, 프라이머는 제1 프라이머였지만, 프라이머는 또한 제2 프라이머(2302)일 수도 있음을 이해할 것이다.
다른 방법을 사용하여 혼합물 용액으로부터 연장된 지지체를 분리할 수 있다. 이러한 분리 방법은 연장된 지지체(예를 들어, 2300)에 결합할 수 있는 하나 이상의 다른 서열 또는 모이어티를 사용하여서, 지지체 개체군의 나머지로부터 연장된 지지체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 서열 또는 모이어티는 용액에 존재하는 시약, 물질, 및/또는 모이어티의 나머지와 비교하여 연장된 지지체에 대해 더 높거나 또는 유의하게 더 높은 결합 친화성을 포함할 수 있다. 그러므로, 이러한 서열 또는 모이어티 (본 명세서에서 분리 모이어티라고 함)는 연장된 지지체에 결합할 수 있고/있거나, 그와 회합될 수 있고/있거나, 포획할 수 있다. 용액의 나머지로부터 연장된 지지체를 분리하는 단계는 일부 예에서 실험, 어세이, 또는 절차, 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 기술된 방법 및 시스템에서 시약으로서 사용할 수 있는, 연장된 지지체의 보다 정제된 조성물을 제공하는데 기여할 수 있다.
연장된 지지체는 시약으로서 생성, 분리, 제작, 및/또는 제조될 수 있다. 연장된 지지체는 키트, 예컨대 실험 키트 또는 검사에 포함될 수 있다. 연장된 지지체는 실험 또는 다른 절차에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 키트는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 이상의 순도 (연장된 지지체 및 비-연장된 지지체의 조합 농도에 대한 연장된 지지체의 농도)를 갖는 연장된 지지체 시약 용액을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
본 개시는 실험에서 연장된 지지체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 연장된 지지체는 서열의 라이브러리, 예컨대 실험 (예컨대, 시퀀싱 실험, 예를 들어, 차세대 시퀀싱, 또는 임의의 다른 유형의 시퀀싱)에서 분석하려는 핵산 서열의 라이브러리가 제공될 수 있다. 서열의 라이브러리는 그에 부착되는 하나 이상의 어댑터 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 서열의 라이브러리는 주형 핵산 서열을 포함할 수 있다. 주형 핵산 서열은 그에 부착된 하나 이상의 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 주형 핵산 서열은 제1 말단에 측접된 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 주형 핵산 서열은 2개 말단이 측접된 동일하거나 또는 상이한 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 주형 분자는 어댑터 서열을 포함하지 않을 수 있다.
일부 예에서, 연장된 지지체는 핵산 서열의 라이브러리와 혼합될 수 있고 혼합물은 지지체에 주형 핵산 서열 (또는 이의 상보체)을 고정화할 수 있는 핵산 연장 반응을 개시하기에 충분한 조건이 가해질 수 있다. 일부 예에서, 이러한 반응은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 파티션 (예를 들어, 에멀션 중 액적)에서 수행될 수 있고, 파티션은 하나 이상의 연장된 지지체 및 하나 이상의 주형 핵산 서열을 포함한다. 다른 예에서, 이러한 반응은 대량 용액에서 수행될 수 있다. 일례에서, 고정화(예를 들어, 혼성화)는 용액(예를 들어, 오프-칩)에서 수행될 수 있고, 용액 중에서 고정화 후에, 고정화된 조립체 (연장된 지지체 및 주형 분자의 조합)는 후속 작업을 위해서 파티션 (예컨대 본 명세서에 기술된 파티션)에 캡슐화될 수 있다. 일부 예에서, 파티션은 액적이다. 일부 예에서, 파티션은 웰이다.
사전-농축
본 명세서는 일반적으로 조립체라고 지칭되는, 사전-조립된 지지체를 생성하기 위한 방법을 제공하고, 조립체는 단일 지지체에 고정화된 단일 주형 핵산 분자를 포함한다. 후속 작업에서, 이러한 조립체는, 수집체로서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 에멀션의 개별 반응 챔버 내에서 주형 핵산 분자의 증폭 반응을 촉진하기 위해 증폭 시약 (예를 들어, 용액 프라이머)과 함께, 분할될 수 있다. 유리하게, 단일 조립체를 포함하는 파티션은 파티션 내 동일 지지체에 증폭 산물의 단일클론 개체군을 고정화시킬 수 있다. 파티션 중 이러한 조립체의 구획화 또는 캡슐화는 포아송 분포를 따라서, 예를 들어, 단일 조립체를 포함하는 파티션 이외에도, 임의의 조립체를 포함하지 않는 파티션, 및/또는 다수의 조립체 (예를 들어, 상이한 주형 서열을 가짐)를 포함하는 파티션을 포함할 수 있다. 분할 전에 사전 조립된 지지체를 제공함으로써, 에멀션의 파티션 중 분포에 대한 이중 포아송 문제가 단일 포아송 분포 문제까지 감소될 수 있다. 다수의 지지체 및 다수의 주형 (지지체에 고정화되지 않음)이 분할되면, 각각은 그 자체의 포아송 분포 모델을 따르고, 단일 지지체 및 단일 주형을 갖는 유의하게 적은 파티션이 1차 포아송 분포 모델과 비교하여 생성된다. 이러한 결과는 본 명세서에 기술된 방법과 비교했을 때 소중한 주형의 손실 및 가치있는 자원의 비효율적인 사용을 야기시킨다.
일부 예에서, 방법은 다수의 연장된 지지체 및 각각이 상이한 핵산 서열을 갖는 다수의 주형 핵산 분자 (예를 들어, 라이브러리 내)의 혼합물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 다수의 연장된 지지체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 연장된 지지체 (연장된 지지체 및 비-연장된 지지체의 혼합물)의 정제된 조성물을 포함할 수 있다. 각각의 주형 핵산 분자는 제2 프라이머와 어닐링되도록 구성될 수 있고/있거나, 어닐링될 수 있다. 다수의 연장된 지지체의 연장된 지지체는 다수의 제1 프라이머 및 단일 카피, 소수의 카피, 몇개의 카피, 및/또는 주형 핵산 분자에 어닐링하는데 이용가능한 다수의 제1 프라이머의 개수에 비해서 유의하게 낮은 수의 제2 프라이머를 포함할 수 있다. 혼합물에 대해서 다수의 연장된 지지체 전반에 분포된 다수의 제2 프라이머에 다수의 주형 핵산 분자를 어닐링시키거나 또는 달리 회합시키기에 충분한 조건을 가할 수 있다. 혼합물에 대해서 지지체에 커플링되지 않은 주형 핵산 분자를 세척하기에 충분한 조건이 가해질 수 있다. 일부 예에서, 이것은 세척 동안 지지체가 안정한 상태로 남아있도록 지지체를 고정화 플랫폼 (예를 들어, 지지체 등에 예컨대 일부 친화성 (예를 들어, 자성, 전기, 소수성, 친수성 등)을 통해서, 지지체를 고정화시키도록 구성된 다른 표면 또는 구조)에 고정화시켜서 획득될 수 있다. 각각의 연장된 지지체는 많은 개수의 다수의 제1 프라이머에 비해서 제2 프라이머의 오직 하나의 카피, 소수의 카피, 몇개의 카피, 및/또는 유의하게 낮은 개수를 갖기 때문에, 최종 반응 산물은 다수의 조립체를 포함할 수 있고, 대부분, 또는 실질적으로 전부의 조립체는 각각이 지지체에 고정화된 단일 주형 핵산 분자를 포함한다. 이러한 조립체는 개별 반응 챔버 내에서 주형 핵산 분자의 증폭 반응을 촉진하기 위해서, 예컨대 증폭 시약 (예를 들어, 용액 프라이머 포함)과 함께, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 분할될 수 있다. 유리하게, 단일 조립체를 포함하는 파티션은 파티션 내 동일 지지체에 증폭 산물의 단일클론 개체군을 고정화시킬 수 있다.
일부 예에서, 연장된 지지체 및 주형 핵산 분자의 혼합 과정 동안, 연장된 지지체의 농도는, 적합한 경우 (예를 들어, 이용가능한 샘플이 많이 존재할 때)에 주형 핵산 분자의 농도에 비해서 더 낮을 수 있다. 예를 들어, 샘플(들)은 과량으로 제공될 수 있다. 과량으로 샘플의 제공은 혼합 및 혼성화로 인한 블랭크 연장된 지지체 (주형 부재)의 개수를 감소시킬 수 있다.
일부 방법을 사용하여, 기술자는 예컨대 조립체의 유용한 개체군을 생성하기 위해 지지체와 샘플을 혼합하기 전에, 샘플을 제조하기 위해 매우 정밀한 측정을 해야만 할 수 있다. 본 개시에 제공된 연장된 지지체는 반응 혼합물 중 라이브러리의 농도의 정밀한 측정이 요구되지 않는 과정과 유리하게 상용성일 수 있다. 일부 예에서, 단지 과량의 샘플 제공은 라이브러리의 농도가 높은 정밀도로 측정되지 않은 경우더라도, 성공적인 혼성화 (예를 들어, 연장된 지지체와) 과정에 기여할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 과량의 샘플 제공은 혼성화 반응을 위한 인큐베이션 시칸의 감소를 가능하게 할 수 있다. 과량의 샘플 (라이브러리)의 제공은 혼성화의 속도 및 수율을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에 샘플은 과량으로 제공되지 않을 수 있다 (예를 들어, 샘플이 소중한 경우).
일부 예에서, 도 24a를 참조하면, 방법은 다수의 지지체 (예를 들어, 지지체(2401), 비-연장된 지지체) 및 각각이 상이한 핵산 서열을 갖는 다수의 주형 핵산 분자 (예를 들어, 주형 핵산 분자(2402))를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 지지체에 부착된 프라이머를 어닐링시키도록 구성될 수 있고/있거나, 어닐링될 수 있다. 주형 핵산 분자는 포획성 기(2408)의 포획성 실체에 의한 후속 포획을 위해 구성된 포획 실체(2406)를 포함할 수 있다. 지지체는 주형 핵산 분자에 어닐링을 위해 이용가능한 다수의 프라이머를 포함할 수 있다.
대안적으로, 도 24b는 예시적인 방법을 예시하고, 여기서 주형 핵산 분자는 포획 실체(2406)가 결여되고, 포획 실체(2406)는 연장 산물에 첨가된다. 도 24a를 참조하여 설명하면, 다수의 지지체 (예를 들어, 지지체(2401), 비-연장된 지지체) 및 각각이 상이한 핵산 서열을 갖는 다수의 주형 핵산 분자 (예를 들어, 주형 핵산 분자(2402))를 포함하는 혼합물이 제공된다. 포획 실체가 결여된 주형 핵산 분자는 지지체에 부착된 프라이머와 어닐링되도록 구성될 수 있고/있거나, 어닐링될 수 있다. 도 22b의 설명과 유사하게, 프라이머는 예를 들어, 상보성 서열 (예를 들어, 제1 프라이머의 서열 및 어댑터 1의 서열 간)의 혼성화를 통해서, 주형 핵산 분자에 부착될 수 있고, 후속하여 지지체에 고정화된 연장 산물을 생성시키도록 연장된다. 연장 반응을 위해서, 포획 실체를 포함하는 시약 (예를 들어, 포획 실체를 포함하는 뉴클레오티드)을 사용하여 포획 실체(2406)를 포함하는 연장 산물을 생성시킬 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 비오틴 (B)일 수 있어서, 비오틴 표지된 뉴클레오티드는 연장 반응에 사용된다. 단일 표지된 염기, 예컨대 표지된 아데닌, 표지된 티민, 표지된 구아닌, 또는 표지된 시토신, 또는 이의 유사체가 적용될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 주형(2402)의 어댑터 1의 서열을 기반으로 선택될 수 있다. 일례에서, 오직 단일 표지된 뉴클레오티드만이 첨가된다. 이것은 2개 작업으로 연장을 수행하여 획득될 수 있다. 제1 작업에서, 오직 제1 뉴클레오티드만이 첨가되고 이 뉴클레오티드는 포획 실체(2406)로 표시된다. 이것은 제1 프라이머의 서열에 상보성이 아닌 어댑터 1의 서열에 존재하는 제1 염기일 수 있다. 제2 연장 반응은 모든 염기와 수행되며, 표지된 염기는 사용되지 않는다. 이것은 오직 하나의 포획 실체(2406)를 포함하는 지지체에 고정화된 연장 산물을 생성시킨다. 대안적으로, 단계식 단일 표지된 뉴클레오티드 첨가는 임의의 다른 연장 위치 (예를 들어, 제2 위치, 제3 위치, 제4 위치 등)에서 수행될 수 있다.
일부 예에서, 반응 혼합물 중 지지체 및 주형 핵산 분자의 개별 농도는 단일 지지체 및 지지체에 고정화된 단일 주형 핵산 분자 (또는 이의 상보체)를 포함하는 대부분의 조립체의 생성을 촉진하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 최종 지지체는 (전체 프라이머 개체군 중에서) 주형 핵산 분자와 회합되지 않은 프라이머의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999% 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 반응 혼합물은 존재하는 지지체의 개수 또는 농도에 대해서 주형 핵산 분자의 더 적은 개수 또는 더 낮은 농도를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 용액 주형 핵산 분자의 농도 대 지지체의 농도의 비율은 많아야 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 이하이다. 대안적으로 또는 추가로, 용액 중 주형 핵산 분자의 농도 대 지지체의 농도의 비율은 적어도 약 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:29, 1:18, 1:17, 1:16, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 이상이다. 일부 예에서, 용액 중 주형 핵산 분자의 농도 대 지지체의 농도의 백분율은 많아야 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 이하이다. 대안적으로 또는 추가로, 용액 중 주형 핵산 분자의 농도 대 지지체의 농도의 백분율은 적어도 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상이다.
도 24a를 다시 참조하면, 혼합물에 대해서 다수의 지지체 전반에 분포된 다수의 프라이머에 다수의 주형 핵산 분자를 어닐링(2403)하기에 충분한 조건을 가할 수 있고, 개별 지지체에 고정화된 개별 주형 핵산 분자의 상보체를 생성하기 위해 연장(2404)을 가할 수 있다. 지지체는 개별 주형 핵산 분자 (예를 들어, 2402)의 개별 포획 실체 (예를 들어, 2406)와 회합된 채로 남아있을 수 있다. 최종 혼합물은 하나 이상의 주형 핵산 분자 (및 포획 실체)를 포함하는 지지체 및 회합된 임의의 주형 핵산 분자 (및 포획 실체)를 포함하지 않는 지지체의 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 포획 실체(2406)는 비오틴 (B)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 포획 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 주형 핵산 분자의 서열은 포획 서열로서 기능할 수 있다. 다른 예에서, 포획 실체는 포획 서열을 포함하는 다른 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 자기장의 인가에 의해 포획될 수 있는 자성 입자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 전기장의 인가에 의해 포획될 수 있는 하전 입자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획 실체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 포획성 실체에 의해 포획될 수 있거나, 또는 그러한 포획을 위해 구성된 하나 이상의 다른 기전을 포함할 수 있다.
그에 회합된 주형 핵산 분자(2402)를 포함하는 지지체(2401)는 포획성 기(2408)와 접촉될 수 있거나, 또는 달리 포획될 수 있다. 포획성 기는 포획 실체(2406)를 포획하도록 구성된 포획성 실체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 포획성 실체는 포획 실체를 표적화하도록 구성될 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 모이어티가 비오틴을 포함하는 경우에 스트렙트아비딘 (SA)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체가 포획 서열 (예를 들어, 상보성 포획 서열에 상보성)을 포함하는 경우에 상보성 포획 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체가 자성 입자를 포함하는 경우에 자기장을 인가하도록 구성된 장비, 시스템, 또는 장치를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체가 하전 입자를 포함하는 경우에 전기장을 인가하도록 구성된 장비, 시스템, 또는 장치를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 실체는 포획 실체를 포획하도록 구성된 하나 이상의 다른 기전을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기는 예를 들어 2차 포획성 실체(2407)에 의한 후속 포획을 위해 2차 포획 실체를 포함한다. 2차 포획 실체 및 2차 포획성 실체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 임의의 하나 이상의 포획성 기전 (예를 들어, 비오틴 및 스트렙트아비딘, 상보성 포획 서열 등)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획 실체는 자성 입자 (예를 들어, 자성 비드)를 포함할 수 있고 2차 포획성 실체는 자성 시스템 (예를 들어, 자기장을 인가하도록 구성된 자석, 장비, 시스템, 또는 장치 등)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획 실체는 하전 입자 (예를 들어, 전하 운반 하전 비드)를 포함할 수 있고 2차 포획성 실체는 전기 시스템 (예를 들어, 전기장을 인가하도록 구성된 자석, 장비, 시스템, 또는 장치 등)을 포함할 수 있다.
그에 회합된 포획 실체(2406)를 포함하는 지지체가 포획성 기(2408)와 접촉되거나, 또는 달리 포획을 겪는 경우에, 포획성 기의 포획성 실체는 포획 실체에 결합, 커플링, 혼성화, 또는 달리 회합될 수 있다. 포획 실체 및 포획성 실체 간 회합은 비-공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 예를 들어, 자극의 인가 시에, 방출가능한 결합의 형성을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 회합은 임의 결합을 형성하지 않을 수 있다. 예를 들어, 회합은 포획성 실체 및 포획 실체 간 물리적 근접성을 증가시킬 수 있다 (또는 물리적 거리를 감소시킬 수 있다). 일부 예에서, 단일 포획 실체는 단일 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로, 단일 포획 실체는 다수 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단일 포획성 실체는 다수 포획 실체와 회합될 수 있다.
일부 예에서, 포획성 기(2408)는 포획 실체를 표적화하여 혼합물로부터 주형 핵산 분자(2402) (및 포획 실체(2406))를 포함하는 지지체(2401)를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기는 혼합물로부터 각각이 하나 이상의 주형 핵산 분자를 포함하는 다중 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 다수의 포획성 기는 혼합물로부터 주형 핵산 분자를 포함하는 지지체를 단리하는데 사용될 수 있다. 단리되면, 세척 및/또는 용융 작업(2405)을 수행하여 지지체로부터 주형 핵산 분자를 해리시켜서 조립체(2400)를 제공할 수 있다.
일부 예에서, 포획성 기(2408)는 혼합물로부터 지지체의 단리없이 지지체와 회합될 수 있다. 일부 예에서, 포획성 기가 2차 포획 실체를 더 포함하는 경우에, 지지체는 혼합물 중 2차 포획 실체와 회합된 채로 남아있을 수 있다. 지지 체는 2차 포획성 실체(2407)와 접촉될 수 있거나, 또는 달리 포획을 겪을 수 있다. 2차 포획성 실체는 포획성 기의 2차 포획 실체에 결합, 커플링, 혼성화, 또는 달리 회합될 수 있다. 2차 포획 실체 및 2차 포획성 실체 간 회합은 비-공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 회합은 예를 들어, 자극의 인가 시에, 방출가능한 결합의 형성을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 회합은 임의 결합을 형성하지 않을 수 있다. 예를 들어, 회합은 2차 포획성 실체 및 2차 포획 실체의 물리적 근접성을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 물리적 거리를 감소시킬 수 있다). 일부 예에서, 단일 2차 포획 실체는 단일 2차 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로, 단일 2차 포획 실체는 다수 2차 포획성 실체와 회합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단일 2차 포획성 실체는 다수 2차 포획 실체와 회합될 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획성 기는 혼합물로부터 주형 핵산 분자를 포함하는 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 2차 포획성 기는 혼합물로부터 다수 지지체를 단리할 수 있다. 일부 예에서, 다수의 2차 포획성 기는 혼합물로부터 지지체를 단리하는데 사용될 수 있다.
단리되면, 세척 및/또는 용융 작업을 수행하여 주형 핵산 분자(2402) 및 포획 기(2408) (및 일부 경우에 또한 2차 포획성 실체(2407))를 지지체로부터 해리하여 조립체(2400)를 제공할 수 있다.
일부 예에서, 2차 포획성 실체(2407)는 혼합물로부터 지지체의 단리없이 지지체와 회합될 수 있다. 일부 경우에, 2차 포획성 실체는 제3 포획성 실체에 의한 후속 포획을 위해 구성된 제3 포획 실체를 포함할 수 있다 (예시되지 않음). 임의 정도의 포획성 실체는 다음 정도의 포획성 실체에 의한 혼합물로부터의 단리 및/또는 회합을 위해서, 다음 정도의 포획성 실체에 의해 포획될 수 있는 다른 포획 기를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 단리되면, 세척 및/또는 용융 작업을 수행하여 지지체로부터 주형 핵산 분자 (및 임의 수의 포획 실체 및/또는 포획성 실체)를 해리하여 조립체(2400)를 제공할 수 있다.
이러한 조립체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 예컨대 증폭 시약 (예를 들어, 용액 프라이머 포함)과 함께 분할될 수 있어서, 개별 반응 챔버 내에서 주형 핵산 분자의 증폭 반응을 촉진시킬 수 있다. 유리하게, 단일 조립체를 포함하는 파티션은 파티션 내 동일 지지체에 증폭 산물의 단일클론 개체군을 고정화시킬 수 있다.
(주형 핵산 분자 또는 이의 상보체를 사용하여) 지지체의 사전-농축을 위한 방법은 용액에서 수행될 수 있다. 일부 예에서, 사전 농축 방법은 임의의 에멀션 또는 파티션을 포함하지 않는 용액에서 수행될 수 있다. 다른 예에서, 사전 농축 방법은 파티션에서 수행될 수 있다. 절차들은 통합될 수 있다. 대안적으로, 과정은 통합되지 않을 수 있다.
컴퓨터 제어 시스템
본 개시는 본 개시의 방법을 구현하도록 프로그램된 컴퓨터 제어 시스템을 제공한다. 도 6은 핵산 서열 및 서열 분석을 수행하는 것같은, 본 개시의 방법 및 시스템을 구현하도록 프로그램되거나 또는 달리 구성된 컴퓨터 시스템(601)을 도시한다.
컴퓨터 시스템(601)은 단일 코어 또는 다수 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 다수의 프로세서일 수 있는, 중앙 처리 유닛 (CPU, 본 명세서에서 또한 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서")(605)을 포함한다. 컴퓨터 시스템(601)은 또한 메모리 또는 메모리 위치(610)(예를 들어, 임의-접근 메모리, 읽기-전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 저장 유닛(615)(예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신을 위한 통신 인터페이스(620)(예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치(625), 예컨대 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리(610), 저장 유닛(615), 인터페이스(620) 및 주변 장치(625)는 통신 버스 (실선), 예컨대 마더보드를 통해서 CPU(605)와 통신한다. 저장 유닛(615)은 데이터 저장을 위한 데이터 저장 유닛 (또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템(601)은 통신 인터페이스(620)의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크")(630)에 작동적으로 커플링될 수 있다. 네트워크(630)는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크(630)는 전기통신 및/또는 데이터 네트워크일 수 있다. 네트워크(630)는 분산 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 컴퓨팅할 수 있는, 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 네트워크(630)는, 컴퓨터 시스템(601)의 도움으로, 동등 계층 네트워크를 구현할 수 있어서, 컴퓨터 시스템(601)에 커플링된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 작동할 수 있게 할 수 있다.
CPU(605)는 프로그램 또는 소프트웨어에서 구현될 수 있는, 기계-판독가능한 명령어의 배열을 실행할 수 있다. 명령어는 메모리 위치, 예컨대 메모리(610)에 저장될 수 있다. 명령어는 CPU(605)로 지정되어서, 이후에 본 개시의 방법을 구현하도록 CPU(605)를 프로그램하거나 또는 구성할 수 있다. CPU(605)에 의해 수행되는 작업의 예는 페치, 디코드, 실행, 및 쓰기 저장을 포함할 수 있다.
CPU(605)는 회로, 예컨대 집적 회로의 일부일 수 있다. 시스템(601)의 하나 이상의 다른 성분은 회로에 포함될 수 있다. 회로는 특수 용도 집적 회로(ASIC)일 수 있다.
저장 유닛(615)은 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장 프로그램을 저장할 수 있다. 저장 유닛(615)은 사용자 데이터, 예를 들어 사용자 선호도 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템(601)은 예컨대 인트라넷 또는 인터넷을 통해서 컴퓨터 시스템(601)과 통신하는 원격 서버에 위치된, 컴퓨터 시스템(601)의 외부에 있는 하나 이상의 추가 데이터 저장 유닛을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템(601)은 네트워크(630)를 통해서 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템(601)은 사용자의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 예는 개인 컴퓨터 (예를 들어, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 태블릿 PC (예를 들어, Apple® iPad, Samsung® Galaxy Tab), 전화기, 스마트 폰 (예를 들어, Apple® iPhone, Android-지원 장치, Blackberry®), 또는 개인 정보 단말기를 포함한다. 사용자는 네트워크(630)를 통해서 컴퓨터 시스템(601)에 접근할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 컴퓨터 시스템(601)의 전자 저장 위치, 예컨대, 예를 들어, 메모리(610) 또는 전자 저장 유닛(615)에서 저장되는 기계 (예를 들어, 컴퓨터 프로세서) 실행가능 코드에 의해 구현될 수 있다. 기계 실행가능 또는 기계 판독가능 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용 동안, 코드는 프로세서(605)에 의해 실행될 수 있다. 코드는 저장 유닛(615)으로부터 회수되어 프로세서(605)에 의한 접근 준비를 위해 메모리(610)에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 유닛(615)이 배제될 수 있고, 기계-실행가능 명령어가 메모리(610)에 저장된다.
코드는 코드를 실행하도록 개조된 프로세서를 구비하는 기계로 사용을 위해 사전-컴파일링될 수 있고 구성될 수 있거나, 또는 런타임 동안 컴파일링될 수 있다. 코드는 사전-컴파일링 또는 컴파일링-동시 방식으로 코드를 실행하도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 공급될 수 있다.
본 명세서에 제공되는 시스템 및 방법의 양태, 예컨대 컴퓨터 시스템(1101)은 프로그래밍으로 구현될 수 있다. 기술의 다양한 양태는 전형적으로 기계 판독가능 매체 유형으로 운반 또는 구현되는 기계 (또는 프로세서) 실행가능 코드 및/또는 연관 데이터의 형태인 "제품" 또는 "제조 물품"으로서 여겨질 수 있다. 기계-실행가능한 코드는 전자 저장 유닛, 예컨대 메모리 (예를 들어, 읽기-전용 메모리, 임의-접근 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 소프트웨어 프로그래밍을 위해 언제든지 비일시적 저장을 제공할 수 있는, 컴퓨터, 프로세서 등, 또는 이의 연관 모듈의 임의의 또는 모든 유형 메모리, 예컨대 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등을 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 다른 전기통신 네트워크를 통해서 통신할 수 있다. 이러한 통신은 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서에서 다른 것으로, 예를 들어, 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터에서 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 소프트웨어 구성요소를 보유할 수 있는 다른 유형의 매체는 유선 및 광학 랜드라인 네트워크를 통해서 다양한 에어-링크 상에서, 로컬 장치 간 물리적 인터페이스에 걸쳐 사용되는 것과 같은, 광학, 전기, 및 전자기 파를 포함한다. 이러한 파동, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등을 보유하는 물리적 구성요소는 또한 소프트웨어를 보유하는 매체로서 간주될 수 있다. 비일시적, 유형의 "저장" 매체에 국한하지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는, 용어 예컨대 컴퓨터 또는 기계 "판독가능 매체"는 실행을 위해 프로세서에 명령어를 제공하는데 참여하는 임의 매체를 지칭한다.
그러한 이유로, 기계 판독가능 매체, 예컨대 컴퓨터-실행가능 코드는 제한없이, 유형의 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함하여, 많은 형태를 취할 수 있다. 비-휘발성 저장 매체는 예컨대, 도면에 도시된, 데이터베이스를 구현하는데 사용될 수 있는, 예를 들어, 광학 또는 자성 디스크, 예컨대 임의 컴퓨터(들)에서의 임의의 저장 장치 등을 포함한다. 휘발성 저장 매체는 동적 메모리, 예컨대 이러한 컴퓨터 플랫폼의 메인 메모리를 포함한다. 유형 전송 매체는 공축 케이블; 컴퓨터 시스템 내에 버스를 포함하는 선을 포함하여, 구리선 및 섬유 광학을 포함한다. 반송파 전송 매체는 무선 주파수(RF) 및 적외선(IR) 데이터 통신 동안 생성되는 것같은, 전기 또는 전자기 신호, 또는 음향 또는 광 웨이브의 형태를 취할 수 있다. 그러므로 컴퓨터-판독가능 매체의 공통 형태는 예를 들어 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 홀 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, 플래시-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령어 수송 반송파, 이러한 반송파 수송 케이블 또는 링크, 또는 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 많은 이들 유형의 컴퓨터 판독가능 매체는 실행을 위해 프로세서에 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 배열을 운반하는데 관여될 수 있다.
컴퓨터 시스템(601)은 예를 들어, 핵산 서열의 결과 (예를 들어, 서열 리드, 공통 서열 등)를 제공하기 위한 사용자 인터페이스(UI)(640)를 포함하는 전자 디스플레이(635)를 포함할 수 있거나 또는 그와 통신할 수 있다. UI의 예는 제한없이, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 및 웹-기반 사용자 인터페이스를 포함한다.
본 개시의 방법 및 시스템은 하나 이상의 알고리즘의 방식으로 구현될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 유닛(605)에 의한 실행 시 소프트웨어에 의해 구현될 수 있다. 알고리즘은 예를 들어 본 개시의 방법을 구현할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 개시의 일정 양태를 더욱 기술하고자 포함되며, 본 개시의 범주를 제한하기 위해 사용되지 않는다.
실시예 1
본 실시예는 핵산 샘플을 분석하기 위해 본 명세서에 기술된 접근법이 다른 기술보다 우수하다는 것을 입증한다.
ePCR 작업흐름을 수행하였고 도 3의 좌측 패널에 도시되어 있다. 비드(303)와 함께 DNA 주형 분자의 변이체 1(301) 및 2(302)를 유화시켰다 (304). 주형 및 비드 둘 모두는 최소 다클론 비드 및 클론 카피를 생성하는 에멀션 중 액적의 총 개수와 비교하여 낮은 존재비로 존재하였다. 대부분의 액적은 비어있었고 (305), 일부 액적은 오직 단일 비드(306)를 함유하였고, 일부 액적은 오직 주형 핵산 분자(307)를 함유하였다. (306) 및 (307) 둘 모두는 증폭된 주형 양성 비드를 전달하지 않았고, (307) 중 DNA 주형은 분석 작업흐름을 탈출하여서 분석하지 않았다. 주형 핵산 분자 및 비드 둘 모두를 포함하는 액적 (예를 들어, 308)만이 후속 분석을 위해 증폭 산물을 생성할 수 있는 기능성 증폭 반응기였다. 에멀션 파괴 및 농축(309) 이후에, 주형 양성 비드는 시퀀싱에 유용한 비드(310)를 전달하였다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 분석 접근법을 수행하였고 도 3의 우측 패널에 도시되어 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 유의하게 더 높은 개수의 비드(311)가 에멀션 액적으로 로딩되었다. 따라서, 다수의 비드 (예를 들어, 0-10 비드)는 에멀션 중 대부분의 액적 중에 액적당 0-1 비드와 반대로 에멀션 중 대부분의 액적 중에 각 액적에 로딩되었다. 주형 핵산 분자를 포함하는 모든 액적은 또한 비드를 포함하였고 그리하여 모든 비드(312), (313)의 다수 클론 카피를 생성하였다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 절차를 사용하여, 파괴 및 농축 이후에 주형 핵산 분자를 손실하지 않았고, 양쪽 변이체(314/315)는 다수회 시퀀싱되어서, 증가된 정확도를 일으켰다.
해상도 (예를 들어, 신호 대 노이즈 비율)를 더욱 향상시키기 위해서, 고유 분자 식별자 (UMI)가 개별 출발 주형에 일정 변이체를 지정하도록 주형의 표지화를 위해 사용되었다.
이러한 데이터는 본 개시의 방법 및 조성물이 핵산 샘플을 분석하기 위해 유의하게 향상된 정확도를 야기시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이것은 오직 매우 제한된 샘플 물질이 존재하는 경우 및/또는 희귀 변이체 검출이 중요한 경우에 특히 중요할 수 있다.
실시예 2
이 실시예는 도 5a 및 도 5b에 도시된 그래프를 생성하는데 사용된 수학 모델을 입증한다. 도 5a는 10% 증분 지수로서, 페어드 리드 생성 확률(%)에 대한 수평축(502), 및 10% 증분 지수로서, 고유 리드 분율(%)에 대한 수직축(501)을 갖는 그래프를 도시한다. 도 5b는 1 증분 지수로서, 평균 액적 개체군에 대한 수평축(504), 및 10% 증분 지수로서 (%)에 대한 수직축(503)을 갖는 그래프를 도시한다.
하기 수학 관계식이 사용된다:
식에서 P(X|Y)는 Y가 주어질 때 X의 확률 분포를 의미하고, MA 및 MB는 각각 개체군 A 및 B의 비드 개수이고, Ldroplet은 액적당 평균 비드 개수이고, Ndroplet은 액적 중 비드 개수에 대한 변수이고, Fsplit은 A형 비드 분율이고, Fseq는 비드가 시퀀싱될 확률이다.
실시예 3
이 실시예는 A형 및 B형 비드의 임의 액적 로딩의 효율의 분석 관계를 보여준다 (도 5a).
평균 비드 로딩의 모수적 스위핑으로, 고유 리드의 예상 분율 및 페어드 리드 생성 확률, 즉, A 및 B 각각의 적어도 하나의 카피의 획득 간에 관계가 확립된다. 예를 들어, 페어드 리드 생성의 50% 확률은 리드의 30%가 고유하다. 도 5b는 소정 평균 액적 비드 로딩에 대한 다양한 판독 시나리오 간 관계를 보여준다. 시나리오는 표지된 P(NA, NB)이고, 여기서 NA 및 NB는 각각 A형 및 B형 리드의 비드 개수이다. 지수(505)는 위에서 아래 순으로, 다음의 상이한 선으로 표시된다: (i) P(>0,>0), (ii) P(1,1), (iii) P(2,1)|P(1,2), (iv) P(2,2), (v) P(3,1)|P(1,3), 및 (vi) F중복. NA>0 및 NB>0, 즉, P(>0,>0)인 경우는 A 및 B 리드 쌍이 획득되고 최고 실선 그래프인 모든 시나리오를 설명한다. P(1,1)는 하나 및 오직 하나의 카피의 각각의 리드가 수득되는 특별한 예이다. 점선 그래프는 A 또는 B의 중복 카피인 리드 분율이다. F분할은 50%이고 양쪽 비드가 아마도 동등한 것을 의미한다. Fseq는 100%이고 비드가 시퀀싱될 가능성이다. 주석은 페어드 리드 생성을 위한 100% 효율 획득이 시퀀싱에서 90% 중복성 (A 및/또는 B의 추가 카피)을 생성시킨다는 것을 보여준다.
실시예 4
이러한 실시예는 생물학적 샘플을 분석하기 위한 방법을 입증한다 (예를 들어, 도 7 참조).
생물학적 샘플을 분석하기 위한 이러한 방법은 2개 유형의 비드를 포함하고, 각각은 다수의 어댑터의 특별한 어댑터에 상응하는 프라이머 서열을 포함하고, 다수의 어댑터는 다수의 바코드 서열을 포함한다. 어댑터는 생물학적 샘플의 다수의 핵산 분자의 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산 분자)의 말단에 커플링될 수 있다. 표적 핵산 라이브러리 삽입 길이 (예를 들어, 도 7에서 핵산 분자(705)로 도시)는 양쪽 말단으로부터 핵산 시퀀싱이 중복이 전혀없거나 또는 매우 최소로 갖는 서열 리드를 제공하도록 선택된다. 삽입부는 다수의 어댑터의 어댑터로 작용화 이전에 말단-복구되고 A-꼬리 첨가된다. 합성 이중 가닥 핵산 분자는 루프형성되고 삽입부와 결찰될 수 있도록 디자인된다. 그러한 이유로, 합성 이중 가닥은 말단 포스페이트없이 바람직하게 T 오버행을 함유한다. 합성 이중 가닥 핵산 분자의 서열은 다음과 같다: 바코드 2', PB' 절단성 구성요소, PA, 바코드 1. 바코드 1 및 바코드 2'은 임의의 상업적으로 입수가능한 바코드 서열일 수 있고 상이한 서열일 수 있다. 대안적으로, 일부 예에서, 바코드 1 및 바코드 2'은 상이한 서열이 아닐 수 있다. 그러나, 바코드 서열은 그들이 서로에 대해서 지정되도록 충분히 정의된다. 절단성 구성요소는 화학, 광, 열, 또는 다른 기전에 의해서 합성 이중 가닥 핵산 분자의 가닥의 분리를 가능하게 한다. 결찰 및 원형화 이후에, 합성 이중 가닥 핵산 분자는 절단되어서 폴리머라제-기반 연장을 통해서 갭 충전된다. 2개 유형의 비드 (예를 들어, 도 8의 파트(806)로 도시된 것)가 클론 증폭에 이용가능한데, 하나는 고정화된 PA(1-8, 도 8) 올리고뉴클레오티드 또는 최소로 PA의 하위부분을 갖는 하나, 및 다른 것은 PB(4-8, 도 8) 올리고뉴클레오티드 또는 최소로 PB의 하위부분이 고정화된 것이다.
따라서, 선형화된 갭-충전 주형의 열 변성은 ePCR 같은 클론 증폭을 위해 충분히 분리된 구획 (예를 들어, 파티션)에 비드의 분포 전에 2개 비드 유형에 어닐링을 가능하게 한다. 임의의 본 명세서에 기술된 방법과 이러한 예의 조합은 핵산 증폭 반응의 어닐링 과정의 제거를 가능하게 할 것이다.
실시예 5
이 실시예는 각 말단 상에 부착된 동일 어댑터 쌍 (A/A')을 갖는 삽입부 라이브러리 (I)를 사용하여 클론 증폭된 비드를 생성하기 위한 방법을 입증한다 (예를 들어, 도 20 참조). 본 명세서에서 사용되는, 프라임 (')은 역방향 상보체 (예를 들어, A'은 A의 역방향 상보체임)를 표시한다. 비드는 이에 부착된 제2 프라이머의 소수 카피 (X A) 및 제1 프라이머의 많은 카피 (X)를 갖는다. 조정된 삽입부 (A' I A)는 제2 프라이머와 혼성화되어 연장된다. 연장 산물은 제1 프라이머의 추가 카피 (X)를 연장시킬 수 있지만 기하급수적은 아니다. 기하급수적 증폭은 연장된 제2 (또는 제1) 프라이머의 나머지 말단이 또한 제4 프라이머 (A B')를 사용하여 연장될 때 가능하다. 기하급수적 표면 증폭은 이제 표면 프라이머의 많은 카피 (X) 및 용액 프라이머의 많은 카피 (제3 프라이머, B')를 사용하여 발생될 수 있다. 다른 비드는 상이한 제1 프라이머 (Z)를 가져서 제1 비드 (X)에서 생성된 연장 산물은 제2 비드 (Z)에 대한 친화성을 첨가하지 않는다. 온도, 농도 및 다른 증폭 조건은 제1 및 제2 연장이 기하급수적 증폭과 비교하여 느리고/느리거나 드문 사건이도록 선택된다. 온도, 농도 및 다른 증폭 조건은 제1 연장 산물 (X)이 다른 비드 (Z)에 대한 주형으로서 제공되지 않게 선택된다.
하기 청구항은 본 발명의 범주를 정의하고 이들 청구항의 범주 내에 있는 방법 및 구조 및 그들 균등물을 포괄하고자 한다.
실시예 6
본 명세서에 기술된 바와 같이, 그에 커플링된 주형 핵산 분자를 포함하는 연장된 지지체는 하기 절차를 사용하여 제조되었다.
라이브러리의 어닐링 및 연장: 100 마이크로리터의 최종 부피를 함유하는 반응 혼합물은 하기 성분/농도로 제조되었다: 1 10X TAQ 폴리머라제 반응 완충액, 8.2 밀리몰 (mM)의 MgCl2, 12 mM의 dNTP, 10 피코몰 (pM)의 라이브러리, 1 마이크로몰/분 (U) Taq DNA 폴리머라제, 및 6.00x107 비드/마이크로리터. 혼합물은 표 2의 조건을 사용하여 열순환기에서 인큐베이션하였다:
비드는 400 마이크로리터 (μL)의 TET 완충액 (TE pH 8.0, 0.05% Triton X-100)을 첨가하여 세척하였다. 혼합물은 30초 동안 와류하였고, 원심분리기에서 8분 동안 21,000 분당 회전수 (RPM)로 스핀다운시켰다. 상등액을 제거하여 100 μL를 남겨두었다. 비드는 500 μL의 1x SA 결합 완충액 (20 mM Tris pH 3.0, 50 mM NaCl, 0.05% Triton X-100)으로 세척하였다. 혼합물은 30초 동안 와류시켰고, 원심분리기에서 8분 동안 21,000 RPM으로 스핀다운시켰다. 상등액을 제거하여 100 μL를 남겨두었다.
연장된 비드의 농축: 100 μL의 자성 스트렙트아비딘 비드를 연장된 비드에 첨가하였다. 이러한 혼합물을 혼합하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 비드는 용액이 투명해질 때까지 적절한 자석 상에서 자기화되었고, 상등액을 제거하였다. 비드는 조심스럽게 재현탁하여 500 μL의 SA 결합 완충액으로 세척하였다. 제2 자기화 작업에서, 비드는 용액이 투명해질 때까지 적절한 자석에서 자기화시켰고, 상등액을 제거하였다. 비드는 조심스럽게 재현탁하여 500 μL의 SA 결합 완충액으로 세척하였다. 제3 자기화 작업에서, 비드는 용액이 투명해질 때까지 적절한 자석에서 자기화시켰고, 상등액을 제거하였다.
연장된 비드의 용리: 비드는 300 μL의 50℃ 용리 완충액 (0.1 mol/리터 (M) NaOH, 0.05% Triton X-100)에 재현탁시켰고, 5분 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. 혼합물은 잠시 와류시켰고 비드는 용액이 투명해질 때까지 적절한 자석에서 자기화시켰다. 비드를 함유하는 상등액을 제거하고 보유하였다. 제2 용리 작업에서, 비드는 300 μL의 50℃ 용리 완충액 (0.1 mol/리터 (M) NaOH, 0.05% Triton X-100)에 재현탁시켰고, 5분 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. 혼합물은 잠시 와류시켰고 비드는 용액이 투명해질 때까지 적절한 자석에서 자기화시켰다. 비드를 함유하는 상등액을 제거하고 보유하였고, 비드를 함유하는 앞선 상등액과 배합하였다. 용리된 비드는 원심분리기에서 8분 동안 21,000 RPM으로 스핀다운하였고, 상등액을 제거하여 100 μL를 남겼다. 비드는 500 μL의 1x SA 결합 완충액으로 세척하였고, 30초 동안 와류시켰다. 비드는 원심분리기에서 8분 동안 21,000 RPM으로 스핀다운시켰고, 상등액을 제거하여 100 μL를 남겼다. 비드는 500 μL의 TET 완충액으로 세척하였고, 30초 동안 와류시켰다. 비드는 원심분리기에서 8분 동안 21,000 RPM으로 스핀다운시켰고, 상등액을 제거하여 100 μL를 남겼다.
농축된 비드는 후속하여 ePCR 절차에서 사용하였다.
실시예 7
하기 표 3 및 도 25는 사전-농축 절차의 수행없는 대조 절차에 대한 사전-농축 (예를 들어, 증폭을 위해 단리 및/또는 농축된 연장된 지지체 혼합물을 사용하여, 클론 증폭 전에, 지지체 (예를 들어, 비드)의 혼합물을 농축) 절차를 사용한 증폭의 결과를 보여준다. 증폭은 이. 콜라이 라이브러리 주형 및 인공 주형에서 수행하였다.
도 25는 패널 (A)에서, 사전 농축 절차가 가해진 이. 콜라이 라이브러리, 패널 (B)에서, 사전-농축 절차가 가해진 인공 주형 라이브러리, 및 패널 (C)에서, (사전-농추 부재의) 대조 절차가 가해진 인공 주형 라이브러리를 도시한다. 각각의 그래프는 계측수 대 알로파이코시아닌 (APC) 형광의 분포를 도시한다. 패널 (A) 및 (C)의 경우에, 수직축 지수는 각각이 오름차순 0, 500, 1,000, 및 1,600으로 읽혀지고, 수평축은 각각 오름차순, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2 으로 읽혀진다. 패널 (B)의 경우, 수직축 지수는 각각 오름차순 0, 200, 400, 600, 및 800으로 읽혀지고, 수평축 지수는 각각 오름차순 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2으로 읽혀진다. 패널 (A)에 도시된 바와 같이, 이. 콜라이 라이브러리 (사전-농축)는 5% 농축 (이론적 10% 대비), 및 95.3% 증폭을 야기시켰다. 패널 (B)에 도시된 바와 같이, 인공 주형 라이브러리 (사전-농축)는 1.6% 농축 (이론적 10% 대비), 및 89.6% 증폭을 야기시켰다. 패널 (C)에 도시된 바와 같이, 인공 주형 라이브러리 (대조)는 16.8% 증폭을 야기시켰다. 사전-농축 인공 주형 라이브러리 개체군의 대략 13.25%가 다클론 증폭을 야기시켰다. 농축후 인공 주형 라이브러리 개체군의 대략 11%가 다클론 증폭을 야기시켰다.
실시예 8
본 명세서에 기술된 바와 같이, 주형 핵산 분자 (예를 들어, 그에 부착된 어댑터)에 부착되도록 구성된 연장 프라이머를 포함하는 연장된 지지체는 하기 절차를 사용하여 제조되었다.
비오틴화된 연장 프라이머 분자의 연속 희석은 10 밀리몰 (mM) Tris pH 8.0 중에서 10 마이크로몰 스톡에서 각각 10 나노몰 (nM), 1 nM, 0.1 nM, 및 0.01 nM 스톡으로 제조하였고, 이들은 더욱 희석하여 6천만개 비드/μL 중 1000, 100, 10, 및 1 피코몰 (pM)의 최종 농도를 획득하였다. 비오틴화된 연장 프라이머 분자는 연장 프라이머 서열의 상보체를 포함한다. 비드 상의 프라이머 분자 및 비오틴화된 연장 프라이머 분자 간 사전-어닐링은 95℃에서 2분 동안 발생되었다. 혼합물은 50℃로 서서히 냉각시켰고, 1x EpiMark® 완충액 중에서 총 45분 동안 유지시켰다. 프라이머는 20분 동안 70℃ 열 블록에서 연장시켰고, 1x BW 완충액으로 2회 세척하였다. 자성 스트렙트아비딘 비드는 비오틴-주형 비드와 1.5시간 동안 로터 상에 실온에서 혼성화시켰다. 비드는 자성 포획되었다. 자성 포획 후에, 비드 (단일 연장 프라이머 서열 존재)는 수 중 0.1% NaOH 및 0.05% Triton X-100을 사용하여 50℃에서 5분 동안 용리하였다. 농축된 비드는 1x EpiMark® 완충액을 사용하여 3회 세척하였고 후속하여 ePCR 절차에서 사용하였다.
실시예 9
하기 표 4 및 도 26-27은 상이한 연장 프라이머:비드 투입 비율에서 프라이머 연장 후 포획된 농축 비드의 결과를 도시한다.
1000 pM 농도의 연장 프라이머, 및 10:1의 연장 프라이머:비드 비율의 경우에, 0, 1, 및 2+ 주형을 갖는 비드에 대한 예상%는 각각 0%, 0%, 및 100%이다. 따라서, 포획된 비드 (적어도 N = 1 연장 프라이머를 가짐)의 예상%는 100%이다. 포획된 비드의 관찰 %는 51%였다.
100 pM 농도의 연장 프라이머, 및 1:1의 연장 프라이머:비드 비율의 경우에, 0, 1, 및 2+ 주형을 갖는 비드에 대한 예상 %는 각각이 37%, 37%, 및 26%이다. 따라서, 포획된 비드 (적어도 N = 1 연장 프라이머를 가짐)의 예상%는 63%이다. 포획된 비드의 관찰 %는 35%였다.
도 26은 패널 (A)에서, 1000 pM 연장 프라이머 투입 농도에서 포획된 농축된 비드의 존재, 및 패널 (B)에서, 100 pM 연장 프라이머 투입 농도에서 포획된 농축된 비드의 존재를 도시한다. 각 그래프는 800 FITC 한계치로서, 계측치 대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 형광의 분포를 도시한다. 각 그래프에서, 수직축 지수는 각각 오름차순 0, 10,000, 및 25,600으로 읽혀지고, 수평축 지수는 각각 오름차순, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2 으로 읽혀진다.
도 27은 패널 (A)에서, 1000 pM 연장 프라이머 투입 농도 및 100:1 연장 프라이머:비드 비율에서, 농축된 비드 중 연장 프라이머 서열의 존재, 및 패널 (B)에서, 100 pM 연장 프라이머 투입 농도 및 1:1 연장 프라이머:비드 비율에서, 농축된 비드 중 연장 프라이머 서열의 존재를 도시한다. 각 그래프는 계측치 대 알로파이코시아닌 (APC) 형광의 분포를 도시한다. 패널 (A) 경우에, 수직축 지수는 각각 오름차순 0, 5,000, 10,000, 및 12,800으로 읽혀지고, 수평축 지수는 각각 오름차순, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2으로 읽혀진다. 패널 (B) 경우에, 수직축 지수는 각각 오름차순 0, 1,000, 2,000, 및 3,200으로 읽혀지고, 수평축 지수는 각각 오름차순, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2으로 읽혀진다. 패널 (A) 및 (B)에 도시된 바와 같이, 농축된 비드의 각각 75.1% 및 79.1%가 적어도 하나의 연장 프라이머 서열을 함유하는 것으로 관찰되었다.
실시예 10
연장된 프라이머 서열을 포함하는 연장된 지지체는 하기 절차를 사용하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 주형 핵산 분자 (예를 들어, 그에 부착된 어댑터)에 부착되었다.
연장된 지지체에 라이브러리 주형의 사전 어닐링: 2개 종의 단일 가닥 주형 및 연장된 비드 (연장된 프라이머 서열을 포함하는 비드)의 혼합물은 20배 과량의 주형:농축 비드로 제공되었고, 95℃에서 2분 동안 어닐링되도록 두었고, 서서히 50℃로 냉각시켰으며, 총 45분 동안 1x EpiMark® 완충액에서 유지시켰다. 혼합물은 2-20시간 동안 회전시키면서 추가 횟수로 50℃에서 인큐베이션시켰다. 비드는 1회 1x EpiMark® 완충액으로 세척하였다. 최종 비드는 그에 커플링된 주형 분자 (예를 들어, 단일 주형 분자)를 갖는다.
ePCR을 위해 주형 연장된 지지체의 분할: 주형 비드는 ePCR를 위해 액적에 분할시켰다. ePCR을 위한 분할 이전에, 주형 비드 (예를 들어, 연장 프라이머 서열을 통해 주형 분자에 커플링된 비드)를 연장 프라이머 서열에 주형의 어닐링을 통해서 및/또는 연장 프라이머 서열로부터 연장을 통해서 주형에 커플링시켜서 비드에 커플링된 주형의 상보체를 생성시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 11
하기 표 5 및 도 28-29는 상이한 연장 프라이머:비드 투입 비율에서 주형 비드를 사용한 ePCR 증폭의 결과를 도시한다. 2개 종의 주형에 대한 Atto 프로브를 증폭된 비드에 어닐링시켰고 전체 증폭을 측정하였다.
도 28은 패널 (A)에서, 1000 pM 연장 프라이머 투입 농도, 10:1 연장 프라이머:비드 투입 비율, 200 pM 주형 투입 농도, 및 1:20 농축된 비드:주형 투입 비율에서, 증폭된 비드 (또는 라이브러리-양성 비드)의 존재, 및 패널 (B)에서, 100 pM 연장 프라이머 투입 농도, 1:1 연장 프라이머:비드 투입 비율, 200 pM 주형 투입 농도, 및 1:20 농축된 비드:주형 투입 비율에서 증폭된 비드 (또는 양성 비드)의 존재를 도시한다. 각각의 그래프는 계측치 대 알로파이코시아닌 (APC) 형광의 분포를 도시한다. 패널 (A) 경우에, 수직축 지수는 각각 오름차순 0, 2000, 4000, 및 6400으로 읽혀지고, 수평축 지수는 각각 오름차순, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2으로 읽혀진다. 패널 (B) 경우에, 수직축 지수는 각각 오름차순 0, 100, 150, 및 200으로 읽혀지고, 수평축 지수는 각각 오름차순, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2으로 읽혀진다. 패널 (A) 및 (B)에 도시된 바와 같이, 1000 pM 및 100 pM 연장 프라이머 투입 농도에 대해서 농축된 비드의 각각 80.1% 및 41.5%가 증폭되었다.
도 29는 수직 패널 (A)에서, 1000 pM 연장 프라이머 투입 농도, 10:1 연장 프라이머:비드 투입 비율, 200 pM 주형 투입 농도, 및 1:20 농축된 비드:주형 투입 비율에서 증폭된 비드의 다클론성을 표시하는 2개 그래프, 및 수직 패널 (B)에서, 100 pM 연장 프라이머 투입 농도, 1:1 연장 프라이머:비드 투입 비율, 200 pM 주형 투입 농도, 및 1:20 농축된 비드:주형 투입 비율에서 증폭된 비드의 다클론성을 표시하는 2개 그래프를 도시한다. 각각의 그래프는 APC 형광 대 FITC 형광의 분포를 도시한다. 각 그래프의 수직축 및 수평축 각각의 경우에, 축 지수는 각각 오름차순 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 및 107.2으로 읽혀진다. 2개 상단 그래프는 FITC에서의 한계치를 갖고, 2개 하단 그래프는 APC 형광에 대한 한계치를 갖는다.
표 5에 도시된 바와 같이, 사전-농축된 비드에 대해 관찰된 다클론 백분율은 각각 67% 및 23% 다클론성에서 이론으로 예측한 것에 비해서 30% 및 6% (각각 1000 pM 및 100pM 연장 프라이머 투입 농도에 대함)로 훨씬 더 낮았다. 더 나아가서, 사전-농축없이 ePCR을 수행하기 위해 예측된 다클론 백분율은 각각 80.1% 및 41.5% 라이브러리-양성 비율에 대해서 44% 및 22%이다 (예를 들어, 도 28에서의 라이브러리-양성 비드 결과 참조). 따라서, 결과는 본 명세서에 기술된 사전-농축 절차의 수행이 표준 포아송 로딩 (사전-농축없음)에 비해서 소정 비율의 라이브러리-양성 비드에서 더 낮은 수준의 다클론성을 생성시킨다는 것을 보여주었다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 표시되고 기술되었지만, 이러한 실시형태는 오직 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 명세서 내에 제공된 특별한 예에 의해 제한하고자 의도되지 않는다. 본 발명은 상기 언급된 명세서를 참조하여 기술되었지만, 본 명세서의 실시형태의 설명 및 예시는 제한의 의미로 해석되는 것을 의미하지 않는다. 다양한 변동, 변화, 및 대체가 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 이제 일어날 것이다. 더 나아가서, 본 발명의 모든 양태는 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본 명세서에 기재된 특별한 묘사, 구성 또는 상대적 비율에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 대안은 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 그러므로 본 발명은 또한 임의의 이러한 대안, 변형, 변동 또는 균등물을 포괄해야 한다는 것을 고려한다. 하기 청구항은 본 발명의 범주를 정의하고 이들 청구항 내 구조 및 그들 균등물은 이에 의해 포괄된다는 것을 의도한다.
Claims (93)
- 핵산 처리 방법으로서,
(a) 다수의 파티션을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 파티션의 파티션은 (i) 다수 비드의 적어도 2개 비드, (ii) 핵산 분자, 및 (iii) 하나 이상의 시약을 포함하는 것인 단계;
(b) 상기 파티션에서, 상기 핵산 분자 및 상기 하나 이상의 시약을 사용하여 상기 핵산 분자의 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 상기 하나 이상의 증폭 산물의 적어도 서브세트는 상기 적어도 2개 비드의 비드에 부착되는 것인 단계;
(c) 상기 파티션으로부터 상기 비드를 회수하는 단계; 및
(d) 상기 비드에 부착된 상기 하나 이상의 증폭 산물의 증폭 산물 또는 이의 유도체를 어세이하여 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계
를 포함하는, 핵산 처리 방법. - 제1항에 있어서, (a)는 (i) 상기 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자를 포함하는 제1 용액 및 (ii) 상기 적어도 2개 비드를 포함하는 상기 다수의 비드를 포함하는 제2 용액을 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액과 비혼화성인 유체와 접촉시켜서, 상기 다수의 파티션을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비드는 상기 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응을 수행하기 위해서 다수의 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, (b)는 상기 다수의 프라이머 분자의 프라이머 분자를 사용하여 상기 하나 이상의 증폭 반응을 수행하여 상기 하나 이상의 증폭 산물의 상기 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 비드는 상기 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위한 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 상기 다수의 프라이머 분자와 상이한 것인 방법.
- 제4항에 있어서, (b)는 상기 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 상기 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 상기 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계를 더 포함하고, 상기 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 상기 비드에 부착되고, (d)는 상기 비드에 부착된 상기 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이고, 상기 핵산 분자의 제1 가닥에 상응하는 증폭 산물은 상기 다수의 프라이머 분자를 사용하여 생성되고, 상기 핵산 분자의 제2 가닥에 상응하는 증폭 산물은 상기 다수의 추가 프라이머 분자를 사용하여 생성되는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, (d)는 상기 하나 이상의 증폭 산물 또는 이의 유도체의 서열과 연관된 페어드-엔드 시퀀싱 리드를 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 적어도 2개 비드의 추가 비드는 상기 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위해 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 상기 다수의 프라이머 분자와 상이한 것인 방법.
- 제8항에 있어서,
(e) 상기 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 상기 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 상기 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 상기 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 상기 적어도 2개 비드의 상기 추가 비드에 부착되는 것인 단계;
(f) 상기 파티션으로부터 상기 추가 비드를 회수하는 단계; 및
(g) 상기 추가 비드에 부착된 상기 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계
를 더 포함하는 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 파티션의 적어도 80%는 각각이 상기 다수의 비드의 2 이상의 비드를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 파티션의 적어도 80%는 각각이 상기 다수의 비드의 3 이상의 비드를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개 비드는 서로에 부착되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 적어도 2개 비드는 화학적 링커 및 스플린트 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나를 통해 서로에 부착되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각이 적어도 2개 비드를 포함하는 상기 다수의 파티션의 파티션을 각각이 최대 1개의 비드를 포함하는 상기 다수의 파티션의 다른 파티션으로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 분리 단계는 각각이 적어도 2개 비드를 포함하는 상기 파티션 또는 각각이 최대 1개의 비드를 포함하는 상기 다른 파티션을 광학적으로 검출하는 단계, 및 적어도 상기 부분에서 상기 광학적 검출을 기반으로, 유체 장치의 유체 흐름 방향을 조정하여, 각각이 상기 유체 장치의 제1 채널에 적어도 2개 비드를 포함하는 상기 파티션 및 각각이 상기 유체 장치의 제2 채널에 최대 1개의 비드를 포함하는 상기 다른 파티션을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 프라이밍 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 프라이밍 서열을 포함하는 상기 핵산 분자는 고유 분자 식별자 서열을 더 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 프라이밍 서열을 포함하는 상기 핵산 분자는 바코드 서열을 더 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 하나 이상의 중합 효소를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 파티션은 다수의 액적인 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, (d)는 상기 증폭 산물 또는 이의 유도체를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서, 상기 핵산 분자는 상기 비드에 부착되는 것인 방법.
- 핵산 처리 방법으로서,
(a) 다수의 파티션을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 파티션의 파티션은 (i) 다수 비드의 적어도 2개 비드로서, 상기 적어도 2개 비드는 서로에 부착되는 것인 비드, (ii) 핵산 분자, 및 (iii) 하나 이상의 시약을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 상기 파티션에서, 상기 핵산 분자 및 상기 하나 이상의 시약을 사용하여 상기 핵산 분자의 하나 이상의 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 상기 하나 이상의 증폭 산물의 적어도 서브세트는 상기 적어도 2개 비드의 비드에 부착되는 것인 단계
를 포함하는, 핵산 처리 방법. - 제23항에 있어서,
(c) 상기 파티션으로부터 상기 비드를 회수하는 단계; 및
(d) 상기 비드에 부착된 상기 하나 이상의 증폭 산물의 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계
를 더 포함하는 방법. - 제23항 또는 제24항에 있어서, (a)는 (i) 상기 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자를 포함하는 제1 용액 및 (ii) 상기 적어도 2개 비드를 포함하는 상기 다수의 비드를 포함하는 제2 용액을 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액과 비혼화성인 유체와 접촉시켜서, 상기 다수의 파티션을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 비드는 상기 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 증폭 반응을 수행하기 위한 다수의 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, (b)는 상기 다수의 프라이머 분자의 프라이머 분자를 사용하여 상기 하나 이상의 증폭 반응을 수행해 상기 하나 이상의 증폭 산물의 상기 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 비드는 상기 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위해 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 상기 다수의 프라이머 분자와 상이하고, (b)는 상기 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 상기 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 상기 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계를 더 포함하고, 상기 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 상기 비드에 부착되고, (d)는 상기 비드에 부착된 상기 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 적어도 2개 비드의 추가 비드는 상기 핵산 분자를 사용하여 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하기 위해 다수의 추가 프라이머 분자가 그에 부착되어 있고, 다수의 추가 프라이머 분자는 상기 다수의 프라이머 분자와 상이하고, 방법은
(e) 상기 다수의 추가 프라이머 분자의 추가 프라이머 분자를 사용하여 상기 하나 이상의 추가 증폭 반응을 수행하여 상기 하나 이상의 증폭 산물의 추가 증폭 산물을 생성하는 단계로서, 상기 추가 증폭 산물의 적어도 서브세트는 상기 적어도 2개 비드의 상기 추가 비드에 부착되는 것인 단계;
(f) 상기 파티션으로부터 상기 추가 비드를 회수하는 단계; 및
(g) 상기 추가 비드에 부착된 상기 추가 증폭 산물, 또는 이의 유도체를 어세이하여, 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법. - 핵산 분자를 처리하는 방법으로서,
(a) (i) 그에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 포함하는 표면으로서, 상기 다수의 제1 프라이머는 제1 서열과 서열 동일성을 갖는 것인 표면, (ii) 상기 핵산 분자로서, 상기 제1 서열의 상보체와 상이한 말단 서열을 포함하는 상기 핵산 분자, 및 (iii) 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 제2 프라이머로서, 상기 제1 부분은 상기 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고, 상기 제2 부분은 연장 서열을 포함하고, 상기 연장 서열, 또는 이의 상보체는 상기 제1 서열과 혼성화되도록 구성되는 것인 제2 프라이머를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계;
(b) 상기 핵산 분자 및 상기 제2 프라이머를 사용하여 연장 산물을 생성하는 단계로서, 연장 산물은 상기 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 것인 단계; 및
(c) 상기 표면에 고정화된 상기 다수의 제1 프라이머를 사용하여 상기 연장 산물을 증폭시키는 단계
를 포함하는, 핵산 분자를 처리하는 방법. - 제29항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 상기 표면에 고정화되는 것인 방법.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 핵산 분자는 (b) 이전에 상기 다수의 제1 프라이머와 혼성화되지 않는 것인 방법.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 증폭 부위의 어레이를 포함하고, 상기 증폭 부위의 어레이는 그에 고정화된 제1 프라이머의 다수 세트를 포함하고, 상기 제1 프라이머의 다수 세트는 상기 제1 서열과 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 반응 혼합물 중의 상기 증폭 부위의 어레이에 대한 유체적 접근성을 갖는 것인 방법.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 비드인 방법.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 에멀션의 분산상의 부피로 제공되는 것인 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 에멀션은 제2 표면을 포함하는 제2 반응 혼합물을 포함하는 상기 분산상의 제2 부피를 포함하는 것인 방법.
- 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 및 (c)는 상기 반응 혼합물에서 수행되는 것인 방법.
- 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 다수의 핵산 분자를 포함하고, 상기 다수의 핵산 분자는 상이한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 다수의 핵산 분자의 각각은, 상기 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 연장 산물을 생성하기 위해 상기 제2 프라이머에 커플링되도록 구성되는 것인 방법.
- 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 반응 혼합물을 포함하는 다수의 파티션을 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 다수의 파티션은 (i) 상기 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자 및 (ii) 상기 표면을 포함하는 다수의 표면을 포함하고, 상기 다수의 파티션의 제1 파티션은 상기 반응 혼합물을 포함하고, 상기 다수의 파티션의 제2 파티션은 상기 다수의 핵산 분자의 제2 핵산 분자 및 상기 다수의 표면의 제2 표면을 포함하는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 다수의 핵산 분자는, 상기 다수의 파티션 중의 파티션당 평균 1개 핵산 분자를 초과하는 밀도로 다수의 파티션 중에 분포되는 것인 방법.
- 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 제3 핵산 분자 및 추가 제2 프라이머를 포함하고, 상기 핵산 분자, 또는 이의 유도체는 상기 제3 핵산 분자가 상기 추가 제2 프라이머에 커플링되기 이전에 상기 다수의 제1 프라이머의 적어도 99%에 커플링되는 것인 방법.
- 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 (b)의 속도보다 적어도 10배 더 빠른 속도로 발생되는 것인 방법.
- 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 (c)의 속도에 대해서 (b)의 속도를 제한하는 상기 반응 혼합물 중의 소정의 농도를 갖는 것인 방법.
- 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 표면에 고정화되지 않은 추가 제1 프라이머를 더 포함하고, 상기 추가 제1 프라이머는 상기 제1 서열과 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은, 상기 제1 프라이머 또는 상기 제2 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응에 사용될 때 핵산 분자를 기하급수적으로 증폭시키도록 구성되는 다수의 제3 프라이머를 더 포함하는 것인 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 제4 프라이머를 더 포함하고, 상기 제4 프라이머는 제3 부분 및 제4 부분을 포함하고, 상기 제3 부분은 상기 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고, 상기 제2 부분은 제2 연장 서열을 포함하고, 상기 방법은
(d) 상기 핵산 분자 및 상기 제4 프라이머를 사용하여 제2 연장 산물을 생성하는 단계로서, 제2 연장은, 상기 제3 프라이머와 혼성화되도록 구성된, 상기 제2 연장 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 상기 다수의 제3 프라이머를 사용하여 상기 제2 연장 산물을 증폭시키는 단계
를 더 포함하는 것인 방법. - 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 또는 (c)는 등온 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
- 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면을 회수하는 단계, 및 상기 핵산 분자의 증폭 산물 또는 이의 유도체를 어세이하여 상기 핵산 분자의 서열을 확인하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 핵산 분자의 5' 말단에 부착된 제1 어댑터 및 상기 핵산 분자의 3' 말단에 부착된 제2 어댑터를 포함하는 것인 방법.
- 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물에 대해서 (b)를 (c)에 대해 더 느린 사건으로 만드는 조건을 가하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 조건은, 상기 핵산 분자와 상기 제2 프라이머 간의 어닐링 온도와 대략 동일한 온도를 포함하는 것인 방법.
- 핵산 분자를 처리하는 시스템으로서, (i) 그에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 포함하는 표면으로서, 상기 다수의 제1 프라이머는 제1 서열과 서열 동일성을 갖는 것인 표면; (ii) 상기 핵산 분자로서, 상기 제1 서열의 상보체와 상이한 말단 서열을 포함하는 것인 상기 핵산 분자; (iii) 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 제2 프라이머로서, 상기 제1 부분은 상기 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고, 상기 제2 부분은 연장 서열을 포함하고, 상기 연장 서열, 또는 이의 상보체는 상기 제1 서열과 혼성화하도록 구성되는 것인 제2 프라이머; 및 (iv) 상기 핵산 분자를 사용하여 핵산 연장 반응을 수행하도록 구성된 시약을 포함하는 반응 혼합물을 포함하는 것인 핵산 분자를 처리하는 시스템.
- 제52항에 있어서, 상기 제2 프라이머는, 상기 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 연장 산물을 생성하기 위해 상기 핵산 분자에 커플링되도록 구성되는 것인 시스템.
- 제53항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 제2 핵산 분자 및 추가 제2 프라이머를 포함하고, 상기 핵산 분자, 또는 이의 유도체는, 제2 핵산 분자가 상기 추가 제2 프라이머에 커플링되기 이전에 상기 다수의 제1 프라이머의 적어도 99%에 커플링되도록 구성되는 것인 시스템.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 제2 프라이머는, 상기 연장 산물이 상기 표면 상에서 증폭되는 속도에 대해서 연장 산물을 생성하기 위해 상기 핵산 분자가 제2 프라이머에 커플링되는 속도를 제한하는 상기 반응 혼합물 중의 소정의 농도를 갖는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머는 표면에 고정화되는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 증폭 부위의 어레이를 포함하고, 상기 증폭 부위의 어레이는 그에 고정화된 제1 프라이머의 다수 세트를 포함하고, 상기 제1 프라이머의 다수 세트는 상기 제1 서열과 서열 동일성을 갖고, 상기 핵산 분자는 상기 반응 혼합물에서 상기 증폭 부위의 어레이에 대해 유체적 접근성을 갖는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 비드인 시스템.
- 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀션을 더 포함하고, 상기 반응 혼합물은 상기 에멀션의 분산상의 부피로 제공되고, 상기 에멀션은, 제2 표면을 포함하는 제2 반응 혼합물을 포함하는 상기 분산상의 제2 부피를 포함하는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 다수의 핵산 분자를 포함하고, 상기 다수의 핵산 분자는 상이한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 다수의 핵산 분자의 각각은 상기 연장 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 연장 산물을 생성하기 위해 상기 제2 프라이머에 커플링되도록 구성된 것인 시스템.
- 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 반응 혼합물을 포함하는 다수의 파티션을 더 포함하고, 상기 다수의 파티션은 (i) 상기 핵산 분자를 포함하는 다수의 핵산 분자 및 (ii) 상기 표면을 포함하는 다수의 표면을 포함하고, 상기 다수의 파티션의 제1 파티션은 상기 반응 혼합물을 포함하고, 상기 다수의 파티션의 제2 파티션은 상기 다수의 핵산 분자의 제2 핵산 분자 및 다수의 표면의 제2 표면을 포함하고, 상기 다수의 핵산 분자는, 상기 다수의 파티션 중의 파티션당 평균 1개 핵산 분자를 초과하는 밀도로 상기 다수의 파티션 중에 분포되는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 상기 표면에 고정화되지 않은 추가 제1 프라이머를 더 포함하는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 (i) 상기 제1 프라이머 또는 상기 제2 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응에 사용될 때 상기 핵산 분자를 기하급수적으로 증폭시키도록 구성된 다수의 제3 프라이머, (ii), 및 제3 부분 및 제4 부분을 포함하는 제4 프라이머로서, 상기 제3 부분은 상기 핵산 분자에 어닐링되도록 구성되고 상기 제4 부분은 제2 연장 서열을 포함하는 것인 제4 프라이머를 더 포함하는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 서열을 확인하기 위해 상기 핵산 분자 또는 이의 유도체의 증폭 산물을 어세이하도록 구성된, 개별적으로 또는 집합적으로, 하나 이상의 프로세서를 더 포함하는 시스템.
- 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 다수의 증폭 부위를 포함하고, 상기 증폭 부위의 각각은 상기 표면에 부착된 상이한 제1 프라이머의 다수 카피를 갖는 것인 시스템.
- 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 핵산 분자의 5' 말단에 부착된 제1 어댑터 및 상기 핵산 분자의 3' 말단에 부착된 제2 어댑터를 포함하는 것인 시스템.
- 핵산 샘플을 클론적으로 증폭시키는 방법으로서, 방법은
(a) 다수의 파티션을 포함하는 에멀션을 형성하는 단계로서, 상기 다수의 파티션의 파티션은 (i) 핵산 분자, (ii) 그에 고정화된 다수의 제1 프라이머를 포함하는 비드로서, 상기 다수의 제1 프라이머는 제1 서열과 서열 동일성을 갖는 것인 비드, 및 (iii) 상기 핵산 분자 또는 이의 유도체가 상기 비드에 부착되도록 허용하는 부착 반응 및 상기 다수의 제1 프라이머를 사용하는 증폭 반응을 수행하도록 구성된 시약 혼합물을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 상기 에멀션을 인큐베이션하여, (i) 상기 핵산 분자, 또는 이의 유도체를 상기 비드에 부착시키기 위한 상기 부착 반응을 수행하고, (ii) 상기 비드에 부착된 상기 핵산 분자, 또는 이의 유도체의 카피를 생성하기 위해 상기 증폭 반응을 수행하는 것인 단계
를 포함하고,
제1 기간은 제2 기간보다 길고, 상기 제1 기간은 (b)의 상기 인큐베이션으로 시작되고, 상기 핵산 분자, 또는 이의 유도체가 상기 비드에 부착될 때 종료되며, 상기 제2 기간은 상기 핵산 분자, 또는 이의 유도체가 상기 비드에 부착될 때 시작되어 상기 증폭 반응이 종료될 때 종료되는 것인, 핵산 샘플을 클론적으로 증폭시키는 방법. - 제67항에 있어서, 제1 기간은 제2 기간보다 적어도 약 5배 더 긴 것인 방법.
- 핵산 분자에 부착되도록 구성된 지지체를 제조하는 방법으로서,
(a) 다수의 지지체 및 다수의 연장 기를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 지지체의 지지체는 제1 프라이머를 포함하고, 상기 다수의 연장 기의 연장 기는 연장 프라이머 분자를 포함하는 것인 단계;
(b) 상기 혼합물에 대해서 상기 연장 기의 상기 연장 프라이머에 상기 지지체의 상기 제1 프라이머를 부착시키기에 충분한 조건을 가하여, (i) 상기 다수의 연장 기와 회합되지 않은 비-연장된 지지체 및 (ii) 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 포획 실체 및 상기 연장 기가 회합된 연장된 지지체를 포함하는 최종 혼합물을 생성하는 단계로서, 상기 연장된 지지체는 상기 연장 프라이머 분자의 서열에 상보성인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 것인 단계; 및
(c) 상기 포획성 실체를 사용하여 상기 포획 실체를 포획하여 상기 최종 혼합물로부터 상기 연장된 지지체를 단리하는 단계
를 포함하는, 핵산 분자에 부착되도록 구성된 지지체를 제조하는 방법. - 제69항에 있어서, 상기 연장된 지지체로부터 상기 연장 기를 해리하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 핵산 분자를 상기 제2 프라이머에 어닐링시켜 주형-부착된 지지체를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 주형-부착된 지지체를 파티션에 분할하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제71항 또는 제72항에 있어서, 증폭 반응을 수행하여 상기 핵산 분자의 다수의 증폭 산물을 상기 연장된 지지체에 고정화하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 비드를 포함하는 것인 방법.
- 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 다수의 제1 프라이머를 포함하고, 상기 다수의 제1 프라이머는 상기 제1 프라이머를 포함하는 것인 방법.
- 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 포획 실체는 비오틴을 포함하고 상기 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함하거나, (ii) 상기 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 상기 포획성 실체는 상기 포획 서열에 대한 상보성 포획 서열을 포함하거나, (iii) 상기 포획 실체는 자성 입자를 포함하고 상기 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함하거나, 또는 (iv) 상기 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 상기 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함하는 것인 방법.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서 상기 연장 기는 상기 포획 실체를 포함하는 것인 방법.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는, 상기 제1 프라이머를 사용하여 연장 반응을 수행하여 상기 포획 실체를 포함하는 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는
(i) 상기 포획성 실체 및 (ii) 2차 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 2차 포획 실체를 포함하는 포획성 기를 제공하는 단계;
상기 포획성 실체를 사용하여 상기 포획 실체를 포획함으로써 상기 포획성 기를 상기 연장된 지지체와 회합시키는 단계; 및
상기 2차 포획성 실체를 사용하여 상기 2차 포획 실체를 포획함으로써 상기 최종 혼합물로부터 상기 연장된 지지체를 단리하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 핵산 분자에 부착되도록 구성된 지지체를 제조하는 방법으로서,
(a) 다수의 비-연장된 지지체 및 다수의 연장된 지지체를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 비-연장된 지지체의 비-연장된 지지체는 프라이머 서열을 포함하지 않고 상기 다수의 연장된 지지체의 연장된 지지체는 상기 프라이머 서열을 포함하고, 상기 프라이머 서열은 상기 핵산 분자에 부착되도록 구성되는 것인 단계;
(b) (i) 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 포획 실체 및 (ii) 상기 연장된 지지체의 상기 프라이머 서열 및 상기 포획 기의 상기 서열을 사용하여 상기 연장된 지지체를 상기 포획 기와 회합시키기 위해 상기 혼합물에 상기 프라이머 서열을 부착시키도록 구성된 서열을 포함하는 포획 기를 제공하는 단계; 및
(c) 상기 포획성 실체를 사용하여 상기 포획 실체를 포획함으로써 상기 최종 혼합물로부터 상기 연장된 지지체를 단리하는 단계
를 포함하는, 핵산 분자에 부착되도록 구성된 지지체를 제조하는 방법. - 지지체를 제조하는 방법으로서,
(a) 다수의 지지체 및 다수의 주형 핵산 분자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 지지체의 지지체는 다수의 프라이머를 포함하고, 상기 다수의 주형 핵산 분자의 주형 핵산 분자는 상기 다수의 프라이머의 프라이머에 부착되도록 구성된 어댑터를 포함하는 것인 단계;
(b) 상기 혼합물에 대해서 상기 주형 핵산 분자의 상기 어댑터에 상기 지지체의 상기 프라이머를 부착시키기에 충분한 조건을 가하여, (i) 상기 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않은 비-연장된 지지체 및 (ii) 상기 주형 핵산 분자에 커플링된 포획 실체와 회합된 연장된 지지체를 포함하는 최종 혼합물을 생성하는 단계로서, 상기 포획 실체는 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성되고, 상기 연장된 지지체는 상기 주형 핵산 분자의 서열에 상보성인 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 연장된 지지체 상의 상기 다수의 프라이머의 적어도 50%는 상기 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는 것인 단계;
(c) 상기 포획성 실체를 사용하여 상기 포획 실체를 포획함으로써 상기 최종 혼합물로부터 상기 연장된 지지체를 단리하는 단계; 및
(d) 다수의 연장된 지지체를 다수의 액적으로 분할하는 단계로서, 상기 다수의 연장된 지지체는 상기 연장된 지지체를 포함하고, 상기 다수의 액적의 액적은 상기 연장된 지지체를 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 지지체를 제조하는 방법. - 제81항에 있어서, 상기 연장된 지지체 상의 상기 다수의 프라이머의 적어도 80%는 상기 다수의 주형 핵산 분자와 회합되지 않는 것인 방법.
- 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 연장된 지지체로부터 상기 주형 핵산 분자를 해리하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 비드를 포함하는 것인 방법.
- 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 포획 실체는 비오틴을 포함하고 상기 포획성 실체는 스트렙트아비딘을 포함하거나, (ii) 상기 포획 실체는 포획 서열을 포함하고 상기 포획성 실체는 상기 포획 서열에 대한 상보성 포획 서열을 포함하거나, (iii) 상기 포획 실체는 자성 입자를 포함하고 상기 포획성 실체는 자기장 시스템을 포함하거나, 또는 (iv) 상기 포획 실체는 하전 입자를 포함하고 상기 포획성 실체는 전기장 시스템을 포함하는 것인 방법.
- 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는
(i) 상기 포획성 실체 및 (ii) 2차 포획성 실체에 의한 포획을 위해 구성된 2차 포획 실체를 포함하는 포획성 기를 제공하는 단계;
상기 포획성 실체를 사용하여 상기 포획 실체를 포획함으로써 상기 포획성 기를 상기 연장된 지지체와 회합시키는 단계; 및
상기 2차 포획성 실체를 사용하여 상기 2차 포획 실체를 포획함으로써 상기 최종 혼합물로부터 상기 연장된 지지체를 단리하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서 상기 주형 핵산 분자는 상기 포획 실체를 포함하는 것인 방법.
- 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 상기 프라이머를 사용하여 연장 반응을 수행하여 상기 포획 실체를 포함하는 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적은 상기 다수의 연장된 지지체의 단일 연장된 지지체를 포함하고, 상기 단일 연장된 지지체는 상기 연장된 지지체인 방법.
- 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 액적의 대부분의 점유 액적은 상기 다수의 연장된 지지체의 단일 연장된 지지체를 포함하는 것인 방법.
- 제81항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 액적은 비점유 액적을 포함하고, 상기 비점유 액적은 상기 다수의 연장된 지지체의 임의의 연장된 지지체를 포함하지 않는 것인 방법.
- 제81항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, (d)는 혼합물을 분할하는 단계를 포함하고, 상기 혼합물은 상기 다수의 연장된 지지체를 포함하고, 상기 혼합물은 비-연장된 지지체보다 더 많은 연장된 지지체를 포함하는 것인 방법.
- 제92항에 있어서, 상기 혼합물 내의 실질적으로 모든 지지체가 연장된 지지체인 방법.
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