JP2022519324A - 核酸分析方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの技術を使用して核酸配列決定の効率及び精度を高めるための方法及びプロセスを提供する。本明細書中に記載の方法は、ビーズ及び／又は核酸鋳型のエマルジョンへのポアソン分布よりも大きい場合でもクローン増幅を達成するために使用され得る。ＰＣＲ方法は、少なくとも２つのビーズ及び／又は少なくとも２つの核酸分子を含むパーティション（例えば、液滴）を生成するステップと、その少なくとも１つのサブセットがビーズに付着され得る核酸分子に対応するクローン増幅産物を生成するステップとを含んでもよい。【選択図】図１８Ｂ

Description

相互参照
この出願は、２０１９年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８０４，０８２号、２０１９年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８９０，２４０号、及び、２０１９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，６８３号の利益を主張し、これらの出願はそれぞれ、あらゆる目的のために参照により全体が本願に組み入れられる。
生体分子の研究の進歩は、部分的には、分子及び／又はそれらの生体反応を特徴付けるために使用される技術の向上によってもたらされてきた。特に、核酸の研究は、配列分析に使用される技術の開発から恩恵を受けている。核酸の配列決定は、分子生物学及び医学の分野において様々な用途がある（例えば、診断及び処置モニタリング）。核酸配列決定は、被検体における特定の状態を診断するため及び／又は処置計画を調整するために使用され得る情報を提供し得る。配列決定は、ベクター設計、遺伝子治療、ワクチン設計、工業用菌株設計、及び、検証を含む分子生物学用途に広く使用される。最終的な配列分析が実行される方法は、そのような分析で取得され得る情報のタイプ及び品質において役割を果たし得る。
核酸サンプルを分析及び／又は処理するための方法（例えば、エマルジョンＰＣＲ）の効率、感度、及び、精度を高めるための方法、プロセス、及び、組成物の必要性が本明細書中で認識される。本開示は、核酸分子（例えば、生体サンプル中で見見出されるもの）を高い精度及び感度並びに効率的な試薬使用量で分析及び／又は処理するための方法及び組成物を提供する。核酸増幅又は配列決定（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、ＰＣＲ）のためにエマルジョン液滴（又はウェルなどの他のタイプのパーティション）中でより多数のビーズを使用する（例えば、核酸分子に対するビーズのより高い比率を使用する）と、クローンコピー数がより多くなって、鋳型損失が減少し、それにより、効率的なワークフローを維持しながら精度及び感度が向上し得る。また、本開示は、パーティション（例えば、エマルジョンパーティション）内に２つ以上の核酸鋳型が存在する場合でもクローン増幅を達成するための方法及びシステムも提供する。本明細書中に記載されるシステム及び方法は、例えば試薬（例えば、ＰＣＲ試薬）を効率的に使用できるように、（例えば、ポアソン分布よりも大きい密度で）パーティション内に複数のビーズ及び／又は核酸鋳型を装填できるようにし得る。
一態様では、核酸処理のための方法であって、（ａ）複数のパーティションを与えるステップであって、複数のパーティションのうちの１つのパーティションが、（ｉ）複数のビーズのうちの少なくとも２つのビーズ、（ｉｉ）核酸分子、及び、（ｉｉｉ）１つ以上の試薬を含む、ステップと、（ｂ）パーティションにおいて、核酸分子及び１つ以上の試薬を使用して、核酸分子の１つ以上の増幅産物を生成するステップであって、１つ以上の増幅産物の少なくとも１つのサブセットが、少なくとも２つのビーズのうちの１つのビーズに付着される、ステップと、（ｃ）パーティションからビーズを回収するステップと、（ｄ）ビーズに付着される１つ以上の増幅産物のうちの１つの増幅産物又はその誘導体をアッセイして、核酸分子の配列を同定するステップとを含む方法が提供される。
幾つかの実施形態において、（ａ）は、（ｉ）核酸分子を含む複数の核酸分子を含む第１の溶液、及び、（ｉｉ）少なくとも２つのビーズを含む前記複数のビーズを含む第２の溶液を、第１の溶液及び第２の溶液と混和しない流体と接触させて、複数のパーティションを生成するステップを含む。幾つかの実施形態では、第１の溶液及び第２の溶液が同じ溶液である。幾つかの実施形態では、第１の溶液及び第２の溶液が異なる溶液である。
幾つかの実施形態において、ビーズには、核酸分子を使用して１つ以上の増幅反応を行なうための複数のプライマー分子が付着されてしまっており、（ｂ）は、複数のプライマー分子のうちのプライマー分子を使用して、１つ以上の増幅反応を行なって、１つ以上の増幅産物のうちの増幅産物を生成するステップを含む。幾つかの実施形態において、ビーズには、核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、これらの複数の更なるプライマー分子は複数のプライマー分子とは異なる。
幾つかの実施形態において、（ｂ）は、複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、１つ以上の更なる増幅反応を行なって、１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップを更に含み、更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットがビーズに付着され、（ｄ）は、核酸分子の配列を同定するために、ビーズに付着される更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイするステップを更に含む。幾つかの実施形態では、核酸分子が二本鎖核酸分子である。幾つかの実施形態では、核酸分子の第１鎖に対応する増幅産物が複数のプライマー分子を使用して生成され、核酸分子の第２鎖に対応する増幅産物が複数の更なるプライマー分子を使用して生成される。幾つかの実施形態において、（ｄ）は、１つ以上の増幅産物又はその誘導体の配列と会合されるペアエンド配列決定リードを生成するステップを含む。
幾つかの実施形態において、少なくとも２つのビーズのうちの更なるビーズには、核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、これらの複数の更なるプライマー分子は複数のプライマー分子とは異なる。幾つかの実施形態において、方法は、（ｅ）複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、１つ以上の更なる増幅反応を行なって、１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップであって、更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットが少なくとも２つのビーズのうちの更なるビーズに付着される、ステップと、（ｆ）パーティションから更なるビーズを回収するステップと、（ｇ）更なるビーズに付着される更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイして、核酸分子の配列を同定するステップとを更に含む。幾つかの実施形態では、核酸分子が二本鎖核酸分子である。幾つかの実施形態では、核酸分子の第１鎖に対応する増幅産物が、ビーズに結合される複数のプライマー分子を使用して生成され、また、核酸分子の第２鎖に対応する増幅産物が、更なるビーズに結合される複数の更なるプライマー分子を使用して生成される。幾つかの実施形態において、（ｄ）は、複数の増幅産物又はその誘導体の配列と会合されるペアエンド配列決定リードを生成するステップを更に含む。
幾つかの実施形態において、複数のパーティションの少なくとも８０％のそれぞれは、複数のビーズのうちの２つ以上のビーズを含む。幾つかの実施形態において、複数のパーティションの少なくとも８５％のそれぞれは、複数のビーズのうちの２つ以上のビーズを含む。幾つかの実施形態において、複数のパーティションの少なくとも９０％のそれぞれは、複数のビーズのうちの２つ以上のビーズを含む。
幾つかの実施形態において、複数のパーティションの少なくとも８０％のそれぞれは、複数のビーズのうちの３つ以上のビーズを含む。幾つかの実施形態において、複数のパーティションの少なくとも８５％のそれぞれは、複数のビーズのうちの３つ以上のビーズを含む。幾つかの実施形態において、複数のパーティションの少なくとも９０％のそれぞれは、複数のビーズのうちの３つ以上のビーズを含む。
幾つかの実施形態では、少なくとも２つのビーズが互いに付着される。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのビーズは、少なくとも１つの化学リンカーを介して互いに付着される。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのビーズは、スプリントオリゴヌクレオチドを介して互いに付着される。
幾つかの実施形態において、方法は、少なくとも２つのビーズをそれぞれが含む複数のパーティションのうちのパーティションを、多くとも１つのビーズをそれぞれが含む複数のパーティションのうちの他のパーティションから分離するステップを更に含む。幾つかの実施形態において、分離するステップは、それぞれが少なくとも２つのビーズを含むパーティション又はそれぞれが多くとも１つのビーズを含む他のパーティションを光学的に検出するステップと、光学的に検出するステップに少なくとも基づき、流体装置内の流体の流れの方向を調整して、流体装置の第１のチャネル内に少なくとも２つのビーズをそれぞれが含むパーティションと、流体装置の第２のチャネル内に多くとも１つのビーズをそれぞれが含む他のパーティションとを与えるステップとを含む。
幾つかの実施形態において、１つ以上の試薬は、プライミング配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、プライミング配列を含む核酸分子は、固有分子識別子配列を更に含む。幾つかの実施形態において、プライミング配列を含む核酸分子は、バーコード配列を更に含む。幾つかの態様では、プライミング配列がターゲット特異的プライミング配列である。幾つかの態様では、プライミング配列が非ターゲット特異的プライミング配列である。
幾つかの実施形態では、１つ以上の試薬が１つ以上の重合酵素を含む。
幾つかの実施形態では、核酸分子が細胞又は細胞の構成要素に由来する。
幾つかの実施形態では、複数のパーティションが複数の液滴である。
幾つかの実施形態において、（ｄ）は、増幅産物又はその誘導体を配列決定するステップを含む。
幾つかの実施形態では、（ａ）において、核酸分子がビーズに付着される。
他の態様では、核酸処理のための方法であって、（ａ）複数のパーティションを与えるステップであって、複数のパーティションのうちの１つのパーティションが、（ｉ）複数のビーズのうちの少なくとも２つのビーズであって、少なくとも２つのビーズが互いに付着される、少なくとも２つのビーズと、（ｉｉ）核酸分子と、（ｉｉｉ）１つ以上の試薬とを含む、ステップと、（ｂ）パーティションにおいて、核酸分子及び１つ以上の試薬を使用して、核酸分子の１つ以上の増幅産物を生成するステップであって、１つ以上の増幅産物の少なくとも１つのサブセットが少なくとも２つのビーズのうちの１つのビーズに付着される、ステップとを含む方法が提供される。
幾つかの実施形態において、方法は、（ｃ）パーティションからビーズを回収するステップと、（ｄ）ビーズに付着される１つ以上の増幅産物のうちの１つの増幅産物又はその誘導体をアッセイして、核酸分子の配列を同定するステップとを更に含む。幾つかの実施形態において、（ａ）は、（ｉ）核酸分子を含む複数の核酸分子を含む第１の溶液、及び、（ｉｉ）少なくとも２つのビーズを含む複数のビーズを含む第２の溶液を、第１の溶液及び第２の溶液と混和しない流体と接触させて、複数のパーティションを生成するステップを含む。
幾つかの実施形態において、ビーズには、核酸分子を使用して１つ以上の増幅反応を行なうための複数のプライマー分子が付着されてしまっており、（ｂ）は、複数のプライマー分子のうちのプライマー分子を使用して、１つ以上の増幅反応を行なって、１つ以上の増幅産物のうちの増幅産物を生成するステップを含む。
幾つかの実施形態において、ビーズには、核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、これらの複数の更なるプライマー分子は複数のプライマー分子とは異なる。幾つかの実施形態において、（ｂ）は、複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、１つ以上の更なる増幅反応を行なって、１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップを更に含み、更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットがビーズに付着され、（ｄ）は、核酸分子の配列を同定するために、ビーズに付着される更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイするステップを更に含む。
幾つかの実施形態において、少なくとも２つのビーズのうちの更なるビーズには、核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、これらの複数の更なるプライマー分子は複数のプライマー分子とは異なる。幾つかの実施形態において、方法は、（ｅ）複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、１つ以上の更なる増幅反応を行なって、１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップであって、更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットが少なくとも２つのビーズのうちの更なるビーズに付着される、ステップと、（ｆ）パーティションから更なるビーズを回収するステップと、（ｇ）更なるビーズに付着される更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイして、核酸分子の配列を同定するステップとを更に含む。
他の態様では、核酸分子をクローン的に増幅するための方法であって、（ａ）（ｉ）複数の第１のプライマーが固定化されて成る表面であって、複数の第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性（又は相同性）を有する表面と、（ｉｉ）核酸分子であって、核酸分子が第１の配列の相補体とは異なる末端配列を含む、核酸分子と、（ｉｉｉ）第１の部分及び第２の部分を含む第２のプライマーであって、第１の部分が核酸分子にアニールするように構成され、第２の部分が伸長配列を含み、前記伸長配列又はその相補体が第１の配列とハイブリダイズするように構成される、第２のプライマーと、を含む反応混合物を与えるステップと、（ｂ）核酸分子及び第２のプライマーを使用して伸長産物を生成するステップであって、伸長産物が伸長配列又はその相補体を含む、ステップと、（ｃ）表面に固定化される複数の第１のプライマーを使用して伸長産物を増幅するステップとを含む方法が提供される。
幾つかの態様では、第２のプライマーが表面に固定化される。
幾つかの実施形態において、核酸分子は、（ｂ）の前に複数の第１のプライマーとハイブリダイズしない。
幾つかの実施形態では、表面が増幅部位のアレイを含み、増幅部位のアレイは、それに固定化される第１のプライマーの複数のセットを含み、第１のプライマーの複数のセットが第１の配列に対して配列相同性を有する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、反応混合物中の増幅部位のアレイに流体アクセスできる。幾つかの実施形態において、増幅部位のアレイの各増幅部位は、その表面に固定化された第１のプライマーの複数のセットのうちの第１のプライマーの１つのセットを含む。
幾つかの実施形態では、表面がビーズである。
幾つかの実施形態において、反応混合物は、エマルジョンのある量の分散相に与えられる。幾つかの実施形態において、エマルジョンは、第２の表面を含む第２の反応混合物を含む第２の量の分散相を含む。
幾つかの実施形態では、（ｂ）及び（ｃ）が反応混合物中で行なわれる。
幾つかの実施形態では、反応混合物が複数の核酸分子を含み、複数の核酸分子は、異なる核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、複数の核酸分子のそれぞれは、第２のプライマーに結合して伸長配列又はその相補体を含む伸長産物を生成するように構成される。
幾つかの実施形態において、方法は、複数の反応混合物を含む複数のパーティションを与えるステップを更に含み、複数のパーティションは、（ｉ）核酸分子を含む複数の核酸分子と、（ｉｉ）表面を含む複数の表面とを含み、複数のパーティションのうちの第１のパーティションが反応混合物を含み、複数のパーティションのうちの第２のパーティションは、複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子と複数の表面のうちの第２の表面とを含む。幾つかの実施形態において、複数の核酸分子は、複数のパーティション間において、複数のパーティションにおいて１パーティション当たり平均１核酸分子よりも大きい密度で分布される。
幾つかの実施形態では、反応混合物が第３の核酸分子及び更なる第２のプライマーを含み、第２の核酸分子が更なる第２のプライマーに結合する前に、核酸分子又はその誘導体が複数の第１のプライマーの少なくとも９９％に結合される。
幾つかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の速度よりも少なくとも１０倍速い速度で行なわれる。
幾つかの実施形態では、核酸分子が一本鎖である。
幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、（ｃ）の速度に対して（ｂ）の速度を制限する所定の濃度を反応混合物において有する。
幾つかの実施形態において、反応混合物は、表面に固定化されない更なる第１のプライマーを更に含み、更なる第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性を有する。
幾つかの実施形態において、反応混合物は、第１のプライマー又は第２のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応で使用されるときに核酸分子を指数関数的に増幅するように構成される複数の第３のプライマーを更に含む。幾つかの実施形態では、反応混合物が第４のプライマーを更に含み、第４のプライマーが第３の部分及び第４の部分を有し、第３の部分が核酸分子にアニールするように構成され、第２の部分が第２の伸長配列を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、（ｄ）核酸分子及び第４のプライマーを使用して第２の伸長産物を生成するステップであって、第２の伸長が、第３のプライマーとハイブリダイズするように構成される第２の伸長配列又はその相補体を含む、ステップと、（ｅ）複数の第３プライマーを用いて第２の伸長産物を増幅するステップとを更に含む。幾つかの実施形態において、核酸分子は、（ｄ）の前に複数の第３のプライマーのうちの１つの第３のプライマーとハイブリダイズしない。幾つかの実施形態において、複数の第３のプライマーの濃度は、反応混合物中の第４のプライマーの濃度より少なくとも１０倍高い。
幾つかの実施形態では、反応混合物が核酸ポリメラーゼを更に含む。
幾つかの実施形態では、（ｂ）が等温条件下で行なわれる。
幾つかの実施形態では、（ｃ）が等温条件下で行なわれる。
幾つかの実施形態において、方法は、表面を回収するステップを更に含む。
幾つかの実施形態において、方法は、核酸分子の増幅産物又はその誘導体をアッセイして核酸分子の配列を同定するステップを更に含む。
幾つかの実施形態において、核酸分子は、核酸分子の５’末端に付着される第１のアダプターと、核酸分子の３’末端に付着される第２のアダプターとを含む。幾つかの実施形態では、第１のアダプター及び第２のアダプターが同一の配列を有する。
幾つかの実施形態において、方法は、（ｂ）を（ｃ）に対してより遅い及び／又はより稀な事象にする条件に反応混合物を供するステップを更に含む。幾つかの実施形態では、条件が温度を含む。幾つかの実施形態において、温度は、核酸分子と第２のプライマーとの間のアニーリング温度にほぼ等しい。
他の態様では、核酸分子をクローン的に増幅するためのシステムであって、（ｉ）複数の第１のプライマーが固定化されて成る表面であって、複数の第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性（又は相同性）を有する表面と、（ｉｉ）核酸分子であって、核酸分子が第１の配列の相補体とは異なる末端配列を含む、核酸分子と、（ｉｉｉ）第１の部分及び第２の部分を含む第２のプライマーであって、第１の部分が核酸分子にアニールするように構成され、第２の部分が伸長配列を含み、伸長配列又はその相補体が第１の配列とハイブリダイズするように構成される、第２のプライマーと、（ｉｖ）核酸分子を使用して核酸伸長反応を行なうように構成される試薬とを含む反応混合物を含む、システムが提供される。
幾つかの実施形態では、核酸分子が一本鎖である。
幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、核酸分子に結合して、第１の配列とハイブリダイズするように構成される伸長配列又は相補体を含む伸長産物を生成するように構成される。
幾つかの実施形態では、伸長産物が反応混合物中で生成され得る。幾つかの実施形態では、伸長産物が等温条件下で生成され得る。幾つかの実施形態において、伸長産物又はその増幅産物は、表面に固定化される複数の第１のプライマーに結合するように構成される。幾つかの実施形態において、伸長産物又はその増幅産物は、反応混合物内で表面に固定化される複数の第１のプライマーに結合するように構成される。幾つかの実施形態において、伸長産物の増幅産物は、等温条件下で生成するように構成される。幾つかの実施形態では、反応混合物が第２の核酸分子及び更なる第２のプライマーを含み、第２の核酸分子が更なる第２のプライマーに結合する前に、核酸分子又はその誘導体が複数の第１のプライマーの少なくとも９９％に結合するように構成される。
幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、核酸分子が第２のプライマーに結合して伸長産物を生成する速度を、伸長産物が表面上で増幅される速度に対して制限する所定の濃度を反応混合物において有する。
幾つかの態様では、第２のプライマーが表面に固定化される。
幾つかの実施形態では、表面が増幅部位のアレイを含み、増幅部位のアレイは、それに固定化される第１のプライマーの複数のセットを含み、第１のプライマーの複数のセットが第１の配列に対して配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、反応混合物中の増幅部位のアレイに流体アクセスできる。幾つかの実施形態において、増幅部位のアレイの各増幅部位は、その表面に固定化された第１のプライマーの複数のセットのうちの第１のプライマーの１つのセットを含む。
幾つかの実施形態では、表面がビーズである。
幾つかの実施形態では、システムがエマルジョンを更に含み、反応混合物がエマルジョンのある量の分散相に与えられる。幾つかの実施形態において、エマルジョンは、第２の表面を含む第２の反応混合物を含む第２の量の分散相を含む。
幾つかの実施形態では、反応混合物が複数の核酸分子を含み、複数の核酸分子は、異なる核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、複数の核酸分子のそれぞれは、第２のプライマーに結合して伸長配列又はその相補体を含む伸長産物を生成するように構成される。
幾つかの実施形態において、システムは、複数の反応混合物を含む複数のパーティションを更に含み、複数のパーティションは、（ｉ）核酸分子を含む複数の核酸分子と、（ｉｉ）表面を含む複数の表面とを含み、複数のパーティションのうちの第１のパーティションが反応混合物を含み、複数のパーティションのうちの第２のパーティションは、複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子と複数の表面のうちの第２の表面とを含む。幾つかの実施形態において、複数の核酸分子は、複数のパーティション間において、複数のパーティションにおいて１パーティション当たり平均１核酸分子よりも大きい密度で分布される。
前記反応混合物は、表面に固定化されない更なる第１のプライマーを更に含む。
幾つかの実施形態において、反応混合物は、第１のプライマー又は第２のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応で使用されるときに核酸分子を指数関数的に増幅するように構成される複数の第３のプライマーを更に含む。幾つかの実施形態では、反応混合物が第４のプライマーを更に含み、第４のプライマーが第３の部分及び第４の部分を有し、第３の部分が核酸分子にアニールするように構成され、第４の部分が第２の伸長配列を含む。
幾つかの実施形態において、システムは、核酸分子の配列を同定するために核酸分子の増幅産物又はその誘導体をアッセイするように構成される１つ以上のプロセッサを個別に又は集合的に更に備える。
幾つかの実施形態では、表面が複数の増幅部位を含み、増幅部位のそれぞれが表面に付着される異なる第１のプライマーの複数のコピーを有する。
幾つかの実施形態において、核酸分子は、核酸分子の５’末端に付着される第１のアダプターと、核酸分子の３’末端に付着される第２のアダプターとを含む。幾つかの実施形態では、第１のアダプター及び第２のアダプターが同一の配列を有する。
他の態様では、核酸サンプルをクローン的に増幅するための方法であって、（ａ）複数のパーティションを含むエマルジョンを形成するステップであって、複数のパーティションのうちの１つのパーティションが、（ｉ）核酸分子と、（ｉｉ）複数の第１のプライマーが固定化されて成るビーズであって、複数の第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性（又は相同性）を有する、ビーズと、（ｉｉｉ）核酸分子又はその誘導体がビーズに付着できるようにする付着反応と複数の第１のプライマーを使用する増幅反応とを実行するように構成される試薬混合物を含む、ステップと、（ｂ）エマルジョンをインキュベートし、それにより、（ｉ）核酸分子又はその誘導体をビーズに付着させるために付着反応を実行する、及び、（ｉｉ）増幅反応を行なって、ビーズに付着される核酸分子又はその誘導体のコピーを生成する、ステップとを含み、第１の期間が第２の期間よりも長く、第１の期間は、（ｂ）でのインキュベートするステップから始まるとともに、核酸分子又はその誘導体がビーズに付着するときに終了し、第２の期間は、核酸分子又はその誘導体がビーズに付着するときに始まるとともに、増幅反応が終了するときに終了する、方法が提供される。
幾つかの実施形態において、第１の期間は、第２の期間よりも少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、又は、少なくとも約１００倍長い。
幾つかの態様において、（ｂ）でのインキュベートするステップは、エマルジョンを少なくとも２つの異なる条件に供するステップを含む。幾つかの実施形態において、エマルジョンは、（ｉ）第１の期間にわたる少なくとも２つの異なる条件のうちの第１の条件、及び、（ｉｉ）第２の期間にわたる少なくとも２つの異なる条件のうちの第２の条件に供される。
幾つかの実施形態において、（ｂ）でのインキュベートするステップは、エマルジョンが付着反応を開始させるのに十分な条件に供されるときに始まる。幾つかの実施形態において、条件は、温度、圧力、試薬の濃度、電場、磁場、及び、放射線への曝露からなるグループから選択される。
幾つかの実施形態では、核酸分子が試薬混合物に溶解され、試薬混合物がビーズと接触している。
幾つかの実施形態において、核酸分子は、エマルジョンのインキュベーションの前にビーズに付着することができない。
幾つかの実施形態において、核酸分子は、エマルジョンのインキュベーションの前に第１のプライマーとハイブリダイズしない。
幾つかの実施形態では、付着反応がライゲーション反応である。
幾つかの実施形態では、付着反応がプライマー伸長反応である。
幾つかの実施形態において、第１の部分及び第２の部分を含む試薬混合物、第２のプライマー、第１の部分は核酸分子にアニーリングし、第２の部分は伸長配列を含む。
幾つかの実施形態では、第２のプライマーがビーズに付着される。幾つかの実施形態において、付着反応は、第２のプライマー及び核酸分子を使用して伸長産物を生成し、該産物は、第１の配列とハイブリダイズするように構成される伸長配列又はその相補体を含む。幾つかの実施形態において、増幅反応は、ビーズに固定化される複数の第１のプライマーを使用して伸長産物を増幅する。幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、第１の期間が第２の期間よりも長くなるように所定の濃度を有する。幾つかの実施形態において、エマルジョンは、第１のプライマー又は第２のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応で使用されるときに核酸分子を指数関数的に増幅できる複数の第３のプライマーを更に含む。
幾つかの実施形態において、増幅反応は、ビーズに付着される複数の第１のプライマーの少なくとも９９％が伸長産物又はその誘導体に結合されるときに終了する。
幾つかの実施形態において、エマルジョンは、複数のパーティション間において、複数のパーティションにおける１パーティション当たり平均１核酸分子よりも大きい密度で分布される、核酸分子を含む核酸分子のライブラリーを含む。幾つかの実施形態において、核酸分子のライブラリーの各核酸分子は、第２のプライマーに結合できる。
幾つかの実施形態では、複数のパーティションのうちのパーティションが複数の核酸分子を含み、複数の核酸分子が核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、核酸分子は、第２の核酸分子がビーズに付着する前に付着反応及び増幅反応を完了する。
幾つかの実施形態では、核酸分子が一本鎖である。
幾つかの実施形態において、エマルジョンは、ビーズに付着されない更なる第１のプライマーを更に含む。
幾つかの実施形態では、エマルジョンが核酸ポリメラーゼを更に含む。
幾つかの実施形態では、伸長反応が等温条件下で行なわれる。
幾つかの実施形態では、増幅反応が等温条件下で行なわれる。
幾つかの実施形態において、方法は、エマルジョンからビーズを回収するステップを更に含む。
幾つかの実施形態において、方法は、核酸分子の増幅産物又はその誘導体をアッセイして核酸分子の配列を同定するステップを更に含む。
幾つかの実施形態において、試薬混合物は、増幅反応が進行できるようにするべく付着反応の前に伸長反応を行なうように更に構成される。幾つかの態様において、伸長反応は第３の期間において行なわれ、この第３の期間は、エマルジョンがインキュベーションを開始するときに始まり、増幅反応が開始するときに終了する。幾つかの実施形態では、第３の期間が第１の期間と同時に起こる。幾つかの実施形態では、第３の期間が第２の期間の前に起こる。
本開示の他の態様は、核酸分子に付着するように構成される担体を調製するための方法であって、（ａ）複数の担体及び複数の伸長基を含む混合物を与えるステップであって、複数の担体のうちの１つの担体が第１のプライマーを含み、複数の伸長基のうちの１つの伸長基が伸長プライマー分子を含む、ステップと、（ｂ）担体の第１のプライマーを伸長基の伸長プライマーに付着させるのに十分な条件に混合物を供して、（ｉ）複数の伸長基と会合されない非伸長担体と、（ｉｉ）伸長基と会合される伸長担体及びキャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成されるキャプチャエンティティとを含む、結果として生じる混合物を生成するステップであって、伸長担体が、伸長プライマー分子の配列に対して相補的な配列を含む第２のプライマーを含む、ステップと、（ｃ）キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップとを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態において、本方法は、伸長担体から伸長基を解離させるステップを更に含む。幾つかの実施形態では、解離するステップが融解を含む。幾つかの実施形態において、方法は、核酸分子を第２のプライマーにアニーリングして鋳型付着担体を生成するステップを更に含む。幾つかの実施形態において、方法は、鋳型付着担体をパーティションで仕切るステップを更に含む。幾つかの実施形態において、方法は、増幅反応を行なって、核酸分子の複数の増幅産物を伸長担体に固定化するステップを更に含む。
幾つかの実施形態では、担体がビーズを含む。幾つかの実施形態では、担体が複数の第１のプライマーを含み、複数の第１のプライマーが第１のプライマーを含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティがビオチンを含み、キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列を含み、キャプチャリングエンティティがキャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含む。
幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが磁性粒子を含み、キャプチャリングエンティティが磁場系を含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが荷電粒子を含み、キャプチャリングエンティティが電場系を含む。
幾つかの実施形態では、（ａ）において、伸長基がキャプチャエンティティを含む。
幾つかの実施形態において、（ｂ）は、キャプチャエンティティを含むヌクレオチドを組み入れるために第１のプライマーを使用して伸長反応を行なうステップを含む。
幾つかの実施形態において、キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップは、（ｉ）キャプチャリングエンティティ及び（ｉｉ）二次キャプチャリングエンティティにより捕捉するように構成される二次キャプチャエンティティを含むキャプチャリング基を与えるステップと、キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによってキャプチャリング基を伸長担体と会合させるステップと、二次キャプチャリングエンティティを使用して二次キャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップとを含む。
幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティがビオチンを含み、二次キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティがキャプチャ配列を含み、二次キャプチャリングエンティティがキャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティが磁性粒子を含み、二次キャプチャリングエンティティが磁場系を含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティが荷電粒子を含み、二次キャプチャリングエンティティが電場系を含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャリングエンティティが複数の伸長担体を捕捉し、複数の伸長担体が伸長担体を含む。幾つかの実施形態において、方法は、キャプチャ基を伸長担体から解離させるステップを更に含む。
他の態様において、本開示は、核酸分子に付着するように構成される担体を調製するための方法であって、（ａ）複数の非伸長担体と複数の伸長担体とを含む混合物を与えるステップであって、複数の非伸長担体のうちの１つの非伸長担体がプライマー配列を含まず、複数の伸長担体のうちの１つの伸長担体がプライマー配列を含み、プライマー配列が核酸分子に付着するように構成される、ステップと、（ｂ）（ｉ）キャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成されるキャプチャエンティティ、及び、（ｉｉ）伸長担体のプライマー配列及びキャプチャ基の配列を使用して伸長担体をキャプチャ基と会合させるべくプライマー配列を混合物に付着させるように構成される配列を含む、キャプチャ基を与えるステップと、（ｃ）キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップとを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態において、方法は、キャプチャ基を伸長担体から解離させるステップを更に含む。幾つかの実施形態では、解離させるステップが融解を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、キャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離した後に、キャプチャリングエンティティを使用して核酸分子をプライマー配列に付着させるステップを更に含む。幾つかの実施形態では、伸長担体がビーズを含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティがビオチンを含み、キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含む。
幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列を含み、キャプチャリングエンティティがキャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが磁性粒子を含み、キャプチャリングエンティティが磁場系を含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが荷電粒子を含み、キャプチャリングエンティティが電場系を含む。
他の態様において、本開示は、担体を調製するための方法であって、（ａ）複数の担体及び複数の鋳型核酸分子を含む混合物を与えるステップであって、複数の担体のうちの１つの担体が複数のプライマーを含み、複数の鋳型核酸分子のうちの１つの鋳型核酸分子が、（ｉ）複数のプライマーのうちの１つのプライマーに付着するように構成されるアダプター、及び、（ｉｉ）それに結合されるキャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成されるキャプチャエンティティを含む、ステップと、（ｂ）担体のプライマーを鋳型核酸分子のアダプターに付着させるのに十分な条件に混合物を供して、（ｉ）複数の鋳型核酸分子と会合されない非伸長担体と、（ｉｉ）鋳型核酸分子に結合されるキャプチャエンティティと会合される伸長担体とを含む結果として生じる混合物を生成するステップであって、伸長担体が、鋳型核酸分子の配列に対して相補的な配列を含む核酸分子を含み、伸長担体上の複数のプライマーの少なくとも５０％が複数の鋳型核酸分子と会合されない、ステップと、（ｃ）キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップとを含む方法を提供する。
他の態様において、本開示は、担体を調製するための方法であって、（ａ）複数の担体及び複数の鋳型核酸分子を含む混合物を与えるステップであって、複数の担体のうちの１つの担体が複数のプライマーを含み、複数の鋳型核酸分子のうちの１つの鋳型核酸分子が、複数のプライマーのうちの１つのプライマーに付着するように構成されるアダプターを含む、ステップと、（ｂ）担体のプライマーを鋳型核酸分子のアダプターに付着させるのに十分な条件に混合物を供して、（ｉ）複数の鋳型核酸分子と会合されない非伸長担体と、（ｉｉ）鋳型核酸分子に結合されるキャプチャエンティティと会合される伸長担体とを含む結果として生じる混合物を生成するステップであって、キャプチャエンティティがキャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成され、伸長担体が、鋳型核酸分子の配列に対して相補的な配列を含む核酸分子を含み、伸長担体上の前記複数のプライマーの少なくとも５０％が前記複数の鋳型核酸分子と会合されない、ステップと、（ｃ）キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップと、（ｄ）複数の伸長担体を複数の液滴に分割するステップであって、複数の伸長担体が伸長担体を含み、複数の液滴のうちの１つの液滴が伸長担体を含む、ステップとを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態において、伸長担体上の複数のプライマーの少なくとも８０％は、複数の鋳型核酸分子と会合されない。幾つかの実施形態において、伸長担体上の複数のプライマーの少なくとも９０％は、複数の鋳型核酸分子と会合されない。幾つかの実施形態において、伸長担体上の複数のプライマーの少なくとも９５％は、複数の鋳型核酸分子と会合されない。幾つかの実施形態において、伸長担体上の複数のプライマーの少なくとも９９％は、複数の鋳型核酸分子と会合されない。
幾つかの実施形態において、方法は、鋳型核酸分子を伸長担体から解離させるステップを更に含む。幾つかの実施形態では、解離させるステップが融解を含む。幾つかの実施形態では、担体がビーズを含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティがビオチンを含み、キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列を含み、キャプチャリングエンティティがキャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが磁性粒子を含み、キャプチャリングエンティティが磁場系を含む。幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが荷電粒子を含み、キャプチャリングエンティティが電場系を含む。
幾つかの実施形態において、キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップは、（ｉ）キャプチャリングエンティティ及び（ｉｉ）二次キャプチャリングエンティティにより捕捉するように構成される二次キャプチャエンティティを含むキャプチャリング基を与えるステップと、キャプチャリングエンティティを使用してキャプチャエンティティを捕捉することによってキャプチャリング基を伸長担体と会合させるステップと、二次キャプチャリングエンティティを使用して二次キャプチャエンティティを捕捉することによって結果として生じる混合物から伸長担体を単離するステップとを含む。
幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティがビオチンを含み、二次キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティがキャプチャ配列を含み、二次キャプチャリングエンティティがキャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャエンティティが磁性粒子を含み、二次キャプチャリングエンティティが磁場系を含む。
幾つかの実施形態では、キャプチャエンティティが荷電粒子を含み、二次キャプチャリングエンティティが電場系を含む。幾つかの実施形態では、二次キャプチャリングエンティティが複数の伸長担体を捕捉し、複数の伸長担体が伸長担体を含む。幾つかの実施形態において、方法は、キャプチャ基を伸長担体から解離するステップを更に含む。
幾つかの実施形態では、（ａ）において、鋳型核酸分子がキャプチャエンティティを含む。
幾つかの実施形態において、（ｂ）は、キャプチャエンティティを含むヌクレオチドを組み入れるためにプライマーを使用して伸長反応を行なうステップを含む。
幾つかの実施形態において、液滴は、複数の伸長担体のうちの単一の伸長担体を含み、単一の伸長担体が伸長担体である。幾つかの実施形態では、複数の液滴の占有液滴の大部分が、複数の伸長担体のうちの単一の伸長担体を含む。幾つかの実施形態では、複数の液滴が非占有液滴を含み、非占有液滴が複数の伸長担体のいずれの伸長担体も含まない。
幾つかの実施形態において、（ｄ）は、混合物を分割するステップであって、混合物が複数の伸長担体を含み、混合物が非伸長担体よりも多くの伸長担体を含む、ステップを含む。幾つかの実施形態では、混合物中の実質的に全ての担体が伸長担体である。
本開示の他の態様は、１つ以上のコンピュータプロセッサによる実行時に、先に記載された又は本明細書中の他の場所で説明された方法のいずれかを実施する機械実行可能なコードを含む持続性コンピュータ可読媒体を提供する。
本開示の他の態様は、１つ以上のコンピュータプロセッサ及びそれに結合されるコンピュータメモリを備えるシステムを提供する。コンピュータメモリは、１つ以上のコンピュータプロセッサによる実行時に、先の又は本明細書中の他の場所の方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む。
本開示の更なる態様及び利点は、本開示の単なる例示的な実施形態が示されて記載されるにすぎない以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになる。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、その幾つかの詳細は、全てが本開示から逸脱することなく、様々な自明な点で変更が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示と見なされるべきであり、限定的であると見なされるべきでない。
参照による組み入れ
この明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び、特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、又は、特許出願が参照により組み入れられるべく具体的に且つ個別に示唆されたと同じ程度に参照により本願に組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物及び特許又は特許出願が明細書中に含まれる開示と矛盾する程度まで、明細書は、任意のそのような矛盾する資料よりも優先する及び／又は優ることを意図している。
本発明の新規の特徴が添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明及び添付図面（本明細書中の「図」及び「ＦＩＧ」も）を参照することによって得られ、添付図面は以下の通りである。
一般的な次世代配列決定（ＮＧＳ）手法の概略図を描き、遺伝物質が分析から逃れる可能性がある状況を示し、及び／又は、ワークフローに存在し得る潜在的なノイズ源及び突然変異を表わす。 一般的なＮＧＳ手法の概略図を描き、分析ワークフローに対する修正が収率（例えば、分析された生体サンプルから得られる情報の量）を増大させ、核酸分析中のノイズ及び突然変異の確率を低下させ得る状況を示す。 パーティションのシングルビーズ（左図）及びマルチビーズ（右図）装填の比較を示す。図に示されるように、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応（ｅｍＰＣＲ又はｅＰＣＲ）中の液滴（又はウェルなどの他のパーティション）のマルチビーズ装填は、ｅＰＣＲワークフローにおけるサンプル材料（例えば、ゲノム材料）の損失を有意に減少させることができ、その結果、シングルビーズ装填（左の図）を伴う方法と比較して、配列分析中のノイズを低減しながら、試薬の精度及び利用を改善し得る。 コード鎖及び逆相補鎖の読み取り（例えば、ペアエンド配列リードの生成）などの更なる手段を核酸分析ワークフローに組み込むことによって配列分析におけるノイズが更に低減され得ることを示す。 液滴装填、Ｌｄｒｏｐｌｅｔ及び掃引（Ｆｓｐｌｉｔ＝５０％、Ｆｓｅｑ＝１００％）についてのリード対合結果を示す。 液滴装填、Ｌｄｒｏｐｌｅｔ及び掃引（Ｆｓｐｌｉｔ＝５０％、Ｆｓｅｑ＝１００％）についてのリード対合結果を示す。 本明細書中で与えられる方法を実施するようにプログラムされる或いはさもなければ構成されるコンピュー制御タシステムを示す。 異なるアダプター配列が隣接する生体サンプル（核酸分子５）の概略図を示す。アダプターＡはプライマーＡ（１－７）及びプライマーＡ’（７０３）を含み、アダプターＢはプライマーＢ（４－７）及びプライマーＢ’（７０２）を含む。 二種類のビーズ（８０６）の概略図を示す。ビーズの１つのタイプは、固定化プライマーＡ（１－８）又はそのフラグメントもしくは部分を含む。１つのタイプのビーズは、固定化されたプライマーＢ（４－８）又はそのフラグメントもしくは部分を含む。 鋳型装填及び配列決定のそれぞれのためのビーズの第１及び第２のセットを含むワークフローを示す。 ビーズ及び鋳型の両方に関してポアソン装填により制限されるｅＰＣＲ法を示す。 ビーズに関してポアソン装填により制限されるがポアソン分布よりも大きい鋳型の密度を達成するｅＰＣＲ法を示す。 ポアソン分布よりも大きい鋳型の密度及びビーズの密度を達成するｅＰＣＲ法を示す。 ｅＰＣＲ方法の一例を示す。 ポリクローナルビーズをもたらすｅＰＣＲ法の一例を示す。 本開示のｅＰＣＲ方法の一例を示す。 複数の鋳型を有する本開示のｅＰＣＲ方法の一例を示す。 本開示のｅＰＣＲ方法の更なる詳細を示す。 本開示のｅＰＣＲ方法の更なる詳細を示す。 本開示のｅＰＣＲ方法の更なる詳細を示す。 本開示のｅＰＣＲ方法の更なる詳細を示す。 本開示のｅＰＣＲ方法の更なる詳細を示す。 開放表面上で実行される本開示の方法を示す。 開放表面上で実行される本開示の方法を示す。 開放表面上で実行される本開示の方法を示す。 開放表面上で実行される本開示の方法を示す。 第２のプライマーが表面に付着される本開示の一実施形態を示す。 第２のプライマーが表面に付着される本開示の一実施形態を示す。 表面上のコロニー位置のそれぞれが異なる第１のプライマーを有する本開示の一実施形態を示す。 表面上のコロニー位置のそれぞれが異なる第１のプライマーを有する本開示の一実施形態を示す。 表面上のコロニー位置のそれぞれが異なる第１のプライマーを有する本開示の一実施形態を示す。 第２の遅い伸長ステップを含む本開示の一実施形態を示す。 第２の遅い伸長ステップを含む本開示の一実施形態を示す。 第２の遅い伸長ステップを含む本開示の一実施形態を示す。 第２の遅い伸長ステップを含む本開示の一実施形態を示す。 アダプターが鋳型核酸分子の各末端に付着される例を示す。 伸長担体を生成する一例を示す。 磁力を加えることによって伸長担体を溶液から分離する例を示す。 磁力を加えることによって伸長担体を溶液から分離する例を示す。 磁力を加えることによって伸長担体を溶液から分離する別の例を示す。 複数の予め濃縮された担体を生成するための予濃縮方法の一例を示す。 複数の予め濃縮された担体を生成するための予濃縮方法の一例を示す。 予濃縮手順を使用する増幅の結果を示す。 異なる伸長プライマー入力濃度で捕捉された濃縮ビーズの存在を示す。 異なる伸長プライマー入力濃度での濃縮ビーズにおける伸長プライマー配列の存在を示す。 異なる伸長プライマー入力濃度での増幅ビーズの存在を示す。 異なる伸長プライマー入力濃度での増幅ビーズにおけるポリクロナリティを示す。
本発明の様々な実施形態を本明細書中で示して説明してきたが、当業者に明らかなように、そのような実施形態は単なる一例として与えられる。本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、及び、置換は当業者に想起し得る。本明細書中に記載される発明の実施形態の様々な代替案を使用できることが理解されるべきである。
値が範囲として記載されている場合、そのような開示は、特定の数値又は特定の部分範囲が明示的に記載されているかどうかにかかわらず、そのような範囲内の全ての可能な部分範囲並びにそのような範囲内に入る特定の数値の開示を含むことが理解される。
範囲は、本明細書中では、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値までとして表現され得る。「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、一般に、所定の値又は値の範囲に対する許容可能な誤差又は変動の程度、例えば、所定の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、１５％以内、１０％以内、又は、５％以内の誤差又は変動の程度を意味するものとする。
本明細書中で使用される「増幅」という用語は、一般に、核酸分子又は伸長産物（例えば、核酸分子上のプライマー伸長反応の産物）の１つ以上のコピーの産生を指す。核酸分子の増幅は、核酸分子にハイブリダイズした一本鎖又は核酸分子もしくはその相補体の複数のコピーを生じ得る。アンプリコンは、出発鋳型核酸分子から増幅手順によって生成される一本鎖又は二本鎖核酸分子であってもよい。アンプリコンは、その少なくとも一部が出発鋳型の少なくとも一部と実質的に同一又は実質的に相補的であってもよい核酸鎖を含み得る。出発鋳型が二本鎖核酸分子である場合、アンプリコンは、一方の鎖の少なくとも一部と実質的に同一であり、いずれかの鎖の少なくとも一部と実質的に相補的である核酸鎖を含み得る。アンプリコンは、最初の鋳型が一本鎖であるか二本鎖であるかにかかわらず、一本鎖又は二本鎖であり得る。増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばエマルジョンポリメラーゼ連鎖反応（ｅＰＣＲ；例えば、ウェル又は液滴などのマイクロリアクタ内で行なわれるＰＣＲ）であってもよい。
本明細書で使用される「変性」という用語は、一般に、二本鎖分子（例えば、ＤＮＡ）の一本鎖分子への分離を指す。変性は、完全又は部分的な変性であってもよい。部分変性では、ＤＮＡ中の二本鎖領域に隣接する２本のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖の変性によって、二本鎖分子内に一本鎖領域が形成され得る。
本明細書で使用される「クローン」という用語は、一般に、そのメンバーのかなりの部分（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％超）が実質的に同一の配列を有する核酸の集団を指す。核酸分子のクローン集団のメンバーは、互いに配列相同性を有し得る。幾つかの例において、そのようなメンバーは、鋳型核酸分子に対して配列相同性を有し得る。幾つかの例では、そのようなメンバーは、鋳型核酸分子の相補体（一本鎖の場合）に対して配列相同性を有し得る。クローン集団のメンバーは、二本鎖又は一本鎖であってもよい。集団のメンバーは、例えば、合成の過程で「エラー」が起こり得、所定の集団の少数が集団の大部分と配列相同性を有さないため、１００％同一又は相補的ではない場合がある。例えば、集団のメンバーの少なくとも５０％は、互いに又は参照核酸分子（すなわち、配列比較の基礎として使用される定義された配列の分子）と実質的に同一であってもよい。集団のメンバーの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上が、参照核酸分子と実質的に同一であってもよい。２つの分子間の同一性パーセントが少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％又はそれを超える場合、２つの分子は実質的に同一（又は相同）であると見なされ得る。２つの分子間の相補性パーセントが少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％又はそれを超える場合、２つの分子は実質的に相補的であると見なされ得る。非相同核酸の混合は低レベル又はわずかなレベルで起こり得るものであり、したがってクローン集団は少数（例えば３０％未満、例えば１０％未満）の多様な核酸を含み得る。
本明細書で使用される「相補的配列」という用語は、一般に、別の配列にハイブリダイズするか又はそのような他の配列と配列相補性を有する配列を指す。２つの一本鎖核酸分子間のハイブリダイゼーションは、特定の条件下で安定な二本鎖構造の形成を含み得る。２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、それらが２つ以上の連続的に隣接する塩基対合によって互いに結合している場合、ハイブリダイズしていると見なされ得る。二本鎖構造の一方の鎖中のヌクレオチドのかなりの割合が、他方の鎖上のヌクレオシドとワトソン－クリック塩基対合を起こし得る。また、ハイブリダイゼーションは、そのような対形成が水素結合の形成を伴うか否かにかかわらず、プローブの縮重を減少させるために使用され得る、デオキシイノシン、ヌクレオシドと２－アミノプリン塩基などのヌクレオシド類似体の対形成を含み得る。
本明細書で使用される「重合酵素」という用語は、一般に、重合反応を触媒する物質を指す。重合酵素を使用して、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の組み込みによって鋳型鎖と対になった核酸プライマーを伸長することができる。重合酵素は、既存のヌクレオチド鎖の３’末端を伸長し、ホスホジエステル結合の生成を介して鋳型鎖に一度に１つずつ適合する新しいヌクレオチドを付加することによって、ＤＮＡの新しい鎖を付加し得る。重合酵素は、核酸ポリメラーゼなどのポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、天然に存在していてもよく又は合成されていてもよい。ポリメラーゼは、比較的高い加工性、すなわち、核酸鋳型を放出することなく核酸鋳型にヌクレオチドを連続的に組み込むポリメラーゼの能力を有し得る。重合酵素は、転写酵素であってもよい。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、修飾ポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、０２９（ｐｈｉ ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸＴａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｅａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、並びにその変異体、修飾産物及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、単一サブユニットポリメラーゼであってもよい。
本明細書で使用される「融解温度」又は「融点」という用語は、一般に、サンプル中の核酸分子の鎖の少なくとも一部が相補鎖の少なくとも一部から分離した温度を指す。融解温度は、二本鎖核酸分子が部分的又は完全に変性した温度であってもよい。融解温度は、所定の核酸分子の複数の配列間の配列の温度又は複数の配列の温度を指し得る。二本鎖核酸分子の異なる領域は、異なる融解温度を有し得る。例えば、二本鎖核酸分子は、第１の融点を有する第１の領域と、第１の融点よりも高い第２の融点を有する第２の領域とを含み得る。したがって、二本鎖核酸分子の異なる領域は、異なる温度で融解（例えば、部分的に変性する）し得る。核酸分子又はその領域（例えば、核酸配列）の融点は、実験的に決定されてもよく（例えば、溶融分析又は他の手順を介して）又は核酸分子の配列及び長さに基づいて推定されてもよい。例えば、ＭＥＬＴＩＮＧなどのソフトウェアプログラムを使用して、核酸配列の融解温度を推定することができる（Ｄｕｍｏｕｓｓｅａｕ Ｍ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｎ、Ｊｕｔｙ Ｎ、Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ Ｎ、ＭＥＬＴＩＮＧ、核酸の融解温度を予測するための柔軟なプラットフォーム．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１２ Ｍａｙ １６；１３：１０１．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１３－１０１）。したがって、本明細書に記載の融点は、推定融点であってもよい。核酸配列の真の融点は、目的の核酸配列に隣接する配列又はその欠如、並びに他の要因に基づいて変化し得る。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、一般に、塩基（例えば、核酸塩基）、糖部分、及びリン酸部分を含む物質を指す。ヌクレオチドは、リン酸基が付着した遊離塩基を含み得る。３つのリン酸基が付着した塩基を含む物質は、ヌクレオシド三リン酸と称され得る。ヌクレオチドが成長中の核酸分子鎖に付加されている場合、ヌクレオチドの近位リン酸と成長鎖との間のホスホジエステル結合の形成は、２つの遠位リン酸のピロリン酸としての放出を伴う高エネルギーリン酸結合の加水分解を伴い得る。ヌクレオチドは、天然に存在してもよく又は天然に存在しなくてもよい（例えば、修飾又は操作されたヌクレオチド）。
本明細書で使用される「ヌクレオチド類似体」という用語は、天然に存在するヌクレオチドであってもなくてもよいヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されない。例えば、ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドを含むアデニン－（Ａ）、チミン－（Ｔ）、シトシン－（Ｃ）、ウラシル－（Ｕ）、又はグアニン－（Ｇ）などのカノニカルヌクレオチドに由来し得る及び／又はそれに対する構造類似性を含み得る。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチドと比較して１つ以上の相違又は修飾を含み得る。ヌクレオチド類似体の例としては、イノシン、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、デアザキサンチン、デアザグアニン、イソシトシン、イソグアニン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、エチニルヌクレオチド塩基、１－プロピニルヌクレオチド塩基、アジドヌクレオチド塩基、ホスホロセレノエート核酸、及び、（例えば、酸化、還元、及び／又はアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシル、又はハロゲン部分による）それらの修飾バージョンが挙げられる。核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド、二本鎖核酸分子、一本鎖核酸分子、プライマー、アダプターなど）は、塩基部分（例えば、一般に相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために利用可能な１つ以上の原子及び／又は一般に相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することができない１つ以上の原子において）、糖部分、又は、リン酸骨格で修飾され得る。ある場合には、ヌクレオチドは、そのリン酸部分に、三リン酸部分の修飾を含む修飾を含み得る。修飾の更なる非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれを超えるホスフェート部分を有するホスフェート鎖）、チオール部分による修飾（例えば、アルファ－チオ三リン酸及びベータ－チオ三リン酸）、及び、セレン部分による修飾（例えば、ホスホロセレノエート核酸）が挙げられる。ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、リボース、デオキシリボース、及び、（例えば、アルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシル又はハロゲン部分などの置換基の酸化、還元及び／又は付加による）それらの修飾型から成るグループから選択される糖を含み得る。また、ヌクレオチド類似体は、修飾リンカー部分（例えば、リン酸部分の代わりに）を含み得る。また、ヌクレオチド類似体は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有付着を可能にするために、アミノアリル－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含有し得る。本開示のオリゴヌクレオチド中の標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、例えば、ビット／立方ｍｍでのより高い密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する耐性）、光プログラム化ポリメラーゼにおけるより容易な識別、及び／又は、より低い二次構造を提供し得る。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド検出のために検出可能な部分と反応又は結合することができる。
本明細書中で使用される「担体」又は「基板」という用語は、一般に、核酸分子などの試薬が固定化され得る任意の固体又は半固体物品を指す。核酸分子は、合成され、付着され、ライゲートされ、或いはさもなければ、固定化され得る。核酸分子は、物理的吸着、イオン結合もしくは共有結合形成、又は、それらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の方法によって基板上に固定化され得る。基板は、２次元（例えば、平面２Ｄ基板）又は３次元であってもよい。ある場合には、基板は、フローセルの構成要素であってもよく、及び／又は、配列決定機器内に含まれてもよく又は配列決定機器によって受けられるようになっていてもよい。基板は、ポリマー、ガラス、又は、金属材料を含むことができる。基板の例としては、膜、平面基材、マイクロタイタープレート、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、フィルタ、試験片、スライド、カバースリップ、及び、試験管が挙げられる。基板は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及びポリアクリルアミド（例えば、ポリアクリルアミドゲル）などの有機ポリマー、並びにそれらのコポリマー及びグラフトを含み得る。基板は、ラテックス又はデキストランを含み得る。また、基板は、ガラス、シリカ、金、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、又は、逆相シリカなどの無機であってもよい。担体の形態は、例えば、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、多孔性マトリックス、又は、基板の形を成してもよい。場合によっては、基板は、単一の固体又は半固体物品（例えば、単一粒子）であってもよく、他の場合では、基板は、複数の固体又は半固体物品（例えば、粒子の集合体）を含んでもよい。基板は、平面、実質的に平面、又は、非平面であってもよい。基板は、多孔質又は非多孔質であってもよく、膨潤又は非膨潤特性を有してもよい。基板は、１つ以上のウェル、凹部、又は、他の容器、うつわ、特徴、又は、位置を含むように成形されてもよい。複数の基板が、様々な位置でアレイ状に構成されてもよい。基板は、（例えば、試薬のロボット送達のために）アドレス指定可能であってもよく、又は、レーザ照射及び共焦点又は偏向光の収集による走査などの検出手法によってアドレス指定可能であってもよい。例えば、基板は、検出器と光学的及び／又は物理的に連通していてもよい。或いは、基板は、ある距離だけ検出器から物理的に分離されてもよい。増幅基板（例えば、ビーズ）は、別の基板（例えば、第２の担体のウェル内）の中又は上に配置することができる。
本明細書中で使用される「標識」という用語は、一般に、例えばヌクレオチド類似体などの種と結合することができる部分を指す。標識は、親和性部分を含み得る。場合によっては、標識は、検出され得る信号を放出する（又は既に放出された信号を減少させる）検出可能な標識であってもよい。ある場合には、そのような信号は、１つ以上のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の取り込みを示し得る。ある場合には、標識は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に結合されてもよく、そのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、プライマー伸長反応において使用され得る。ある場合には、標識は、プライマー伸長反応後にヌクレオチド類似体に結合され得る。標識は、ある場合には、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体と特異的に反応性であってもよい。結合は、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン相互作用、ファンデルワールス力などを介して）であってもよい。ある場合には、結合は、開裂可能、例えば光開裂可能（例えば、紫外光下で開裂可能）、化学開裂可能（例えば、還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）により）又は酵素開裂可能（例えば、エステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ又はプロテアーゼにより）であってもよいリンカーによるものであってもよい。場合によっては、標識は、発光性、すなわち、蛍光性又はリン光性であってもよい。標識は消光分子であってもよい。本明細書中で使用される「消光剤」という用語は、放出された信号を減少させることができる分子を指す。例えば、鋳型核酸分子は、検出可能な信号を放出するように設計され得る。消光剤を含むヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の組み込みは、信号を低減又は排除することができ、その後、その低減又は排除が検出される。場合によっては、本明細書中の他の箇所に記載されるように、消光剤による標識化は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の取り込み後に起こり得る。色素及び標識は、核酸配列に組み込まれ得る。染料及び標識は、１つ以上のビーズを互いに連結するためのリンカーなどのリンカーに組み込まれてもよい。染料の非限定的な例としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨウ素、ヘキスト、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジン及びアクリジン、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー－１及び－２、エチジウムモノアジド、及びＡＣＭＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、７－ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、ヒドロキシスチルバミジン、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３、ＪＯＪＯ－１、ＬＯＬＯ－１、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＢＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、ＰＯ－ＰＲＯ－３、ＢＯ－ＰＲＯ－１、ＢＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＪＯ－ＰＲＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ ＤＸ、ＳＹＴＯ－４０、－４１、－４２、－４３、－４４、－４５（青）、ＳＹＴＯ－１３、－１６、－２４、－２１、－２３、－１２、－１１、－２０、－２２、－１５、－１４、－２５（緑）、ＳＹＴＯ－８１、－８０、－８２、－８３、－８４、－８５（オレンジ）、ＳＹＴＯ－６４、－１７、－５９、－６１、－６２、－６０、－６３（赤）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ－フィコエリトリン、Ｃｙ－２、Ｃｙ－３、Ｃｙ－３．５、Ｃｙ－５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ－７、テキサスレッド、ファーレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、７－ＡＡＤ、エチジウムホモダイマーＩ、エチジウムホモダイマーＩＩ、エチジウムホモダイマーＩＩＩ、エチジウムブロマイド、アンベリフェロン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、ユーロピウムやテルビウムなどの蛍光ランタニド錯体、カルボキシテトラクロロフルオレセイン、５及び／又は６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ＶＩＣ、５－（又は６－）ヨードアセトアミドフルオレセイン、５－｛［２（及び３）－５－（アセチルメルカプト）－スクシニル］アミノ｝フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ－フルオレセイン）、リサミンローダミンＢスルホニル塩化物、５及び／又は６カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、７－アミノ－メチル－クマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム塩、３，６－ジスルホネート－４－アミノ－ナフタルイミド、フィコビリプロテイン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、及び７９０色素、ＤｙＬｉｇｈｔ ３５０、４０５、４８８、５５０、５９４、６３３、６５０、６８０、７５５、及び８００色素、又はその他のフルオロフォア、ＢＨ１－０、ＢＨＱなどのブラックホール消光剤色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）－１、ＢＨＱ－３、ＢＨＱ－１０）；ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５などのＱＳＹ色素蛍光消光剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、及びＤａｂｃｙｌやＤａｂｓｙｌなどの他の消光剤、Ｃｙ５Ｑ及びＣｙ７Ｑ及びダークシアニン色素（ＧＥヘルスケア）；ＤＹＱ－６６０やＤＹＱ－６６１などのＤｙ－Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、及び、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、５８０Ｑ、６１２ＱなどのＡＴＴＯ蛍光消光剤（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）が挙げられる。ある場合には、標識は、自己消光しないか又は近接消光を示すタイプであってもよい。自己消光又は近接消光を示さない標識タイプの非限定的な例としては、モノブロモビマンなどのビマン誘導体が挙げられる。本明細書で使用される「近接消光」という用語は、一般に、互いに近接する１つ以上の色素が、それらが個々に示す蛍光と比較してより低い蛍光を示し得る現象を指す。ある場合には、色素は、ドナー色素及びアクセプター色素が互いに１ｎｍ～５０ｎｍ以内にある近接消光に供し得る。
本明細書で使用される「検出器」という用語は、一般に、組み込まれたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の存在又は非存在を示す信号などの信号を検出することができる装置を指す。検出器は、信号を検出することができる光学部品及び／又は電子部品を含むことができる。検出器を含む検出方法の非限定的な例には、光学的検出、分光学的検出、静電検出、及び電気化学的検出が含まれる。光学的検出方法としては、蛍光測定及び紫外可視吸光度が挙げられるが、これらに限定されない。分光検出方法としては、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、及び赤外分光法が挙げられるが、これらに限定されない。静電検出方法としては、例えばゲル電気泳動などのゲルベースの技術が挙げられるが、これらに限定されない。電気化学的検出方法としては、増幅産物の高速液体クロマトグラフィー分離後の増幅産物の電気化学的検出が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書中で使用される「配列決定」という用語は、一般に、核酸分子などの生体分子の配列を生成又は同定するプロセスを指す。そのような配列は、核酸塩基の配列（例えば、核酸塩基）を含み得る核酸配列であってもよい。配列決定は、例えば、一分子配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、又は、ライゲーションによる配列決定であってもよい。配列決定は、フローセル又は１つ以上のビーズなどの担体上に固定化された鋳型核酸分子を使用して実施され得る。配列決定アッセイは、１つ以上の鋳型核酸分子に対応する１つ以上の配列決定リードをもたらし得る。
本明細書中で使用される「リード」という用語は、一般に、配列決定リードなどの核酸配列を指す。配列決定リードは、核酸配列決定アッセイを介して取得された核酸塩基（例えば、ヌクレオチド）又は塩基対の推測配列であってもよい。配列決定リードは、超並列アレイシーケンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又はＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの核酸シーケンサーによって生成され得る。配列決定リードは、被検体のゲノムの一部又は場合によっては全部に対応し得る。配列決定リードは一連の配列決定リードの一部であってもよく、これは、例えば、（例えば、参照ゲノムに対する）アラインメントによって組み合わされて被検体のゲノムの配列をもたらし得る。
本明細書中で使用される「被検体」という用語は、一般に、生体サンプル（例えば、処理又は分析を受けているか又は受けることになる生体サンプル）が由来し得る個体又はエンティティを指す。被検体は、動物（例えば、哺乳動物又は非哺乳動物）又は植物であってもよい。被検体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、鳥、非ヒト霊長類、サル、家畜、コンパニオンアニマル、スポーツ動物、又は、げっ歯類であってもよい。被検体は患者であってもよい。被検体は、癌（例えば、乳癌、結腸直腸癌、脳癌、白血病、肺癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、リンパ腫、食道癌又は子宮頸癌）又は感染性疾患などの疾患又は障害を有してもよく又は有すると疑われてもよい。これに代えて又は加えて、被検体は、疾患又は障害を以前に有していたことが知られていてもよい。被検体は、軟骨無形成症、アルファ－１抗トリプシン欠損症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、シャルコー・マリー・トゥース、クリ・デュ・チャット、クローン病、嚢胞性線維症、デルカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン型血小板増加症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳脊髄症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、Ｎｏｏｎａｎ症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド異常、ポルフィリン、早老症、網膜色素変性、重症複合免疫不全、鎌状鎌状鎌状赤血球症、筋萎縮症、筋萎縮症、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、軟口蓋心顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、又は、ウィルソン病などの遺伝性疾患を有してもよく又は有すると疑われてもよい。被検体は、疾患又は障害の処置を受けていてもよい。被検体は、所定の疾患又は障害の症候性又は無症候性であってもよい。被検体は、健康（例えば、疾患又は障害を有することが疑われない）であってもよい。被検体は、所定の疾患に対する１つ以上の危険因子を有してもよい。被検体は、所定の体重、身長、ボディーマス指数又は他の身体的特徴を有してもよい。被検体は、所定の民族的又は人種的背景、出生地又は居住地、国籍、疾患又は寛解状態、家族の病歴又は他の特徴を有してもよい。
本明細書中で使用される場合、「生体サンプル」という用語は、一般に、被検体から取得されたサンプルを指す。生体サンプルは、被検体から直接的又は間接的に取得されてもよい。サンプルは、スピッティング、スワビング、採血、生検、排泄物（例えば、尿、便、痰、嘔吐物、又は唾液）の取得、切除、掻き取り、及び、穿刺を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって被検体から得ることができる。サンプルは、例えば、静脈内又は動脈内で循環系にアクセスすること、分泌された生体サンプル（例えば、便、尿、唾液、痰など）を収集すること、呼吸すること、又は、組織（例えば、生検）を外科的に抽出することによって被検体から取得することができる。サンプルは、皮膚又は子宮頸部のこすり取り、頬の拭き取り、又は、唾液、尿、糞便、月経、涙もしくは精液の採取を含むがこれらに限定されない非侵襲的方法によって取得することができる。或いは、サンプルは、生検、穿刺吸引又は静脈切開などの侵襲的手順によって取得されてもよい。サンプルは、例えば限定されないが、血液（例えば、全血、赤血球、白血球又は白血球、血小板）、血漿、血清、汗、涙、唾液、痰、尿、精液、粘液、滑液、母乳、初乳、羊水、胆汁、骨髄、間質液もしくは細胞外液、又は、脳脊髄液などの体液を含んでもよい。例えば、穿刺法によってサンプルを得て、血液及び／又は血漿を含む体液を取得することができる。そのようなサンプルは、細胞及び無細胞核酸材料の両方を含み得る。或いは、サンプルは、血液、汗、毛包、頬組織、涙、月経、糞便、又は、唾液を含むがこれらに限定されない任意の他の供給源から取得することができる。生体サンプルは、腫瘍生検などの組織サンプルであってもよい。サンプルは、皮膚、心臓、肺、腎臓、乳房、膵臓、肝臓、腸、脳、前立腺、食道、筋肉、平滑筋、膀胱、胆嚢、結腸、又は甲状腺を含むがこれらに限定されない本明細書で与えられる組織のいずれかから取得することができる。本明細書中で与えられる取得方法としては、細針吸引、コアニードル生検、真空補助生検、大コア生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、シェービング生検又は皮膚生検を含む生検方法が挙げられる。生体サンプルは、１つ以上の細胞を含み得る。生体サンプルは、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子（例えば、細胞内に含まれる又は細胞内に含まれない）などの１つ以上の核酸分子を含み得る。核酸分子は、細胞内に含まれ得る。これに代えて又は加えて、核酸分子は、細胞内に含まれなくてもよい（例えば、無細胞核酸分子）。生体サンプルは無細胞サンプルであってもよい。
本明細書中で使用される「無細胞サンプル」という用語は、一般に、細胞（例えば、体積基準で１０％未満の細胞）を実質的に含まないサンプルを指す。無細胞サンプルは、任意の供給源（例えば、本明細書に記載されるように、）に由来し得る。例えば、無細胞サンプルは、血液、汗、尿又は唾液に由来し得る。例えば、無細胞サンプルは、組織又は体液に由来し得る。無細胞サンプルは、複数の組織又は体液に由来し得る。例えば、第１の組織又は体液からのサンプルは、（例えば、サンプルが得られている間又はサンプルが取得された後に）第２の組織又は体液からのサンプルと組み合わせることができる。一例では、第１の流体及び第２の流体を被検体（例えば、同じ時間又は異なる時間に）から収集することができ、第１及び第２の流体を組み合わせてサンプルを提供することができる。無細胞サンプルは、１つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ分子などの１つ以上の核酸分子を含み得る。
無細胞サンプルでないサンプル（例えば、１つ以上の細胞を含むサンプル）は、無細胞サンプルを提供するために処理され得る。例えば、１つ以上の細胞並びに細胞内に含まれない（例えば、無細胞核酸分子）１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子）を含むサンプルを被検体から取得することができる。サンプルを（例えば、本明細書に記載されるように）処理して、細胞内に含まれない核酸分子から細胞及び他の物質を分離し、それによって無細胞サンプル（例えば、細胞内に含まれない核酸分子を含む）を提供することができる。その後、無細胞サンプルを更なる分析及び処理に供してもよい（例えば、本明細書で提供されるように）。細胞内に含まれない核酸分子（例えば、無細胞核酸分子）は、細胞及び組織に由来し得る。例えば、無細胞核酸分子は、（例えば、身体の組織の）腫瘍組織又は分解された細胞に由来し得る。無細胞核酸分子は、任意のタイプの核酸分子（例えば、本明細書に記載されるように）を含み得る。無細胞核酸分子は、二本鎖、一本鎖、又はそれらの組み合わせであってもよい。無細胞核酸分子は、分泌又は細胞死プロセス、例えば細胞壊死、アポトーシスなどを介して体液に放出され得る。無細胞核酸分子は、癌細胞（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））から体液中に放出され得る。また、無細胞核酸分子は、母体血流中を自由に循環する胎児ＤＮＡであってもよい（例えば、ｃｆｆＤＮＡなどの無細胞胎児核酸分子）。これに代えて又は加えて、無細胞核酸分子が健康な細胞から体液に放出されてもよい。
被検体から直接得られた生体サンプルは、被検体から取得された後に更に処理されてしまっていなくてもよい。例えば、血液サンプルは、被検体の循環系にアクセスし、被検体から血液を取り出し（例えば、針を介して、）、取り出した血液を容器に移すことによって、被検体から直接取得することができる。容器は、血液サンプルが更なる分析に有用であるように試薬（例えば、抗凝固剤）を含んでもよい。別の例では、スワブを使用して、被検体の中咽頭表面上の上皮細胞にアクセスすることができる。被検体から生体サンプルを取得した後、生体サンプルを含有するスワブを流体（例えば、緩衝液）と接触させて、スワブから生物学的流体を収集することができる。
１つ以上の核酸分子を含む任意の適切な生体サンプルを被検体から取得することができる。本明細書中で与えられる方法に従って使用するのに適したサンプル（例えば、生体サンプル又は無細胞生体サンプル）は、試験される個体の組織、細胞、分解細胞、核酸、遺伝子、遺伝子フラグメント、発現産物、遺伝子発現産物、及び／又は遺伝子発現産物フラグメントを含む任意の材料であってもよい。生体サンプルは、固形物（例えば、生体組織）であってもよく、流体（例えば、生物学的流体）であってもよい。一般に、生物学的流体は、生物と会合される任意の流体を含み得る。生体サンプルの非限定的な例としては、被検体の任意の解剖学的位置（例えば、組織、循環系、骨髄）から得られた血液（又は血液の成分、例えば白血球、赤血球、血小板）、被検体の任意の解剖学的位置から取得された細胞、皮膚、心臓、肺、腎臓、呼気、骨髄、便、精液、膣液、腫瘍組織に由来する間質液、乳房、膵臓、脳脊髄液、組織、喉スワブ、生検、胎盤液、羊水、肝臓、筋肉、平滑筋、膀胱、胆嚢、結腸、腸、脳、空洞液、痰、膿、微生物叢、メコニウム、母乳、前立腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿、胃及び消化液、涙、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、髄液、毛髪、指爪、皮膚細胞、血漿、鼻咽頭スワブ又は鼻咽頭洗浄液、脊髄液、血液、空体液、及び／又は、他の排泄物又は身体組織が挙げられる。サンプルの適合性及び／又は適切性を決定するための方法が提供される。サンプルは、血液、血漿、組織、細胞、分解細胞、無細胞核酸分子、及び／又は細胞からの、又は無細胞核酸分子などの個体の細胞に由来する生物学的材料を含み得るが、これらに限定されない。サンプルは、細胞、組織又は無細胞生物学的材料の不均一又は均一な集団であってもよい。生体サンプルは、本明細書に記載の分析方法に適したサンプルを提供できる任意の方法を使用して取得することができる。
サンプル（例えば、生体サンプル又は無細胞生体サンプル）は、分析のための調製において、濾過、遠心分離、選択的沈殿、透過処理、単離、撹拌、加熱、精製、及び／又は他のプロセスを含むがこれらに限定されない１つ以上のプロセスを経てもよい。例えば、サンプルは、汚染物質又は他の材料を除去するために濾過され得る。一例では、細胞を含むサンプルを処理して、サンプル中の他の材料から細胞を分離することができる。そのようなプロセスは、無細胞核酸分子のみを含むサンプルを調製するために使用され得る。そのようなプロセスは、多段階遠心分離プロセスから成ってもよい。同じ被検体からの複数のサンプル（例えば、同じもしくは異なる身体位置から同じもしくは異なる方法で得られる、及び／又は同じもしくは異なる時間（例えば、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月、又は数年離れている）に取得される）又は異なる被検体からの複数のサンプルなどの複数のサンプルを、本明細書に記載の分析のために得ることができる。一例において、第１のサンプルは、被検体が治療レジメン又は処置を受ける前に被検体から得られ、第２のサンプルは、被検体が治療レジメン又は処置を受けた後に被検体から取得される。これに代えて又は加えて、複数のサンプルを同じ被検体から同じ時間又はほぼ同じ時間に取得することができる。同じ被検体から得られた異なるサンプルは、同じ又は異なる方法で取得され得る。例えば、第１のサンプルは生検を介して取得されてもよく、第２のサンプルは採血を介して取得されてもよい。異なる方法で得られたサンプルは、異なる技術を使用して、異なる時間に、及び／又は異なる場所で、異なる医療専門家によって取得されることができる。同じ被検者から得られた異なるサンプルは、身体の異なる領域から取得されてもよい。例えば、第１のサンプルは、身体の第１の領域（例えば、第１の組織）から得られてもよく、第２のサンプルは、身体の第２の領域（例えば、第２の組織）から取得されてもよい。
本明細書で使用される生体サンプル（例えば、１つ以上の核酸分子を含む生体サンプル）は、反応容器に提供される場合、精製されなくてもよい。更に、１つ以上の核酸分子を含む生体サンプルに関しては、生体サンプルが反応容器に提供されるときに、１つ以上の核酸分子が抽出されなくてもよい。例えば、生体サンプルを反応容器に供給する際に、生体サンプルから生体サンプルのリボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を抽出しなくてもよい。また、生体サンプルを反応容器に供給する際に、生体サンプル中に存在するターゲット核酸（例えば、ターゲットＲＮＡ又はターゲットＤＮＡ分子）を濃縮しなくてもよい。或いは、生体サンプルを精製してもよく及び／又は核酸分子を生体サンプル中の他の材料から単離してもよい。
本明細書中に記載の生体サンプルは、ターゲット核酸を含有し得る。本明細書中で使用される「鋳型核酸」、「ターゲット核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸フラグメント」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、及び、「核酸」という用語は、一般に、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）もしくはリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）又はそれらの類似体などの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、互換的に使用され得る。核酸は、任意の三次元構造を有してもよく、既知又は未知の任意の機能を果たしてもよい。核酸分子は、少なくとも約１０核酸塩基（「塩基」）、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３、ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ又はそれを超える長さを有し得る。オリゴヌクレオチドは、一般に、４つのヌクレオチド塩基、すなわち、アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；及び、チミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミン（Ｔ）についてはウラシル（Ｕ））の特定の配列から構成される。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の（１又は複数の）非標準ヌクレオチド、（１又は複数の）ヌクレオチド類似体及び／又は修飾ヌクレオチドを含み得る。核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（例えば、剪断ｇＤＮＡなどのｇＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ、遺伝子又は遺伝子フラグメントのコード領域又は非コード領域、連結分析から定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。核酸は、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、核酸の構築の前又は後に行なわれ得る。核酸のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。核酸は、重合後に、例えばレポーター剤とのコンジュゲーション又は結合によって更に修飾され得る。
本明細書に記載のターゲット核酸又はサンプル核酸を増幅して増幅産物を生成することができる。ターゲット核酸は、ターゲットＲＮＡ又はターゲットＤＮＡであってもよい。ターゲット核酸がターゲットＲＮＡである場合、ターゲットＲＮＡは、本明細書の他の箇所に記載されるＲＮＡのタイプを含む任意のタイプのＲＮＡであってもよい。ターゲットＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ及び／又は腫瘍ＲＮＡであってもよい。ウイルスＲＮＡは、被検体に対して病原性であってもよい。病原性ウイルスＲＮＡの非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスｎ（ＨＩＶ １１）、オルトミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、又はＨ５Ｎ１）、ヘルペスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎（例えば、外装ＲＮＡ－ＨＣＶウイルス）ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス及び麻疹ウイルスが挙げられる。
生体サンプルは、複数のターゲット核酸分子を含み得る。例えば、生体サンプルは、単一の被検体由来の複数のターゲット核酸分子を含み得る。別の例では、生体サンプルは、第１の被検体由来の第１のターゲット核酸分子及び第２の被検体由来の第２のターゲット核酸分子を含み得る。
本明細書中に記載の方法は、反応容器（例えば、エマルジョン中の液滴、又は複数のウェルのうちのウェル）中で行なわれ得る。任意の適切な反応容器を使用してもよい。反応容器は、内面、外面、並びに場合によっては開放端及び反対側の閉鎖端を含み得る本体を備える。場合によっては、反応容器は、開放端又は閉鎖端を備えなくてもよい。例えば、反応容器は液滴であってもよい。他の場合には、反応容器がキャップを備えてもよく、このキャップは、接触が行なわれると反応容器の開放端が閉じられるように、開放端で本体に接触するように構成されてもよい。キャップは、開放構成及び閉鎖構成で反応容器に付着されたままであるように、反応容器に恒久的に関連付けられてもよい。反応容器が開いているときにキャップが反応容器から分離されるように、キャップが取り外し可能であってもよい。フローセルチャンバ（例えば、油中水型エマルジョン又は複数のウェルを含むフローセルチャンバ）などの反応容器は、１つ以上の入口又は出口を備えてもよく、この入口又は出口は、反応に使用するための試薬を提供及び除去するために使用することができる。試薬は、圧力及び真空制御を介してチャンバの内外に移動させることができる。本明細書で使用される反応容器は、シールされていてもよく、密閉されていてもよい（例えば、シールされたマイクロウェルプレート）。
反応容器は、様々なサイズ、形状、重量、及び、形態のものであってもよい。幾つかの反応容器は、実質的に円形又は楕円形の管状であってもよい。幾つかの反応容器は、長方形、正方形、ダイヤモンド、円形、楕円形、又は三角形の形状であってもよい。反応容器は、規則的な形状又は不規則な形状であってもよい。例えば、液滴（例えば、エマルジョン中の液滴、例えば水性液滴）である反応容器は、実質的に球形であってもよい。反応容器（例えば、マイクロウェルプレート又はフローセルのウェル）の閉じた末端は、先細、丸みを帯びた、又は平坦な表面を有することができる。反応容器の種類の非限定的な例としては、チューブ、ウェル、毛細管、カートリッジ、キュベット、遠心管、液滴又はピペットチップが挙げられる。反応容器は、ガラス、金属、プラスチック、非混和性流体、及びそれらの組み合わせを含むそのような材料の非限定的な例を有する任意の適切な材料から構成され得る。一例では、反応容器は、油などの非混和性流体中の水性液滴などの液滴であってもよい。反応容器は、任意の適切なサイズであってもよい。例えば、反応容器は、少なくとも約１ナノメートル（ｎｍ）、１０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、１ミクロン（μｍ）、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、１０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、又は１センチメートル（ｃｍ）の直径を有するほぼ球形の液滴であってもよい。或いは、反応容器は、少なくとも約１００μｍ、１ｍｍ、５ｍｍ、又は１０ｍｍの直径を有するウェルであってもよい。ウェルの深さは、ウェルの直径と同じであっても異なっていてもよい。例えば、ウェルは、約５ｍｍの直径及び約１０ｍｍの深さを有することができる。
反応容器は、反応容器の集合体又はアレイの一部であってもよい。反応容器の集合体又はアレイは、方法の自動化及び／又は複数のサンプルの同時処理に特に有用であり得る。反応容器は、多数のウェルからなるマイクロウェルプレートのウェルであってもよい。反応容器は、サーモサイクラーのサーマルブロックのウェル内に保持されてもよく、サーマルサイクルのブロックは、それぞれがサンプル容器を受けることができる複数のウェルを含む。反応容器（例えば、液滴又はマイクロウェル）から構成される集合体又はアレイは、任意の適切な数の反応容器を含んでもよい。反応容器の集合体又はアレイは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０，１００，２００，３００，４００，５００、１，０００、１万個又はそれ以上の容器を含み得る。例えば、反応容器の集合体又はアレイは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３５、４８、９６，１４４，３８４個、又はそれ以上の反応容器を含み得る。流体ハンドリングデバイスが反応容器を正しく識別し、適切な流体材料を反応容器に分注することができるように、反応容器の集合体又は一連の反応容器（例えば、マイクロウェル）の反応容器部分は、流体ハンドリング装置によって個別にアドレス指定することもできる。流体ハンドリング装置は、反応容器への流体材料の添加を自動化するのに有用であり得る。
場合によっては、１つ以上の反応容器が別の反応容器内に含まれてもよい。例えば、ビーカー、試験管、フローセルチャンバ、又は他の容器などの容器に複数の液滴が含まれてもよく、或いは、フローセルチャンバなどの容器に（例えば、マイクロウェルプレート又はフローセルの）複数のウェルが含まれてもよい。一例では、核酸反応がフローセル上で直接起こり得るように、複数のウェルをフローセルチャンバの表面に設けることができる。別の例では、１つ以上の液滴が、容器の表面などの所定の領域に物理的に拘束されてもよい。液滴は、例えば、容器の材料（例えば、表面）と液滴内に含まれる材料（例えば、常磁性ビーズ又はビーズに結合した磁気標識）との間の磁気引力を介して又は光学ピンセットの使用を介してなど、電磁力を介して物理的に拘束され得る。一例では、液滴は（例えば、マイクロウェルプレート又はフローセルの）ウェル内に拘束され得る。
本明細書で使用される反応容器（例えば、液滴又はウェル）は、複数の熱ゾーンを含み得る。反応容器内の感熱性層状材料を用いて、反応容器内に熱ゾーンを形成することができる。そのような場合、感熱性積層材料の加熱を使用して、１つの熱ゾーンから次のゾーンに反応混合物を放出することができる。反応容器は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０又はそれ以上の熱ゾーンを含み得る。反応容器内の熱ゾーンは、反応容器の異なる領域を異なる温度サイクル条件に曝露することによって達成され得る。例えば、フローセルチャンバの異なる領域（例えば、複数のウェル及び／又は液滴を含む）は、異なる温度サイクル条件に供されてもよい。或いは、反応容器のアレイ又は集合体のうちの１つ以上の反応容器は、１つ以上の異なる熱ゾーンに供されてもよい。例えば、反応容器の第１のセットを第１の熱ゾーン内に配置することができ、反応容器の第２のセットを第２の熱ゾーン内に配置することができる（例えば、様々な反応容器を物理的に分離することによって）。これに代えて又は加えて、反応容器のアレイ又は集合体のうちの１つ以上の反応容器は、複数の異なる温度（例えば、プロセス全体の異なる時間に）に晒されてもよい。反応容器に適用される温度は、例えば、核酸反応の初期化、核酸分子のアニーリング、アニーリングされた核酸分子の伸長（例えば、プライマー伸長）、二本鎖核酸配列又はその一部の部分的又は完全な変性又は任意の他の有用なプロセスに適し得る。例えば、温度は、熱サイクリングプロトコルに従って制御されてもよい。一例において、反応容器の全部又は一部は、第１の時間に第１の期間にわたって第１の温度に晒されてもよく、反応容器又はその一部は、その後、第２の時間に第２の期間にわたって第２の温度に晒されてもよい。第１の温度は、例えば、核酸反応の初期化（例えば、ＰＣＲ）又は第１の核酸分子の第２の核酸分子へのアニーリング（例えば、ハイブリダイゼーション）に適した温度であってもよい。第２の温度は、例えば、アニーリングされた核酸分子（例えば、プライマー分子）の伸長及び／又はアニーリングされた核酸分子の変性に適した温度であってもよい。更なる異なる温度を適用することもできる。温度は、任意の適切な回数（例えば、任意の数の熱サイクルにわたって）繰り返されてもよい。
本明細書中に記載の「ビーズ」という用語は、一般に、任意の形状及び寸法の固体担体、樹脂、ゲル（例えば、ヒドロゲル）、コロイド、又は、粒子を指す。ビーズは、ガラス又はセラミック、１つ以上のポリマー、及び／又は、金属などの任意の適切な材料を含んでもよい。適切なポリマーの例としては、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、セルロース、セルロース誘導体、又はデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。適切な金属の例としては、常磁性金属、例えば鉄が挙げられる。ビーズは、磁性又は非磁性であってもよい。例えば、ビーズは、１つ以上の磁気標識を有する１つ以上のポリマーを含み得る。磁気ビーズは、電磁力を使用して操作されてもよい（例えば、位置間で移動されてもよく又は例えばフローセルチャンバなどの反応容器の所定の位置に物理的に拘束されてもよい）ビーズは、直径を含む１つ以上の異なる寸法を有することができる。ビーズの寸法（例えば、ビーズの直径）は、約１ｍｍ未満、約０．１ｍｍ未満、約０．０１ｍｍ未満、約０．００５ｍｍ未満、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１μｍ～約１００μｍ、又は約１ｍｍ～約１００ｍｍであってもよい。ビーズの集合体は、同じ又は異なる特性を有する１つ以上のビーズを含み得る。例えば、ビーズの集合体のうちの第１のビーズが第１の直径を有してもよく、ビーズの集合体のうちの第２のビーズが第２の直径を有してもよい。第１の直径は、第２の直径と同じであってもよく又はほぼ同じであってもよく又は異なっていてもよい。同様に、第１のビーズは、第２のビーズと同じ又は異なる形状及び組成を有してもよい。一例では、第１のビーズが第１のポリマー材料を含んでもよく、第２のビーズが第２のポリマー材料を含んでもよい。第１のポリマー材料は、第２のポリマー材料と同じであっても異なっていてもよい。第１のビーズは、それに結合した第１のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）などの第１の材料を含んでもよく、第２のビーズは、それに結合した第２のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）などの第２の材料を含んでもよい。第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、第１のプライマー）は、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、第２のプライマー）と同じ核酸配列又は異なる核酸配列を有し得る。ある場合には、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、第１のプライマー）は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含んでもよく、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、第２のプライマー）は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列を含んでもよい。第１及び第３の核酸配列が同じであってもよい。例えば、第１及び第３の核酸配列がバーコード配列であってもよい。第２及び第４の核酸配列が異なっていてもよい。例えば、第２及び第４の核酸配列は、異なる機能を果たすように構成された機能配列であってもよい。第２及び第４の核酸配列は、本明細書に記載されるように、異なる核酸分子を捕捉するように構成されたプライマー（例えば、キャプチャ）配列であってもよい。一例において、第１のビーズは、それに結合した複数の第１のオリゴヌクレオチド（例えば、第１のプライマー）を有してもよく、第２のビーズは、それに結合した複数の第２のオリゴヌクレオチド（例えば、第２のプライマー）を有してもよく、複数の第１のオリゴヌクレオチドのうちの所定の第１のオリゴヌクレオチドは、第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含み、複数の第２のオリゴヌクレオチドのうちの所定の第２のオリゴヌクレオチドは、第３の核酸配列及び第４の核酸配列を含む。第１及び第３の核酸配列が同じであってもよい（例えば、バーコード配列）。第２及び第４の核酸配列が異なっていてもよい（例えば、異なる機能配列）。ある場合には、第１のビーズに結合された複数の第１のオリゴヌクレオチドの第２の核酸配列が変化してもよく、及び／又は、第２のビーズに結合された複数の第１のオリゴヌクレオチドの第４の核酸配列が変化してもよい。例えば、第２の核酸配列及び／又は第４の核酸配列は、様々な鋳型核酸分子を捕捉するのに適し得るランダムなＮ－ｍｅｒであってもよい。ビーズに結合されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は、任意の有用な塩基組成及び長さの任意の有用な配列を有し得る。ある場合には、ビーズに結合されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は、カノニカルヌクレオチドのみを含み得るが、他の場合、ビーズに結合されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含み得る。核酸配列は、１つ以上の標識又は色素、例えば１つ以上の蛍光標識、色素、磁気標識、高周波標識、又は他のタグを含み得る。ビーズに結合されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は、複製ブロック、開裂可能な塩基、又は可逆的ターミネーターなどの１つ以上の更なる特徴を含み得る。
本明細書で使用される場合、「プライマー」又は「プライマー分子」という用語は、一般に、鋳型核酸分子の一部に対して相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、プライマーは、鋳型核酸分子の鎖の一部に対して相補的であってもよい。プライマーは、核酸反応（例えば、ＰＣＲなどの核酸増幅反応）の成分であり得るプライマー伸長反応などの、核酸合成のための出発点としての機能を果たす核酸の鎖であってもよい。プライマーは鋳型鎖にハイブリダイズしてもよく、その後、時としてポリメラーゼなどの重合酵素を用いて、ヌクレオチド（例えば、カノニカルヌクレオチド又はヌクレオチド類似体）がプライマーの（１つ又は複数の）末端に付加されてもよい。したがって、ＤＮＡサンプルの複製中、複製を触媒する酵素は、ＤＮＡサンプルに付着したプライマーの３’末端で複製を開始し、反対の鎖をコピーし得る。プライマー（例えば、オリゴヌクレオチド）は、プライマーをビーズ又は粒子などの担体又はキャリアに結合するために使用され得る１つ以上の官能基を有し得る。
プライマーは、鋳型核酸に対して完全に又は部分的に相補的であってもよい。プライマーは、鋳型核酸に対して配列同一性又は相同性又は相補性を示し得る。プライマーと鋳型核酸との間の相同性又は配列同一性又は相補性は、プライマーの長さに基づき得る。例えば、プライマー長が約２０個の核酸である場合、プライマーは鋳型核酸に対して相補的な１０個以上の連続する核酸塩基を含有し得る。
プライマーと鋳型核酸との間の相補性又は相同性又は配列同一性が限定されてもよい。プライマーの長さは、８ヌクレオチド塩基～５０ヌクレオチド塩基であってもよい。プライマーの長さは、２ヌクレオチド塩基超、３ヌクレオチド塩基超、４ヌクレオチド塩基、５ヌクレオチド塩基、６ヌクレオチド塩基、７ヌクレオチド塩基、８ヌクレオチド塩基、９ヌクレオチド塩基、１０ヌクレオチド塩基、１１ヌクレオチド塩基、１２ヌクレオチド塩基、１３ヌクレオチド塩基、１４ヌクレオチド塩基、１５ヌクレオチド塩基、１６ヌクレオチド塩基、１７ヌクレオチド塩基、１８ヌクレオチド塩基、１９ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基、２１ヌクレオチド塩基、２２ヌクレオチド塩基、２３ヌクレオチド塩基、２４ヌクレオチド塩基、２５ヌクレオチド塩基、２６ヌクレオチド塩基、２７ヌクレオチド塩基、２８ヌクレオチド塩基、２９ヌクレオチド塩基、３０ヌクレオチド塩基、３１ヌクレオチド塩基、３２ヌクレオチド塩基、３３ヌクレオチド塩基、３４ヌクレオチド塩基、３５ヌクレオチド塩基、３７ヌクレオチド塩基、４０ヌクレオチド塩基、４２ヌクレオチド塩基、４５ヌクレオチド塩基、４７ヌクレオチド塩基又は５０ヌクレオチド塩基であってもよい。プライマーの長さは、５０ヌクレオチド塩基、４７ヌクレオチド塩基、４５ヌクレオチド塩基、４２ヌクレオチド塩基、４０ヌクレオチド塩基、３７ヌクレオチド塩基、３５ヌクレオチド塩基、３４ヌクレオチド塩基、３３ヌクレオチド塩基、３２ヌクレオチド塩基、３１ヌクレオチド塩基、３０ヌクレオチド塩基、２９ヌクレオチド塩基、２８ヌクレオチド塩基、２７ヌクレオチド塩基、２６ヌクレオチド塩基、２５ヌクレオチド塩基、２４ヌクレオチド塩基、２３ヌクレオチド塩基、２２ヌクレオチド塩基、２１ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基、１９ヌクレオチド塩基、１８ヌクレオチド塩基、１７ヌクレオチド塩基、１６ヌクレオチド塩基、１５ヌクレオチド塩基、１４ヌクレオチド塩基、１３ヌクレオチド塩基、１２ヌクレオチド塩基、１１ヌクレオチド塩基、１０ヌクレオチド塩基、９ヌクレオチド塩基、８ヌクレオチド塩基、７ヌクレオチド塩基、６ヌクレオチド塩基、５ヌクレオチド塩基、４ヌクレオチド塩基、３ヌクレオチド塩基又は２ヌクレオチド塩基未満であってもよい。
「％配列同一性」という用語は、本明細書では「％同一性」という用語と互換的に使用されてもよく、配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合の２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列同一性のレベルを指し得る。本明細書で使用される８０％同一性は、定義されたアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同じものとなり得るものであり、所定の配列が別の配列の別の長さと少なくとも８０％同一であることを意味する。％同一性は、例えば、所定の配列に対する少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上の配列同一性から選択され得る。％同一性は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は、約９５％～約９９％の範囲であってもよい。
「％配列相同性」又は「パーセント配列相同性」又は「パーセント配列同一性」という用語は、本明細書では「％相同性」、「％配列同一性」又は「％同一性」という用語と互換的に使用されてもよく、配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合の２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列相同性のレベルを指し得る。例えば、本明細書中で使用される場合、８０％相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定される８０％配列相同性と同じものであってもよく、したがって、所定の配列の相同体は、所定の配列の長さにわたって８０％を超える配列相同性を有する。％相同性は、例えば、所定の配列に対する少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上の配列相同性から選択され得る。％相同性は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約９９％の範囲であってもよい。
本明細書中で使用される場合、「プライマー伸長反応」という用語は、一般に、鋳型核酸の鎖に対するプライマーの結合、それに続く（１又は複数の）プライマーの伸長を指す。また、「プライマー伸長反応」という用語は、二本鎖核酸の変性及び変性した鋳型核酸鎖の一方又は両方に対するプライマー鎖の結合、その後の（１又は複数の）プライマーの伸長を含み得る。プライマー伸長反応を使用して、酵素（例えば、ポリメラーゼなどの重合酵素）を使用することによって鋳型指向様式でヌクレオチド又はヌクレオチド類似体をプライマーに組み込むことができる。プライマー伸長反応は、核酸増幅反応のプロセスであってもよい。
本明細書中で使用される「アダプター」という用語は、一般に、例えばターゲット核酸分子と相互作用して配列決定（例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ））を促進することによって、配列決定機器がターゲットポリヌクレオチドを配列決定できるようにするようになっている分子（例えば、ポリヌクレオチド）を指す。配列決定アダプターは、配列決定機器によってターゲット核酸分子を配列決定できるようにし得る。例えば、配列決定アダプターは、ビーズ又はフローセルなどの配列決定システムの固体担体に付着したキャプチャポリヌクレオチドにハイブリダイズ又は結合するヌクレオチド配列を含み得る。配列決定アダプターは、配列決定システムによってターゲットポリヌクレオチドを配列決定できるようにするヘアピンループを生成するためにポリヌクレオチドにハイブリダイズ又は結合するヌクレオチド配列を含み得る。配列決定アダプターは、別の分子（例えば、ポリヌクレオチド）のフローセル配列に対して相補的であり且つターゲットポリヌクレオチドを配列決定するために配列決定システムによって使用可能なヌクレオチド配列であってもよいシーケンサーモチーフを含み得る。また、シーケンサーモチーフは、合成による配列決定などの配列決定に使用するためのプライマー配列を含み得る。シーケンサーモチーフは、ライブラリーアダプターを配列決定システムに結合するための（１又は複数の）配列を含んで、ターゲットポリヌクレオチド（例えば、サンプル核酸）を配列決定することができる。
本明細書中に記載されるように、アダプターは、第１のサブパート及び第２のサブパートを有することができる。第１のサブパート及び第２のサブパートは、配列相補性を有し得る。本明細書中に記載のアダプターは、ペアエンド配列リードを生成するのに有用なペアエンドアダプターであってもよい。
本明細書中で使用される「ポリメラーゼ」、「重合酵素」、又は、「ポリメライゼーション酵素」という用語は、一般に、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指し、互換的に使用され得る。重合酵素を使用して、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を組み込んでプライマーを伸長させることができる。ポリメラーゼの例としては、限定されないが、核酸ポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、天然に存在していてもよく又は合成されていてもよい。ポリメラーゼの例は、Φ２９ポリメラーゼ又はその誘導体である。ポリメラーゼは、重合酵素であってもよい。転写酵素又はリガーゼも使用され得る（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、修飾ポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼΦ２９（ｐｈｉ ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼＰｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｅｘ－Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｗポリメラーゼ、ＳｓｏポリメラーゼＰｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、ＭｔｈポリメラーゼＥＳ ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、白金Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏボポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、及び、その変異体、修飾産物及び誘導体が挙げられる。ポリメラーゼは、単一サブユニットポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、高い加工性、すなわち、核酸鋳型を放出することなく核酸鋳型にヌクレオチドを連続的に組み込むポリメラーゼの能力を有し得る。
本明細書で使用される「少なくとも部分的に」という用語は、一般に、全体の量の任意の一部分を指す。例えば、「少なくとも部分的に」は、全体の量の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９．９％を指し得る。
本明細書で使用される「バーコード」又は「バーコード配列」という用語は、一般に、１つ以上の特定の核酸を同定するために使用され得る１つ以上のヌクレオチド配列を指す。バーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のヌクレオチド（例えば、連続ヌクレオチド）を含み得る。バーコードは、少なくとも約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００又はそれを超える連続ヌクレオチドを含み得る。増幅及び／又は配列決定プロセス（例えば、ＮＧＳ）に使用されるバーコードは全て異なっていてもよい。バーコードを含む核酸の集団における異なるバーコードの多様性は、ランダムに生成されても非ランダムに生成されてもよい。
バーコードは、１つ以上のセグメントから構成され得る。例えば、バーコードは、第１の核酸配列を有する第１のセグメントと、第２の核酸配列を有する第２のセグメントとを含み得る。第１の核酸配列は、第２の核酸配列と同じであっても異なっていてもよい。複数のセグメントを含むバーコード配列は、スプリットプール方式に従って組み合わせ形態で組み立てられてもよく、このスプリットプール方式では、複数の異なる第１のセグメントが複数の第１のパーティション間で分配され、その内容物は、その後、プールされて複数の第２のパーティション間で分配される。その後、複数の異なる第２のセグメントが、複数の第２のパーティション間で分配されて、複数の第２のパーティション内の複数の異なる第１のセグメントに連結され、その後、複数の第２のパーティションの内容物がプールされる。プロセスは、任意のレベルのバーコード多様性を与えるために、任意の数の異なるセグメント及びパーティションを使用して任意の回数繰り返すことができる。ある場合には、バーコード配列の第１のセグメントがビーズに結合され得る。
本明細書中に記載されるように、バーコードの使用は、次世代配列決定技術を使用して複数のサンプルのハイスループット分析を可能にし得る。複数の核酸分子を含むサンプルは、複数のパーティション（例えば、エマルジョン中の液滴）全体に分布していてもよく、各パーティションは、固有のバーコード配列を含む核酸バーコード分子を含む。サンプルは、複数のパーティションのうちの全て又は大部分のパーティションが複数の核酸分子のうちの少なくとも１つの核酸分子を含むように分割され得る。その後、所定のパーティションの核酸分子及び核酸バーコード分子を使用して、核酸分子の少なくとも１つの配列の１つ以上のコピー及び／又は相補体を（例えば、核酸増幅反応を介して）生成することができ、このコピー及び／又は相補体は、核酸バーコード分子のバーコード配列又はその相補体を含む。その後、様々なパーティションの内容物（例えば、増幅産物又はその誘導体）をプールし、配列決定に供することができる。ある場合には、核酸バーコード分子がビーズに結合され得る。そのような場合、コピー及び／又は相補体もビーズに結合され得る。核酸バーコード分子並びにコピー及び／又は相補体は、配列決定機器を使用して核酸配列決定を容易にするためにパーティション内又はプール後にビーズから放出され得る。複数の核酸分子のうちの核酸分子のコピー及び／又は相補体はそれぞれ固有のバーコード配列又はその相補体を含むため、核酸配列決定アッセイを使用して取得された配列決定リードは、それらが対応する複数の核酸分子のうちの核酸分子と会合され得る。この方法は、複数のパーティション間で分割された細胞内に含まれる核酸分子及び／又は複数の異なるサンプルに由来する核酸分子に適用され得る。
幾つかの態様では、本明細書において、パーティションが複数のビーズを含むシステム、方法及び組成物が提供される。幾つかの態様では、本明細書において、パーティションが２つ以上の検体（例えば、核酸分子、例えば鋳型核酸分子）を含むシステム、方法、及び組成物が提供される。有益なことに、本開示のシステム、方法、及び組成物は、下流側処理をうまく行なうために（例えば、シングルビーズを用いる、単一検体を用いる）内容物の単一装填に依存する必要がない。有益には、本開示のシステム、方法、及び組成物は、ポアソン分布に従って（例えば、シングルビーズを用いて、単一検体を用いて）最大でも単一に装填されるパーティションを形成することに依存する必要がなく、これは、多くの場合、かなりの数のパーティションが特定のリソース（例えば、ビーズ、検体、試薬など）を消費するが特定の他のリソース（例えば、ビーズ、検体）のうちの１つ以上の欠如（又はそうでなければ誤った数もしくは誤った組成）に起因して有用ではないリソースの浪費をもたらし得る。幾つかの例では、有益には、本開示のシステム、方法及び組成物は、単一装填に依存するシステム、方法及び組成物よりも高い効率及び／又は高い出力を達成することができる。
方法
本開示は、生体サンプルを分析及び／又は処理するための方法を提供する。特に、本開示は、１つ以上の核酸分子（例えば、複数の核酸分子）を含む核酸サンプルを分析及び／又は処理する方法を提供する。核酸サンプル（例えば、生体サンプル又は無細胞生体サンプル）は、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子などの複数の核酸分子を含み得る。本明細書中に開示される生体サンプルを分析及び／又は処理する方法は、複数のパーティション（例えば、複数の液滴を含むエマルジョンを生成することなどによって、複数のウェル又は液滴）を生成することを含むことができ、各パーティション（例えば、液滴又はウェル）は、（ｉ）複数のビーズ及び（ｉｉ）少なくとも１つの核酸分子（例えば、生体サンプルのターゲット核酸分子）を含み得る。また、複数のパーティションの所定のパーティションは、１つ以上の試薬を含み得る。
場合によっては、複数のパーティションのうちの１つのパーティション（例えば、所定のパーティション）は、少なくとも２つのビーズを含み得る。したがって、本開示の方法は、エマルジョン中の液滴などのパーティション内部の核酸分子に対するビーズの比率（例えば、２以上又は４以上の比率など）を増加させることができる。複数のパーティションのうちの第１のパーティションの少なくとも１つの核酸分子は、複数のパーティションのうちの第２のパーティションの少なくとも１つの核酸分子と異なっていてもよい（例えば、異なるヌクレオチド配列を有する）。例えば、第１のパーティションの少なくとも１つの核酸分子は、第１の生体サンプル（例えば、第１の被検体からのもの）に由来してもよく、第２のパーティションの少なくとも１つの核酸分子は、第２の生体サンプル（例えば、第２の被検体又は第１の被検体からのものであるが、異なる時間に又は異なる方法を介して採取されたもの）に由来し得る。別の例では、第１のパーティションの少なくとも１つの核酸分子は、生体サンプルからの第１の細胞に由来してもよく、第２のパーティションの少なくとも１つの核酸分子は、同じ生体サンプルからの第２の細胞に由来し得る。或いは、複数のパーティションのうちの第１のパーティションの少なくとも１つの核酸分子は、複数のパーティションのうちの第２のパーティションの少なくとも１つの核酸分子と同一（例えば、同一のヌクレオチド配列を有する）又はほぼ同一（例えば、高い配列相補性を有する）であってもよい。
複数のパーティションのうちの１つのパーティション内に配置された少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つの核酸分子の１つ以上の増幅産物を生成することによって、パーティション内（例えば、エマルジョン中の液滴の内部）で増幅され得る。増幅プロセス及び／又は配列決定プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して行なうことができる。増幅プロセスは、少なくとも１つの核酸分子がビーズに付着され（例えば、共有又は非共有連結され）る間又は少なくとも１つの核酸分子がビーズに付着していない間に実施され得る。例えば、少なくとも１つの核酸分子がパーティション内に含まれる少なくとも２つのビーズのうちの１つのビーズに付着される間に、少なくとも１つの核酸分子の１つ以上の増幅産物が複数のパーティションの１つのパーティション内で生成され得る。複数のパーティションの内容物がプールされてもよい（例えば、核酸分子並びに対応する増幅産物及びビーズは、エマルジョン中の複数の液滴のうちの液滴から放出され得る）。複数のパーティションのうちのパーティションからビーズ－核酸分子複合体（又は複数の複合体）が放出されると、ビーズ－核酸分子複合体（又は複数の複合体）が他の材料から（例えば、エマルジョンの複数の液滴のうちの液滴のプールされた内容物から）分離され（例えば、磁気的に分離され）得る。続いて、形成されてしまった可能性のある複数のパーティションのうちの１つのパーティションの少なくとも１つの核酸分子もしくはそれに対応する任意の増幅産物又はその誘導体をアッセイ又は分析することができる（例えば、シーケンサーにおいてヌクレオチド配列を決定することによって）。
図１は、一般的な次世代配列決定（ＮＧＳ）手法の概略図を描き、遺伝物質が分析から逃れることができ、及び／又は潜在的なノイズ源及び突然変異が導入され得るワークフローの部分を示す。生体サンプルを提供することができる（１０１）。例えば、生体サンプルは、ｃｆＤＮＡ及び剪断ｇＤＮＡなどの適切なサイズのＤＮＡを含み得る。生体サンプルは、稀な変異体を含む全材料を表わす限られた入力（１１１）であってもよい。生体サンプルは、アダプターライゲーション（１０２）に供され得る。このプロセスの間、ゲノム材料は、不完全なライゲーション及び非生産的なアダプターの組み合わせなどのために失われ得る（１１２）。アダプター連結サンプルをＰＣＴ増幅に供してもよく（１０３）、これにより、コピー数及び突然変異の増加をもたらし得る（１１３）。産物は、エマルジョンＰＣＲ（１０４）などによるクローン増幅に供され得る。このプロセスの間に、二重ポアソン装填スキーム、混合鋳型のクローンコピーを最小化するための最適化スキームなどにより、より多くの材料が失われる可能性があり、突然変異数が増加する可能性がある（１１４）。クローン増幅産物を配列決定に供することができる（１０５）。このプロセス中、一般的なノイズ及び信号減衰（１１５）からエラーが生じる可能性がある。図２は、ワークフローに対する修正が収率（例えば、分析された生体サンプルから得られた情報の量）を増加させて核酸分析中のノイズ及び突然変異の確率を低下させ得る、図１の概略図の修正バージョンを描く。生体サンプルを提供することができる（２０１）。この準備の間、ＰＣＲ濃縮を行なうことにより、サンプル損失を低減することができる（２１１）。場合によっては、突然変異率が増加し得る。生体サンプルは、アダプターライゲーション（２０２）に供され得る。このプロセスの間、ランダム化された識別子を有するアダプターが使用されてもよい。場合によっては、ペアエンドアダプターが使用されてもよい（２１２）。配列決定中（例えば、２０５）、そのようなアダプターは、複数のリードの必要性を低減又は排除し得る。アダプター連結サンプルをＰＣＴ増幅に供してもよく（２０３）、その間に突然変異をランダム化識別子によって修正することができる（２１３）。産物は、エマルジョンＰＣＲ（２０４）などによるクローン増幅に供され得る。このプロセスの間、ライブラリー鋳型ごとに複数のビーズを使用することができ（２１４）、これにより鋳型損失を最小限に抑えることができる。クローン増幅産物を配列決定に供することができる（２０５）。このプロセスの間、複数のリード及び／又はペアエンドリードが処理され得る（２１５）。ある場合には、１ライブラリー鋳型当たり複数のビーズ（例えば、２１４）を使用することにより、複数のリードを生成する必要性及び／又はランダム化された識別子を使用してＰＣＲ増幅由来変異を補正する必要性が低減又は排除され得る。本明細書で提供される方法は、核酸増幅及び配列決定を強化するための一般的なＮＧＳ手法に対する修正を導入する。本開示の方法の利点は、パーティション（例えば、液滴）内の核酸分子に対するビーズの比率（例えば、＞２）を増大させることができることであり、これは、例えば、所定の核酸分子のより高いクローンコピー数及び減少したサンプル又は鋳型損失に起因して、サンプル分析中の精度及び感度の向上をもたらし得る。
本明細書で使用される「二重ポアソン」という用語は、一般に、２つの異なる種類の項目からの単一の個別の項目をランダムサンプリングによってパーティションに分配する統計的困難性を指す。一般に、それぞれの種の装填はポアソン統計によって支配される。Ｍ個の等しいパーティション間にランダムに分布したＮ個の項目の所定のケースの場合、パーティションに見られる相対母集団は、パーティションに対する項目の比率λに依存する。
Figure 2022519324000002
。
項目の２つの種が別々にパーティションに分配される場合、それぞれがそれ自体のポアソン分布に従うことになり、それにより、二重ポアソン分布がもたらされ、せいぜい、各種の単一インスタンスを有するパーティションの小部分がもたらされる。パーティションに対する項目の比率λが与えられると、ｎ個の項目を含むパーティションの確率は、以下のように計算することができる。
Figure 2022519324000003
。
単一のポアソンプロセスの場合、パーティションごとに１つの装填で１つの項目のみを有するパーティションの割合は、次のように計算される。
Ｐ（ｎ＝１｜λ＝１）＝１／ｅ≒３６．８％。
これは、導関数
Figure 2022519324000004
を設定して任意のｎに関してｎ＝λの場合に極値が生じることに留意することによって導出することができる。これは、項目の３６．８％にも相当する。２つの種ａ及びｂがパーティションに装填される場合、分布は次の通りである。
Figure 2022519324000005
。
これを、それぞれの種ごとにλ＝１に関して以下の表１にまとめる。この場合、１／ｅ２≒１３．５％のパーティションのみが、種ａ及びｂのそれぞれの単一の項目を有する。
Figure 2022519324000006
本開示で企図されるように、核酸鋳型の種（例えば、ａ）及びビーズの種（例えば、ｂ）が液滴（例えば、パーティション）に分割される場合、鋳型、ビーズ、パーティション及び陽性ビーズ（少なくとも１つの鋳型を有するパーティション中のビーズ）の相対コストは実質的に変動し得るため、λｔｅｍｐｌａｔｅ及びλｂｅａｄに関する最適値は、コストを最小化して効率を高めるように最適化され得る。例えば、パーティション及びビーズがより低いコストで重み付けされてもよく、鋳型及び陽性ビーズがより高いコストで重み付けされてもよい。そのような最適化は、液滴及びビーズにコストがかかる鋳型を液滴に装填することができないなど、異なる故障事象のコストを考慮することができる。しかしながら、この場合、ビーズはネガティブビーズ（鋳型を含まないパーティションのビーズ）であるため、陰性ビーズを洗い流す濃縮ステップ後に更なるコストは評価されない。別の故障事象では、パーティションに２つ以上の鋳型及び１つ以上のビーズが装填され、それにより、鋳型及びビーズのコストがかかり、更に下流側の処理コストを招く可能性があるポリクローナル（混合鋳型を含む）である１つ以上の陽性ビーズが作成される。
本明細書で提供される方法に従って使用するための生体サンプルは、固体生体サンプル（例えば、生検サンプルなどの組織サンプル）又は液体生体サンプル（例えば、血液などの体液から）であってもよい。生体サンプルは、複数の核酸分子を含み得る。ある場合には、生体サンプルは、複数の核酸分子を含む複数の細胞を含み得る。他の場合では、生体サンプルは無細胞生体サンプル（例えば、本明細書に記載されるように）であってもよい。生体サンプルを処理して、細胞物質及び／又は他の残屑を除去し、細胞を単離及び／又は溶解し、試薬を添加又は除去し、或いはその後の処理のために生体サンプルを調製することができる。例えば、生体サンプルは、無細胞生体サンプルを提供するために処理され得る。本明細書に開示される方法を用いて分析され得る核酸分子は、無細胞核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ又はｃｔＤＮＡ）であってもよい。無細胞核酸分子は、生物又は被検体の特定の組織又は器官、例えば癌性組織に由来していてもよく、低濃度から非常に低濃度（例えば、＜１０ｎｇ／ｍＬ）でサンプル中に存在していてもよい。
本明細書に開示される生体サンプルを分析する方法は、極性及び粘度などの同じ又は異なる物理化学的特性を有する２つ以上の溶媒、液体、又は流体を接触させること（例えば、混合又は組み合わせ）を含み得る。２つ以上の材料を接触させると、複数の液滴（例えば、油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョン）を含むエマルジョンが生成され得る。２つ以上の材料（例えば、液体）は、非混和性であってもよい。本明細書に開示される方法は、第１の極性を有する（例えば、特定の第１の親水性又は親油性を有する）第１の材料（例えば、溶媒又は溶液）を、第２の極性を有する（例えば、特定の第２の親水性又は親油性を有する）第２の材料（例えば、溶媒又は溶液）と接触させることを含み得る。第１の材料（例えば、水溶液）の極性は、第２の材料（例えば、油などの非極性流体）の極性と同一であってもよく、類似していてもよく、又は異なっていてもよい。本明細書に開示されるように、第１の材料は水溶液であってもよく、第２の材料は油であってもよい。水溶液が油と接触すると、エマルジョンが形成され得る（例えば、液滴生成接合部で）。エマルジョンは、分散相と連続相とを有していてもよい。
一般に、本開示の方法は、水性分散相及び連続油相を含むエマルジョンを含む。したがって、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子、複数のビーズ、及び複数の試薬を含む水溶液と油とを接触させて、複数の核酸分子の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）、複数のビーズのビーズ、及び複数の試薬の試薬を含む複数の水性液滴を生成することを含み得る。ある場合には、複数の核酸分子は、複数の水性液滴が複数の細胞を含み得るように、複数の細胞内に含まれ得る。幾つかの例では、液滴は１つ以下の細胞を含み得る。場合によっては、同じ相の１つ以上の液滴を組み合わせてもよい。例えば、複数の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）を含む複数の第１の液滴（例えば、水性液滴）を、複数のビーズ及び／又は試薬を含む複数の第２の液滴（例えば、水性液滴）と組み合わせて（例えば、併合又は合体される）、複数の核酸分子並びに複数のビーズ及び／又は試薬を含む複数の第３の液滴（例えば、水性液滴）を提供することができる。第１及び第２の複数の液滴は、同じ材料（例えば、極性などの同じ特性を有する）を含んでもよく、又は異なる材料（例えば、異なる極性などの異なる特性を有する）であってもよい。他の場合では、複数の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）を含む第１の材料（例えば、水溶液）を、複数のビーズ及び／又は試薬を含む第２の材料（例えば、水溶液）と組み合わせて、複数の核酸分子並びに複数のビーズ及び／又は試薬を含む第３の材料を提供することができる。その後、第３の材料を、第１及び／又は第２の溶液（例えば、油）と非混和性であってもよい液体又は流体と接触させて（又は接触状態に至らせて）、複数の液滴（例えば、水性液滴）を生成することができる。したがって、第１及び第２の溶液は水溶液であってもよく、第１及び第２の溶液と混和しない第３の液体又は流体は油（又はその任意の誘導体）であってもよい。
液滴は、任意の有用な方法によって生成され得る。例えば、エアロゾル又はエアナイフ液滴発生器を使用して、前駆体流体（例えば、水溶液などの第１の材料）の液滴を別の溶液に分配することによって液滴を生成することができる。マイクロ流体液滴生成方法も使用され得る。例えば、第１の材料（例えば、水溶液）は、液滴生成接合部に向かって第１のチャネル内を流れることができ、液滴生成接合部で、液滴生成接合部に向かって第２のチャネル内を流れる第２の材料（例えば、油）と接触し、そこで液滴が形成され得る。場合によっては、第１の材料の液滴は、第１の材料をノズルに通して第２の材料を含む領域に押し込むことによって形成されてもよい。第１の材料は、水溶液であってもよく、形成された液滴が核酸分子、ビーズ及び／又は試薬を含み得るように、複数の核酸分子、複数のビーズ及び／又は複数の試薬などの１つ以上の要素を含んでもよい。様々な他の構成を使用して液滴を生成することができる。液滴生成方法のそのような構成及び詳細の例は、例えば、米国特許第９，６９４，３６１号及び米国特許出願公開第２０１８／０３３４６７０号に見出すことができ、これらは参照によりその全体が本願に組み入れられる。
場合によっては、複数のパーティション（例えば、液滴）を生成することは、複数の核酸分子を含む第１の水溶液及びビーズ（例えば、その表面に付着したプライマー配列を有するミード）などの複数の粒子を含む第２の水溶液の使用を含み得る。その後、第１の水溶液及び第２の水溶液を、第１及び／又は第２の溶液と非混和性であってもよい第３の液体又は流体（例えば、油）と接触（例えば、液滴生成接合部で）させることができる。この非混和性又は極性の差は、エマルジョン（例えば、油中水性エマルジョン）の形成をもたらし得る。本明細書に記載のエマルジョンは、液滴（例えば、水性液滴）などの複数のパーティションを含み得る。これらの液滴は、ビーズ、核酸分子、及び試薬などの更なる成分を含み得る。ある場合には、本明細書で提供される方法に従って生成された複数の液滴の液滴はそれぞれ、１つ以上の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）、２つ以上のビーズ、及び１つ以上の試薬を含み得る。そのような試薬は、１つ以上の核酸分子に対応する増幅産物が液滴内で生成され得る反応容器として機能し得る。液滴がそれぞれ１つ以上の核酸分子を含む１つ以上の細胞を含む場合、試薬は、その中の１つ以上の核酸分子へのアクセスを提供するために細胞を溶解及び／又は透過処理するための試薬を含み得る。
複数の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）は、第１の溶液（例えば、水溶液）に提供されてもよく、複数のビーズは、第２の溶液（例えば、水溶液）に提供されてもよい。第１及び第２の溶液は、同じ溶液（例えば、両方の水溶液）であってもよいし、異なる溶液であってもよい。複数の核酸分子を含む第１の溶液及び複数のビーズを含む第２の溶液を、第３の液体又は流体（例えば、油）と接触させることができる。第３の液体又は流体は、第１及び第２の溶液の両方と非混和性であってもよく、第１及び第２の溶液（例えば、本明細書に記載されるように、）と接触したときにエマルジョンを形成してもよい。１つ以上の溶液を１つ以上の非混和性流体と接触させることから生じるエマルジョンは、複数のパーティション（例えば、複数の液滴）を形成又は生成することができる。
本明細書に開示されるパーティションは、水性分散相から形成され、連続相（例えば、油）によって封入され得る液滴であってもよい。エマルジョンは、連続相内の分散相粒子（例えば、液滴などのパーティション）のサイズ（例えば、おおよその直径）に応じて、マイクロエマルジョン又はナノエマルジョンであってもよい。場合によっては、パーティションは、第１のパーティションを第２のパーティションから分離する又はパーティションの内部ボリュームをパーティションの外側のボリュームから分離するように構成された任意のユニットを指すことができる。例えば、パーティションは、ウェル、マイクロウェル、容器、チューブ、貯蔵所、レセプタクル又は他の容器であってもよい。
したがって、分割は、本明細書では、複数の液滴（例えば、エマルジョン中の水性液滴）又はウェルの提供として説明され得る。複数の液滴のうちの１つの液滴などの複数のパーティションのうちの１つのパーティションは、１つ以上の核酸分子及び／又は１つ以上の（例えば、２つ以上）ビーズを含む水溶液を含み得る。また、パーティションは、１つ以上の試薬、例えば、細胞を溶解又は透過処理するための１つ以上の試薬、又は増幅反応（例えば、ヌクレオチド、重合酵素など）を行なうための１つ以上の試薬を含み得る。複数のパーティションのうちのパーティションは、異なる構成要素又はその量を含んでもよい。例えば、複数のパーティションのうちの第１のパーティションは、１つ以上の核酸分子を含み、ビーズを含まなくてもよく、複数のパーティションのうちの第２のパーティションは、１つ以上の核酸分子及び２つ以上のビーズを含んでもよい。更に、複数のパーティションのうちの第３のパーティションは、１つ以上の核酸分子及び１つのビーズを含んでもよく、複数のパーティションのうちの第４のパーティションは、１つ以上のビーズを含んでもよく、核酸分子を含まなくてもよい。場合によっては、複数のパーティションのうちの１つ以上のパーティションは、非占有（例えば、核酸分子、ビーズ又は試薬を含まない）であってもよい。パーティション内の材料の分布は、ポアソン分布によって少なくとも部分的に制御されてもよい。場合によっては、液滴内に供給される材料（例えば、核酸分子、ビーズ及び試薬）の量は、様々な溶液中に供給される材料の量並びにマイクロ流体チャネルを通る溶液及び流体の流量を最適化することによって調整することができる。例えば、マイクロ流体チャネルを通る流体又は溶液の流量は、特定の圧力又は真空の適用、及び／又はチャネルの長さ及び幅の慎重な選択によって少なくとも部分的に制御することができる。濾過構造、テーパ領域、流量調整器、及びエアトラップなどの要素を使用して、液滴生成システムを使用して生成された液滴の占有率を制御することもできる。一例では、過剰なビーズを使用してポアソン統計を無効にし、そうでなければ生成され得るよりも少なくとも２つのビーズを含むより多くのパーティションを生成しようと試みることができる。例えば、液滴生成システムには、少なくとも２つのビーズを含む複数のパーティションのより大きな割合のパーティションの生成を促進するためにビーズが過剰に装填され得る。
場合によっては、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ以下の生成されたパーティションが非占有さであってもよい。場合によっては、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ以下の生成されたパーティションはビーズを含まない。ある場合には、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ未満の生成されたパーティションは、核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）を含まない。場合によっては、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ以下の生成されたパーティションは試薬を含まない。生成されたパーティションの少なくとも１つのサブセットは、１つ以上の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）、１つ以上のビーズ、及び１つ以上の試薬を含み得る（例えば、本明細書に記載されるように）。生成されたパーティションの少なくとも１つのサブセットは、１つ以上の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）、２つ以上のビーズ（例えば、少なくとも２つのビーズ）、及び１つ以上の試薬を含み得る（例えば、本明細書に記載されるように）。液滴などのパーティションは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも５つの核酸分子と、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、又は少なくとも１０個のビーズとを含み得る。
液滴などのパーティションは、それらのヌクレオチド配列に関して、及び／又はそれらの核酸分子が連結されている１つ以上のアダプター配列に関して、同一又は異なるなど、同一又は異なる少なくとも２つの核酸分子を含み得る。一般に、本開示のパーティションは、前記パーティションに存在する核酸分子の数と比較して過剰なビーズを含み得る。パーティションは、核酸分子の少なくとも２倍の数のビーズを含み得る。液滴などのパーティションの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はそれ以上のビーズは、同じ（例えば、同一）ビーズであってもよく、又は異なるビーズであってもよい。異なるビーズは、サイズ、直径、流動性、剛性、多孔性、又は圧縮性などの異なる特性を含み得る。異なるビーズは、異なる材料（例えば、異なるヒドロゲル）から形成されてもよい。ある場合には、パーティションは、ヒドロゲルビーズである少なくとも１つのビーズ及び常磁性である少なくとも１つのビーズを含み得る。更に、第１の液滴などの第１のパーティションの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、又は少なくとも１０個のビーズは、第２の液滴などの第２のパーティションの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、又は少なくとも１０個のビーズと同じであっても異なっていてもよい。ビーズは、それに結合された複数の材料（例えば、核酸バーコード分子又はプライマー分子）を含んでもよい（例えば、ビーズの構成要素の表面に結合又は連結される）。
複数のパーティション（例えば、各液滴）の各パーティション（例えば、複数の液滴）は、複数のパーティション（例えば、別の液滴）の任意の他のパーティション（例えば、複数の液滴）、又はそれらの任意の組み合わせと比較して、同一又は異なる核酸分子及び／又は同一又は異なるビーズのいずれかを含み得る。したがって、複数のパーティション（例えば、複数の液滴）の第１のパーティション（例えば、第１の液滴）は、複数のパーティション（例えば、複数の液滴）の第２のパーティション（例えば、第１の液滴）と比較して、同一又は異なる核酸分子（例えば、異なるヌクレオチド配列を有する）を含み得る。同様に、第１のパーティション（例えば、第１の液滴）は、第２のパーティション（例えば、第１の液滴）と比較して同一又は異なるビーズ（例えば、異なるプライマーを有する）を含んでもよい。
本明細書に記載の粒子（例えば、ビーズ）（例えば、エマルジョン液滴などのパーティションの内側に位置するビーズ）は、複数のプライマー分子（例えば、核酸バーコード分子）を含み得る。複数のプライマー分子は、ビーズに付着され（例えば、化学的に連結され）てもよく、１つ以上のプライマー分子から構成されてもよい。ビーズに付着され得る１つ以上のプライマー分子は、同一又は異なるヌクレオチド配列を含み得る。複数のプライマー分子は、核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）がビーズに結合された複数のプライマー分子のうちの少なくとも１つのプライマー分子に結合し（例えば、共有結合又は非共有結合し）又はハイブリダイズし、それによって核酸分子をビーズに連結（例えば、固定化）することができるように、ビーズに付着され（例えば、化学的に連結され）てもよい。複数のプライマー分子を使用して、１つ以上の増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を行ない、液滴などのパーティションの内側に複数の増幅産物を生成することができる。１つ以上の増幅反応は、１つ以上のプライマー伸長反応を含んでもよく、この反応は、ターゲット核酸分子へのプライマーのハイブリダイゼーション、及びその後のターゲット核酸分子の配列の相補体を生成するためのプライマー分子の伸長（例えば、重合酵素を介して）を含み得る。各パーティション（例えば、液滴）で生成される増幅産物は、パーティション（例えば、同一のヌクレオチド配列を有する）内に含まれる核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）又はその誘導体もしくはフラグメント（例えば、異なるヌクレオチド配列を有する）の同一のコピーであってもよい。そのような誘導体及びフラグメントは、それらのヌクレオチド配列の長さ及び／又は配列が異なることができ、増幅反応中に生成され得る（例えば、ＰＣＲ）。場合によっては、増幅反応を使用して、１つ以上の配列を増幅産物に組み込むことができる。例えば、１つ以上のバーコード配列、固有分子識別子、アダプター配列、フローセルアダプター、又は他の配列を増幅産物に組み込むことができる。そのような配列は、（例えば、核酸配列決定アッセイを介した）後続の処理を容易にすることができる。
例えば、第１のビーズは、それに結合した第１のセットの核酸バーコード分子を含んでもよく、第２のビーズは、それに結合した第２のセットの核酸バーコード分子を含んでもよい。第１の核酸バーコード分子セットの核酸バーコード分子はそれぞれ、第１のバーコード配列及び第１のプライマー配列を含んでもよく、第２の核酸バーコード分子セットの核酸バーコード分子はそれぞれ、第２のバーコード配列及び第２のプライマー配列を含んでもよい。第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列と異なっていてもよい。第１のプライマー配列は、第２のプライマー配列と同じであっても異なっていてもよい。所定のパーティションの第１及び第２のビーズは、互いに連結（例えば、繋がれている）されてもよい。バーコード配列は、ビーズが同じバーコード配列を含まないように固有であってもよい。或いは、バーコード配列は、バーコード配列が異なるパーティション間で繰り返されることが予想されないように著しく希釈され得る（例えば、少なくとも１００万、少なくとも１０００万、又はそれ以上の異なるバーコード配列など、そのような多数の中に存在するバーコード配列が使用される）。一例では、複数のパーティションのうちの第１のパーティションは、（ｉ）核酸バーコード分子の第１のセットが結合されて成る第１のビーズであって、核酸バーコード分子のそれぞれが第１のバーコード配列及び第１のプライマー配列を含む、第１のビーズと、（ｉｉ）核酸バーコード分子の第２のセットが結合されて成る第２のビーズであって、核酸バーコード分子のそれぞれが第２のバーコード配列及び第２のプライマー配列を含む、第２のビーズとを含み得る。複数のパーティションのうちの第２のパーティションは、（ｉ）核酸バーコード分子の第３のセットが結合されて成る第３のビーズであって、核酸バーコード分子のそれぞれが第３のバーコード配列及び第３のプライマー配列を含む、第３のビーズと、（ｉｉ）核酸バーコード分子の第４のセットが結合されて成る第４のビーズであって、核酸バーコード分子のそれぞれが第４のバーコード配列及び第４のプライマー配列を含む、第４のビーズとを含み得る。第１、第２、第３、及び第４のバーコード配列が全て互いに異なっていてもよい。第１、第２、第３及び第４のプライマー配列が全て同じであってもよい。例えば、様々なプライマー配列は、所定のターゲット核酸分子、又は１つもしくは複数のターゲット核酸分子に結合されたアダプターにハイブリダイズする及び／又はこれらを捕捉するように構成されたターゲット化プライマー配列であってもよい。一例では、様々なプライマー配列は、ポリ（Ｔ）配列を含み、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子などのリボ核酸（ＲＮＡ）分子のポリ（Ａ）配列にハイブリダイズするように構成され得る。
図４は、鋳型核酸分子に結合され得る機能配列の一例を示す。例えば、機能配列は、増幅プライマー配列、配列決定プライマー配列、それらの相補体及び／又はそれらの組み合わせである。増幅プライマー配列は、溶液増幅プライマー配列であってもよい。増幅プライマー配列は、基板固定化プライマー配列であってもよい。配列決定プライマー配列は、コード鎖の配列決定を容易にするように構成され得る。配列決定プライマー配列は、鋳型鎖の逆相補体の配列決定を促進するように構成され得る。左パネルの左部分は、鋳型核酸分子の第１鎖４２０に結合された基板固定化プライマー分子４０３を介して表面４５０に固定化された鋳型核酸分子を示す。鋳型核酸分子の第２鎖４３０は、コード鎖の配列決定のためのアダプター４０６並びに溶液増幅プライマー分子４０７を含む。左パネルの右部分は、鋳型核酸分子の第２鎖４３０に結合された基板固定化プライマー分子４０３を介して表面４５０に固定化された鋳型核酸分子の同一のコピーを示す。核酸分子の第１鎖４２０は、溶液増幅プライマー分子４０７と、逆相補鎖の配列決定のためのアダプター４０８とを含む。基板固定化プライマー（例えば、４０３）は、第２のアダプター４０２（「アダプター２」）と見なされてもよく、一方、鋳型核酸分子の所定の鎖に結合された増幅及び配列決定プライマー（例えば、４０６及び４０７，４０８及び４０７）は、一緒になって第１のアダプター４０１（「アダプター１」）を構成し得る。図４に示すように、第１のアダプター４０１は、様々な配列が異なる融解温度を有することができ、したがって、例えばアダプターを含む分子を所定の温度範囲に加熱することによって部分的に変性され得るように構成され得る。図４の右側パネルは、配列決定アダプター４７５（例えば、配列決定プライマー）を介して第２の鋳型核酸分子４８０に連結された第１の鋳型核酸分子４７０を示し、複合体は、基板固定化プライマー分子４６５を介して基板４６０に固定化される。配列決定アダプター４７５は、ステムループ構成４０３（「アダプター１」）で提供されてもよく、複合体の自由端に付加されたアダプター４８５は、Ｙ字形構成４０４（「アダプター２」）で提供されてもよい。アダプター４８５は、配列決定プライマー及び溶液増幅プライマーを含み得る。
１つ以上の異なるプライマー分子が１つのビーズに連結され（例えば、化学的に連結され）得る限りにおいて、本明細書中に記載のパーティション又は液滴は複数のビーズを含んでもよく、この場合、各ビーズは１つ以上のプライマー分子に連結され、１つ以上のプライマー分子は同一であっても異なっていてもよい（例えば、同一又は異なるヌクレオチド配列を含む）。換言すれば、単一のパーティション又は液滴内の複数のビーズは、複数の同一又は異なる核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）に結合することができる複数の同一又は異なるプライマー分子を含み得る。そのため、複数の核酸分子をパーティションで増幅し、複数のプライマー分子を用いて複数の増幅産物を生成してもよい（例えば、核酸バーコード分子）。また、本開示の方法は、第１のビーズを第２のビーズに（例えば、１つ以上の化学リンカー又は１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドを介して）連結することによって形成され得るビーズ対の使用を含んでもよく、ビーズ対の第１のビーズ及び第２のビーズは異なるプライマー分子（例えば、核酸バーコード分子）を含む。
ビーズは、１つ以上のリンカーを介して連結され得る。リンカーはオリゴヌクレオチドであってもよい。リンカーは、１つ以上の炭水化物分子を含み得る。リンカーは、親和性結合タンパク質を含み得る。リンカーは親水性であってもよい。リンカーは疎水性であってもよい。リンカーは静電的であってもよい。リンカーは標識化されていてもよい。リンカーは、開裂可能なリンカー又は開裂不可能なリンカーであってもよい。１つ以上のヌクレオチド及び／又は１つ以上のリンカー部分は、色素、フルオロフォア又は量子ドット（例えば、本明細書に記載されるように、）で標識化され得る。
複数のパーティション（例えば、複数の液滴）の各パーティション（例えば、液滴）は、１つ以上のターゲット核酸分子及び１つ以上のビーズに加えて、１つ以上の試薬を更に含み得る。各パーティションの内側に存在し得る試薬は、緩衝液（例えば、特定の濃度の様々なイオン）、タンパク質（例えば、重合酵素などの酵素）、モノマー分子（例えば、ｄＮＴＰなどのヌクレオチド）、オリゴマー分子（例えば、オリゴヌクレオチド）、及びポリマー分子（例えば、合成核酸分子などの核酸）を含み得る。試薬は、細胞を溶解又は透過処理して、その中の核酸分子へのアクセスを提供するのに有用であり得る。試薬は、増幅及び／又はプライマー伸長反応に有用であり得る。「試薬」核酸分子は（生体サンプルの「サンプル」又は「ターゲット」核酸分子とは対照的に）、プライミング配列及び／又は固有分子識別子（例えば、ランダム化された識別子又はバーコード）を含み得る。本明細書に記載及び使用されるプライミング配列は、ターゲット特異的又は非ターゲット特異的（例えば、ランダムなＮ－ｍｅｒ）であってもよい。更に、試薬核酸分子は、配列決定アダプター及びフローセル配列などの機能配列を含んでもよい。そのような「試薬」核酸分子は、ビーズ（例えば、本明細書に記載されるように、）に結合されてもよい。本明細書に開示される重合酵素は、ポリメラーゼ酵素（例えば、本明細書に記載されるように、）であってもよい。ポリメラーゼ酵素は、内因性ポリメラーゼ酵素又は改変（例えば、操作された）ポリメラーゼ酵素であってもよい。ポリメラーゼ酵素は、増幅反応（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）を行なって複数の増幅産物を生成するために使用され得る。
パーティションの更なる成分は、合成核酸分子であってもよい。合成核酸分子は二本鎖であってもよい。合成核酸分子は、開裂可能要素を含み得る。開裂可能要素は、合成核酸分子の成分の分離を可能にし得る。分離は、化学的、光、熱又は他の手法によって達成され得る。また、合成核酸分子は、ライゲーション及び／又は環状化に供され得る。ライゲーション及び／又は環状化の際に、合成核酸分子を開裂して、開裂された合成核酸分子を提供することができる。その後、開裂された合成核酸分子は、増幅反応（例えば、本明細書に記載されるように、）によってギャップ装填に供され得る。
生体サンプルの核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）は、複数のパーティション間で分割される前に処理され得る。或いは、生体サンプルの核酸分子は、複数のパーティションの間で分割された後に処理されてもよい。例えば、核酸分子は、１つ以上のアダプター（例えば、ハイブリダイゼーション又はライゲーションプロセスを介して）で官能化され得る。アダプターは、データ分析（例えば、配列決定及び配列分析）中に元のサンプル核酸分子及び対応する増幅産物の同定を可能にし得るランダム化された識別子配列（例えば、バーコード又は固有分子識別子（ＵＭＩ）配列）を含み得る（例えば、本明細書に記載されるように）。アダプター（又は複数のアダプター）に対する核酸分子のライゲーション反応は、溶液（例えば、複数のパーティション間で分割する前に）又はエマルジョン（例えば、複数のパーティション間の分割に続いて）中で起こり得る。したがって、ライゲーション反応は、核酸分子とアダプターの両方が水溶液中にあるときに起こることができ、水溶液は、エマルジョン液滴などのパーティション内部の水溶液であってもよい。核酸分子（例えば、一本の核酸鎖）に付着した（例えば、共有又は非共有的に連結された）アダプターの配列は、プライマー分子又はその配列への核酸分子の結合を促進し得る。そのようなプライマー分子は、アダプター配列を介した核酸分子とプライマーとの相互作用（例えば、共有結合的又は非共有結合的などの結合）がエマルジョン液滴又はウェルなどのパーティション内のビーズに核酸分子を付着させることができるように、ビーズに付着させることができる。核酸分子をビーズに連結すると、１つ以上の増幅反応（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）を実施して、前記核酸分子の複数の増幅産物（例えば、本明細書に記載されるように）を生成することができる。本明細書中に記載される方法及び組成物と組み合わせて使用され得るアダプターは、ペアエンド配列リードの作製を可能にし得る。したがって、核酸分子に対するビーズのより高い量比及びペアエンドアダプターの使用の組み合わせは、生体サンプル（例えば、ターゲット核酸分子）を分析するための精度及び感度が向上した方法を提供し得る。
本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、１つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、２つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、３つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、４つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、５つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、６つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、７つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、８つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、９つ以上のビーズを含む。本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％は、１０個以上のビーズを含む。
本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも７５％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８０％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８５％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９０％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９５％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９７％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９９％は、約１～３個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの約１００％は、約１～３個のビーズを含む。
本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも７５％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８０％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８５％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９０％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９５％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９７％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９９％は、約２～５個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの１００％は、約２～５個のビーズを含む。
本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも７５％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８０％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８５％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９０％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９５％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９７％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９９％は、約３～７個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの１００％は、約３～７個のビーズを含む。
本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも７５％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８０％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８５％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９０％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９５％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９７％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９９％は、約５～１０個のビーズを含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの１００％は、約５～１０個のビーズを含む。
本開示の方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも７５％は、２以上、３以上、４以上、５以上、又は１０以上のビーズ対核酸分子比率を含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも８５％は、２以上、３以上、４以上、５以上、又は１０以上のビーズ対核酸分子比率を含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９５％は、２以上、３以上、４以上、５以上、又は１０以上のビーズ対核酸分子比率を含む。方法は、複数のパーティション（例えば、液滴）を提供することができ、複数のパーティションの少なくとも９９％は、２以上、３以上、４以上、５以上、又は１０以上のビーズ対核酸分子比率を含む。
本開示の方法は、複数の異なるビーズセットの使用を含み得る。例えば、方法は、第１のビーズセット及び第２のビーズセットの使用を含み得る。ビーズの第１のセット（又は複数）の第１のビーズは、生体サンプル（例えば、１つ以上の核酸分子、例えば１つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ分子）の第１の核酸鎖に結合された（例えば、共有又は非共有的に連結された）第１のアダプターと少なくとも部分的な配列相補性（例えば、第１のペアエンドアダプター配列）を有する第１のプライマーを含み得る。第２のビーズセットの第２のビーズは、生体サンプルの第２の核酸鎖に結合された第２のアダプターとの配列相補性（例えば、第２のペアエンドアダプター配列）を有する第２のプライマーを含み得る。第１のプライマーは、第２のプライマーと異なっていてもよい。本明細書に記載の方法は、（ｉ）第１のビーズセットの第１のビーズ、（ｉｉ）第２のビーズセットの第２のビーズ、及び（ｉｉｉ）それに結合された第１又は第２のアダプターを含む核酸分子をパーティションに分割すること（例えば、共分配すること）を含み得る。分割は、例えば、１つ以上の液滴（例えば、エマルジョン中で）又はウェルを使用して達成され得る。所定のビーズ対が第１のセットのビーズ及び第２のセットのビーズを含むように、第１及び第２のセットのビーズを含むビーズ対を使用することができる。そのような方法は、ビーズ対を含む所定のパーティションへの第１のプライマー及び第２のプライマーの両方の送達を容易にし得る。
一例では、少なくとも２つのビーズ（ビーズ対として構成されていてもよい、第１のビーズセットの第１のビーズ及び第２のビーズセットの第２のビーズであって、第１のビーズが第１のプライマー分子を含み、第２のビーズが第２のプライマー分子を含む、第１のビーズセットの第１のビーズ及び第２のビーズセットの第２のビーズ）と、１つ以上のアダプター配列（第１のビーズのプライマー配列と相互作用するように構成された第１のアダプター及び／又は第２のビーズのプライマー配列と相互作用するように構成された第２のアダプター）を含む核酸分子とを含む複数のパーティション（例えば、複数の液滴）のうちの１つのパーティション（例えば、１つの液滴）は、第１及び／又は第２のアダプターに結合された核酸分子又はその鎖（例えば、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ又はＲＮＡ）の１つ以上のコピー、又はその相補体（又はフラグメント）の生成を可能にする条件に供され得る。核酸分子が二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ）である場合、核酸分子の両方の鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体もしくはそのフラグメントが生成され得る。第１鎖及び／もしくは第２鎖の１つ以上のコピー、又はそれらの相補体を生成することは、プライマー伸長反応及び／又は核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）を実施するのに十分な条件に第１及び第２のビーズ及び核酸分子を供することを含み得る。第１のビーズの第１のプライマー分子及び／又は第２のビーズの第２のプライマー分子は、第１及び／又は第２のアダプター配列の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体を含む核酸分子を生成するために使用され得る。核酸分子の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体は、第１又は第２のビーズに結合されてもよく、したがって、更なる増幅反応に使用されてもよい。特定の例において、核酸分子は、第１のアダプターに連結された第１鎖及び第２のアダプターに結合された第２鎖を含んでもよく、第１のアダプターは第１のビーズの第１のプライマー分子と相互作用するように構成され、第２のアダプターは第２のビーズの第２のプライマー分子と相互作用するように構成される。第１のプライマー分子は、核酸分子の第１鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体を生成するために使用されてもよく、第２のプライマー分子は、核酸分子の第２鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体を生成するために使用されてもよい。核酸分子の第１鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体は、第１のビーズに結合され得る。第２鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体は、第２のビーズに結合され得る。これらの結合したコピー及び／又は相補体は、更なる増幅反応に使用され得る。第１鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体の配列は、第２鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体の配列と少なくとも部分的に重複し得る。
当業者であれば分かるように、二本鎖鋳型分子を記載する例は、一本鎖鋳型分子にも適用される。特定の例において、鋳型一本鎖は、第１アダプターに結合されてもよく、第２のアダプターに相補的な領域を含んでもよく、第１アダプターは第１のビーズの第１のプライマー分子と相互作用するように構成され、第２のアダプターは第２のビーズの第２のプライマー分子と相互作用するように構成される。第２のアダプターは鋳型に存在しないが、相補鎖の合成後、新しい鎖が第２のアダプターを含む。第１のプライマー分子は鋳型の１つ以上の相補体を生成するために使用されてもよく、第２のプライマー分子は鋳型の相補体の１つ以上の相補体又はコピーを生成するために使用されてもよい。鋳型一本鎖分子の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体は、第１のビーズに結合され得る。鋳型一本鎖分子に対する相補体の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体は、第２のビーズに結合され得る。一般に、前述の実施例の全体にわたって二本鎖鋳型が記載されるが、第２鎖に記載される領域に相補的な領域を含む一本鎖鋳型も使用され得ることが理解される。
増幅プロセスが完了すると、複数のパーティションに分配された複数のビーズ（例えば、複数のビーズ－核酸分子複合体）は、複数のパーティション（例えば、液滴又はウェル）から回収されてもよく、ビーズ（例えば、複数のビーズ－核酸分子複合体）は、エマルジョン又は混合物から分離（例えば、磁気的に分離）されてもよい。続いて、先の増幅及び／又は処理工程のいずれかの間に形成され得る核酸分子又はその任意の誘導体をアッセイ又は分析することができる（例えば、シーケンサーにおいてヌクレオチド配列を決定することによって）。
場合によっては、異なる数のビーズを含むパーティション（例えば、液滴）を互いに分離することができる。例えば、第１の数のビーズを含む第１のパーティション（例えば、液滴）は、第２の数のビーズを含む第２のパーティション（例えば、液滴）から分離されてもよい。第１の数のビーズ及び第２の数のビーズは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、第１のパーティションは単一のビーズを含んでもよく、第２のパーティションは２つのビーズを含んでもよい。場合によっては、所定の数のビーズを含むパーティションの全部又は大部分は、異なる数のビーズを含むパーティションの全部又は大部分から分離され得る。例えば、シングルビーズを含むパーティションの全部又は大部分は、０ビーズを含むパーティション及び／又は２つ以上のビーズを含むパーティションから分離され得る。別の例では、２つのビーズを含むパーティションの全部又は大部分が、他の数のビーズを含むパーティションから分離され得る。異なる数のビーズを含むパーティションの分離は、例えば、異なる数のビーズを含むパーティションを光学的に検出し、そのような光学的検出に少なくとも部分的に基づいて、第１の方向に（例えば、第１のチャネルに沿って）第１の数のビーズを含むパーティション（例えば、液滴）を送るとともに第２の方向に（例えば、第２のチャネルに沿って）第２の数のビーズを含むパーティション（例えば、液滴）を送るために（例えば、マイクロ流体チャネルシステム内の）流れの方向を調整することによって達成され得る。それに代えて又は加えて、光学的及び非光学的戦略を含む他の分離戦略を使用することができる。例えば、パーティションの質量又は密度などの物理的特性を使用して、パーティションを分離することができる。幾つかの例では、複数のパーティションは、そのような分離を容易にするために１つ以上の力又は場を受けることができる。
ある場合には、ビーズに付着した核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）が配列決定される。他の場合では、ビーズに付着していない核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）が配列決定される。例えば、ビーズに付着した核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）は、ビーズから除去され（例えば、核酸分子とビーズを分離することによって）、配列決定のための配列決定システムに提供され得る（例えば、本明細書に記載されるように）。核酸分子は、例えば、ビーズ又はそれを含むパーティションに刺激を加えることによってビーズから除去され得る。このような刺激としては、例えば、熱刺激、光刺激、化学刺激（例えば、還元剤）等が挙げられる。ビーズから除去された核酸分子は、続いてフローセル（例えば、フローセル内の１つ以上のウェルに）の表面に付着することができ、そこで１つ以上の配列決定反応及び／又は１つ以上の更なる増幅反応を受けることができる。
ある場合には、複数の異なるビーズセットを使用して、配列決定のための核酸サンプルを調製することができる。例えば、第１のビーズセットの第１のビーズを使用して第１の機能を実行することができ、第２のビーズセットの第２のビーズを使用して第２の機能を実行することができる。ビーズの異なるセットは、同じ又は異なる材料を含み、任意の数の共有又は異なる特性（例えば、形状、サイズ、常磁性状態など）を有し得る。例えば、第１のビーズセットの第１のビーズは、第２のビーズセットの第２のビーズより小さくてもよい。ビーズの第１のセットの第１のビーズは、約５０ｎｍなどの約１～１００ナノメートル（ｎｍ）の直径を有するナノビーズであってもよく、ベッドの第２のセットの第２のビーズは、約１００ｎｍより大きい直径を有し得る。例えば、ビーズの第２のセットの第２のビーズは、約１～１００マイクロメートル（μｍ）の直径を有するマイクロビーズであってもよい。第１のビーズは磁性であってもよく、第２のビーズは磁性でなくてもよい。ビーズの異なるセットによって行なわれる異なる機能には、例えば、鋳型装填、増幅及び配列決定が含まれ得る。一例では、第１のビーズセットの第１のビーズを使用して、後続の処理のために複数の核酸分子を含むサンプルを調製することができる。第１のビーズは、それに結合された複数のプライマー分子を含んでもよく、このプライマー分子は、複数の核酸分子の核酸分子の配列に対して相補的であってもよい。例えば、ビーズの第１のセットの第１のサブセットは、複数の核酸分子のうちの核酸分子の第１の配列に対して相補的な第１のプライマー分子を含んでもよく、ビーズの第１のセットの第２のサブセットは、複数の核酸分子のうちの核酸分子の第２の配列に対して相補的な第２のプライマー分子を含んでもよい。第１の配列は、複数の核酸分子の核酸分子に結合した第１のアダプターの配列であってもよく、第２の配列は、複数の核酸分子の核酸分子（例えば、同じ又は異なる核酸分子）に結合した第２のアダプターの配列であってもよい。第１の配列は、複数の核酸分子の核酸分子の第１鎖に結合されてもよく、第２の配列は、複数の核酸分子の核酸分子の第２鎖に結合されてもよい。ビーズの第１のセット及び複数の核酸分子は、バルク溶液中で組み合わされ、ビーズの第１のセットの第１のビーズに結合したプライマー分子を複数の核酸分子の核酸分子の配列にハイブリダイズさせるのに十分な条件に供され得る。その後、プライマー分子を伸長させて、複数の核酸分子の鎖に相補的な鎖を生成することができる。結果として得られた二本鎖核酸分子は、ビーズの第１のセットの第１のビーズに結合され得る。ビーズに結合された二本鎖核酸分子は、例えば、末端トランスフェラーゼを使用して末端ブロックされ得る。ある場合には、一本鎖二本鎖核酸分子が所定の第１のビーズに結合され得る。他の場合には、複数の二本鎖核酸分子が所定のビーズに結合され得る。その後、バルク溶液を洗浄し、第１のビーズセットを、複数の核酸分子の遊離核酸分子を含む溶液中の他の材料（例えば、磁気分離を介して）から分離することができる。
その後、第１のビーズセットを複数のパーティション（例えば、液滴；本明細書に記載されるように）に分割することができる。複数のパーティションのパーティションは、１つ以上の二本鎖核酸分子（例えば、鋳型核酸分子）に結合したビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズを含み得る。複数のパーティションの他のパーティションは、二本鎖核酸分子に結合していないビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズを含み得る。複数のパーティションの更に他のパーティションは、ビーズの第１のセットの第１のビーズを含まなくてもよい。
ビーズの第１のセットは、１つ以上の試薬（例えば、本明細書に記載されるように、）及びビーズの第２のセットと共分割され得る。ビーズの第２のセットは、配列決定の調製において鋳型核酸分子を捕捉及び増幅するのに適したプライマー分子を含み得る（例えば、本明細書に記載されるように）。ビーズの第２のセットは、本明細書では「配列決定ビーズ」と呼ばれることがある。したがって、複数のパーティションは、（ｉ）１つ以上の二本鎖核酸分子に結合されたビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズとビーズの第２のセットの少なくとも２つの第２のビーズとを含むパーティションの第１のサブセット；（ｉｉ）１つ以上の二本鎖核酸分子に結合されるビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズとビーズの第２のセットのたった１つの第２のビーズとを含むパーティションの第２のサブセット；（ｉｉｉ）１つ以上の二本鎖核酸分子に結合されるビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズを含むがビーズの第２のセットの第２のビーズを含まないパーティションの第３のサブセット；（ｉｖ）二本鎖核酸分子に結合されないビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズとビーズの第２のセットの少なくとも２つの第２のビーズとを含むパーティションの第４のサブセット；（ｖ）二本鎖核酸分子に結合されないビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズとビーズの第２のセットのたった１つの第２のビーズとを含むパーティションの第５のサブセット；（ｖｉ）二本鎖核酸分子に結合されないビーズの第１のセットの１つ以上の第１のビーズを含むがビーズの第２のセットの第２のビーズを含まないパーティションの第６のサブセット；（ｖｉｉ）ビーズの第１のセットの第１のビーズを含まずビーズの第２のセットの少なくとも２つの第２のビーズを含むパーティションの第７のサブセット；（ｖｉｉｉ）ビーズの第１のセットの第１のビーズを含まずビーズの第２セットのたった１つの第２のビーズを含むパーティションの第８のサブセット；（ｉｘ）ビーズの第１のセットの第１のビーズ又はビーズの第２のセットの第２のビーズを含まないパーティションの第９のサブセットのうちの１つ以上を含んでもよい。したがって、複数のパーティションの特定のサブセットのみが、鋳型核酸分子と第２のビーズセットの少なくとも１つの第２のビーズの両方を含み得る。上記のパーティションの第３のサブセットのうちのパーティションは、ビーズの第１のセットの第１のビーズに結合した少なくとも１つの鋳型核酸分子を含むが、ビーズの第２のセットの第２のビーズ（例えば、配列決定ビーズ）を含まない。これらのパーティションは配列決定ビーズを含まないので、配列決定のための材料は調製されない。パーティションの第３のセットのうちのパーティションの内容物を回収すると、磁気捕捉を使用して第１のビーズを除去することができる。したがって、パーティションの第３のセットのうちのパーティションに対応する配列決定産物は検出されない。上記のパーティションの第７のサブセットのうちのパーティションは、鋳型核酸分子を担持する第１のビーズを含まないが、ビーズの第２のセットの少なくとも２つの第２のビーズを含む。これらのパーティションは鋳型核酸分子を含まないので、鋳型核酸分子に対応する増幅産物は生成されず、配列決定リードは得られない。磁気分離を使用して、鋳型核酸分子に連結されていない任意の第１のビーズを除去することができる。上記のパーティションの第１のサブセットのうちのパーティションは、鋳型核酸分子に結合された少なくとも１つの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの少なくとも２つの第２のビーズを含む（例えば、本明細書に記載されるように）。したがって、増幅及び配列決定は、本明細書に記載されるように、少なくとも２秒間のビーズに対して行なわれ得る。増幅後の磁気捕捉は、これらのビーズが配列決定アッセイによって検出されないように、鋳型装填ナノビーズ（例えば、第１のビーズ）を排除し得る。図９は、第１及び第２のビーズセットを含むこの方法を示す。配列決定ビーズ９０１のセット及び鋳型装填ナノビーズ９０２のセットが提供される。一例では、鋳型装填ナノビーズが直径約５０ナノメートルである。鋳型装填ナノビーズは、磁性であってもよく、及び／又は別の捕捉機構を含んでもよい。鋳型装填ナノビーズはプライマーでコーティングすることができる。第１の鋳型調製操作９１０では、鋳型装填ナノビーズ（プライマー被覆）及び鋳型核酸分子をバルク混合物中で組み合わせることができる。ナノビーズは過剰に提供されてもよい。第２の鋳型調製操作９２０において、鋳型は、（ｉ）鋳型をナノビーズにアニールし、（ｉｉ）伸長するのに十分な条件に供され得る。結合していない鋳型は、ナノビーズを固定化するか、そうでなければ捕捉し、洗浄液を適用することなどによって洗い流され得る。末端は、末端トランスフェラーゼを使用してブロックされてもよい。そのような鋳型調製操作は、ナノビーズ結合鋳型を生成し得る。エマルジョン操作９３０では、ナノビーズ結合鋳型を配列決定ビーズ及び他の試薬（例えば、溶液プライマー分子）と共に液滴に分割して、様々に占有された液滴、場合によっては非占有液滴を生成することができる（９４０）。幾つかの液滴（ｉ）は、配列決定ビーズを伴うことなくナノビーズ結合鋳型を含み得る。幾つかの液滴（ｉｉ）は、ナノビーズ結合鋳型を伴わない配列決定ビーズを含み得る。幾つかの液滴（ｉｉｉ）は、ナノビーズ結合鋳型と配列決定ビーズの両方を含み得る。鋳型陽性配列決定ビーズを達成するためには、ナノビーズが存在しなければならない。液滴は、増幅９４０に供され得る。エマルジョンが破壊され、液滴の内容物がプールされ得る。事例（ｉ）のように配列決定ビーズが存在しない場合、増幅後のナノビーズ捕捉（例えば、磁石を使用する）がナノビーズ結合鋳型を排除することができ、また、ナノビーズの捕捉及び小さいサイズに起因して、シーケンサーはナノビーズ（又はそのようなナノビーズに結合した鋳型）を検出せず、その結果、これらの液滴からの配列決定リードが得られない。（ｉｉ）の場合のように鋳型が存在しない場合、鋳型が存在しないので増幅は進行し得ない。増幅後のナノビーズ捕捉は、空のナノビーズ（それらに結合した鋳型を有しない）を排除することができる。これらの液滴から配列決定リードは生成されない。事例（ｉｉｉ）のように配列決定ビーズ及びナノビーズ結合鋳型が存在する場合、増幅産物を配列決定ビーズに固定化することができる。増幅後のナノビーズ捕捉は、ナノビーズに結合した鋳型及び他のナノビーズを排除し得る。ナノビーズの捕捉及び小さいサイズに起因して、シーケンサーはナノビーズ（又はそのようなナノビーズに結合した鋳型）を検出しない場合があり、配列決定リードは、これらの液滴中の配列決定ビーズ上の核酸分子の配列決定から生成される。
増幅反応
本明細書に開示される生体サンプルを分析及び／又は処理する方法は、ターゲット核酸分子を分析及び／又は処理して、ターゲット核酸分子の１つ以上のコピー又は相補体（例えば、増幅された核酸分子又は増幅産物）を生成するための任意の有用なタイプの反応（例えば、任意の核酸増幅反応）を含み得る。核酸分子の増幅産物（例えば、コピー又は相補体）は、核酸分子に対して少なくとも部分的な配列相補性（例えば、＞９０％）を有し得る。本明細書に記載される増幅反応は、例えば核酸増幅が行なわれる場合、単一プライマー伸長反応を含み得る。核酸の増幅は、線形、指数関数、又はそれらの組み合わせであってもよい。増幅は、エマルジョン系であってもよく、非エマルジョン系であってもよい。本明細書に開示される方法と組み合わせて使用され得る核酸増幅反応の非限定的な例としては、逆転写、プライマー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、非対称増幅、ローリングサークル増幅、及び多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。本明細書に記載の方法を使用して生成され得る増幅産物は、ＤＮＡであってもよい。ターゲットＲＮＡを増幅する場合、ＲＮＡの逆転写によってＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））を取得し、その後ＤＮＡを増幅して増幅ＤＮＡ産物を生成することができる。増幅されたＤＮＡ産物は、生体サンプル中のターゲットＲＮＡの存在を示し得る。ＤＮＡを増幅する場合、どのようなＤＮＡ増幅方法を用いてもよい。ＤＮＡ増幅法の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲの変異体（例えば、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ（例えば、ｅＰＣＲ）、ダイヤルアウトＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプリマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、線形ＤＮＡ増幅を含み得る。本明細書に記載の方法は、指数関数的ＤＮＡ増幅を含み得る。ＤＮＡ増幅は、増幅されたＤＮＡ産物を検出する感度を改善し得るネステッドＰＣＲによって達成され得る。更に、生体サンプルを分析するための精度及び／又は感度（例えば、信号対雑音比を増加させることによって、）を高めるために、ペアエンドアダプターをＰＣＲ増幅に使用することができる。
本明細書に記載の方法は、様々な期間（例えば、数分又は数時間）の増幅反応を使用することができる。生体サンプル中のターゲット核酸分子の存在を示す検出可能な量の増幅産物を増幅がもたらす期間は、ターゲット核酸分子が取得され得る生体サンプル、実施され得る特定の核酸増幅反応、実施され得る増幅反応の特定のサイクル数、及び複数の液滴の生成などの実施される分割プロセスに応じて変化し得る。また、様々な検出及び配列決定スキームが様々な検出限界を可能にし得る。ターゲット核酸分子の増幅は、２４０分以下、１２０分以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３５分以下、３０分以下、２５分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、又は、５分以下の期間にわたってターゲット核酸の存在を示す検出可能な量の増幅産物をもたらし得る。ある場合には、核酸分子の単一コピー又は相補体が検出可能であってもよい（例えば、核酸配列決定アッセイの使用）。そのような低い検出限界は、ペアエンド配列決定によって可能になり得る。
本明細書で提供される方法のいずれにおいても、核酸配列決定を使用して、核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）のコピー及び／又は相補体の配列を同定することができる。配列決定リードとして核酸配列決定アッセイで取得された核酸分子のコピー及び／又は相補体の配列は、バーコード配列又は他のサンプルインデックスもしくは標識を使用して、それらが由来する核酸分子と会合され得る。例えば、所定の細胞又は所定のサンプルの核酸分子に対応する配列決定リードは、バーコード配列などを使用して所定の細胞又はサンプルで同定され得る。ある場合には、サンプルの核酸分子の第１鎖の１つ以上のコピー（例えば、ターゲット核酸分子）及び核酸分子の第２鎖の１つ以上のコピー、又はそれらの相補体は、核酸配列決定を受け得る（例えば、本明細書に記載されるように）。上記のように、核酸配列決定は、合成又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による配列決定を含み得る核酸プロセシング反応の一種である。幾つかの方法では、核酸配列決定は、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応（ｅＰＣＲ）を含み得る。
複数のパーティションのうちの少なくとも１つのパーティションは、少なくとも第１のビーズ、第２のビーズ、並びに第１及び第２のサンプル核酸分子に加えて、材料又は成分を含み得る。パーティションの更なる成分は、合成核酸分子であってもよい。合成核酸分子は二本鎖であってもよい。合成核酸分子は、開裂可能要素を含み得る。開裂可能要素は、合成核酸分子の成分の分離を可能にし得る。分離は、化学的、光、熱又は他の手法によって達成され得る。また、合成核酸分子は、ライゲーション及び／又は環状化に供され得る。ライゲーション及び／又は環状化の際に、合成核酸分子を開裂して、開裂された合成核酸分子を提供することができる。その後、開裂された合成核酸分子は、増幅反応（例えば、本明細書に記載されるように、）によってギャップ装填に供され得る。
（例えば、一定期間及び／又は増幅サイクル数の後に）増幅プロセスが完了すると、複数のパーティション間で分配された複数のビーズ（例えば、複数のビーズ－核酸分子複合体）を複数のパーティション（例えば、液滴又はウェル）から回収することができ、また、ビーズ（例えば、複数のビーズ－核酸分子複合体）をエマルジョン又は混合物から分離（例えば、磁気的に分離）することができる。続いて、先の増幅及び／又は処理工程のいずれかの間に形成され得る核酸分子又はその任意の誘導体をアッセイ又は分析することができる（例えば、シーケンサーにおいてヌクレオチド配列を決定することによって）。ある場合には、ビーズに結合された核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）のみが配列決定される。他の場合では、ビーズに結合されていない核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）のみが配列決定される。ある場合には、ビーズに結合された核酸分子とビーズに結合されていない核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）の両方が配列決定される（例えば、同時に又は別々に）。
本開示の方法の利点は、パーティション（例えば、液滴）内の核酸分子に対するビーズの比率（例えば、＞２）を増大させることができることであり、これは、少なくとも部分的に、所定の核酸分子のより高いクローンコピー数及び減少したサンプル又は鋳型損失に起因して、サンプル分析中の精度及び感度の向上をもたらし得る。鋳型を有するがビーズを含まないパーティションの割合は、十分に多数のビーズを添加することによって大幅に減少させることができる。これにより、二重ポアソン分布方式が単一ポアソン分布方式に低減される。これは、生体サンプルが腫瘍の診断及び病期分類においてｃｆＤＮＡなどの微量の核酸しか含有しない可能性がある領域では非常に重要であり得る。更に、核酸分子に対するビーズのより高い量比及びペアエンドアダプターの使用の組み合わせは、生体サンプル（例えば、サンプル核酸分子）を分析するための精度及び感度が向上した方法を提供し得る。
ビーズ組成物
生体サンプルを分析するための本明細書に開示される方法は、１つ以上の（例えば、複数の）核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）の増幅を含み得る。本明細書に記載の核酸増幅は、１つ以上の核酸分子（例えば、一本鎖核酸分子）が結合し得る１つ以上のビーズ又はビーズ粒子（例えば、ビーズの１つ以上のセット）を使用して実施され得る。ビーズの第１のセット及び／又はビーズの第２のセットは、様々な方法を使用して調製することができる。ビーズの第１のセット及び／又はビーズの第２のセットは、１つ以上の材料及び／又は成分から構成されてもよい。ビーズの第１のセット及び／又はビーズの第２のセットは、例えば、ポリマービーズであってもよい（例えば、本明細書に記載されるように）。ビーズの第１及び／又は第２のセットは、ＰＥＧ層又はヒドロゲルなどのコーティングを有し得る（例えば、本明細書に記載されるように）。ビーズの第１及び／又は第２のセットは、同じコアビーズ又は異なるコアビーズを含有し得る（例えば、同じ又は異なる材料を含む）。したがって、ビーズの第１のセットのビーズは第１の材料から調製されてもよく、ビーズの第２のセットのビーズは第２の材料から調製されてもよく、第１の材料は第２の材料と同じであっても異なっていてもよい。ビーズの第１のセットのビーズは、それに結合された第１のプライマー分子を含んでもよく、ビーズも第２のセットのビーズは、それに結合された第２のプライマー分子を含んでもよい。第１及び第２のプライマー分子は、ビーズの第１及び第２のセットの調製（例えば、合成）中に、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットにそれぞれ提供され得る。或いは、第１及び第２のプライマー分子は、ビーズの第１及び第２のセットの調製後に、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットにそれぞれ提供され得る（例えば、プライマー分子をまだ含まない「コアビーズ」及び／又は予め官能化されたビーズ）。プライマー分子がその後のプロセスでビーズに固定化される場合、ビーズの第１及び第２のセットのビーズは別々に更に処理され得る。各ビーズセットにおけるプライマー分子は、様々な化学反応を使用してビーズに固定化され得る。結合は、例えば、アミド、エステル又はジスルフィド官能基を介して起こり得る。クリックケミストリー（例えば、シュタウディンガーライゲーション又はディールス・アルダー化学反応）は、ビーズへのプライマー分子の固定化に使用され得る。固定化されたプライマー分子は、更なる下流側の化学反応を用いて更に修飾され得る。
生体サンプルを分析及び／又は処理するための本明細書に開示される方法は、解放可能に（例えば、熱的に又は化学的に解放可能に）結合された第１のビーズ及び第２のビーズのセットが生成されるように、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットの調製（例えば、合成）を含み得る。例えば、第１のビーズは、第２のビーズに解放可能に結合されてもよく、それにより、ビーズは、刺激（例えば、熱刺激、化学刺激、又は光刺激）の適用時に互いに解放可能であってもよい。同様に、第１及び／又は第２のビーズセットのビーズに結合したプライマー分子は、熱、化学、又は光刺激などの刺激の適用時にビーズから解放可能であってもよい。
解放可能に結合された第１のビーズ及び第２のビーズは、非共有結合相互作用又は結合（例えば、タンパク質相互作用）又は共有結合を介して結合され得る。第１のビーズは、１つ以上の化学リンカーを介して、及び／又は１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドを介して、第２のビーズに連結され得る。タンパク質相互作用などの非共有結合相互作用は、水素結合、ファンデルワールス力、双極子－双極子相互作用、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。共有結合は、結合反応（例えば、アミド結合形成）又はクリックケミストリー（例えば、シュタウディンガーライゲーション又はディールス・アルダー反応）などの様々な化学反応を使用してビーズ間に形成され（例えば、合成的に形成され）得る。
第２のビーズに解放可能に結合された第１のビーズを含む解放可能に結合されたビーズ対は、第２のビーズからの第１のビーズの解放を刺激する刺激（例えば、熱的又は化学的な刺激）を受けてもよい。刺激は、温度変化及び／又は化学的刺激（例えば、ｐＨ及び／又はイオン濃度の変化）を含み得る。
或いは、不可逆的に結合された第１のビーズ及び第２のビーズのセット（例えば、各々が第２のビーズに不可逆的に結合された第１のビーズを含むビーズ対のセット）が生成され得るように、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットも調製され得る（例えば、合成される）。また、ビーズの第１のセットの第１のビーズは、ビーズの第２のセットの第２のビーズに除去不能に結合されてもよい。この除去不能な結合は、共有化学結合を介した第１のビーズと第２のビーズとの間の架橋を含み得る。
ビーズの第１及び第２のセットのビーズの初期調製（例えば、合成）に続いて、第１のビーズ及び／又は第２のビーズの様々な組み合わせを区別することができるサイズ選択プロセスを実施することができる。例えば、サイズ選択プロセスは、第２のビーズに結合された第１のビーズを含むビーズ対と、２つの第１のビーズを含むビーズ対又は２つの第２のビーズを含むビーズ対とを区別することができる。濾過プロセスなどのサイズ選択プロセスを使用して、ビーズの塊又は凝集体を分離し、及び／又は複数のビーズを含む溶液から破片を除去することもできる。
ペアエンド配列リードを生成するための方法
本明細書に記載されるように、本開示の方法は、増幅及び／又は配列決定プロセスを実行する場合、パーティション（例えば、液滴）内の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）に対するビーズの増加した比率（例えば、＞２）を利用し得る。これは、少なくとも部分的には、サンプル又は鋳型の損失が減少した所定の核酸分子のより高いクローンコピー数を生成する能力に起因して、サンプル分析中の精度及び感度の向上をもたらす。より高いビーズ対核酸分子比率の使用とペアエンドアダプターの使用とを組み合わせることにより、生体サンプルの核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）を分析するための更に高い精度及び感度を有する方法を提供することができる。
ある場合には、本明細書において提供される方法は、生体サンプルの核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）の配列と会合し得るペアエンド配列決定リードを生成することを含み得る。ペアエンド配列決定リードの生成は、本明細書で提供される方法の感度及び精度を高め得る。
ペアエンド配列決定リードを生成するための１つ以上のステップを含む本明細書に記載の方法は、粒子の第１のセット（例えば、ビーズ）及び粒子の第２のセット（例えば、ビーズ）を提供することを含み得る（例えば、本明細書に記載されるように）。ビーズの第１のセットの第１のビーズは、生体サンプル（例えば、ターゲット核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ分子）の核酸分子の第１の核酸鎖に結合された第１のアダプターに対して少なくとも部分的な配列相補性を有する第１のプライマー分子（例えば、第１のビーズに結合される）を含み得る。ビーズの第２のセットの第２のビーズは、ターゲット核酸分子の第２の核酸鎖に結合された第２のアダプターに対して配列相補性を有する第２のプライマー分子（例えば、第２のビーズに結合される）を含み得る。第１のプライマー分子は、第２のプライマー分子と異なっていてもよい。或いは、第１及び第２のプライマー分子は、同じ（例えば、同じ核酸配列を含む）又は互いに相補的であってもよい。
ペアエンド配列決定リードを生成することを含む方法は、（ｉ）ビーズの第１のセットの第１のビーズ、（ｉｉ）ビーズの第２のセットの第２のビーズ、及び（ｉｉｉ）生体サンプルの核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）を分割（例えば、共分割）することを含んでもよく、この場合、核酸分子は、核酸分子の第１鎖に結合された第１のアダプター及び核酸分子の第２鎖に結合された第２のアダプターをパーティション（例えば、エマルジョン中の水性液滴などの液滴）内に含む。分割は、本明細書で提供される方法に従って達成されてもよく、複数のパーティション（例えば、複数の液滴又はウェル）を提供してもよく、該パーティションの少なくとも１つのサブセットはそれぞれ、ビーズの第１のセットの少なくとも１つの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの少なくとも１つの第２のビーズ並びに複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を含んでもよく、その核酸分子は、第１のアダプター配列を含む第１鎖及び第２のアダプター配列を含む第２鎖を含んでもよい。第１及び第２のアダプター配列は、ペアエンドアダプター配列であってもよい。また、複数の核酸分子の所定の核酸分子の各鎖は、鋳型核酸配列も含み得る。
ペアエンド配列決定リードを生成することを含む方法は、（ｉ）ビーズの第１のセットの第１のビーズ、（ｉｉ）ビーズの第２のセットの第２のビーズ、及び（ｉｉｉ）生体サンプルの核酸分子（例えば、ターゲット一本鎖核酸分子）を分割（例えば、共分割）することを含んでもよく、この場合、核酸分子は、それに結合された第１のアダプター及び第２のアダプターに対して相補的な領域（例えば、配列）をパーティション（例えば、エマルジョン中の水性液滴などの液滴）内に含む。分割は、本明細書で提供される方法に従って達成されてもよく、複数のパーティション（例えば、複数の液滴又はウェル）を提供してもよく、該パーティションの少なくとも１つのサブセットはそれぞれ、ビーズの第１のセットのうちの少なくとも１つの第１のビーズ及びビーズの第２のセットのうちの１つの第２のビーズ並びに複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を含んでもよく、その核酸分子は、それに結合された第１のアダプター配列と第２のアダプター配列に対して相補的な領域（例えば、配列）とを含んでもよい。第１及び第２のアダプター配列は、ペアエンドアダプター配列であってもよい。
ビーズの第１のセットの少なくとも１つの第１のビーズ、ビーズの第２のセットの１つの第２のビーズ、及び、核酸分子の第１鎖に結合された第１のアダプターと核酸分子の第２鎖に結合された第２のアダプターとを含む複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を含むパーティションは、第１の核酸分子の第１鎖の１つ以上のコピー又はその相補体、及び／又は、第２のアダプターに結合された第２の核酸分子の第２鎖の１つ以上のコピー又はその相補体を生成するのに十分な条件に供され得る。第１鎖及び／又は第２鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体を生成することは、第１及び第２のビーズと核酸分子とを含むパーティションを、プライマー伸長反応及び／又は核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）を実施するのに十分な条件に供することを含み得る。反応は、１つ以上の試薬の使用を含んでもよく、この１つ以上の試薬は、パーティション内に含まれてもよい。第１のビーズの第１のプライマー分子は、第１鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体を生成するために使用され得る。第１鎖の１つ以上のコピー及び／又はその相補体は、第１のビーズに結合されてもよく、したがって、更なる増幅反応（例えば、指数関数的増幅）のための鋳型として使用され得る。第２のビーズの第２のプライマー分子は、第２鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体を生成するために使用され得る。第２鎖の１つ以上のコピー及び／又はその相補体は、第２のビーズに結合されてもよく、したがって、更なる増幅反応（例えば、指数関数的増幅）のための鋳型として使用され得る。第１鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体の配列は、第２鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体の配列と少なくとも部分的に重複し得る。
本明細書に記載の生体サンプルを分析するために、任意の有用なタイプの反応（例えば、任意の核酸増幅反応）を使用してターゲット核酸分子を処理し、ターゲット核酸分子の１つ以上のコピー又はその相補体（例えば、増幅産物）を生成することができる。増幅は、エマルジョン系であってもよく、非エマルジョン系であってもよい。本明細書に開示される方法と組み合わせて使用され得る核酸増幅反応の非限定的な例としては、逆転写、プライマー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、非対称増幅、ローリングサークル増幅、及び多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。本明細書に記載の方法を使用して生成され得る増幅産物は、ＤＮＡであってもよい。ターゲットＲＮＡを増幅する場合、ＲＮＡの逆転写によってＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））を取得し、その後ＤＮＡを増幅して増幅ＤＮＡ産物を生成することができる。増幅されたＤＮＡ産物は、生体サンプル中のターゲットＲＮＡの存在を示し得る。ＤＮＡを増幅する場合、どのようなＤＮＡ増幅方法を用いてもよい。ＤＮＡ増幅法の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲの変異体（例えば、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ（例えば、ｅＰＣＲ）、ダイヤルアウトＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプリマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、線形ＤＮＡ増幅を含み得る。本明細書に記載の方法は、指数関数的ＤＮＡ増幅を含み得る。ＤＮＡ増幅は、増幅されたＤＮＡ産物を検出する感度を改善し得るネステッドＰＣＲによって達成され得る。更に、生体サンプルを分析するための精度及び／又は感度（例えば、信号対雑音比を増加させることによって、）を高めるために、ペアエンドアダプターをＰＣＲ増幅に使用することができる。
増幅されたターゲット核酸の存在を示す検出可能な量の増幅産物を増幅がもたらす期間は、ターゲット核酸が取得された生体サンプル、実施される特定の核酸増幅反応、増幅反応の特定のサイクル数（例えば、最大１２０分）、及び複数の液滴の生成などの実施される分割プロセスに応じて変化し得る。ターゲット核酸分子の増幅は、２４０分以下、１２０分以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３５分以下、３０分以下、２５分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、又は、５分以下の期間にわたってターゲット核酸の存在を示す検出可能な量の増幅産物をもたらし得る。
ビーズの第１のセット（例えば、複数のビーズ）からの第１のビーズは、ビーズの第２のセット（例えば、複数のビーズ）からの第２のビーズに解放可能に（例えば、熱的及び／又は化学的に解放可能に）結合され得る。同様に、ビーズの第１のセットの更なるビーズは、解放可能に結合された第１のビーズ及び第２のビーズのセットが存在し得るように、ビーズの第２のセットの更なるビーズに解放可能に結合され得る。例えば、第１のビーズは、第２のビーズに解放可能に結合されてもよく、それにより、ビーズは、刺激（例えば、熱刺激、化学刺激、又は光刺激）の適用時に互いに解放可能であってもよい。同様に、第１及び／又は第２のビーズセットのビーズに結合したプライマー分子は、熱、化学、又は光刺激などの刺激の適用時にビーズから解放可能であってもよい。
解放可能に結合された第１のビーズ及び第２のビーズは、非共有結合相互作用又は結合（例えば、タンパク質相互作用）又は共有結合を介して結合され得る。第１のビーズは、１つ以上の化学リンカーを介して、及び／又は１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドを介して、第２のビーズに連結され得る。タンパク質相互作用などの非共有結合相互作用は、水素結合、ファンデルワールス力、双極子－双極子相互作用、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。共有結合は、結合反応（例えば、アミド結合形成）又はクリックケミストリー（例えば、シュタウディンガーライゲーション又はディールス・アルダー反応）などの様々な化学反応を使用してビーズ間に形成され（例えば、合成的に形成され）得る。
第２のビーズに解放可能に結合された第１のビーズを含む解放可能に結合されたビーズ対は、第２のビーズからの第１のビーズの解放を刺激する刺激（例えば、熱的又は化学的な刺激）を受けてもよい。刺激は、温度変化及び／又は化学的刺激（例えば、ｐＨ及び／又はイオン濃度の変化）を含み得る。
或いは、不可逆的に結合された第１のビーズ及び第２のビーズのセット（例えば、各々が第２のビーズに不可逆的に結合された第１のビーズを含むビーズ対のセット）が生成され得るように、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットも調製され得る（例えば、合成される）。また、ビーズの第１のセットの第１のビーズは、ビーズの第２のセットの第２のビーズに除去不能に結合されてもよい。この除去不能な結合は、共有化学結合を介した第１のビーズと第２のビーズとの間の架橋を含み得る。
ビーズの第１及び第２のセットのビーズの初期調製（例えば、合成）に続いて、第１のビーズ及び／又は第２のビーズの様々な組み合わせを区別することができるサイズ選択プロセスを実施することができる。例えば、サイズ選択プロセスは、第２のビーズに結合された第１のビーズを含むビーズ対と、２つの第１のビーズを含むビーズ対又は２つの第２のビーズを含むビーズ対とを区別することができる。濾過プロセスなどのサイズ選択プロセスを使用して、ビーズの塊又は凝集体を分離し、及び／又は複数のビーズを含む溶液から破片を除去することもできる。
本明細書に記載されるように、第１鎖（例えば、生体サンプルの第１の核酸分子）は第１のアダプター（例えば、第１のペアエンドアダプター）に結合されてもよく、第２鎖（例えば、生体サンプルの第２の核酸分子）は第２のアダプター（例えば、第１のペアエンドアダプター）に結合されてもよい。第１及び／又は第２のアダプターは、核酸配列決定プロセス（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）に関与し得る。第１のアダプターは、第１のサブパート及び第２のサブパートを含むことができ、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有することができる。配列相補性は、一般に、対になっている配列と相補的な配列を指す。同様に、第２のアダプターは、第１のサブパート及び第２のサブパートを含むことができ、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有することができる。アダプターの１つ以上の部分は、異なる融解温度を有してもよい。例えば、アダプターは、第１の融解温度を有する第１の部分と、第２の融解温度を有する第２の部分とを備えてもよく、第１の融解温度は第２の融解温度よりも高い。例えば、アデニン、チミン及びイノシンが濃縮された配列を含むアダプターを使用することによって、異なる融解温度が付与され得る。そのようなアダプターは、それらが結合している核酸分子のその後の処理のためのアクセスを提供するために、アダプターの部分的な変性を促進し得る。
本明細書に記載されるように、核酸配列決定（例えば、ＮＧＳ）は、１つのパーティション又は複数のパーティション（例えば、複数の液滴又はウェル）で行なわれ得る。そのようなパーティション（例えば、複数のパーティション）は、少なくとも（ｉ）ビーズの第１のセットからの１つの第１のビーズ、（ｉｉ）ビーズの第２のセットからの少なくとも１つの第２のビーズ、及び、（ｉｉｉ）第１鎖（例えば、第１の核酸分子）に結合された第１のアダプターと第２鎖（例えば、第２の核酸分子）に結合された第２のアダプターとを含む生体サンプル（又はその特定の割合の量）（例えば、核酸分子）を含み得る。パーティションは、液滴であってもよく又はウェルであってもよい。
本明細書中に記載のペアエンド配列リードを含む方法は、第１のアダプターとの配列相補性を有する第１のプライマー分子（例えば、図８の部分１－８）を伴うビーズの第１のセットからの第１のビーズと、第２のアダプターとの配列相補性を有する第２のプライマー分子（例えば、図８の部分４－８）を伴うビーズの第２のセットからの第２のビーズとを与えることを含み得る（例えば、図８参照）。その後、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットは、複数のパーティションのうちの所定のパーティションがビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズを含むように、複数のパーティション間で分布（例えば、ランダムに分布）され得る（例えば、本明細書に記載されるように）。図７に示すように、核酸分子７０５は、第１鎖及び第２鎖を含んでもよく、第１鎖は第２鎖に対して配列相補性を有する。アダプター１～７及び４～７は、両端からの核酸増幅が重複領域を作り出すように選択され得る。アダプター１～７は相補配列７０３に対応し、アダプター４～７は相補配列７０２に対応する。重複は、生体サンプルの第１鎖のコピー又はその相補体と、生体サンプルの第２鎖のコピー又はその相補体とのマッチングを可能にし得る。重複は、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，２５０，３００，３５０又はそれを超える塩基対（例えば、各鎖のコピーの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，２５０，３００，３５０個又はそれを超えるヌクレオチド又はその相補体）を含み得る。第１鎖及び第２鎖又はそのコピーもしくは相補体の核酸配列決定（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）は、重複の全部又は一部を含む配列リードを提供し得る。重複領域は、２つのアダプター間に位置されてもよい。例えば、第１鎖は、第１のアダプター及び第３のアダプターを含んでもよく、第１及び第３のアダプターは第１の鋳型配列に隣接し、また、第２鎖は、第２のアダプター及び第４のアダプターを含んでもよく、第２及び第４のアダプターは第２の鋳型配列に隣接し、この場合、第１の鋳型配列は第２の鋳型配列に対して配列相補性を有し得る。これらのアダプターは、一本鎖アダプターであってもよい。第３及び第４のアダプターは、それぞれ第２及び第１のアダプターの相補体であってもよい。或いは、二本鎖アダプターが使用されてもよい。そのようなシステムが図７に示されており、この場合、第１のアダプターは、第１のサブパート（例えば、図７の部分１－７）及び第２のサブパート（例えば、図７の配列７０３）を含み、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有し得る。第２のアダプターは、第１のサブパート（例えば、図７の部分４－７）及び第２のサブパート（例えば、図７の配列７０２）を有し、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有し得る。第１鎖及び第２鎖を含む生体サンプル（例えば、核酸分子）は、ビーズの第１のセットからの第１のビーズ及びビーズの第２のセットからの第２のビーズを伴って１つのパーティション（例えば、１つ以上の液滴又はウェル）に分割されてもよい（例えば、本明細書に記載されるように）。パーティションに含まれる材料は、その後、核酸増幅反応及び／又は核酸配列決定に供され得る。生体サンプルは、図７に示すような核酸分子であってもよい。核酸分子は、複数の塩基対を含む重複領域（例えば、白色で示される図７の核酸分子７０５）を含む。第１及び第２のビーズを伴うパーティション分割に続いて、パーティション中の材料を核酸配列決定に供して、核酸分子の第１鎖及び第２鎖に対応する配列リードを提供することができる。一例として、システムリード長が約１０００ヌクレオチドであり、生体サンプルの長さが約１８００ヌクレオチドである場合、第１鎖に対応する約１０００ヌクレオチドの配列リード及び第２鎖に対応する約１０００ヌクレオチドの配列リードが生成されてもよく、この場合、第１及び第２の配列リードは約２００ヌクレオチドの重複を有する。
本明細書に記載の生体サンプルを分析及び／又は処理するための方法は、第１のアダプターと配列相補性を有する第１のプライマー分子（例えば、図８の部分１－８）を伴うビーズの第１のセットの第１のビーズと、第２のアダプターと配列相補性を有する第２のプライマー分子（例えば、図８の部分４－８）を伴うビーズの第２のセットの第２のビーズとを含み得る（例えば、図８参照）。ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズは、解放可能に結合されてもよい。したがって、ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズを含む解放可能に結合されたビーズ対を形成することができる。第１のビーズと第２のビーズとの結合は、本明細書に記載のタンパク質相互作用又は共有結合によって達成され得る。そのような解放可能に結合されたビーズ対のセットを調製することができ、この場合、各ビーズ対は、ビーズの第２のセットのビーズに解放可能に結合されたビーズの第１のセットのビーズを含む。解放可能に結合された第１のビーズ及び第２のビーズのセットの調製中に、サイズ選択プロセスを実行して、第１のビーズ及び／又は第２のビーズの他の組み合わせとは別個の解放可能に結合された第１のビーズ及び第２のビーズの対を識別又は選択することができる（例えば、ビーズの第１のセットの２つのビーズ又はビーズの第２のセットの２つのビーズを含む対）。本明細書に記載されるように、第２のビーズに解放可能に結合された第１のビーズを含む解放可能に結合されたビーズ対は、刺激（例えば、熱的又は化学的刺激）を受けることができる。刺激の適用は、第１のビーズを第２のビーズから解放することができる。
生体サンプルの第１鎖及び第２鎖は、それぞれが二本鎖アダプターであってもよい２つの別個のアダプター、すなわち、第１のアダプター及び第２のアダプターに隣接し得る。第１のアダプターは、第１のサブパート（例えば、図７の部分１－７）及び第２のサブパート（例えば、図７の配列７０３）から構成され、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有することができる（例えば、図７参照）。第２のアダプターは、第１のサブパート（例えば、図７の部分４－７）及び第２のサブパート（例えば、図７の配列７０２）を有し、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有し得る。（例えば、図７参照）その後、生体サンプルは、ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズを伴ってパーティションに分割される（例えば、１つ以上のエマルジョン中の１つ以上の液滴）。パーティション内に配置された又は存在する材料及び／又は構成要素（例えば、液滴）は、その後、核酸増幅及び核酸配列決定（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）などの後続の処理に供され得る。
本開示の方法は、第１のアダプターと配列相補性を有する第１のプライマー分子を（例えば、図８の部分１～８によって示されるように）含むビーズの第１のセットの第１のビーズと、第２のアダプターと配列相補性を有する第２のプライマー分子を（例えば、図８の部分４－８によって示されるように）含むビーズの第２のセットの第２のビーズとを含み得る（例えば、図８参照）。ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズは、解放不能に（例えば、不可逆的に）結合されて、ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズを含むビーズ対を形成し得る。第１のビーズと第２のビーズとの結合は、タンパク質相互作用、共有結合、１つ以上の化学リンカーを介して、及び／又は１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドを介して達成され得る。そのような解放不能に結合されたビーズ対のセットを調製することができ、この場合、各ビーズ対は、ビーズの第２のセットのビーズに解放不能に結合されたビーズの第１のセットのビーズを含む。解放不能に結合された第１のビーズ及び第２のビーズのセットの調製中に、サイズ選択プロセスを実行して、第１のビーズ及び／又は第２のビーズの他の組み合わせとは別個の第１のビーズ及び第２のビーズの対を識別及び／又は選択することができる（例えば、ビーズの第１のセットの２つのビーズ又はビーズの第２のセットの２つのビーズを含む対）。
生体サンプルは（例えば、第１鎖及び第２鎖を含む図７の核酸分子７０５によって示されるように）、両端からの核酸増幅が重複するように選択されてもよい（例えば、図７参照）。重複は、生体サンプルの第１鎖のコピーと生体サンプルの第２鎖のコピーとのマッチングを可能にする。生体サンプルは、２つの別個のアダプター、すなわち、第１のアダプター及び第２のアダプターに隣接していてもよく、それぞれが二本鎖アダプターであってもよい。第１のアダプターは、（例えば、図７の部分１～７によって示されるような）第１のサブパート及び（例えば、図７の配列７０３によって示されるような）第２のサブパートから構成されてもよく、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有してもよい（例えば、図７参照）。第２のアダプターは、（例えば、図７の部分４－７によって示されるような）第１のサブパート及び（例えば、図７の配列７０２によって示されるような）第２のサブパートを含み、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有してもよい（例えば、図７参照）。その後、生体サンプルは、ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズを伴ってパーティション（例えば、１つ以上の液滴又はウェル）に分割される（例えば、１つ以上の液滴に分割される）。その後、パーティション内の材料は、核酸増幅及び／又は核酸配列決定などの後続の処理に供される。
本開示は、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットを提供することを含む、生体サンプル（例えば、第１鎖及び第２鎖を含む核酸分子）を処理するための方法を更に提供する。ビーズの第１のセットの第１のビーズは、生体サンプルの第１鎖に結合された第１のアダプターに対して配列相補性を有する第１のプライマー分子を含み得る。ビーズの第２のセットの第２のビーズは、生体サンプルの第２鎖に結合された第２のアダプターに対して配列相補性を有する第２のプライマー分子を含み得る。第１のプライマー分子は、第２のプライマー分子と異なっていてもよい。
方法は、（ｉ）ビーズの第１のセットの第１のビーズ、（ｉｉ）ビーズの第２のセットの第２のビーズ、及び（ｉｉｉ）第１鎖に結合された第１のアダプター及び第２鎖に結合された第２のアダプターを含む生体サンプルをパーティションに分割すること（例えば、１つ以上の液滴を生成すること）を含み得る。分割は、例えば、エマルジョン又はウェル中の液滴を使用して達成され得る。
第１及び第２のビーズと生体サンプルとを含むパーティションは、第１のアダプターに結合された第１鎖の１つ以上のコピー又はその相補体、及び／又は、第２のアダプターに結合された第２鎖の１つ以上のコピー又はその相補体を生成するのに十分な条件に供され得る。第１鎖及び／又は第２鎖の１つ以上のコピー、又はそれらの相補体を生成することは、プライマー伸長反応及び／又は核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ、例えば、ｅＰＣＲ）を実施するのに十分な条件に第１及び第２のビーズ及び生体サンプルを供することを含み得る。第１のビーズの第１のプライマーは、第１鎖の１つ以上のコピー、及び／又はその相補体を生成するために使用され得る。第１鎖の１つ以上のコピー及び／又はその相補体は、第１のビーズに結合されてもよく、増幅反応（例えば、線形又は指数関数的増幅）に使用されてもよい。第２のビーズの第２のプライマーは、第２鎖の１つ以上のコピー及び／又はその相補体を生成するために使用され得る。第２鎖の１つ以上のコピー及び／又はその相補体は、第２のビーズに結合されてもよく、増幅反応（例えば、線形又は指数関数的増幅）に使用されてもよい。第１鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体の配列は、第２鎖の１つ以上のコピー、又はその相補体の配列と少なくとも部分的に重複し得る。本明細書に記載されるように、増幅産物（例えば、第１鎖及び／又は第２鎖又はその相補体の１つ以上のコピー）を生成するために、任意のタイプの核酸増幅反応を使用することができる。第１鎖の１つ以上のコピーは、第２鎖の１つ以上のコピーと重複しなくてもよい。
複数のパーティションのうちの少なくとも１つのパーティションは、少なくとも第１のビーズ、第２のビーズ、並びに第１及び第２のサンプル核酸分子に加えて、材料又は成分を含み得る。パーティションの更なる成分は、合成核酸分子であってもよい。合成核酸分子は二本鎖であってもよい。合成核酸分子は、開裂可能要素を含み得る。開裂可能要素は、合成核酸分子の成分の分離を可能にし得る。分離は、化学的、光、熱又は他の手法によって達成され得る。また、合成核酸分子は、ライゲーション及び／又は環状化に供され得る。ライゲーション及び／又は環状化の際に、合成核酸分子を開裂して、開裂された合成核酸分子を提供することができる。その後、開裂された合成核酸分子は、増幅反応（例えば、本明細書に記載されるように、）によってギャップ装填に供され得る。これに代えて又は加えて、パーティションは、１つ以上の試薬、例えば、細胞を溶解もしくは透過処理するための又はプライマー伸長もしくは増幅反応（例えば、ヌクレオチド及び重合酵素）に使用するための１つ以上の試薬を含み得る。
本明細書に開示されるように、生体サンプルを分析及び／又は処理するための方法は、ビーズの第１のセットの第１のビーズを、ビーズの第２のセットの第２のビーズに解放可能に結合させることができる。ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズは、タンパク質相互作用又は共有結合を介して解放可能に結合され得る。タンパク質相互作用は、水素結合、ファンデルワールス力、双極子－双極子相互作用、又はそれらの任意の組み合わせを指し得る。共有結合は、結合反応及び／又はクリックケミストリーなどの様々な化学反応を使用してビーズ間で形成（例えば、合成的に形成）され得る。
第２のビーズに解放可能に結合された第１のビーズは、刺激に供され得る。刺激は、第２のビーズからの第１のビーズの解放を引き起こす。刺激は、温度変化であってもよく、化学的刺激であってもよい。或いは、ビーズの第１のセットの第１のビーズは、ビーズの第２のセットの第２のビーズに除去不能に結合されてもよい。この除去不能な結合は、第１のビーズと第２のビーズとの間の架橋（例えば、共有連結）を含み得る。
生体サンプルを分析及び／又は処理するための本開示の方法において、方法は、ビーズの第１のセット及び／又はビーズの第２のセットを含む複数のビーズを調製すること（例えば、合成すること）を含み得る。ビーズの第１のセット又はビーズの第２のセットは、例えば、ポリマービーズであってもよい。ビーズは、ヒドロゲルビーズであってもよい。ビーズは、ＰＥＧ層又はヒドロゲルなどのコーティングを有していてもよい。ビーズの複数のセットが使用される場合、ビーズの複数のセットは、同じコアビーズ又は異なるコアビーズを含有する（例えば、同じ又は異なる材料を含む）ことができる。例えば、ビーズの第１のセットのうちのビーズが第１の材料から調製されてもよく、ビーズの第２のセットのうちのビーズが第２の材料から調製されてもよく、第１の材料は第２の材料と同じであっても異なっていてもよい。第１及び第２のプライマー分子は、ビーズの第１及び第２のセットの調製（例えば、合成）中に、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットにそれぞれ提供され得る。或いは、第１及び第２のプライマー分子は、ビーズの第１及び第２のセットの調製後に、ビーズの第１のセット及びビーズの第２のセットに（例えば、まだプライマー分子を含まない「コアビーズ」に）それぞれ提供され得る。プライマー分子がその後のプロセスでビーズに固定化される場合、ビーズの第１及び第２のセットのビーズは別々に更に処理され得る。各ビーズセットにおけるプライマー分子は、様々な化学反応を使用してビーズに固定化され得る。結合は、例えば、アミド、エステル又はジスルフィド官能基を介して起こり得る。クリックケミストリー（例えば、シュタウディンガーライゲーション又はディールス・アルダー化学）は、ビーズへのプライマーの固定化に使用され得る。固定化されたプライマー分子は、更なる下流側の化学反応を用いて更に修飾され得る。
本明細書に記載されるように、ビーズはビーズ対を成して提供され得る。ビーズ対のビーズは、互いに解放可能又は解放不能に（例えば、不可逆的に）結合され得る（例えば、本明細書に記載されるように）。ビーズ対は、ビーズの第１のセットの第１のビーズ及びビーズの第２のセットの第２のビーズを含み得る（例えば、本明細書に記載されるように）。
生体サンプルを分析及び／又は処理するための本明細書に開示される方法は、核酸配列決定（例えば、ＮＧＳ）を受け得る第１鎖の１つ以上のコピー及び第２鎖の１つ以上のコピーを含み得る。本明細書に記載されるように、核酸配列決定は、合成又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による配列決定を含み得る核酸増幅反応の一種である。核酸増幅及び／又は配列決定は、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応（ｅＰＣＲ）を含み得る。本明細書に開示されるように、ｅＰＣＲなどのＰＣＲは、エマルジョン液滴などのパーティションで行なわれてもよく、その少なくとも１つのサブセットはそれぞれ、第１のプライマー分子を含む少なくとも１つの第１のビーズ、第２のプライマー分子を含む１つの第２のビーズ、並びに、第１及び第２のアダプターを含む第１及び第２の核酸鎖をそれぞれ含んでもよく、第１及び第２のアダプター（例えば、ペアエンドアダプター）はそれぞれ第１及び第２のプライマー分子に対して少なくとも部分的な配列相補性を有し得る。
第１のアダプターは、第１のサブパート及び第２のサブパートを含むことができ、第１のサブパートは、第２のサブパートに対して配列相補性を有する（例えば、図７に示すように）。配列相補性は、一般に、対になっている配列に対して相補的な配列を指す。
複数のパーティションの各パーティション（例えば、各液滴又はウェル）は、ビーズの第１のセットの少なくとも１つの第１のビーズ、ビーズの第２のセットの少なくとも１つの第２のビーズ、及び、第１鎖に結合された第１のアダプター及び第２鎖に結合された第２のアダプターを含む生体サンプルを含み得る。パーティションは、液滴又はウェルであってもよい。
生体サンプルを分析するための本明細書に記載の方法は、それぞれが特定のアダプターに対応するプライマー配列を含む２種類のビーズ（例えば、第１のビーズ及び第２のビーズ）を含んでもよく、この場合、アダプターは、１つ以上の鋳型配列を含む生体サンプルの核酸分子に結合され得る。核酸分子の鋳型配列は、アダプターに含まれる１つ以上のバーコード配列によって同定可能であってもよい。ターゲット核酸ライブラリーインサート（例えば、図７の核酸分子７０５によって示される）の長さは、両端からの核酸配列決定が重複を全く有さない又は非常に最小限の重複を有する配列リードを提供するように選択され得る。インサートは、末端修復及びＡテール加工されてもよい。合成二本鎖核酸分子は、合成二本鎖が好ましくは末端ホスフェートを伴うことなくＴオーバーハングを含有し得るように、インサートとループしてライゲートし得るように設計され得る。合成二本鎖核酸分子の配列は、以下の通り、すなわち、バーコード２’、ＰＢ’開裂可能要素、ＰＡ、バーコード１であってもよい。バーコード１及びバーコード２’は市販されている場合があり、バーコード１及びバーコード２’は異なる配列であってもなくてもよい。本明細書に記載の方法で使用されるバーコード配列は、互いに対して割り当てられるように十分に定義され得る。開裂可能要素は、化学的、光、熱、又は他の機構による合成二本鎖核酸分子の鎖の分離を可能にし得る。ライゲーション及び環状化の後、合成二本鎖核酸分子を開裂してポリメラーゼに基づく伸長によってギャップ装填することができる。２つのタイプのビーズ（例えば、図８の部分８０６を参照）がクローン増幅のために利用可能であってもよく、１つのタイプのビーズは固定化ＰＡ（１－２）オリゴヌクレオチドを伴い又はＰＡのサブ部分を最小限に含み、もう１つのタイプのビーズはＰＢ（４－２）オリゴヌクレオチドを伴い又はＰＢのサブ部分を最小限に含む。
増幅プロセスが完了すると、複数のパーティションに分配された複数のビーズ（例えば、複数のビーズ－核酸分子複合体）は、複数のパーティション（例えば、液滴又はウェル）から回収されてもよく、ビーズ（例えば、複数のビーズ－核酸分子複合体）は、エマルジョン又は混合物から分離（例えば、磁気的に分離）されてもよい。続いて、先の増幅及び／又は処理工程のいずれかの間に形成され得る核酸分子又はその任意の誘導体をアッセイ又は分析することができる（例えば、シーケンサーにおいてヌクレオチド配列を決定することによって）。ある場合には、ビーズに結合された核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）のみが配列決定される。他の場合では、ビーズに結合されていない核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）のみが配列決定される。ある場合には、ビーズに結合された核酸分子とビーズに結合されていない核酸分子（例えば、増幅産物又はその誘導体）の両方が配列決定される（例えば、同時に又は別々に）。
したがって、本明細書に開示される方法の利点は、生体サンプルが低量及び／又は低濃度の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）を含有する場合に特に重要であり得る。同様に、本開示の方法の精度及び感度は、稀な対立遺伝子を検出するために（例えば、癌の診断及び検出において）サンプルを分析するときに特に重要であり得る。
クローン増幅のための方法及びシステム
増幅後にモノクローナルビーズを確保にするために液滴にシングルビーズ及び単一鋳型を装填する、プライマービーズのクローン増幅のためのエマルジョンＰＣＲの以前の方法は、二重ポアソン分布に起因して大量の試薬が有効に利用されていないという問題を抱え得る。図１０Ａは、シングルビーズ及び単一の鋳型を含む液滴を達成するための概略図の一例を示す。液滴が最大でもシングルビーズ及び／又は最大でも単一の鋳型を有するようにするべく、ポアソン分布に従って液滴に試薬（例えば、鋳型１０１０及びビーズ１００８）を装填することができる。しかしながら、図１０Ａに示されるように、これは、ビーズ１００２及び鋳型１００４を有する液滴のごく一部（例えば、液滴１０００）をもたらし得る。これにより、分割のために入力されるビーズ１００８及び鋳型１０１０の初期量に対してわずかな増幅ビーズ１００６しか得られない。また、そのような手順は、エマルジョン液滴の多くがビーズを欠く（例えば、液滴１０１２）、鋳型を欠く（例えば、液滴１０１４）、又はビーズと鋳型の両方を欠く（例えば、液滴１０１６）ため、増幅試薬を非効率的に使用し得る。幾つかのプロトコルは、全ての液滴の約２０～３０％のみに鋳型を装填することを提案することができる。鋳型は、ポアソン分布に従って分布することができる。３０％装填では、全ての増幅されたビーズの１５％未満がポリクローナルビーズである可能性が高い（パーティション内に２つ以上の鋳型）。しかしながら、鋳型を含まない全ての液滴（例えば、残りの７０％）は、下流側処理のために機能的ではなく、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマービーズ及びプライマーなどの試薬は、それらの液滴中で浪費される。幾つかの例において、ビーズは、また、「機能的」液滴の数を更に希釈するポアソン分布に従って装填される（例えば、シングルビーズ及び少なくとも１つのビーズを有する）。第２の欠点は、増幅されたプライマービーズのみに関心がある場合、増幅されたビーズを増幅されていないビーズ（例えば、鋳型を含まないパーティションに由来するビーズ）から選別するために更なる濃縮ステップが必要であることである。
これに対し、図１０Ｂを参照すると、本明細書に開示される方法、システム及び組成物は、液滴１０２０の多くが複数の鋳型を含有し、それでも下流側処理に実行可能なモノクローナルビーズ１０２２を生成するように、実質的により多くの鋳型１０１８をエマルジョンに装填することができる。本明細書に記載の特徴がなければ、そのような鋳型の過剰装填（例えば、複数の装填）は、増幅後に大きな割合のポリクローナルビーズ（例えば、複数の鋳型から誘導されるコピーを含むビーズ）をもたらすと予想される。しかしながら、本明細書に記載の方法、システム及び組成物を使用すると、結果として生じるビーズ（例えば、増幅ビーズ）は実質的にモノクローナル（例えば、モノクローナルビーズ１０２２）のままである。したがって、本明細書において、複数の鋳型及びビーズ（又は他の担体、例えば表面）を含むパーティションを含む方法、システム及び組成物、並びに、複数の鋳型を含むそのようなパーティションからモノクローナルビーズ（又は他の担体、例えば表面）を得るための方法、システム及び組成物が提供される。
有益なことに、ビーズは、また、より効率的に使用され、場合によっては、後の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定のために）で使用される前に、増幅されたビーズのための別個の濃縮手順を必要としないことがある。幾つかの例において、本明細書中に記載される方法は、分割のために入力されるビーズの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９７％の増幅をもたらす。幾つかの例において、本明細書中に記載される方法は、分割のために入力されるビーズの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも又は約９７％の増幅をもたらす。
有益には、鋳型は、また、より効率的に使用され、これは希少な又は貴重なサンプルにとって特に重要である。ある場合には、本明細書中に記載される方法は、分割のために入力される鋳型分子の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９７％の増幅をもたらす。ある場合には、本明細書中に記載される方法は、分割のために入力される鋳型分子の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも又は約９７％の増幅をもたらす。
図１０Ｂに記載された実施形態は、図１０Ａの実施形態よりも効率的であり得る。これは、図１０Ａの実施形態ではモノクローナルビーズがシングルビーズ及び単一の鋳型を有する液滴から生じ得るが、図１０Ｂでは、鋳型の数にかかわらず、ビーズ及び少なくとも１つの鋳型を含む液滴の大部分がモノクローナルビーズをもたらし得るからである。しかしながら、そのような実施形態では、ビーズを欠く液滴は依然として増幅試薬を浪費する。したがって、本開示は、液滴１０２６の大部分が少なくとも１つのビーズ及び少なくとも１つの鋳型を含むように、比較的多数の鋳型１０２４及び比較的多数のビーズ１０２８が液滴の数に対して装填される、図１０Ｃに示すような実施形態を提供する。そのような実施形態は、モノクローナルビーズが少なくとも１つの鋳型及び少なくとも１つのビーズを有する液滴から生じ得るので、試薬の効率的な使用、ビーズの効率的な使用、及び／又は核酸鋳型の効率的な使用をもたらし得る。したがって、本明細書では、少なくとも１つの鋳型及び少なくとも１つのビーズ（又は他の担体、例えば表面）を含むパーティションを含む方法、システム及び組成物、並びに、少なくとも１つの鋳型及び少なくとも１つのビーズ（又は他の担体、例えば表面）を含むそのようなパーティションからモノクローナルビーズ（又は他の担体、例えば表面）を得るための方法、システム及び組成物が提供される。
本明細書に記載の方法は、分割のために入力されるビーズ１０２６の初期量及び／又は核酸鋳型１０２４の初期数に対して多数のモノクローナル増幅ビーズ１０３０をもたらすことができる。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、分割のために入力される鋳型核酸分子の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９７％の増幅及びビーズに対する付着をもたらす。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、分割のために入力される鋳型核酸分子の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも又は約９７％の増幅及びビーズに対する付着をもたらす。
ある場合には、分割に続いて、液滴の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９７％が、少なくとも１つのビーズ及び少なくとも１つの核酸鋳型を含有する。ある場合には、分割に続いて、本明細書に記載の方法は、液滴の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも又は約９７％が少なくとも１つのビーズ及び少なくとも１つの核酸鋳型を含有することをもたらす。
増幅される任意の適切な割合のビーズは、モノクローナルであってもよい。例えば、本明細書に記載の方法は、増幅されたビーズの約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９７％がモノクローナルであることをもたらす。幾つかの例では、増幅されたビーズの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％がモノクローナルである。
核酸鋳型を表面に付着させて増幅することができる。例えば、図１１を参照すると、増幅は、液滴内のエマルジョン中で行なうことができる。エマルジョンの連続相１１００（例えば、油）は、分散相１１０２（例えば、水溶液）を取り囲む。連続相は、分散相を複数のパーティションに分割することができる。複数のパーティションの一部は、ビーズの表面に付着された表面プライマー１１０６（第１のプライマー）の複数のコピーを有する１つ以上のビーズ１１０４を含み得る。複数の第１のプライマーは、第１の配列に対して配列相同性を有していてもよい。また、核酸鋳型１１０８は、分散相のパーティション中にもあり得る。鋳型の一端１１１０は、表面プライマー１１０６にアニールすることができ、及び／又は、表面プライマー１１０６によって増幅することができる。他端１１１２は、第２のプライマー１１１４にアニールすることができ、及び／又は、第２のプライマーによって増幅することができる。場合によっては、第２のプライマー１１１４は、パーティション内の分散相中にあり得る。増幅１１１６に続いて、そのような系は、ビーズに付着した鋳型核酸（又はその逆相補体）の複数の（クローン）コピーを有するビーズをもたらし得る。鋳型のクローンコピーを有するそのようなビーズは、例えば、鋳型の単一コピーから生成され得る信号と比較して配列決定信号を増幅するために、ＤＮＡ配列決定方法において使用され得る。
従来の方法では、分散相が２つ以上の異なる鋳型核酸を含む場合に合併症が生じ得る。異なる鋳型は、核酸ライブラリーの非クローン性メンバーであり得る。例えば、図１２を参照すると、複数のパーティションのうちの１つのパーティション１２００は、第１の核酸鋳型１２０２と、第１の核酸鋳型１２０２とは異なる第２の核酸鋳型１２０４とを含む。鋳型ライブラリーを作成する過程で、共通の第１の末端１２０６及び共通の第２の末端１２０８をそれぞれの鋳型に追加することができる（例えば、ライブラリーメンバーをビーズに付着させて単一のプロトコルを使用して増幅することを容易にするために）。増幅１２１０に続いて、そのような系は、非クローン性（すなわち、第１の鋳型の少なくとも１つのコピー及び第２の鋳型の少なくとも１つのコピーがビーズに付着している）のビーズをもたらし得る。例えば、非クローンビーズがＤＮＡ配列決定方法で使用される場合、配列決定データはクローンビーズと比較して不十分であり得る。両方の鋳型に由来する非クローンビーズからの信号は、シングルビーズの分解能で分解することが困難又は不可能であり得る。
本明細書で認識されるのは、２つ以上の核酸鋳型がパーティション（例えば、液滴）に装填されるが、鋳型のうちの１つのみがビーズ（又は他の担体）に付着して増幅される方法の必要性である。本明細書では、少なくとも上記の（１又は複数の）必要性に対処する方法、システム、及び組成物が提供される。本開示のシステム、方法、及び組成物は、モノクローナルであるビーズの割合を犠牲にすることなく、単一鋳型パーティションに限定される従来の方法よりも少ない試薬を廃棄することができる（すなわち、提示された方法を使用することにより、増幅が可能な少なくとも１つの核酸鋳型分子を含有するより多くの液滴が可能になるからである）。
本開示の方法は、最初に鋳型核酸又はその誘導体を表面に最初に付着させ、続いてそのような付着した鋳型を表面上で増幅させる２つの重要な段階で、分割からクローン増幅までのプロセス全体を制御することを含む。本明細書に記載の方法は、前者の速度を低下させること（すなわち、付着）及び／又は後者の速度を増加させること（すなわち、増幅）を含むことができる。その結果、複数の異なる鋳型の存在下であっても、ほとんどのビーズは単一鋳型のクローンコピーのみを有する。例えば、付着が増幅と比較して遅い及び／又は稀な事象である場合、表面に付着する第１の鋳型は、迅速に増幅され、第２の鋳型が表面に付着することができる前に実質的に全ての表面プライマーを消費する。
図１３を参照すると、エマルジョン液滴１３００は、ビーズ１３０２、鋳型核酸分子１３０４、ビーズ１３０６に付着した第１のプライマー、及び第２のプライマー１３０８を含むことができる。ビーズは、第１の配列に対して配列相同性を有する複数の第１のプライマーを含み得る。また、液滴は、溶液中に第３のプライマー１３１０を含むことができる。鋳型は、第１の末端１３１６及び第２の末端１３１８を備えてもよい。鋳型のいずれの末端も、場合によっては、第２のプライマー１３０６によって伸長される前にビーズ上の第１のプライマー１３０８にアニーリングすることができないことがある。例えば、鋳型の末端配列は、第１の配列に対して相補的でなくてもよい。第２のプライマー１３０８は、第１の部分１３１２と第２の部分１３１４とを有する。第２の部分は、伸長配列を含み得る。第１の部分１３１２は鋳型の第１の末端１３１６にアニールしてもよく、また、複合体を核酸伸長反応に供して、伸長配列又はその相補体を含む伸長産物１３２０を生成することができる。伸長産物１３２０は、伸長配列又はその相補体を使用してビーズ上の第１のプライマー１３０６にアニーリングすることができる。第３のプライマー１３１０は、伸長反応を開始するために、核酸鋳型の第２の末端１３１８又はその相補体にアニーリングすることができる。伸長産物１３２０を増幅してビーズ１３０２に付着したクローン増幅鋳型を作製するために使用することができるビーズ１３２２上の第１のプライマー１３０６のコピーが多数存在し得る。
本明細書に記載の方法及びシステムを使用して、クローン増幅ビーズ（すなわち、ポリクローナルではないビーズ）を作製することができる。図１４を参照すると、エマルジョン液滴１４００は、複数の核酸鋳型分子を有することができる。この図は、第１の鋳型１４０２及び第２の鋳型１４０４を示しているが、２つより多い鋳型が存在してもよい。両方の鋳型は、第２のプライマー１４０６によって伸長され得る。しかしながら、このプロセスは、ビーズ１４０８に付着した第１のプライマーへの伸長産物のアニーリング及び／又は第１のプライマーを使用したビーズ上での指数関数的増幅と比較して、より遅くなる（例えば、より稀に発生する）ように操作される。したがって、少なくとも第１の核酸鋳型の伸長産物からの第１の核酸鋳型のその後の増幅の前に、第２の鋳型ではなく第１の核酸鋳型１４１０から伸長産物が作製される可能性が高い。増幅は伸長及び／又は付着よりも速いため、複数の鋳型が最初に液滴中に装填されたとしても、第１の核酸鋳型１４１５に対応するモノクローナル増幅産物を有するビーズを作製することができる。ビーズを回収することができ、及び／又は、非増幅鋳型をビーズから洗い流すことができる。
核酸鋳型は、一本鎖又は二本鎖であり得る。図１０～図１４は、これらの図が核酸鋳型を表わす単一の線を示す場合であっても、鋳型の単一又は二重鎖を区別しない。図１５Ａは、第１の鋳型１５００及び第２の鋳型１５０２が最初は一本鎖である実施形態を具体的に示す。明確にするために、一本鎖鋳型の５’末端及び３’末端を示す。第２のプライマーの第１の部分１５０４は、鋳型核酸分子の３’末端とハイブリダイズすることができる。その後、第２のプライマー及び第１の核酸鋳型をそれぞれの３’末端から伸長させて、二本鎖伸長産物１５０６を得ることができる。鋳型が一本鎖であることの利点の１つは、伸長産物が作製されるまで第３のプライマー（第３のプライマー）１５０８が鋳型を（直線的にさえ）増幅しないことである。
ある場合には、第２のプライマー（すなわち、伸長プライマー）は、限界濃度を有する。ある場合には、エマルジョン液滴は、伸長プライマーのコピー１５１０を１つだけ有する。そのような場合、伸長プライマーは消費され、第２の核酸鋳型を伸長するために利用できない。第２の鋳型が伸長されない場合、第２の鋳型はビーズに付着したプライマーとハイブリダイズすることができず、増幅されたビーズはモノクローナルである可能性が高い（液滴が最初に多くの異なる鋳型を含有していたとしても）。伸長プライマーの濃度を制限する（低下させる）ことは、液滴中に伸長プライマーが数コピー存在する場合であっても有益であり得る。低濃度の伸長プライマーは、伸長後のビーズ上の増幅率と比較して、伸長反応を起こりにくくすることができる（すなわち、より遅い）。これらのプロセスの速度のこの差は、高い割合のモノクローナルビーズをもたらし得る。場合によっては、第１のプライマーの濃度に対する伸長プライマーの濃度の比率は、約１０－１，１０－２，１０－３，１０－４，１０－５，１０－６，１０－７，１０－８，１０－９以下の程度である。場合によっては、第３のプライマーの濃度に対する伸長プライマーの濃度の比率は、約１０－１，１０－２，１０－３，１０－４，１０－５，１０－６，１０－７，１０－８，１０－９以下程度である。
引き続き図１５Ｂを参照すると、二本鎖伸長産物１５０６中の二本鎖は解離することができ（例えば、変性によって）、伸長産物１５１２の鎖の一方は、ビーズ（表面プライマー）１５１４に付着した第１のプライマーとアニールすることができる（例えば、その３’末端で）。表面プライマーを伸長させることができ（１５１６）、それにより、一本鎖がビーズに付着した二本鎖構築物１５１８が得られる。引き続き図１５Ｃを参照すると、ビーズ１５２０に付着していない二本鎖構築物の鎖は解離し、表面プライマー１５２２の第２のコピーとハイブリダイズすることができる。方法（すなわち、図１５Ｃ）のこの増幅プロセスは、伸長及びアニーリング（すなわち、図１５Ａ～図１５Ｂ）よりも速くすることができる。場合によっては、増幅は指数関数的である。表面プライマーの第２のコピーを伸長させることができる１５２４。第１の表面プライマーの伸長されたコピーを溶液プライマー（第３のプライマー）１５２６と併せて使用して、更に多くの表面プライマーを伸長することができる別の鋳型を作製することもできる。
幾つかの例において、エマルジョン液滴は、増幅速度を促進するために表面に付着していない第１のプライマーの更なるコピーを更に含み得る。図１６Ａを参照すると、二本鎖伸長産物１６００を作製するための鋳型核酸分子の最初の伸長（第２のプライマーを使用）の後、溶液中の伸長産物を指数関数的に増幅するために、溶液１６０２中の幾つかの更なる第１のプライマーを溶液（第３の）プライマー１６０４と併せて使用することができる。この溶液ベースの増幅の利点は、伸長産物１６０６の更なる溶液コピーのため、（１又は複数の）伸長産物が更なる指数関数的増幅のためにビーズに対してより速くアニールできることであり得る。遅い伸長ステップの後、第２の鋳型分子を伸長させることができる前に、残りの方法を迅速に進めることができる。
第１のプライマーを溶液中にも有するという更なる利点があり得る。図１６Ｂを参照すると、第２の（伸長）プライマー１６０８の余分なコピーを第１の鋳型の伸長後に迅速に消費することができ、その結果、それらは第２の鋳型を伸長するために利用できない。第１のプライマーの溶液コピーは、（溶液ベースの増幅と比較して）より遅い表面ベースの増幅に頼ることなく、伸長産物１６１０の更なるコピーを迅速に生成することができる。伸長産物の更なるコピーは、第２のプライマー１６１２の更なるコピーをハイブリダイズ及び消費するための基板であり得る。第２のプライマーの全てのコピーは、それらが第２の核酸鋳型を伸長するために使用され得る前に、第１の核酸鋳型（又はその誘導体コピー）を使用して迅速に伸長され得る。
本明細書に記載のシステム及び方法は、ビーズ上の鋳型のクローン増幅及び／又はエマルジョン中の増幅に限定されないことが理解される。図１７Ａを参照すると、方法は、ガラス、プラスチック、シリコンウェハ、又は任意の他の適切な表面などの表面１７００上で実行することができる。表面は、分離された領域１７０２、１７０４を有することができ、各領域は、表面の領域内に付着された複数の第１のプライマー１７０６を有する。例えば、各領域は、十分なギャップ領域（第１のプライマーの欠如を有する）によって分離され得る。ある場合には、第１の領域における任意の第１のプライマーと第２の領域における任意の第１のプライマーとの間の最小距離は、およそ１０－１，１０－２，１０－３，１０－４，１０－５，１０－６，１０－７，１０－８，１０－９ｍ又はそれ未満であってもよい。鋳型核酸分子１７０８、１７１０のライブラリーは、複数の分離された領域と流体接触することができる。すなわち、本明細書に記載の方法は、複数のエマルジョン液滴で実施される必要はないが、実施されてもよい。
全ての成分が第１のプライマーの複数のクラスターに流体アクセスできる開放表面上の主要な機構は、エマルジョン中で実施される場合と同様であり得る。図１７Ｂを参照すると、第２のプライマー１７１２は、第１核酸鋳型を伸長することができる。図１７Ｃにおいて、伸長産物１７１４は、伸長され得る開放表面上の第１のクラスター上の第１のプライマーのコピーの一方にハイブリダイズし得る１７１６。伸長産物を作製する遅いプロセスに続いて、第２の鋳型に由来する伸長産物が同じクラスター位置でアニールすることができる前に、クラスター位置での第１のプライマーのコピーの実質的に全てが消費され得る（及びクローンであり得る）ように、表面での増幅をより速くすることができる。図１７Ｄを参照すると、第１の核酸鋳型１７１８に対応するクローンクラスターを作成することができる。他のクラスター位置１７２０は、別の（１又は複数の）核酸鋳型のクローン増幅に利用可能であり得る。
場合によっては、第２のプライマーも表面に付着される（溶液中に存在することに代えて又は加えて）。第２のプライマーの濃度は、クラスター内（又はビーズ上）に付着した第１のプライマーの数に対して制限的であり得る（例えば、低い）。これらの実施形態の利点は、本方法の初期プロセスが、第１のプライマーの局所コピーを迅速に消費する後の増幅プロセスと比較して更に減速され得ることであり得る。図１８Ａを参照すると、表面１８００は複数のクラスターを有することができる。クラスターは、（例えば、別個のクラスターの撮像によるＤＮＡ配列決定のために）アレイを形成することができる。クラスターは、幾つかのコピーの第１のプライマー１８０２及びより少ないコピーの第２のプライマー１８０４を有することができる。ある場合には、第１のプライマーの濃度に対する第２のプライマーの濃度の比率は、約１０－１，１０－２，１０－３，１０－４，１０－５，１０－６，１０－７，１０－８，１０－９以下程度である。クラスターは、第１の鋳型１８０６及び第２の鋳型１８０８を含む核酸ライブラリーと流体接触することができる。引き続き図１８Ｂを参照すると、第１の核酸鋳型１８０６を第２のプライマーで伸長して伸長産物を作製することができ、これを続いて第１のプライマー１８０２で増幅してクローンクラスターを作製することができる。
幾つかの実施形態において、第１のプライマーのそれぞれの配列は、表面の異なるクラスター位置（又は異なるビーズ上）で異なる。図１８Ｃを参照すると、第１のクラスター位置１８１２（又は第１のビーズ上）にある複数の第１のプライマー１８１０は、第２のクラスター位置１８１６（又は第２のビーズ上）にある複数の第１のプライマー１８１４とは異なる配列を有する。また、第２のプライマーは、異なるクラスター又はビーズ位置で異なり得る。ある場合には、第２のプライマーは、共通の第１の部分及び異なる第２の部分を有する。図１８Ｃに示されるように、第１クラスター位置１８１２（又は第１のビーズ上）に位置する第１の第２のプライマーの第１の部分１８１８は、第２のクラスター位置１８１６（又は第２のビーズ上）に位置する第２の第２のプライマーの第１の部分１８２０と同じである。しかしながら、それぞれの第２のプライマーの第２の部分は異なっていてもよい。場合によっては、第１の第２のプライマーの第２の部分１８２２は、第１の第１のプライマー１８１０と同じであり得る。ある場合には、第２の第２のプライマーの第２の部分１８２４は、第２の第１のプライマー１８１４と同じであり得る。
第１のプライマーを異なるクラスター位置（又は異なるビーズ上）で異なるようにすることにより、最初にクラスター位置で伸長される鋳型が得られ、そのクラスター位置に対して更なる親和性を発現する（他のクラスター位置に対して更なる親和性を有さない）。所定のクラスター位置からの伸長領域は、非伸長鋳型と第２のプライマーとの間のハイブリダイゼーションの親和性と比較して、所定のクラスター位置に対する相同性及び増加した親和性の更なる塩基対を提供する。アニーリング反応、伸長反応、及び／又はエマルジョンのインキュベーションは、伸長を伴わずにアニーリング及び／又は伸長が稀な及び／又は遅い事象であるような十分なストリンジェンシーの条件（例えば、温度）で行なうことができる。
図１８Ｄを参照すると、第１の鋳型１８０６を第１のクラスター位置（又はビーズ）１８１２で伸長させて、第１の第１のプライマー１８１０に対して相補的な領域を含む第１の伸長産物を得ることができる。第２の鋳型１８０８を第２のクラスター位置（又はビーズ）１８１６で伸長させて、第２の第１のプライマー１８１４に対して相補的な領域を含む第２の伸長産物を得ることができる。図１８Ｅを参照すると、第１の伸長産物１８２６は、第１のクラスター位置１８１２にある第１のプライマーと相同性の領域を有し、第１のプライマーにアニールすることができ、第１のプライマーの伸長のための鋳型を提供することができるが、第２のクラスター位置１８１６ではそうではない。すなわち、これは、第１の鋳型が最初に第１のクラスター位置で伸長されたからである。同様に、第２の伸長産物１８２８は、第２のクラスター位置１８１６にある第１のプライマーと相同性の領域を有し、第１のプライマーにアニールすることができ、第１のプライマーの伸長のための鋳型を提供することができるが、第２のクラスター位置１８１２ではそうではない。すなわち、これは、第１の鋳型が最初に第２のクラスター位置で伸長されたからである。特に、第２のプライマーと核酸鋳型との間のアニーリング温度より高いか又は類似する温度が使用される場合、クラスター位置間の伸長産物の移動は好ましくない。本明細書に記載の任意の溶液は、バルク溶液又は液滴内の環境（例えば、表面、例えばビーズ又は他の担体の表面を含む）を指し得る。
本開示は、表面への鋳型の最初の遅い又は稀な付着と、それに続く表面プライマーを使い果たすための表面付着鋳型（又はその誘導体）の迅速な増幅とを含み、それにより、クローン増幅鋳型（又はその誘導体）を提供することができる。前述のように、これは、付着を可能にするために鋳型の伸長部を使用することによって達成することができる。更に、増幅前の別の遅い又は稀なステップを本明細書に記載の方法に加えることができる。更に遅いステップも、鋳型の伸長を、このときには、表面に付着する鋳型の末端よりも遠位側の末端で伴うこともできる。
図１９Ａを参照すると、システム、方法、及び組成物は、（表面に固定化された）第２のプライマー１９０２にアニーリングして伸長することにより伸長産物を生成する鋳型１９００を含み得る。第２のプライマーは、核酸鋳型分子を鋳型として使用して伸長させることができ、それにより、配列決定されるべき核酸分子の最終的なコロニーの第１のコピーを作製する。引き続き図１９Ｂを参照すると、伸長産物１９０４は、第２のプライマーから拡散し、表面に付着した第１のプライマー１９０６のコピーとハイブリダイズして、第１のプライマー１９０８の伸長のための鋳型として機能することができる。しかしながら、この伸長は指数関数的ではなく線形であり、すなわち、第１の（表面）プライマーのたった１つのコピーのみが各サイクルで伸長される。これは、鋳型及び／又は伸長産物１９０４の遠位端１９１０（表面固定化プライマーに結合する末端とは反対側の末端）が最初は第３のプライマー１９１２と相補的ではないためである。システムは、第１の部分１９１６及び第２の部分１９１８を有する第４のプライマー１９１４を更に含み得る。第１の部分は核酸鋳型にアニールすることができ、第２の部分は、伸長産物が第３のプライマーとハイブリダイズすることができるように核酸鋳型を伸長することができる。
引き続き図１９Ｃを参照すると、第４のプライマー１９１４は、表面１９２０に固定化された（第１のプライマー又は第２のプライマーのいずれかからの）以前に伸長したコピーを更に伸長することができる。また、第４のプライマーは、ある場合には、例えばライブラリー鋳型が二本鎖である場合、溶液中で鋳型核酸（又はその産物）を伸長させることができる。ある場合には、ライブラリー鋳型は一本鎖であり、第４のプライマーは、第１又は第２のプライマーで最初に伸長されるまでライブラリー鋳型とハイブリダイズしない。
この伸長に続いて、図１９Ｄを続けると、第３のプライマー１９１２を伸長させて、第１のプライマー１９０６の更なるコピーの伸長のための鋳型として機能することができる更なるポリヌクレオチドを作製することができる。（第２のプライマー及び第４のプライマーを使用した）各末端における元のライブラリー鋳型の最初の伸長は、（第１のプライマー及び第３のプライマーを使用した）指数関数的増幅と比較して比較的遅く、稀な事象であり得る。場合によっては、指数関数的増幅が表面に付着した第１のプライマーのクラスターによって定義されるコロニー位置を満たす前に、両方の伸長が完了する必要がある。
別の態様では、核酸サンプルをクローン増幅するための方法が本明細書で提供される。この方法は、複数のパーティションを有するエマルジョンを形成することを含むことができる。複数のパーティションのうちの１つのパーティションは、鋳型核酸と、ビーズに付着した第１のプライマーの複数のコピーを有するビーズと、鋳型核酸又はその誘導体をビーズに付着させる付着反応及び第１のプライマーの複数のコピーを使用する増幅反応を行なうことができる試薬混合物とを含むことができる。方法は、エマルジョンをインキュベートすることにより、鋳型核酸又はその誘導体をビーズに付着させる付着反応を行なうとともに、ビーズに付着した鋳型核酸又はその誘導体を増幅させる増幅反応を行なうことを更に含み得る。
場合によっては、第１の期間（後述する期間）は、第２の期間（後述する期間）よりも長い。第１の期間は、エマルジョンがインキュベーションを開始するときに始まり、鋳型核酸又はその誘導体がビーズに付着するときに終了することができる。ある場合には、第２の期間は、鋳型核酸又はその誘導体がビーズに付着するときに始まり、増幅反応が終了したときに終了することができる。場合によっては、第２の期間を定義する目的で、表面上のクラスター位置のビーズ上の第１のプライマー又は第１のプライマーのクラスターが完全に伸長されるときに増幅反応が終了したと見なすことができる。場合によっては、第２の期間を定義する目的で、表面上のクラスター位置のビーズ上の第１のプライマー又は第１のプライマーのクラスターの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又はそれ以上が伸長されるときに増幅反応が終了したと見なすことができる。
第１の期間は、第２の期間よりも任意の適切な係数だけ大きくすることができる。幾つかの実施形態において、第１の期間は、第２の期間よりも約５、約１０、約２０、約５０、又は約１００倍長い。幾つかの実施形態において、第１の期間は、第２の期間よりも少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍長い。
担体を提供する方法
本明細書の他の箇所に記載されるように、伸長プライマー（例えば、第２のプライマー）を含む担体を生成及び／又は提供するための方法が本明細書で提供される。本明細書に記載の担体のいずれかは、その後、例えばｅＰＣＲ操作中に分割され得る。少なくとも１つの伸長プライマー分子（例えば、第２のプライマー）及び／又は少なくとも１つの鋳型核酸分子を含む担体は、一般に、本明細書では伸長担体と呼ばれ得る。例えば、図１８Ａを参照すると、伸長担体は表面１８００を含み、この表面は、プライマーのクラスター又は複数のそのようなクラスターを含み、クラスターは、第１の数の第１のプライマー（例えば、１８０２）及び第２の数の第２のプライマー（例えば、１８０４）を含む。場合によっては、第２の数を第１の数よりも小さくすることができる。例えば、表面上の第１のプライマーの濃度に対する第２のプライマーの濃度の比率は、約１０－１，１０－２，１０－３，１０－４，１０－５，１０－６，１０－７，１０－８，１０－９以下程度である。操作の一例では、本明細書中に記載されるように、核酸鋳型が、表面に付着された第２のプライマーに結合し（例えば、アニール）、核酸伸長反応に供されて伸長産物が作製され、この伸長産物又はその誘導体は、その後、表面に付着された第１のプライマーで増幅され得る。ある場合には、核酸鋳型は、第１のプライマーにアニーリングすることができない可能性がある。別の例において、伸長担体は表面を含み、表面はプライマーのクラスター又は複数のプライマーを含み、鋳型核酸分子はクラスターのプライマーに結合される。
（１又は複数の）非伸長担体と（１又は複数の）伸長担体との混合物から伸長担体を単離するための方法が本明細書で提供される。場合によっては、担体は、個別に又は集合的に他の担体と共に、第１の位置から第２の位置に輸送することができる可動担体（例えば、ビーズ、粒子など）となり得る。担体は、本明細書の他の箇所に記載されている任意の担体であってもよい。単離された伸長担体の組成物、混合物、又は溶液は、本明細書の他の箇所に記載されているように、液滴へのその後の分割などの下流側の操作に特に有益となる場合があり、そのような液滴の占有は、一般に、単独で占有された液滴の有効濃度の生成を確保するために、非占有又は単独で占有された液滴の大部分の生成をもたらすポアソン分布に従う。好適には、伸長担体のみが分割される場合、担体によって占有される液滴の集団は、伸長担体よりも下流側の操作（例えば、ライブラリーのクローン増幅）のために、使用不可能ではないにしても非効率的である非伸長担体を含有する液滴によって希釈されない。伸長担体が、それに結合した鋳型核酸分子を含む場合、（担体占有率及び液滴中の鋳型占有率のそれぞれに関する）二重ポアソン分布は、（液滴中の単一の鋳型－担体アセンブリ占有率に関する）単一ポアソン分布に低減され得る。本明細書の他の箇所に記載されているように、伸長担体は、液滴の過装填（例えば、液滴で２つ以上）を有利に可能にし得る。ウェル又は他の容器などの液滴以外のパーティションを使用することができる。本明細書の他の箇所に記載されているように、伸長担体は、バルク溶液での使用にも有益であり得る。
図２１は、伸長担体２１００を生成及び／又は提供するための例示的な方法を示し、伸長担体２１００は、担体の表面（例えば、ビーズ）に付着された複数のプライマーを含む。複数のプライマーは、第１のプライマー２１０２のうちの１つ以上及び第２のプライマー２１０３のうちの１つ以上を含んでもよい。場合によっては、第１のプライマー２１０２の数と比較して相対的に少ない数の第２のプライマー２１０３を含むクラスターを含む伸長担体２１００を生成することが特に重要であり得る。場合により、伸長担体は、それに付着した第２のプライマー２１０３の１つのコピーを有する。他の場合、伸長担体は、第２のプライマー２１０３の複数のコピー、例えば第２のプライマー２１０３の少数のコピー又は幾つかのコピー（図示せず）を有する。これに代えて又は加えて、第１のプライマー２１０２の数又は濃度は、担体の表面に付着した第２のプライマー２１０３の数又は濃度より高くてもよい。一例では、本明細書中に記載されるように、伸長担体がサンプル調製のために（例えば、核酸鋳型の増幅のために）使用されるとき、核酸鋳型は、その後に第１のプライマーで増幅され得る伸長産物を作製するために、稀に、したがって律速操作において、第２のプライマーで伸長されてもよく、その増幅は、担体上に提供された第２のプライマーよりも第１のプライマーのコピーが多いため、最初の伸長産物生成反応よりも有意に速い速度で起こり得る。ある場合には、増幅反応は、別の核酸鋳型が反応混合物中の別の第２のプライマー（もしあれば）で伸長され得る前に、伸長担体上の第１のプライマーのコピーを排出し（例えば、それに結合することによって）、それにより、担体上の（又は担体上のクラスター内の）モノクローナル集団を促進し得る
出発担体２１０１（又は非伸長担体）は、第１のプライマー２１０２を含み得る出発担体は、複数の第１のプライマー、例えば第１のプライマーのクラスターを含み得る第１のプライマーは、例えば相補的配列のハイブリダイゼーションを介して伸長プライマー２１０４に付着され、続いて伸長されて、担体に固定化された伸長プライマーである第２のプライマー２１０３を生成することができる。付着反応（例えば、ハイブリダイゼーション）は、溶液中で、例えば複数の非伸長担体を含むバルク溶液中で、及び／又は非伸長担体を含むパーティションを含むエマルジョン中で行なわれ得る。付着プロセス（ハイブリダイゼーションなど）は、単一サイクル伸長プロセスを含み得る。第２のプライマーが生成された後、洗浄及び／又は溶融操作を行なって伸長プライマーを解離させて伸長担体２１００を生成することができる。
場合によっては、反応混合物中の非伸長担体（例えば、２１０１）及び伸長プライマー（例えば、２１０４）のそれぞれの濃度を調節して、最小数（例えば、１つ、少数、幾つかなど）の第２のプライマーを含む伸長担体の生成を促進することができる。例えば、伸長担体は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％又はそれを超える（第１のプライマー及び第２のプライマー集団の合計の中からの）第１のプライマーを含み得る。
例えば、反応混合物は、存在する第１のプライマーの数又は濃度に対して少ない数又は少ない濃度の伸長プライマーを含有し得る（例えば、非伸長担体への付着を介して）。ある場合には、溶液中の非伸長担体の濃度に対する伸長プライマーの濃度の比率は、最大で約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００、１：５０００、１：１００００又はそれ以下である。これに代えて又は加えて、溶液中の非伸長担体の濃度に対する伸長プライマーの濃度の比率は、少なくとも約１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：２９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０又はそれを超える。ある場合には、溶液中の非伸長担体の濃度に対する伸長プライマーの濃度のパーセンテージは、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％以下である。これに代えて又は加えて、非伸長担体の濃度に対する伸長プライマーの濃度のパーセンテージは、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超える。結果として生じる混合物は、（１又は複数の）伸長担体と伸長されないままの（１又は複数の）非伸長担体との混合物を含み得る。
本明細書では、（１又は複数の）非伸長担体と（１又は複数の）伸長担体との混合物から伸長担体を単離する方法が提供される。
図２２Ａは、伸長担体を単離するための方法の一例を示す図である。出発担体２２０１（又は非伸長担体）は、第１のプライマー２２０２を含み得る。出発担体は、複数の第１のプライマー、例えば第１のプライマーのクラスターを含み得る出発担体は、伸長基２２０４と接触させることができる。第１のプライマーは、伸長基に付着され得る。伸長基は、キャプチャエンティティ２２０５を含むプライマー分子を含み得る。幾つかの例では、キャプチャエンティティがビオチン（Ｂ）を含むことができ、それによりプライマー分子がビオチン化される。幾つかの例では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列（例えば、核酸配列）を含み得る。幾つかの例において、プライマー分子の配列は、キャプチャ配列として機能し得る。他の例において、キャプチャエンティティは、キャプチャ配列を含む別の核酸分子を含み得る。幾つかの例において、キャプチャエンティティは、磁場の印加によって捕捉することができる磁性粒子を含み得る。幾つかの例において、キャプチャエンティティは、電場の印加によって捕捉することができる荷電粒子を含み得る。幾つかの例において、キャプチャエンティティは、キャプチャリングエンティティにより捕捉するように構成される又はキャプチャリングエンティティによって捕捉可能な１つ以上の他の機構を含み得る。
第１のプライマー２２０２は、例えば相補的な配列のハイブリダイゼーション（例えば、第１のプライマー２２０２の配列とプライマー分子の配列との間）を介して伸長基２２０４に付着し、続いて伸長して、担体に固定化された伸長プライマーである第２のプライマー２２０３を生成し得る。付着反応（例えば、ハイブリダイゼーション）は、溶液中で、例えば複数の非伸長担体を含むバルク溶液中で、及び／又は非伸長担体を含むパーティションを含むエマルジョン中で行なわれ得る。付着プロセス（ハイブリダイゼーションなど）は、単一サイクル伸長プロセスを含み得る。第２のプライマーが生成された後、伸長基２２０４は、第１のプライマー２２０２と会合して担体に固定されたままであってもよい。
或いは、図２２Ｂを参照すると、出発担体２２０１（又は非伸長担体）は、第１のプライマー２２０２を含み得る。出発担体は、複数の第１のプライマー、例えば第１のプライマーのクラスターを含み得る出発担体は、伸長基２２０４と接触させることができる。第１のプライマーは、伸長基に付着され得る。この例の伸長基はキャプチャエンティティ２２０５を欠く。第１のプライマー２２０２は、例えば相補的な配列のハイブリダイゼーション（例えば、第１のプライマー２２０２の配列とプライマー分子の配列との間）を介して伸長基２２０４に付着し、続いて伸長して、担体に固定化された伸長プライマーである第２のプライマー２２０３を生成し得る。伸長反応のために、キャプチャエンティティ（例えば、ビオチンなどのキャプチャエンティティを含むヌクレオチド）を含む試薬を使用して、キャプチャエンティティ２２０５を含む第２のプライマー２２０３を得ることができる。幾つかの例では、ビオチン標識ヌクレオチドが伸長反応に使用されるように、キャプチャエンティティはビオチン（Ｂ）であってもよい。標識アデニン、標識チミン、標識グアニン、もしくは標識シトシン、又はそれらの類似体などの単一の標識塩基を使用することができる。標識されたヌクレオチドは、伸長基２２０４の配列に基づいて選択され得る。一例では、単一の標識ヌクレオチドのみが付加される。これは、特定の塩基の一残基のみを含む伸長基２２０４の配列を選択することによって達成することができる。或いは、伸長は２回の操作で行なうことができる。最初の操作では、最初のヌクレオチドのみが付加され、このヌクレオチドはキャプチャエンティティ２２０５で標識化される。第２の伸長反応は、全ての塩基を用いて行なわれ、標識化された塩基は使用されない。これにより、１つのキャプチャエンティティ２２０５のみを含む第２のプライマー２２０３が得られる。或いは、段階的な単一標識ヌクレオチド付加は、伸長の任意の他の位置（例えば、第２の位置、第３の位置、第４の位置など）で行なうことができる。幾つかの例では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列（例えば、核酸配列）を含み得る。ある場合には、第２のプライマー２２０３がキャプチャ配列を含むように、伸長基２２０４の相補体がキャプチャ配列である。
図２２Ａを再び参照すると、付着された伸長基２２０４を含む担体は、キャプチャリング基２２２０と接触させられる或いはさもなければキャプチャリング基２２２０による捕捉に供されてもよい。場合によっては、キャプチャリング基は、キャプチャエンティティ２２０５を捕捉するように構成されたキャプチャリングエンティティ２２０７を含むことができる。例えば、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティをターゲットとするように構成され得る。幾つかの例では、キャプチャ部分がビオチンを含む場合、キャプチャリングエンティティがストレプトアビジン（ＳＡ）を含み得る。幾つかの例では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列（例えば、これは相補的なキャプチャ配列に対して相補的である）を含む場合、キャプチャリングエンティティは相補的なキャプチャ配列を含み得る。幾つかの例では、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティが磁性粒子を含む場合に磁場を印加するように構成された装置、システム、又はデバイスを含み得る。幾つかの例では、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティが荷電粒子を含むときに電場を印加するように構成された装置、システム、又はデバイスを含み得る。場合によっては、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティを捕捉するように構成された１つ以上の他の機構を含み得る。場合によっては、キャプチャリング基は、例えば、二次キャプチャリングエンティティ２２０６による後続の捕捉のために、二次キャプチャエンティティ２２０８を含むことができる。二次キャプチャエンティティ及び二次キャプチャリングエンティティは、本明細書の他の箇所に記載されている捕捉機構（例えば、ビオチン及びストレプトアビジン、相補的なキャプチャ配列など）のいずれか１つ以上を含み得る。幾つかの例では、二次キャプチャエンティティは磁性粒子（例えば、磁気ビーズ）を含むことができ、二次キャプチャリングエンティティは磁気系（例えば、磁場を印加するように構成された磁石、装置、システム、又はデバイスなど）を含むことができる。幾つかの例では、二次キャプチャエンティティは荷電粒子（例えば、電荷を運ぶ荷電ビーズ）を含むことができ、二次キャプチャリングエンティティは電気系（例えば、電場を印加するように構成された磁石、装置、システム、又はデバイスなど）を含むことができる。
伸長基２２０４が付着されて成る担体をキャプチャリング基２２２０と接触させる或いはさもなければキャプチャリング基２２２０による捕捉に供されると、キャプチャリング基のキャプチャリングエンティティ２２０７は、担体に固定化されたキャプチャエンティティ２２０５と結合、連結、ハイブリダイズ、又はそうでなければ会合し得る。キャプチャエンティティとキャプチャリングエンティティとの間の会合は、非共有結合の形成を含み得る。会合は、共有結合の形成を含み得る。会合は、例えば刺激の適用時に、解放可能な結合の形成を含み得る。幾つかの例では、会合は結合を形成しなくてもよい。例えば、会合は、キャプチャリングエンティティとキャプチャエンティティとの間の物理的近接性を増加させる（又は物理的距離を減少させる）ことができる。場合によっては、単一のキャプチャエンティティは、単一のキャプチャリングエンティティと会合できてもよい。或いは、単一のキャプチャエンティティは、複数のキャプチャリングエンティティと会合できｔｒもよい。それに代えて又は加えて、単一のキャプチャリングエンティティは、複数のキャプチャエンティティと会合できてもよい。キャプチャエンティティ／キャプチャリングエンティティの対は、任意の組み合わせであってもよい。この対には、ビオチン／ストレプトアビジン、アジド／シクロオクチン及びチオール／マレイミドが含まれ得るが、これらに限定されない。当業者であれば分かるように、対のいずれかの分子がキャプチャエンティティ又はキャプチャリングエンティティのいずれかとして使用されてもよく、キャプチャエンティティはヌクレオチドに連結することができる。ビオチン、アジド、シクロオクチン、テトラゾール及びチオールを含む化学的に修飾された塩基、及び多くの他のものがキャプチャエンティティとして適している。
複数の非伸長担体及び複数の伸長基は、バルク溶液中で本明細書に記載の操作を受けることができる。場合によっては、反応混合物中の非伸長担体及び伸長基のそれぞれの濃度を調節して、最小数（例えば、１つ、少数、幾つかなど）の第２のプライマーを含む伸長担体の生成を促進することができる。例えば、反応混合物は、存在する第１のプライマーの数又は濃度（例えば、非伸長担体への付着を介して）と比較して、少ない数又は少ない濃度の伸長プライマー（例えばプライマー分子）を含有し得る。幾つかの例では、溶液中の非伸長担体の濃度に対する伸長基の濃度の比率は、最大で約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００、１：５０００、１：１００００以下である。これに代えて又は加えて、溶液中の非伸長担体の濃度に対する伸長基の濃度の比率は、少なくとも約１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：２９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０又はそれを超える。ある場合には、溶液中の非伸長担体の濃度に対する伸長基の濃度の百分率は、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％以下である。これに代えて又は加えて、非伸長担体の濃度に対する伸長基の濃度の百分率は、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％又はそれを超える。結果として生じる混合物は、（１又は複数の）伸長担体と伸長されないままの（１又は複数の）非伸長担体との混合物を含み得る。
ある場合には、キャプチャリング基は、それに付着した伸長基をターゲットとすることによって、（１又は複数の）伸長担体（それぞれが伸長担体に付着された伸長基を含む）及び（１又は複数の）非伸長担体（伸長基に付着されない）の混合物から伸長担体を単離し得る。幾つかの例において、キャプチャリング基は、それに付着されたそれぞれの伸長基をターゲットとすることによって、（１又は複数の）伸長担体（それぞれが伸長担体に付着された伸長基を含む）と（１又は複数の）非伸長担体（伸長基に付着されない）との混合物から複数の伸長担体を単離することができる。幾つかの例では、複数のキャプチャリング基を使用して、（１又は複数の）伸長担体（それぞれが伸長担体に付着された伸長基を含む）及び（１又は複数の）非伸長担体（伸長基に付着されない）の混合物から、それに付着した伸長基をターゲットとすることによって伸長担体を単離することができる。
一旦単離されると、洗浄及び／又は溶融操作を実行して、伸長担体２２００を提供するために担体から伸長基を解離することができる。
幾つかの例において、キャプチャリング基２２２０は、混合物から伸長担体を単離することなく、伸長担体と会合し得る。場合によっては、キャプチャリング基が二次キャプチャエンティティ２２０６を更に含む場合、担体は混合物中の二次キャプチャエンティティと会合されたままであってもよい。担体は、二次キャプチャリングエンティティ２２０８と接触されてもよく或いはさもなければ二次キャプチャリングエンティティ２２０８による捕捉に供されてもよい。二次キャプチャリングエンティティは、キャプチャリング基の二次キャプチャエンティティと結合、連結、ハイブリダイズし、或いはさもなければ会合し得る。二次キャプチャエンティティと二次キャプチャリングエンティティとの間の会合は、非共有結合の形成を含み得る。会合は、共有結合の形成を含み得る。会合は、例えば刺激の適用時に、解放可能な結合の形成を含み得る。幾つかの例では、会合は結合を形成しなくてもよい。例えば、会合は、二次キャプチャリングエンティティ及び二次キャプチャエンティティの物理的近接性（例えば、物理的距離を減少させる）を増加させることができる。場合によっては、単一の二次キャプチャエンティティは、単一の二次キャプチャリングエンティティと会合できてもよい。或いは、単一の二次キャプチャエンティティは、複数の二次キャプチャリングエンティティと会合できてもよい。これに代えて又は加えて、単一の二次キャプチャリングエンティティは、複数の二次キャプチャエンティティと会合できてもよい。ある場合には、二次キャプチャリング基は、それに付着したキャプチャ基をターゲットとすることによって、（１又は複数の）伸長担体（それぞれが伸長担体に付着されたキャプチャ基を含む）と（１又は複数の）非伸長担体（キャプチャ基に付着されない）との混合物から伸長担体を単離し得る。ある場合には、二次キャプチャリング基は、それに付着したそれぞれのキャプチャ基をターゲットとすることによって、（１又は複数の）伸長担体（それぞれが伸長担体に付着されたキャプチャ基を含む）と（１又は複数の）非伸長担体（キャプチャ基に付着されない）との混合物から複数の伸長担体を単離し得る。ある場合には、複数の二次キャプチャリング基を使用して、それに付着したキャプチャ基をターゲットとすることによって、（１又は複数の）伸長担体（それぞれが伸長担体に付着されたキャプチャ基を含む）と（１又は複数の）非伸長担体（キャプチャ基に付着されない）との混合物から伸長担体を単離することができる。
一旦単離されると、洗浄及び／又は溶融操作が実行されて、伸長担体２２００を提供するために、担体から伸長基及びキャプチャ基（場合によっては二次キャプチャリングエンティティも）を解離することができる。
場合によっては、二次キャプチャリングエンティティ２２０８は、混合物から伸長担体を単離することなく、伸長担体と会合されてもよい。場合によっては、二次キャプチャリングエンティティは、第３のキャプチャリングエンティティ（図示せず）によってその後に捕捉するように構成された第３のキャプチャエンティティを含み得る。任意の程度のキャプチャリングエンティティは、混合物からの単離及び／又は次の程度のキャプチャリングエンティティによる会合のために、次の程度のキャプチャリングエンティティによって捕捉され得る別のキャプチャ基を含み得ることが理解される。単離されると、洗浄及び／又は溶融操作を実行して、伸長担体２２００を提供するために、伸長基（並びに任意の数のキャプチャエンティティ及び／又はキャプチャリングエンティティ）を担体から解離することができる。
操作の一例では、それぞれが複数の第１のプライマーを含む複数の担体を、それぞれがビオチン化プライマー分子を含む複数の伸長基と接触させる。幾つかの例において、プライマー分子は、第１のプライマーに付着し、核酸伸長を受けて、担体に固定化された第２のプライマーを生成する。担体は、ビオチン化プライマー分子と会合したままであり、磁気ビーズに結合したストレプトアビジンを含むキャプチャ基と接触させる。ストレプトアビジンがビオチンに結合することにより、磁性ビーズと担体とが会合する。幾つかの例では、担体は伸長基と接触せず、磁気ビーズと会合されない。例えば、混合物は、（１又は複数の）磁気ビーズと会合した（１又は複数の）伸長担体と、磁気ビーズと会合していない（１又は複数の）非伸長担体とを含み得る。磁石を使用するか又は他の磁場を印加して、（１又は複数の）磁気ビーズをターゲットとし、（１又は複数の）磁気ビーズと会合される（１又は複数の）伸長担体を混合物から単離する。結果として生じる単離された組成物は、（１又は複数の）伸長担体のみ又は（１又は複数の）伸長担体の大部分を含む。単離された組成物中に幾らかの汚染が存在し得ることが理解される。洗浄操作は、（１又は複数の）伸長担体から（１又は複数の）伸長基及び／又は（１又は複数の）キャプチャ基を解離するために行なわれる。
図２３は、伸長担体を単離するための別の例示的な方法を示す。図２１に関して説明した方法などに従って、第２のプライマー２３０２を含む伸長担体２３００を提供することができる。キャプチャエンティティ２３０５（例えば、磁気ビーズ）及びそれに付着した核酸配列２３０３を含むキャプチャ基が提供され得る。キャプチャエンティティに付着した核酸配列は、伸長担体に付着した第２のプライマーの配列との配列相同性を含み得る。キャプチャ基は、核酸配列と第２のプライマーの配列とのハイブリダイゼーションなどを介して伸長担体と会合し、それによってキャプチャエンティティを伸長担体と会合することができる。キャプチャ基会合担体は、キャプチャリングエンティティ２３０６（例えば、磁石）と接触させられ得る或いはさもなければキャプチャリングエンティティ２３０６による捕捉に供され得る。キャプチャ基及び／又はキャプチャエンティティは、会合後に伸長担体から解離できてもよい。場合によっては、キャプチャ基を再利用することができる。場合によっては、キャプチャエンティティを再利用することができる。ある場合には、核酸配列２３０３を含む核酸分子を再使用することができる。異なる試薬を再使用することは、伸長担体を単離するための費用効果の高い手法であってもよい。キャプチャエンティティ及びキャプチャリングエンティティは、本明細書の他の箇所に記載される捕捉機構（例えば、ビオチン及びストレプトアビジン、相補的なキャプチャ配列、磁性粒子及び磁場、荷電粒子及び電場など）のいずれか１つ以上を含み得る。例えば、キャプチャエンティティは、磁気特性を有する粒子を含んでもよく、キャプチャリングエンティティは、磁場を印加するように構成され得る。例えば、キャプチャエンティティは、電荷を運ぶ荷電粒子を含んでもよく、キャプチャリングエンティティは、電場を印加するように構成され得る。例えば、キャプチャエンティティは核酸キャプチャ配列を含んでもよく、キャプチャリングエンティティは相補的な核酸キャプチャ配列を含み得る。当業者であれば分かるように、核酸配列２３０３は、キャプチャエンティティ２３０５を第２のプライマー２３０２に直接付着させるために使用され得る。図２２Ｂに記載されたように、伸長反応を使用して、キャプチャ配列又はキャプチャエンティティ２３０５を含む修飾ヌクレオチドを担体上のプライマーに直接付加することができる。図２２Ｂでは、プライマーは第１のプライマーであったが、プライマーは第２のプライマー２３０２であってもよいことが理解される。
他の方法を使用して、伸長担体を混合溶液から分離することができる。そのような分離方法は、伸長担体に結合することができる１つ以上の他の配列又は部分（例えば、２３００）を使用し、それにより、伸長担体を担体集団の残りから分離することを含み得る。幾つかの例では、そのような配列又は部分は、溶液中に存在する残りの試薬、材料及び／又は部分と比較して、伸長担体に対してより高い又は有意に高い結合親和性を含み得る。したがって、そのような配列又は部分（本明細書では分離部分と呼ばれる）は、伸長担体に結合し、伸長担体と会合し、及び／又は伸長担体を捕捉することができる。伸長担体を溶液の残りの部分から分離することは、伸長担体のより精製された組成物を提供することに寄与することができ、これは、幾つかの例では、本明細書の他の箇所に記載される方法及びシステムなどの実験、アッセイ又は手順における試薬として使用され得る。
伸長担体は、試薬として生成、分離、製造、及び／又は調製することができる。伸長担体は、実験キット又は試験などのキットに含まれてもよい。伸長担体は、実験又は他の手順で使用されてもよい。例えば、キットは、少なくとも約５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，９９．１％，９９．２％，９９．３％，９９．４％，９９．５％，９９．６％，９９．７％，９９．８％，９９．９％又はそれを超える純度（伸長担体と非伸長担体とを合わせた濃度までの伸長担体の濃度）を有する伸長担体試薬溶液を含む組成物を含み得る。
本開示は、実験において伸長担体を使用する方法を提供する。例えば、伸長担体には、実験において分析される核酸配列のライブラリー（例えば、配列決定実験、例えば次世代配列決定、又は任意の他のタイプの配列決定）などの配列のライブラリーが提供され得る。配列のライブラリーは、それに付着した１つ以上のアダプター配列を含み得る核酸配列を含み得る。配列のライブラリーは、鋳型核酸配列を含み得る。鋳型核酸配列は、それに付着した１つ以上のアダプター配列を含み得る。例えば、鋳型核酸配列は、第１の末端に隣接するアダプター配列を含み得る。別の例では、鋳型核酸配列は、２つの末端に隣接する同じ又は異なるアダプター配列を含み得る。或いは、鋳型分子はアダプター配列を含まなくてもよい。
幾つかの例において、伸長担体は、核酸配列のライブラリーと混合されてもよく、混合物は、鋳型核酸配列（又はその相補体）を担体に固定化することができる核酸伸長反応を開始するのに十分な条件に供され得る。幾つかの例において、そのような反応は、本明細書の他の箇所に記載されるように、パーティション（例えば、エマルジョン中の液滴）において行なわれてもよく、パーティションは、１つ以上の伸長担体及び１つ以上の鋳型核酸配列を含む。他の例では、そのような反応はバルク溶液中で行なわれ得る。幾つかの例において、固定化（例えば、ハイブリダイゼーション）は、溶液（例えば、オフチップ）中で行なわれてもよく、溶液中での固定化の後、固定化されたアセンブリ（伸長担体と鋳型分子との組み合わせ）は、その後の操作のためにパーティション（本明細書中に記載されるパーティションなど）に封入され得る。幾つかの例では、パーティションは液滴である。幾つかの例では、パーティションはウェルである。
予濃縮
本明細書では、本明細書で一般にアセンブリと呼ばれる事前に組み立てられた担体を生成する方法であって、アセンブリが単一の担体に固定化された単一の鋳型核酸分子を含む、方法が提供される。その後の操作では、そのようなアセンブリは、本明細書に記載されるように、増幅試薬（例えば、溶液プライマー）と共に分割されて、エマルジョンの個々の反応チャンバ内の鋳型核酸分子の増幅反応を促進し得る。有益には、単一のアセンブリを含むパーティションは、増幅産物のモノクローナル集団をパーティション内の同じ担体に固定化することができる。パーティション内のそのようなアセンブリの区分化又はカプセル化は、例えば、単一のアセンブリを含むパーティション、アセンブリを含まないパーティション、及び／又は複数のアセンブリ（例えば、異なる鋳型配列を有する）を含むパーティションに加えて、ポアソン分布に従うことができる。分割前に予め組み立てられた担体を提供することにより、有益には、エマルジョンの分割間の分布に関する二重ポアソン問題を単一ポアソン分布問題に低減することができる。複数の担体及び複数の鋳型（担体に固定されていない）が、それぞれがそれ自体のポアソン分布モデルに従って区分化される場合、１次ポアソン分布モデルと比較して、単一の担体及び単一の鋳型を有する区分が著しく少なく生成される。これは、本明細書に記載の方法と比較した場合、貴重なリソースの非効率的な使用及び貴重な鋳型の損失をもたらす。
幾つかの例において、方法は、それぞれが異なる核酸配列を有する複数の伸長担体及び複数の鋳型核酸分子（例えば、ライブラリーにおいて）を含む混合物を提供することを含み得る。複数の伸長担体は、本明細書の他の箇所に記載されているように、（伸長担体と非伸長担体との混合物からの）伸長担体の精製された組成物を含み得る。鋳型核酸分子のそれぞれは、第２のプライマーとアニーリングするように及び／又はアニーリングすることができるように構成され得る。複数の伸長担体のうちの１つの伸長担体は、複数の第１のプライマーと、鋳型核酸分子へのアニーリングに利用可能な複数の第１のプライマーの数と比較して、単一のコピー、少数コピー、幾つかのコピー、及び／又は有意に少ない数の第２のプライマーとを含み得る。混合物は、複数の鋳型核酸分子を、複数の伸長担体にわたって分布した複数の第２のプライマーにアニール又は会合させるのに十分な条件に供され得る。混合物は、担体に結合していない鋳型核酸分子を洗浄するのに十分な条件に供され得る。場合によっては、これは、洗浄中に担体が安定化されたままであるように、担体を固定化プラットフォーム（例えば、担体に対する何らかの親和性（例えば、磁性、電気、疎水性、親水性など）などを介して、担体を固定化するように構成された別の表面又は構造）に固定化することによって達成され得る。各伸長担体は、複数の第１のプライマーの数と比較して、ただ１つのコピー、少数のコピー、幾つかのコピー、及び／又は有意に少ない数の第２のプライマーを有するため、得られた反応産物は、複数のアセンブリを含むことができ、アセンブリの大部分又は実質的に全ては、それぞれ、担体に固定化された単一の鋳型核酸分子を含む。そのようなアセンブリは、個々の反応チャンバ内の鋳型核酸分子の増幅反応を促進するために、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば増幅試薬（例えば、溶液プライマーを含む）と共に分割され得る。有益には、単一のアセンブリを含むパーティションは、増幅産物のモノクローナル集団をパーティション内の同じ担体に固定化することができる。
幾つかの例において、伸長担体と鋳型核酸分子との混合プロセスの間、伸長担体の濃度は、適切な場合、鋳型核酸分子の濃度よりも低くてもよい（例えば、利用可能なサンプルが豊富にある場合）。例えば、（１又は複数の）サンプルは過剰に提供されてもよい。サンプルを過剰に提供すると、混合及びハイブリダイゼーションから生じるブランク伸長担体（鋳型を欠く）の数が減少し得る。
幾つかの方法を使用して、技術者は、サンプルを担体と混合してアセンブリの有用な集合体を生成する前などに、サンプルを調製するために非常に正確な測定を行なわなければならない場合がある。本開示において提供される伸長担体は、反応混合物中のライブラリーの濃度の正確な測定を必要としないプロセスと有利に適合し得る。幾つかの例では、ライブラリーの濃度が高精度で測定されない場合でも、単にサンプルを過剰に提供することが、ハイブリダイゼーションプロセスの成功に（例えば、伸長担体に）寄与し得る。例えば、場合によっては、サンプルを過剰に提供することにより、ハイブリダイゼーション反応のためのインキュベーション時間の短縮が可能になり得る。サンプル（ライブラリー）を過剰に提供することは、ハイブリダイゼーションの速度及び収率を増加させ得る。或いは、場合によっては、サンプルは過剰に提供されなくてもよい（例えば、サンプルが貴重である場合）。
幾つかの例において、図２４Ａを参照すると、方法は、それぞれが異なる核酸配列を有する複数の担体（例えば、担体２４０１、非伸長担体）及び複数の鋳型核酸分子（例えば、鋳型核酸分子２４０２）を含む混合物を提供することを含み得る。鋳型核酸分子は、担体に付着したプライマーとアニーリングするように及び／又はアニーリングすることができるように構成され得る。鋳型核酸分子は、キャプチャリング基２４０８のキャプチャリングエンティティによってその後に捕捉するように構成されたキャプチャエンティティ２４０６を含み得る。担体は、鋳型核酸分子へのアニーリングに利用可能な複数のプライマーを含み得る。
或いは、図２４Ｂは、鋳型核酸分子がキャプチャエンティティ２４０６を欠き、キャプチャエンティティ２４０６が伸長産物に付加される方法の一例を示す。図２４Ａに関して説明したように、複数の担体（例えば、担体２４０１、非伸長担体）と、それぞれ異なる核酸配列を有する複数の鋳型核酸分子（例えば、鋳型核酸分子２４０２）とを含む混合物が提供される。キャプチャエンティティを欠く鋳型核酸分子は、担体に付着したプライマーとアニーリングするように及び／又はアニーリングすることができるように構成され得る。図２２Ｂの説明と同様に、プライマーは、例えば相補的配列のハイブリダイゼーション（例えば、第１のプライマーの配列とアダプター１の配列との間）を介して鋳型核酸分子に付着し、続いて伸長して、担体に固定化される伸長産物を生成し得る。伸長反応のために、キャプチャエンティティ（例えば、キャプチャエンティティを含むヌクレオチド）を含む試薬を使用して、キャプチャエンティティ２４０６を含む伸長産物を得てもよい。幾つかの例では、ビオチン標識ヌクレオチドが伸長反応に使用されるように、キャプチャエンティティはビオチン（Ｂ）であってもよい。標識アデニン、標識チミン、標識グアニン、もしくは標識シトシン、又はそれらの類似体などの単一の標識塩基を使用することができる。標識されたヌクレオチドは、鋳型２４０２のアダプター１の配列に基づいて選択され得る。一例では、単一の標識ヌクレオチドのみが付加される。これは、２回の操作で伸長を行なうことで実現できる。最初の操作では、最初のヌクレオチドのみが付加され、このヌクレオチドはキャプチャエンティティ２４０６で標識化される。これは、第１のプライマーの配列に相補的ではないアダプター１の配列に存在する第１の塩基であり得る。第２の伸長反応は、全ての塩基を用いて行なわれ、標識化された塩基は使用されない。これにより、ただ１つのキャプチャエンティティ２４０６を含む担体に固定化された伸長産物が得られる。或いは、段階的な単一標識ヌクレオチド付加は、伸長の任意の他の位置（例えば、第２の位置、第３の位置、第４の位置など）で行なうことができる。
ある場合には、反応混合物中の担体及び鋳型核酸分子のそれぞれの濃度を調節して、単一の担体及び担体に固定化された単一の鋳型核酸分子（又はその相補体）を含むアセンブリの大部分の生成を促進することができる。例えば、結果として生じる担体は、鋳型核酸分子と会合していない（全プライマー集団のうちの）プライマーの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％又はそれ以上を含み得る。
例えば、反応混合物は、存在する担体の数又は濃度に対してより少ない数又はより低い濃度の鋳型核酸分子を含有し得る。幾つかの例において、溶液中の担体の濃度に対する鋳型核酸分子の濃度の比率は、最大で約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０又はそれ未満である。これに代えて又は加えて、溶液中の担体の濃度に対する鋳型核酸分子の濃度の比率は、少なくとも約１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：２９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０又はそれを超える。ある場合には、溶液中の担体の濃度に対する鋳型核酸分子の濃度のパーセンテージは、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％以下である。これに代えて又は加えて、溶液中の担体の濃度に対する鋳型核酸分子の濃度のパーセンテージは、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超える。
図２４Ａに戻って参照すると、混合物は、複数の担体にわたって分布した複数のプライマーに複数の鋳型核酸分子をアニールさせる（２４０３）のに十分な条件に供され、それぞれの担体に固定化されたそれぞれの鋳型核酸分子の相補体を生成させるために伸長（２４０４）に供され得る。担体は、それぞれの鋳型核酸分子（例えば、２４０２）のそれぞれのキャプチャエンティティ（例えば、２４０６）と会合したままであってもよい。結果として生じる混合物は、それに会合した１つ以上の鋳型核酸分子（及びキャプチャエンティティ）を含む担体と、それに会合したいかなる鋳型核酸分子（及びキャプチャエンティティ）も含まない担体との混合物を含み得る。
幾つかの例では、キャプチャエンティティ２４０６はビオチン（Ｂ）を含み得る。幾つかの例では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列（例えば、核酸配列）を含み得る。幾つかの例において、鋳型核酸分子の配列は、キャプチャ配列として機能し得る。他の例において、キャプチャエンティティは、キャプチャ配列を含む別の核酸分子を含み得る。幾つかの例において、キャプチャエンティティは、磁場の印加によって捕捉することができる磁性粒子を含み得る。幾つかの例において、キャプチャエンティティは、電場の印加によって捕捉することができる荷電粒子を含み得る。場合によっては、キャプチャエンティティは、本明細書の他の箇所に記載されているように、キャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成された又はキャプチャリングエンティティにより捕捉できる１つ以上の他の機構を含み得る。
鋳型核酸分子２４０２が会合されて成る担体２４０１は、キャプチャリング基２４０８と接触させられてもよく或いはさもなければキャプチャリング基２４０８による捕捉に供されてもよい。キャプチャリング基は、キャプチャエンティティ２４０６を捕捉するように構成されたキャプチャリングエンティティを含むことができる。例えば、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティをターゲットとするように構成され得る。幾つかの例では、キャプチャ部分がビオチンを含む場合、キャプチャリングエンティティがストレプトアビジン（ＳＡ）を含み得る。幾つかの例では、キャプチャエンティティがキャプチャ配列（例えば、これは相補的なキャプチャ配列に対して相補的である）を含む場合、キャプチャリングエンティティは相補的なキャプチャ配列を含み得る。幾つかの例では、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティが磁性粒子を含む場合に磁場を印加するように構成された装置、システム、又はデバイスを含み得る。幾つかの例では、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティが荷電粒子を含むときに電場を印加するように構成された装置、システム、又はデバイスを含み得る。場合によっては、キャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティを捕捉するように構成された１つ以上の他の機構を含み得る。場合によっては、キャプチャリング基は、例えば、二次キャプチャリングエンティティ２４０７による後続の捕捉のための二次キャプチャエンティティを含むことができる。二次キャプチャエンティティ及び二次キャプチャリングエンティティは、本明細書の他の箇所に記載されている捕捉機構（例えば、ビオチン及びストレプトアビジン、相補的なキャプチャ配列など）のいずれか１つ以上を含み得る。幾つかの例では、二次キャプチャエンティティは磁性粒子（例えば、磁気ビーズ）を含むことができ、二次キャプチャリングエンティティは磁気系（例えば、磁場を印加するように構成された磁石、装置、システム、又はデバイスなど）を含むことができる。幾つかの例では、二次キャプチャエンティティは荷電粒子（例えば、電荷を運ぶ荷電ビーズ）を含むことができ、二次キャプチャリングエンティティは電気系（例えば、電場を印加するように構成された磁石、装置、システム、又はデバイスなど）を含むことができる。
キャプチャエンティティ２４０６が会合されて成る担体がキャプチャリング基２４０８と接触させられてもよい或いはそうでなければキャプチャリング基２４０８による捕捉に供されてもよい場合、キャプチャリング基のキャプチャリングエンティティは、キャプチャエンティティと結合するか、連結するか、ハイブリダイズするか、そうでなければ会合し得る。キャプチャエンティティとキャプチャリングエンティティとの間の会合は、非共有結合の形成を含み得る。会合は、共有結合の形成を含み得る。会合は、例えば刺激の適用時に、解放可能な結合の形成を含み得る。幾つかの例では、会合は結合を形成しなくてもよい。例えば、会合は、キャプチャリングエンティティとキャプチャエンティティとの間の物理的近接性を増加させる（又は物理的距離を減少させる）ことができる。場合によっては、単一のキャプチャエンティティは、単一のキャプチャリングエンティティと会合できてもよい。或いは、単一のキャプチャエンティティは、複数のキャプチャリングエンティティと会合できｔｒもよい。それに代えて又は加えて、単一のキャプチャリングエンティティは、複数のキャプチャエンティティと会合できてもよい。
幾つかの例において、キャプチャリング基２４０８は、鋳型核酸分子２４０２（及びキャプチャエンティティ２４０６）を含む担体２４０１を、キャプチャエンティティをターゲットとすることによって混合物から単離することができる。幾つかの例において、キャプチャリング基は、それぞれが混合物から１つ以上の鋳型核酸分子を含む複数の担体を単離し得る。ある場合には、複数のキャプチャリング基を使用して、混合物から鋳型核酸分子を含む担体を単離することができる。単離されると、洗浄及び／又は融解操作（２４０５）を行なって、鋳型核酸分子を担体から解離させてアセンブリ２４００を提供することができる。
ある場合には、キャプチャリング基２４０８は、混合物から担体を単離することなく担体と会合することができる。場合によっては、キャプチャリング基が二次キャプチャエンティティを更に含む場合、担体は混合物中の二次キャプチャンティティと会合されたままであってもよい。担体は、二次キャプチャリングエンティティ２４０７と接触させられてもよく或いはさもなければ二次キャプチャリングエンティティ２４０７による捕捉に供されてもよい。二次キャプチャリングエンティティは、キャプチャリング基の二次キャプチャエンティティと結合、連結、ハイブリダイズし、或いはさもなければ会合し得る。二次キャプチャエンティティと二次キャプチャリングエンティティとの間の会合は、非共有結合の形成を含み得る。会合は、共有結合の形成を含み得る。会合は、例えば刺激の適用時に、解放可能な結合の形成を含み得る。幾つかの例では、会合は結合を形成しなくてもよい。例えば、会合は、二次キャプチャリングエンティティ及び二次キャプチャエンティティの物理的近接性（例えば、物理的距離を減少させる）を増加させることができる。場合によっては、単一の二次キャプチャエンティティは、単一の二次キャプチャリングエンティティと会合できてもよい。或いは、単一の二次キャプチャエンティティは、複数の二次キャプチャリングエンティティと会合できてもよい。これに代えて又は加えて、単一の二次キャプチャリングエンティティは、複数の二次キャプチャエンティティと会合できてもよい。幾つかの例において、二次キャプチャリング基は、鋳型核酸分子を含む担体を混合物から単離し得る。場合によっては、二次キャプチャリング基は、混合物から複数の担体を単離し得る。場合によっては、複数の二次キャプチャリング基を使用して、混合物から担体を単離することができる。
単離されると、洗浄及び／又は融解操作を行なって、鋳型核酸分子２４０２及びキャプチャ基２４０８（場合によっては二次キャプチャリングエンティティ２４０７も）を担体から解離させ、アセンブリ２４００を提供することができる。
場合によっては、二次キャプチャリングエンティティ２４０７は、混合物から担体を単離することなく担体と会合されてもよい。場合によっては、二次キャプチャリングエンティティは、第３のキャプチャリングエンティティ（図示せず）によりその後に捕捉するように構成された第３のキャプチャエンティティを含み得る。任意の程度のキャプチャリングエンティティは、混合物からの単離及び／又は次の程度のキャプチャリングエンティティによる会合のために、次の程度のキャプチャリングエンティティによって捕捉され得る別のキャプチャ基を含み得ることが理解される。単離されると、洗浄及び／又は融解操作を行なって、鋳型核酸分子（並びに任意の数のキャプチャエンティティ及び／又はキャプチャリングエンティティ）を担体から解離させ、アセンブリ２４００を提供することができる。
そのようなアセンブリは、個々の反応チャンバ内の鋳型核酸分子の増幅反応を促進するために、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば増幅試薬（例えば、溶液プライマーを含む）と共に分割され得る。有益には、単一のアセンブリを含むパーティションは、増幅産物のモノクローナル集団をパーティション内の同じ担体に固定化することができる。
（鋳型核酸分子又はその相補体を用いた）担体の予濃縮のための方法は、溶液中で実施され得る。幾つかの例では、予濃縮方法は、エマルジョン又はパーティションを含まない溶液中で実施され得る。他の例では、予濃縮方法はパーティションで実行されてもよい。手順は統合されてもよい。或いは、プロセスは統合されなくてもよい。
コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされるコンピュータシステムを提供する。図６は、核酸配列及び配列分析を実行するなど、本開示の方法及びシステムを実施するようにプログラム又は他の方法で構成されたコンピュータシステム６０１を示す。
コンピュータシステム６０１は、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、或いは、並列処理のための複数のプロセッサとなり得る中央処理ユニット（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」でもある）６０５を含む。また、コンピュータシステム６０１は、メモリ又は記憶場所６１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子ストレージユニット６１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インタフェース６２０（例えば、ネットワークアダプター）、及び、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／又は、電子ディスプレイアダプターなどの周辺装置６２５も含む。メモリ６１０、ストレージユニット６１５、インタフェース６２０、及び、周辺装置６２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ６０５と通信している。ストレージユニット６１５は、データを記憶するためのデータストレージユニット（又はデータリポジトリ）となり得る。コンピュータシステム６０１は、通信インタフェース６２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）６３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク６３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、或いは、インターネットと通信しているイントラネット及び／又はエクストラネットとなり得る。ネットワーク６３０は、電気通信及び／又はデータネットワークであってもよい。ネットワーク６３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク６３０は、場合によっては、コンピュータシステム６０１の助けを借りて、ピアツーピアネットワークを実装することができ、これにより、コンピュータシステム６０１に結合された装置がクライアント又はサーバとして動作することが可能になる。
ＣＰＵ６０５は、プログラム又はソフトウェアで具体化することができる一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ６１０などの記憶場所に記憶することができる。命令をＣＰＵ６０５に向けることができ、該命令は、その後、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ６０５をプログラムする或いはさもなければ構成することができる。ＣＰＵ６０５によって実行される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、及び、ライトバックを挙げることができる。
ＣＰＵ６０５は、集積回路などの回路の一部であってもよい。システム６０１の１つ以上の他の構成要素が回路に含まれてもよい。回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であってもよい。
ストレージユニット６１５は、ドライバ、ライブラリー、及び、保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。ストレージユニット６１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザ選択及びユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム６０１は、イントラネット又はインターネットを介してコンピュータシステム６０１と通信しているリモートサーバ上に位置されるようなコンピュータシステム６０１の外部にある１つ以上の更なるデータストレージユニットを含むことができる。
コンピュータシステム６０１は、ネットワーク６３０を介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム６０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（ポータブルＰＣなど）、スレート又はタブレットＰＣ（Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂなど）、電話、スマートフォン（Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応装置、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標）など）又は携帯情報端末が挙げられる。ユーザは、ネットワーク６３０を介してコンピュータシステム６０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ６１０又は電子ストレージユニット６１５などの、コンピュータシステム６０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能コード又は機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供できる。使用中、コードはプロセッサ６０５によって実行することができる。コードは、ストレージユニット６１５から取り出され、プロセッサ６０５による即時アクセスのためにメモリ６１０に記憶され得る。状況によっては、電子ストレージユニット６１５を排除することができ、また、機械実行可能命令がメモリ６１０に記憶される。
コードは、事前にコンパイルして、コードを実行するようになっているプロセッサを有するマシンで使用するように構成することもでき、また、実行時にコンパイルすることもできる。コードは、コードが予めコンパイルされた又はコンパイルされる態様で実行できるようにするべく選択されるプログラミング言語で供給されてもよい。
コンピュータシステム１１０１など、本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで具体化することができる。技術の様々な態様は、典型的には機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又はあるタイプの機械可読媒体に保持又は組み込まれる関連データの形の「製品」又は「製造品」と考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶ユニットに記憶することができる。「ストレージ」タイプの媒体としては、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれか又は全て、或いは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも持続性ストレージを提供できる、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの関連モジュールを挙げることができる。ソフトウェアの全て又は一部は、インターネット又はその他の様々な通信ネットワークを通じて通信される場合がある。そのような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータへの、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を担うことができる別のタイプの媒体は、有線及び光の地上回線ネットワークを介して、及び様々なエアリンクを介して、ローカルデバイス間の物理インタフェース全体で使用されるような、光、電気及び電磁波を含む。有線又は無線リンク、光リンクなど、そのような波を運ぶ物理的要素も、ソフトウェアを搭載したメディアと見なすことができる。本明細書中で使用されるコンピュータ又は機械「読み取り可能媒体」などの用語は、持続性の有形な「記憶」媒体に限定されなければ、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形の記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実装するために使用され得るような、（１又は複数の）任意のコンピュータなどの任意の記憶装置などの、光ディスク又は磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形の伝送媒体としては、同軸ケーブル、コンピュータシステム内のバスを構成する配線を含めて、銅線及び光ファイバが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号又は電磁信号、又は無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるような音響波又は光波の形をとることがある。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形式としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、その他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ又はＤＶＤ－ＲＯＭ、その他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンがある任意の他の物理的な記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ又はカートリッジ、データ又は命令を伝送する搬送波、そのような伝送波を伝送するケーブル又はリンク、又は、コンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読み取ることができるようにする任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のためにプロセッサに１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを担持することに関与し得る。
コンピュータシステム６０１は、例えば、核酸配列（例えば、配列リード、コンセンサス配列など）の結果を提供するためのユーザインタフェース（ＵＩ）６４０を備える電子ディスプレイ６３５を含む或いは電子ディスプレイ６３５と通信することができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）やウェブベースのユーザインタフェースが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の方法及びシステムは、１つ以上のアルゴリズムによって実装することができる。アルゴリズムは、中央処理ユニット６０５による実行時にソフトウェアを介して実装することができる。アルゴリズムは、例えば、本開示の方法を実施することができる。
［実施例］
以下の例は、本開示の特定の態様を更に説明するために含まれ、本開示の範囲を限定するために使用されるものではない。
［実施例１］
この例は、核酸サンプルを分析するための本明細書に記載の手法が他の技術よりも優れていることを実証する。
ｅＰＣＲワークフローが、実行されて、図３の左パネルに示されている。ＤＮＡ鋳型分子の変異体１（３０１）及び２（３０２）をビーズ（３０３）と共に乳化させた（３０４）。鋳型及びビーズの両方が、エマルジョン中の液滴の総数と比較して低存在量であり、最小のポリクローナルビーズ及びクローンコピーをもたらした。液滴の大部分は空であり（３０５）、幾つかの液滴は単一のビーズのみを含有し（３０６）、幾つかの液滴は鋳型核酸分子のみを含有した（３０７）。（３０６）及び（３０７）の両方は、増幅された鋳型陽性ビーズを送達せず、（３０７）のＤＮＡ鋳型は分析ワークフローを脱したので分析しなかった。鋳型核酸分子とビーズ（例えば、３０８）の両方を含む液滴のみが、その後の分析のための増幅産物を生成することができる機能的増幅反応器であった。エマルジョンブレーク及び濃縮（３０９）の後、鋳型陽性ビーズは、配列決定に有用なビーズを送達した（３１０）。
本明細書に記載の核酸分析手法が、実施されて、図３の右側パネルに示される。本明細書に記載されるように、有意により多数のビーズ（３１１）をエマルジョン液滴中に装填した。したがって、エマルジョン中の大部分の液滴中の液滴あたり０～１個のビーズとは対照的に、エマルジョン中の大部分の液滴中の各液滴中に複数のビーズ（例えば、０～１０個のビーズ）を装填した。鋳型核酸分子を含む全ての液滴もビーズを含み、したがって、全てのビーズの複数のクローンコピーを生成した（３１２）、（３１３）。本明細書に記載の１つ以上の手順を使用すると、破壊及び濃縮後に鋳型核酸分子は失われず、両方の変異体（３１４／３１５）が複数回配列決定され、精度が向上した。
分解能（例えば、信号対雑音比）を更に高めるために、鋳型の標識に固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、特定の変異体を個々の出発鋳型に割り当てた。
このデータは、本開示の方法及び組成物が、核酸サンプルを分析するための精度の有意な向上をもたらし得ることを実証している。これは、非常に限られたサンプル材料しか存在しない場合、及び／又は稀な変異体の検出が重要である場合に特に重要であり得る。
［実施例２］
この例は、図５Ａ及び図５Ｂに示すグラフを生成するために使用された数学的モデルを実証する。図５Ａは、１０％の増分インデックスを有するペアリードを生成する確率（％）の横軸５０２と、１０％の増分インデックスを有する固有リードの割合（％）の縦軸５０１とを有するグラフを示す。図５Ｂは、平均液滴集合（Ｍｅａｎ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の横軸５０４を有し、１つの増分インデックスを有し、縦軸５０３を有し、１０％の増分インデックスを有するグラフを示す。
以下の数学的関係が使用される。
Figure 2022519324000007
式中、Ｐ（Ｘ｜Ｙ）はＸの確率分布を示し、Ｙ、ＭＡ及びＭＢはそれぞれ集団Ａ及びＢのビーズの数であり、Ｌｄｒｏｐｌｅｔは液滴あたりのビーズの平均数であり、Ｎｄｒｏｐｌｅｔは液滴中のビーズの数について可変であり、ＦｓｐｌｉｔはタイプＡのビーズの割合であり、Ｆｓｅｑはビーズが配列決定される確率である。
［実施例３］
この例は、ビーズタイプＡ及びＢのランダムな液滴装填の効率の分析的関係を示す（図５Ａ）。
平均ビーズ装填をパラメトリックに掃引すると、予想される固有リードの割合と、ペアリードを生成する確率、すなわち、Ａ及びＢの各々の少なくとも１つのコピーを達成する確率との間に関係が確立される。例えば、ペアリードを生成する確率が５０％の場合、リードの３０％が固有である。図５Ｂは、所定の平均液滴ビーズ装填に対する様々な読み取りシナリオ間の関係を示す。シナリオは、Ｐ（ＮＡ，ＮＢ）と標識付けされ、ＮＡ及びＮＢは、それぞれ読み取られたタイプＡ及びＢのビーズの数である。インデックス５０５は、上から順に、（ｉ）Ｐ（＞０、＞０）、（ｉｉ）Ｐ（１、１）、（ｉｉｉ）Ｐ（２，１）｜Ｐ（１，２）、（ｉｖ）Ｐ（２，２）、（ｖ）Ｐ（３，１）｜Ｐ（１、３）、及び（ｖｉ）Ｆｒｅｄｕｎｄａｎｔで、異なるグラフ線を標識化する。ＮＡ＞０及びＮＢ＞０の事例、すなわちＰ（＞０、＞０）は、Ａ＆Ｂリード対が得られる全てのシナリオを説明し、最も高い実線曲線である。Ｐ（１、１）は、各リードのただ１つのコピーが取得される特別なインスタンスである。点線の曲線は、Ａ又はＢの冗長コピーであるリードの割合である。Ｆｓｐｌｉｔは５０％であり、両方のビーズが等しく可能性があることを示す。Ｆｓｅｑは１００％であり、ビーズが配列決定される可能性である。アノテーションは、ペアリードを生成するために１００％の効率を達成することが、配列決定において９０％の冗長性（Ａ及び／又はＢの更なるコピー）をもたらすことを示す。
［実施例４］
この例は、生体サンプル（例えば、図７参照）を分析するための方法を実証する。
生体サンプルを分析するためのこの方法は、各々が複数のアダプターのうちの特定のアダプターに対応するプライマー配列を含む２種類のビーズを含み、複数のアダプターは複数のバーコード配列を含む。アダプターは、生体サンプルの複数の核酸分子の核酸分子（例えば、ターゲット核酸分子）の末端に結合され得る。ターゲット核酸ライブラリーインサートの長さ（例えば、図７の核酸分子７０５によって示される）は、両端からの核酸配列決定が、重複を全く有さないか、又は非常に最小の重複を有する配列リードを提供するように選択される。インサートは、複数のアダプターのアダプターによる機能化の前に末端修復及びＡテール加工される。合成二本鎖核酸分子は、インサートとループ及びライゲートし得るように設計される。そのため、合成二本鎖は、好ましくは末端リン酸塩を含まないＴオーバーハングを含む。合成二本鎖核酸分子の配列は、以下の通り、すなわち、バーコード２’、ＰＢ’開裂可能要素、ＰＡ、バーコード１である。バーコード１及びバーコード２’は、任意の市販のバーコード配列であってもよく、異なる配列であってもよい。或いは、幾つかの例では、バーコード１及びバーコード２’は異なる配列でなくてもよい。しかしながら、バーコード配列は十分に定義されているため、互いに対して割り当てられてもよい。開裂可能要素は、化学的、光、熱、又は他の機構による合成二本鎖核酸分子の鎖の分離を可能にする。ライゲーション及び環状化の後、合成二本鎖核酸分子は開裂され、ポリメラーゼに基づく伸長によってギャップ装填される。２つのタイプのビーズ（例えば、図８の部分８０６によって示されるもの）がクローン増幅のために利用可能であり、１つは固定化ＰＡ（図８の１－８）オリゴヌクレオチド又は最小限ＰＡの部分を有し、もう１つはＰＢ（４－８、図８）オリゴヌクレオチド又は最小限ＰＢの部分を固定化している。
したがって、線形化されたギャップ装填鋳型の熱変性は、ｅＰＣＲなどのクローン増幅のために十分に分離された区分（例えば、パーティション）にビーズを分配する前に、２つのビーズタイプにアニーリングすることを可能にする。この例を本明細書に記載の方法のいずれかと組み合わせることにより、核酸増幅反応のアニーリングプロセスの排除が可能になり得る。
［実施例５］
この例は、各末端（例えば、図２０参照）に付着された同じアダプター対（Ａ／Ａ’）を有するインサートライブラリー（Ｉ）を使用してクローン増幅ビーズを作製する方法を実証する。本明細書で使用される場合、プライム（’）は逆相補体（例えば、Ａ’はＡの逆相補体である）を示す。ビーズは、ビーズに付着した少数コピーの第２のプライマー（Ｘ Ａ）及び多くのコピーの第１のプライマー（Ｘ）を有する。適合したインサート（Ａ’ＩＡ）は、第２のプライマーとハイブリダイズし、伸長される。伸長産物は、第１のプライマー（Ｘ）の更なるコピーを伸長させることができるが、指数関数的に伸長させることはできない。伸長された第２（又は第１）のプライマーの他端も第４のプライマー（ＡＢ’）を用いて伸長されると、指数増幅が許容される。ここで、表面プライマー（Ｘ）の多くのコピー及び溶液プライマー（第３のプライマー、Ｂ’）の多くのコピーを用いて指数関数的な表面増幅を行なうことができる。他のビーズは異なる第１のプライマー（Ｚ）を有するため、第１のビーズ（Ｘ）から生成された伸長産物は、第２のビーズ（Ｚ）に対して付加された親和性を有さない。温度、濃度及び他の増幅条件は、第１及び第２の伸長が指数関数的増幅と比較して遅い及び／又は稀な事象であるように選択される。温度、濃度及び他の増幅条件は、第１の伸長産物（Ｘ）が他のビーズ（Ｚ）の鋳型として機能しないように選択される。
以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図されている。
［実施例６］
本明細書に記載されるように、結合された鋳型核酸分子を含む伸長担体を、以下の手順を使用して調製した。
ライブラリーのアニーリング及び伸長：１００マイクロリットルの最終容量を含有する反応混合物を、以下の成分／濃度：１１０×ＴＡＱポリメラーゼ反応緩衝液、８．２ミリモル（ｍＭ）のＭｇＣｌ２、１２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ピコモル（ｐＭ）のライブラリー、１マイクロモル／分（Ｕ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び６．００×１０７ビーズ／マイクロリットルを用いて調製した。表２の条件を使用して、以下のように混合物をサーモサイクラーでインキュベートした。
Figure 2022519324000008
４００マイクロリットル（μＬ）のＴＥＴ緩衝液（ＴＥ ｐＨ８．０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を加えることによってビーズを洗浄した。混合物を３０秒間ボルテックスし、遠心分離機で２１，０００回転／分（ＲＰＭ）で８分間スピンダウンした。上清を除去して１００μＬを残した。ビーズを５００μＬの１×ＳＡ Ｂｉｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ３．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で洗浄した。混合物を３０秒間ボルテックスし、遠心分離機で２１，０００ＲＰＭで８分間スピンダウンした。上清を除去して１００μＬを残した。
拡張ビーズを濃縮する：１００μＬの磁性ストレプトアビジンビーズを伸長ビーズに添加した。この混合物を混合し、室温で１時間インキュベートした。溶液が透明になるまでビーズを適切な磁石で磁化し、上清を除去した。ビーズを穏やかな再懸濁によって５００μＬのＳＡ Ｂｉｎｄ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。２回目の磁化操作では、溶液が透明になるまでビーズを適切な磁石で磁化し、上清を除去した。ビーズを穏やかな再懸濁によって５００μＬのＳＡ Ｂｉｎｄ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。３回目の磁化操作では、溶液が透明になるまでビーズを適切な磁石で磁化し、上清を除去した。
伸長ビーズを溶出させる。すなわち、ビーズを３００μＬの５０℃ Ｍｅｌｔｏｆｆ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／リットル（Ｍ）ＮａＯＨ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁し、５０℃で５分間インキュベートした。混合物を短時間ボルテックスし、溶液が透明になるまで適切な磁石でビーズを磁化した。ビーズを含む上清を除去し、保持した。２回目のメルトオフ操作では、ビーズを３００μＬの５０℃ Ｍｅｌｔｏｆｆ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／リットル（Ｍ）ＮａＯＨ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁し、５０℃で５分間インキュベートした。混合物を短時間ボルテックスし、溶液が透明になるまで適切な磁石でビーズを磁化した。ビーズを含有する上清を取り出して保持し、ビーズを含有する先の上清と合わせた。溶出したビーズを遠心分離機で２１，０００ＲＰＭで８分間スピンダウンし、上清を除去して１００μＬを残した。ビーズを５００μＬの１×ＳＡ Ｂｉｎｄ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、３０秒間ボルテックスした。ビーズを遠心分離機で２１，０００ＲＰＭで８分間スピンダウンし、上清を除去して１００μＬを残した。ビーズを５００μＬのＴＥＴ緩衝液で洗浄し、３０秒間ボルテックスした。ビーズを遠心分離機で２１，０００ＲＰＭで８分間スピンダウンし、上清を除去して１００μＬを残した。
その後、濃縮したビーズをｅＰＣＲ手順で使用した。
［実施例７］
以下の表３及び図２５は、予濃縮手順を実施しない対照手順に対する予濃縮（例えば、クローン増幅の前に、増幅のために単離された及び／又は濃縮された伸長担体混合物を使用するために、担体の混合物（例えば、ビーズ）を濃縮すること）手順を使用した増幅の結果を示す。大腸菌ライブラリー鋳型及び人工鋳型で増幅を行なった。
Figure 2022519324000009
図２５は、パネル（Ａ）では前濃縮手順に供された大腸菌ライブラリーを示し、パネル（Ｂ）では予濃縮手順に供された人工鋳型ライブラリーを示し、パネル（Ｃ）では対照手順に供された人工鋳型ライブラリーを示す（前濃縮の非存在下）。各グラフは、カウント対アロフィコシアニン（ＡＰＣ）蛍光の分布を示す。パネル（Ａ）及び（Ｃ）の場合、縦軸インデックスはそれぞれ０、５００、１，０００、及び１，６００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６、及び１０７．２の昇順で読み取られる。パネル（Ｂ）の場合、縦軸インデックスはそれぞれ０、２００、４００、６００、及び８００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６、及び１０７．２の昇順で読み取られる。パネル（Ａ）に示すように、大腸菌ライブラリー（予濃縮）は、（理論値の１０％に対して）５％の濃縮及び９５．３％の増幅をもたらした。パネル（Ｂ）に示されるように、人工鋳型ライブラリー（予濃縮）は、（理論値の１０％に対して）１．６％の濃縮及び８９．６％の増幅をもたらした。パネル（Ｃ）に示されるように、人工鋳型ライブラリー（対照）は１６．８％の増幅をもたらした。予濃縮人工鋳型ライブラリー集団の約１３．２５％がポリクローナル増幅をもたらした。濃縮後人工鋳型ライブラリー集団の約１１％がポリクローナル増幅をもたらした。
［実施例８］
本明細書に記載の鋳型核酸分子（例えば、付着されたアダプター）に付着するように構成された伸長プライマー配列を含む伸長担体を、以下の手順を用いて調製した。
ビオチン化伸長プライマー分子の段階希釈物を、１０ミリモル（ｍＭ）のＴｒｉｓ ｐＨ８．０中、１０マイクロモルのストックから１０ナノモル（ｎＭ）、１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０１ｎＭのストックまでそれぞれ調製し、これらを更に希釈して、６０００万ビーズ／μＬ中で１０００、１００、１０及び１ピコモル（ｐＭ）の最終濃度を達成した。ビオチン化伸長プライマー分子は、伸長プライマー配列の相補体を含む。ビーズ上のプライマー分子とビオチン化伸長プライマー分子との間のプレアニーリングを９５℃で２分間行なった。混合物をゆっくりと５０℃まで冷却し、１×ＥｐｉＭａｒｋ（Ｒ）緩衝液中で合計４５分間保持した。プライマーを７０℃のヒートブロックで２０分間伸長させ、１×ＢＷ緩衝液で２回洗浄した。磁性ストレプトアビジンビーズを室温でローター上で１．５時間ビオチン鋳型ビーズとハイブリダイズさせた。ビーズを磁気的に捕捉した。磁気捕捉後、水中０．１％ ＮａＯＨ及び０．０５％及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて５０℃で５分間、ビーズ（単一伸長プライマー配列を有する）を溶出した。濃縮したビーズを、１×ＥｐｉＭａｒｋ（Ｒ）緩衝液を用いて３回洗浄し、その後、ｅＰＣＲ手順で使用した。
［実施例９］
以下の表４及び図２６～図２７は、異なる伸長プライマー：ビーズ入力比率でのプライマー伸長後に捕捉された濃縮ビーズの結果を示す。
Figure 2022519324000010
１０００ｐＭ濃度の伸長プライマー及び１０：１の伸長プライマー：ビーズ比率の場合、０、１、及び２＋鋳型を有するビーズの予測％は、それぞれ０％、０％、及び１００％である。したがって、捕捉された（少なくともＮ＝１個の伸長プライマーを有する）ビーズの予測％は１００％である。捕捉されたビーズの観察された％は５１％であった。
１００ｐＭ濃度の伸長プライマー、及び１：１の伸長プライマー：ビーズ比率の場合、０、１、及び２＋鋳型を有するビーズの予測％は、それぞれ３７％、３７％、及び２６％である。したがって、捕捉された（少なくともＮ＝１個の伸長プライマーを有する）ビーズの予測％は６３％である。捕捉されたビーズの観察された％は３５％であった。
図２６は、パネル（Ａ）において１０００ｐＭ伸長プライマー入力濃度で捕捉された濃縮ビーズの存在を示し、パネル（Ｂ）において１００ｐＭ伸長プライマー入力濃度で捕捉された濃縮ビーズの存在を示す。各グラフは、８００ ＦＩＴＣ閾値を有する、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）蛍光に対するカウントの分布を示す。各グラフについて、縦軸インデックスはそれぞれ０、１００００、及び２５，６００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６及び１０７．２の昇順で読み取られる。
図２７は、パネル（Ａ）において、１０００ｐＭの伸長プライマー入力濃度及び１０：１の伸長プライマー：ビーズ比率での濃縮ビーズ中の伸長プライマー配列の存在を示し、パネル（Ｂ）において、１００ｐＭの伸長プライマー入力濃度及び１：１の伸長プライマー：ビーズ比率での濃縮ビーズ中の伸長プライマー配列の存在を示す。各グラフは、カウント対アロフィコシアニン（ＡＰＣ）蛍光の分布を示す。パネル（Ａ）の場合、縦軸インデックスはそれぞれ０、５，０００、１００００、及び１２，８００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６及び１０７．２の昇順で読み取られる。パネル（Ｂ）の場合、縦軸インデックスはそれぞれ０、１，０００、２，０００、及び３，２００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６及び１０７．２の昇順で読み取られる。パネル（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、濃縮ビーズの７５．１％及び７９．１％がそれぞれ、少なくとも１つの伸長プライマー配列を含有することが観察された。
［実施例１０］
本明細書に記載のように、以下の手順を用いて、伸長プライマー配列を含む伸長担体を鋳型核酸分子（例えば、付着されたアダプター）に付着させた。
伸長担体へのライブラリー鋳型のアニーリング前：二種の一本鎖鋳型と伸長ビーズ（伸長プライマー配列を含むビーズ）との混合物を、２０倍過剰の鋳型：濃縮ビーズで準備し、９５℃で２分間アニーリングし、５０℃にゆっくり冷却し、１×ＥｐｉＭａｒｋ（Ｒ）緩衝液中で合計４５分間保持した。混合物を２～２０時間回転させながら５０℃で更に複数回インキュベートした。ビーズを１×ＥｐｉＭａｒｋ（Ｒ）緩衝液で１回洗浄した。得られたビーズは、それに結合した鋳型分子（例えば、単一鋳型分子）を有する。
ｅＰＣＲのための鋳型化された伸長担体の分割：鋳型化されたビーズをｅＰＣＲのための液滴に分割した。ｅＰＣＲのための分割の前に、鋳型を伸長プライマー配列にアニーリングすることによって、及び／又は伸長プライマー配列からの伸長によって鋳型に鋳型ビーズ（例えば、伸長プライマー配列を介して鋳型分子に結合されたビーズ）を結合して、ビーズに結合された鋳型の相補体を生成し得ることが理解される。
［実施例１１］
以下の表５及び図２８～図２９は、異なる伸長プライマー：ビーズ入力比率で鋳型ビーズを使用したｅＰＣＲ増幅の結果を示す。２種の鋳型のためのアトプローブを増幅ビーズにアニーリングし、全増幅を測定した。
図２８は、パネル（Ａ）において、１０００ｐＭ伸長プライマー入力濃度、１０：１伸長プライマー：ビーズ入力比率、２００ｐＭ鋳型入力濃度及び１：２０濃縮ビーズ：鋳型入力比率での増幅ビーズ（又はライブラリー陽性ビーズ）の存在を示し、パネル（Ｂ）において、１００ｐＭ伸長プライマー入力濃度、１：１伸長プライマー：ビーズ入力比率、２００ｐＭ鋳型入力濃度及び１：２０濃縮ビーズ：鋳型入力比率での増幅ビーズ（又は陽性ビーズ）の存在を示す。各グラフは、カウント対アロフィコシアニン（ＡＰＣ）蛍光の分布を示す。パネル（Ａ）の場合、縦軸インデックスはそれぞれ０、２０００、４０００、及び６４００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６、及び１０７．２の昇順で読み取られる。パネル（Ｂ）の場合、縦軸インデックスはそれぞれ０、１００、１５０、及び２００の昇順で読み取られ、横軸インデックスはそれぞれ１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６、及び１０７．２の昇順で読み取られる。パネル（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、１０００ｐＭ及び１００ｐＭ伸長プライマー入力濃度についてそれぞれ濃縮ビーズの８０．１％及び４１．５％を増幅した。
図２９は、垂直パネル（Ａ）において、１０００ｐＭ伸長プライマー入力濃度、１０：１伸長プライマー：ビーズ入力比率、２００ｐＭ鋳型入力濃度及び１：２０濃縮ビーズ：鋳型入力比率での増幅ビーズのポリクロナリティを示す２つのグラフを示し、垂直パネル（Ｂ）において、１００ｐＭ伸長プライマー入力濃度、１：１伸長プライマー：ビーズ入力比率、２００ｐＭ鋳型入力濃度及び１：２０濃縮ビーズ：鋳型入力比率での増幅ビーズのポリクロナリティを示す２つのグラフを示す。各グラフは、ＡＰＣ蛍光対ＦＩＴＣ蛍光の分布を示す。各グラフの縦軸及び横軸のそれぞれについて、軸インデックスはそれぞれ昇順１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６、及び１０７．２で読み取られる。上の２つのグラフはＦＩＴＣに閾値を有し、下の２つのグラフはＡＰＣ蛍光に閾値を有する。
Figure 2022519324000011
表５に示すように、予備濃縮ビーズについて観察されたポリクローナル割合は、理論予測の６７％及び２３％のポリクローナル性よりも、それぞれ３０％及び６％（それぞれ１０００ｐＭ及び１００ｐＭ伸長プライマー入力濃度について）とはるかに低かった。更に、予濃縮なしでｅＰＣＲを実施するための予測ポリクローナルパーセンテージは、８０．１％及び４１．５％のライブラリー陽性率（例えば、図２８に関するライブラリー陽性ビーズの結果を参照されたい）についてそれぞれ４４％及び２２％である。したがって、結果は、本明細書に記載の予濃縮手順を実施すると、標準的なポアソン装填（予濃縮なし）を用いた場合よりも、所定の割合のライブラリー陽性ビーズでより低いレベルのポリクロナリティが生成されることを示した。
本発明の好ましい実施形態について図示して本明細書中で説明してきたが、当業者に明らかなように、そのような実施形態は単なる一例として与えられる。本発明が、明細書中で提供される特定の例によって限定されることは意図されていない。前述の明細書を参照して本発明を説明してきたが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意図していない。この時点では、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び、置換が当業者に想起される。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書中に記載された特定の描写、形態、又は、相対的比率に限定されないことが理解されるものとする。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に使用されてもよいことが理解されるべきである。したがって、本発明は、そのような代替、修正、変形、又は同等物もカバーするものとすることが企図されている。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図されている。

Claims (93)

  1. 核酸処理のための方法であって、
    （ａ）複数のパーティションを与えるステップであって、前記複数のパーティションのうちの１つのパーティションが、（ｉ）複数のビーズのうちの少なくとも２つのビーズ、（ｉｉ）核酸分子、及び、（ｉｉｉ）１つ以上の試薬を含む、ステップと、
    （ｂ）前記パーティションにおいて、前記核酸分子及び前記１つ以上の試薬を使用して、前記核酸分子の１つ以上の増幅産物を生成するステップであって、前記１つ以上の増幅産物の少なくとも１つのサブセットが、前記少なくとも２つのビーズのうちの１つのビーズに付着される、ステップと、
    （ｃ）前記パーティションから前記ビーズを回収するステップと、
    （ｄ）前記ビーズに付着される前記１つ以上の増幅産物のうちの１つの増幅産物又はその誘導体をアッセイして、前記核酸分子の配列を同定するステップと、
    を含む方法。
  2. （ａ）は、（ｉ）前記核酸分子を含む複数の核酸分子を含む第１の溶液、及び、（ｉｉ）前記少なくとも２つのビーズを含む前記複数のビーズを含む第２の溶液を、前記第１の溶液及び前記第２の溶液と混和しない流体と接触させて、前記複数のパーティションを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ビーズには、前記核酸分子を使用して１つ以上の増幅反応を行なうための複数のプライマー分子が付着されてしまっており、（ｂ）は、前記複数のプライマー分子のうちのプライマー分子を使用して、前記１つ以上の増幅反応を行なって、前記１つ以上の増幅産物のうちの前記増幅産物を生成するステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ビーズには、前記核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、前記複数の更なるプライマー分子が前記複数のプライマー分子とは異なる、請求項３に記載の方法。
  5. （ｂ）は、前記複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、前記１つ以上の更なる増幅反応を行なって、前記１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップを更に含み、前記更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットが前記ビーズに付着され、（ｄ）は、前記核酸分子の配列を同定するために、前記ビーズに付着される前記更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイするステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記核酸分子が二本鎖核酸分子であり、前記核酸分子の第１鎖に対応する増幅産物が前記複数のプライマー分子を使用して生成され、前記核酸分子の第２鎖に対応する増幅産物が前記複数の更なるプライマー分子を使用して生成される、請求項５に記載の方法。
  7. （ｄ）は、前記１つ以上の増幅産物又はその誘導体の配列と会合されるペアエンド配列決定リードを生成するステップを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記少なくとも２つのビーズのうちの更なるビーズには、前記核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、前記複数の更なるプライマー分子が前記複数のプライマー分子とは異なる、請求項３に記載の方法。
  9. （ｅ）前記複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、前記１つ以上の更なる増幅反応を行なって、前記１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップであって、前記更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットが前記少なくとも２つのビーズのうちの前記更なるビーズに付着される、ステップと、
    （ｆ）前記パーティションから前記更なるビーズを回収するステップと、
    （ｇ）前記更なるビーズに付着される前記更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイして、前記核酸分子の配列を同定するステップと、
    を更に含む請求項８に記載の方法。
  10. 前記複数のパーティションの少なくとも８０％のそれぞれが、前記複数のビーズのうちの２つ以上のビーズを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記複数のパーティションの少なくとも８０％のそれぞれが、前記複数のビーズのうちの３つ以上のビーズを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも２つのビーズが互いに付着される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも２つのビーズは、化学リンカー及びスプリントオリゴヌクレオチドの少なくとも一方を介して互いに付着される、請求項１２に記載の方法。
  14. 少なくとも２つのビーズをそれぞれが含む前記複数のパーティションのうちのパーティションを、多くとも１つのビーズをそれぞれが含む前記複数のパーティションのうちの他のパーティションから分離するステップを更に含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 分離する前記ステップは、それぞれが少なくとも２つのビーズを含む前記パーティション又はそれぞれが多くとも１つのビーズを含む前記他のパーティションを光学的に検出するステップと、光学的に検出する前記ステップに少なくとも基づき、流体装置内の流体の流れの方向を調整して、前記流体装置の第１のチャネル内に少なくとも２つのビーズをそれぞれが含む前記パーティションと、前記流体装置の第２のチャネル内に多くとも１つのビーズをそれぞれが含む前記他のパーティションとを与えるステップとを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記１つ以上の試薬は、プライミング配列を含む核酸分子を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記プライミング配列を含む前記核酸分子が固有分子識別子配列を更に含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記プライミング配列を含む前記核酸分子がバーコード配列を更に含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記１つ以上の試薬が１つ以上の重合酵素を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記複数のパーティションが複数の液滴である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. （ｄ）は、前記増幅産物又はその誘導体を配列決定するステップを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. （ａ）において、前記核酸分子が前記ビーズに付着される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 核酸処理のための方法であって、
    （ａ）複数のパーティションを与えるステップであって、前記複数のパーティションのうちの１つのパーティションが、（ｉ）複数のビーズのうちの少なくとも２つのビーズであって、前記少なくとも２つのビーズが互いに付着される、少なくとも２つのビーズと、（ｉｉ）核酸分子と、（ｉｉｉ）１つ以上の試薬とを含む、ステップと、
    （ｂ）前記パーティションにおいて、前記核酸分子及び前記１つ以上の試薬を使用して、前記核酸分子の１つ以上の増幅産物を生成するステップであって、前記１つ以上の増幅産物の少なくとも１つのサブセットが前記少なくとも２つのビーズのうちの１つのビーズに付着される、ステップと、
    を含む方法。
  24. （ｃ）前記パーティションから前記ビーズを回収するステップと、
    （ｄ）前記ビーズに付着される前記１つ以上の増幅産物のうちの１つの増幅産物又はその誘導体をアッセイして、前記核酸分子の配列を同定するステップと、
    を更に含む請求項２３に記載の方法。
  25. （ａ）は、（ｉ）前記核酸分子を含む複数の核酸分子を含む第１の溶液、及び、（ｉｉ）前記少なくとも２つのビーズを含む前記複数のビーズを含む第２の溶液を、前記第１の溶液及び前記第２の溶液と混和しない流体と接触させて、前記複数のパーティションを生成するステップを含む、請求項２３から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ビーズには、前記核酸分子を使用して１つ以上の増幅反応を行なうための複数のプライマー分子が付着されてしまっており、（ｂ）は、前記複数のプライマー分子のうちのプライマー分子を使用して、前記１つ以上の増幅反応を行なって、前記１つ以上の増幅産物のうちの前記増幅産物を生成するステップを含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記ビーズには、前記核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着してしまっており、前記複数の更なるプライマー分子が前記複数のプライマー分子とは異なり、（ｂ）は、前記複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、前記１つ以上の更なる増幅反応を行なって、前記１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップであって、前記更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットが前記ビーズに付着される、ステップを更に含み、（ｄ）は、前記ビーズに付着される前記更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイして前記核酸分子の配列を同定するステップを更に含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記少なくとも２つのビーズのうちの更なるビーズには、前記核酸分子を使用して１つ以上の更なる増幅反応を行なうための複数の更なるプライマー分子が付着されてしまっており、前記複数の更なるプライマー分子が前記複数のプライマー分子とは異なり、前記方法は、
    （ｅ）前記複数の更なるプライマー分子のうちの更なるプライマー分子を使用して、前記１つ以上の更なる増幅反応を行なって、前記１つ以上の増幅産物のうちの更なる増幅産物を生成するステップであって、前記更なる増幅産物の少なくとも１つのサブセットが、前記少なくとも２つのビーズのうちの前記更なるビーズに付着される、ステップと、
    （ｆ）前記パーティションから前記更なるビーズを回収するステップと、
    （ｇ）前記更なるビーズに付着される前記更なる増幅産物又はその誘導体をアッセイして、前記核酸分子の配列を同定するステップと、
    を更に含む請求項２６に記載の方法。
  29. 核酸分子を処理するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）複数の第１のプライマーが固定化されて成る表面であって、前記複数の第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性を有する表面と、（ｉｉ）前記核酸分子であって、前記核酸分子が前記第１の配列の相補体とは異なる末端配列を含む、前記核酸分子と、（ｉｉｉ）第１の部分及び第２の部分を含む第２のプライマーであって、前記第１の部分が前記核酸分子にアニールするように構成され、前記第２の部分が伸長配列を含み、前記伸長配列又はその相補体が前記第１の配列とハイブリダイズするように構成される、第２のプライマーと、を含む反応混合物を与えるステップと、
    （ｂ）前記核酸分子及び前記第２のプライマーを使用して伸長産物を生成するステップであって、前記伸長産物が前記伸長配列又はその相補体を含む、ステップと、
    （ｃ）前記表面に固定化される前記複数の第１のプライマーを使用して前記伸長産物を増幅するステップと、
    を含む方法。
  30. 前記第２のプライマーが前記表面に固定化される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記核酸分子は、（ｂ）の前に前記複数の第１のプライマーとハイブリダイズしない、請求項２９から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記表面が増幅部位のアレイを含み、増幅部位の前記アレイは、それに固定化される第１のプライマーの複数のセットを含み、第１のプライマーの前記複数のセットが前記第１の配列に対して配列同一性を有する、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記核酸分子は、前記反応混合物中の増幅部位の前記アレイに流体アクセスできる、請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記表面がビーズである、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記反応混合物がエマルジョンのある量の分散相中に与えられる、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記エマルジョンは、第２の表面を含む第２の反応混合物を含む第２の量の前記分散相を含む、請求項３５のいずれか一項記載の方法。
  37. （ｂ）及び（ｃ）が前記反応混合物中で行なわれる、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記反応混合物が複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が異なる核酸配列を含む核酸分子を含み、前記複数の核酸分子のそれぞれは、前記伸長配列又はその相補体を含む伸長産物を生成するべく前記第２のプライマーに結合するように構成される、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 複数の反応混合物を含む複数のパーティションを与えるステップを更に含み、前記複数のパーティションは、（ｉ）前記核酸分子を含む複数の核酸分子と、（ｉｉ）前記表面を含む複数の表面とを含み、前記複数のパーティションのうちの第１のパーティションが前記反応混合物を含み、前記複数のパーティションのうちの第２のパーティションは、前記複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子と前記複数の表面のうちの第２の表面とを含む、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記複数の核酸分子は、前記複数のパーティション間において、前記複数のパーティションにおける１パーティション当たり平均１核酸分子よりも大きい密度で分布される、請求項３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記反応混合物が第３の核酸分子及び更なる第２のプライマーを含み、前記第３の核酸分子が前記更なる第２のプライマーに結合する前に、前記核酸分子又はその誘導体が前記複数の第１のプライマーの少なくとも９９％に結合される、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. （ｃ）は、（ｂ）の速度よりも少なくとも１０倍速い速度で行なわれる、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記第２のプライマーは、（ｃ）の速度に対して（ｂ）の速度を制限する所定の濃度を前記反応混合物において有する、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記反応混合物は、前記表面に固定化されない更なる第１のプライマーを更に含み、前記更なる第１のプライマーが前記第１の配列に対して配列同一性を有する、請求項２９から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記反応混合物は、前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応で使用されるときに前記核酸分子を指数関数的に増幅するように構成される複数の第３のプライマーを更に含む、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記反応混合物が第４のプライマーを更に含み、前記第４のプライマーが第３の部分及び第４の部分を含み、前記第３の部分が前記核酸分子にアニールするように構成され、前記第２の部分が第２の伸長配列を含み、前記方法は、
    （ｄ）前記核酸分子及び前記第４のプライマーを使用して第２の伸長産物を生成するステップであって、第２の伸長が、前記第３のプライマーとハイブリダイズするように構成される前記第２の伸長配列又はその相補体を含む、ステップと、
    （ｅ）前記複数の第３のプライマーを用いて前記第２の伸長産物を増幅するステップと、
    を更に含む、請求項４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. （ｂ）又は（ｃ）が等温条件下で行なわれる、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記表面を回収するとともに、前記核酸分子の増幅産物又はその誘導体をアッセイして、前記核酸分子の配列を同定するステップを更に含む、請求項２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記核酸分子は、前記核酸分子の５’末端に付着される第１のアダプターと、前記核酸分子の３’末端に付着される第２のアダプターとを含む、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. （ｂ）を（ｃ）に対してより遅い事象にする条件に前記反応混合物を供するステップを更に含む、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記条件は、前記核酸分子と前記第２のプライマーとの間のアニーリング温度にほぼ等しい温度を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 核酸分子を処理するためのシステムであって、（ｉ）複数の第１のプライマーが固定化されて成る表面であって、前記複数の第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性を有する表面と、（ｉｉ）前記核酸分子であって、前記核酸分子が前記第１の配列の相補体とは異なる末端配列を含む、前記核酸分子と、（ｉｉｉ）第１の部分及び第２の部分を含む第２のプライマーであって、前記第１の部分が前記核酸分子にアニールするように構成され、前記第２の部分が伸長配列を含み、前記伸長配列又はその相補体が前記第１の配列とハイブリダイズするように構成される、第２のプライマーと、（ｉｖ）前記核酸分子を使用して核酸伸長反応を行なうように構成される試薬とを含む反応混合物を含む、システム。
  53. 前記第２のプライマーは、前記核酸分子に結合して、前記伸長配列又はその相補体を含む伸長産物を生成するように構成される、請求項５２に記載のシステム。
  54. 前記反応混合物は、第２の核酸分子及び更なる第２のプライマーを含み、前記核酸分子又はその誘導体は、前記第２の核酸分子が前記更なる第２のプライマーに結合する前に前記複数の第１のプライマーの少なくとも９９％に結合するように構成される、請求項５３に記載のシステム。
  55. 前記第２のプライマーは、前記核酸分子が前記第２のプライマーに結合して伸長産物を生成する速度を、前記伸長産物が前記表面上で増幅される速度に対して制限する所定の濃度を前記反応混合物において有する、請求項５３から５４のいずれか一項に記載のシステム。
  56. 前記第２のプライマーが前記表面に固定化される、請求項５２から５５のいずれか一項に記載のシステム。
  57. 前記表面が増幅部位のアレイを含み、増幅部位の前記アレイは、それに固定化される第１のプライマーの複数のセットを含み、第１のプライマーの前記複数のセットが前記第１の配列に対して配列同一性を有し、前記核酸分子は、前記反応混合物における増幅部位の前記アレイに流体アクセスできる、請求項５２から５６のいずれか一項に記載のシステム。
  58. 前記表面がビーズである、請求項５２から５７のいずれか一項に記載のシステム。
  59. エマルジョンを更に含み、前記反応混合物が前記エマルジョンのある量の分散相に与えられ、前記エマルジョンは、第２の表面を含む第２の反応混合物を含む第２の量の前記分散相を含む、請求項５２から５８のいずれか一項に記載のシステム。
  60. 前記反応混合物が複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が異なる核酸配列を含む核酸分子を含み、前記複数の核酸分子のそれぞれは、前記第２のプライマーに結合して、前記伸長配列又はその相補体を含む伸長産物を生成するように構成される、請求項５２から５９のいずれか一項に記載のシステム。
  61. 複数の反応混合物を含む複数のパーティションを更に含み、前記複数のパーティションは、（ｉ）前記核酸分子を含む複数の核酸分子と、（ｉｉ）前記表面を含む複数の表面とを含み、前記複数のパーティションのうちの第１のパーティションが前記反応混合物を含み、前記複数のパーティションのうちの第２のパーティションは、前記複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子と前記複数の表面のうちの第２の表面とを含み、前記複数の核酸分子は、前記複数のパーティション間において、前記複数のパーティションにおける１パーティション当たり平均１核酸分子よりも大きい密度で分布される、請求項５２から６０のいずれか一項に記載のシステム。
  62. 前記反応混合物は、前記表面に固定化されない更なる第１のプライマーを更に含む、請求項５２から６１のいずれか一項に記載のシステム。
  63. 前記反応混合物は、（ｉ）前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応で使用されるときに前記核酸分子を指数関数的に増幅するように構成される複数の第３のプライマー、（ｉｉ）及び第４のプライマーを更に含み、前記第４のプライマーが第３の部分及び第４の部分を含み、前記第３の部分が前記核酸分子にアニールするように構成され、前記第４の部分が第２の伸長配列を含む、請求項５２から６２のいずれか一項に記載のシステム。
  64. 前記核酸分子の配列を同定するために前記核酸分子の増幅産物又はその誘導体をアッセイするように構成される１つ以上のプロセッサを個別に又は集合的に更に備える、請求項５２から６３のいずれか一項に記載のシステム。
  65. 前記表面が複数の増幅部位を含み、前記増幅部位のそれぞれが前記表面に付着される異なる第１のプライマーの複数のコピーを有する、請求項５２から６４のいずれか一項に記載のシステム。
  66. 前記核酸分子は、前記核酸分子の５’末端に付着される第１のアダプターと、前記核酸分子の３’末端に付着される第２のアダプターとを含む、請求項５２から６５のいずれか一項に記載のシステム。
  67. 核酸サンプルをクローン的に増幅するための方法であって、
    （ａ）複数のパーティションを含むエマルジョンを形成するステップであって、前記複数のパーティションのうちの１つのパーティションが、（ｉ）核酸分子と、（ｉｉ）複数の第１のプライマーが固定化されて成るビーズであって、前記複数の第１のプライマーが第１の配列に対して配列同一性を有する、ビーズと、（ｉｉｉ）前記核酸分子又はその誘導体が前記ビーズに付着できるようにする付着反応と前記複数の第１のプライマーを使用する増幅反応とを実行するように構成される試薬混合物を含む、ステップと、
    （ｂ）前記エマルジョンをインキュベートし、それにより、（ｉ）前記核酸分子又はその誘導体を前記ビーズに付着させるために前記付着反応を実行する、及び、（ｉｉ）前記増幅反応を行なって、前記ビーズに付着される前記核酸分子又はその誘導体のコピーを生成する、ステップと、
    を含み、
    第１の期間が第２の期間よりも長く、前記第１の期間は、（ｂ）でのインキュベートする前記ステップから始まるとともに、前記核酸分子又はその誘導体が前記ビーズに付着するときに終了し、前記第２の期間は、前記核酸分子又はその誘導体が前記ビーズに付着するときに始まるとともに、前記増幅反応が終了するときに終了する、
    方法。
  68. 前記第１の期間は、前記第２の期間よりも少なくとも約５倍長い、請求項６７に記載の方法。
  69. 核酸分子に付着するように構成される担体を調製するための方法であって、
    （ａ）複数の担体及び複数の伸長基を含む混合物を与えるステップであって、前記複数の担体のうちの１つの担体が第１のプライマーを含み、前記複数の伸長基のうちの１つの伸長基が伸長プライマー分子を含む、ステップと、
    （ｂ）前記担体の前記第１のプライマーを前記伸長基の前記伸長プライマーに付着させるのに十分な条件に前記混合物を供して、（ｉ）前記複数の伸長基と会合されない非伸長担体と、（ｉｉ）前記伸長基と会合される伸長担体及びキャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成されるキャプチャエンティティとを含む、結果として生じる混合物を生成するステップであって、前記伸長担体が、前記伸長プライマー分子の配列に対して相補的な配列を含む第２のプライマーを含む、ステップと、
    （ｃ）前記キャプチャリングエンティティを使用して前記キャプチャエンティティを捕捉することによって前記結果として生じる混合物から前記伸長担体を単離するステップと、
    を含む方法。
  70. 前記伸長基を前記伸長担体から解離するステップを更に含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 鋳型付着担体を生成するために前記核酸分子を前記第２のプライマーにアニールするステップを更に含む、請求項６９から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記鋳型付着担体をパーティションで仕切るステップを更に含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 増幅反応を行なって、前記核酸分子の複数の増幅産物を前記伸長担体に固定化するステップを更に含む、請求項７１から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記担体がビーズを含む、請求項６９から７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記担体が複数の第１のプライマーを含み、前記複数の第１のプライマーが前記第１のプライマーを含む、請求項６９から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. （ｉ）前記キャプチャエンティティがビオチンを含み、前記キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含み、（ｉｉ）前記キャプチャエンティティがキャプチャ配列を含み、前記キャプチャリングエンティティが前記キャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含み、（ｉｉｉ）前記キャプチャエンティティが磁性粒子を含み、前記キャプチャリングエンティティが磁場系を含み、又は、（ｉｖ）前記キャプチャエンティティが荷電粒子を含み、前記キャプチャリングエンティティが電場系を含む、請求項６９から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. （ａ）において、前記伸長基が前記キャプチャエンティティを含む、請求項６９から７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. （ｂ）は、前記キャプチャエンティティを含むヌクレオチドを組み込むために前記第１のプライマーを使用して伸長反応を行なうステップを含む、請求項６９から７６のいずれか一項に記載の方法。
  79. （ｃ）は、
    （ｉ）前記キャプチャリングエンティティ及び（ｉｉ）二次キャプチャリングエンティティにより捕捉するように構成される二次キャプチャエンティティを含むキャプチャリング基を与えるステップと、
    前記キャプチャリングエンティティを使用して前記キャプチャエンティティを捕捉することによって前記キャプチャリング基を前記伸長担体と会合させるステップと、
    前記二次キャプチャリングエンティティを使用して前記二次キャプチャエンティティを捕捉することによって前記結果として生じる混合物から前記伸長担体を単離するステップと、
    を含む請求項６９から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 核酸分子に付着するように構成される担体を調製するための方法であって、
    （ａ）複数の非伸長担体と複数の伸長担体とを含む混合物を与えるステップであって、前記複数の非伸長担体のうちの１つの非伸長担体がプライマー配列を含まず、前記複数の伸長担体のうちの１つの伸長担体が前記プライマー配列を含み、前記プライマー配列が前記核酸分子に付着するように構成される、ステップと、
    （ｂ）（ｉ）キャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成されるキャプチャエンティティ、及び、（ｉｉ）前記伸長担体の前記プライマー配列及び前記キャプチャ基の前記配列を使用して前記伸長担体を前記キャプチャ基と会合させるべく前記プライマー配列を前記混合物に付着させるように構成される配列を含む、キャプチャ基を与えるステップと、
    （ｃ）前記キャプチャリングエンティティを使用して前記キャプチャエンティティを捕捉することによって前記結果として生じる混合物から前記伸長担体を単離するステップと、
    を含む方法。
  81. 担体を調製するための方法であって、
    （ａ）複数の担体及び複数の鋳型核酸分子を含む混合物を与えるステップであって、前記複数の担体のうちの１つの担体が複数のプライマーを含み、前記複数の鋳型核酸分子のうちの１つの鋳型核酸分子が、前記複数のプライマーのうちの１つのプライマーに付着するように構成されるアダプターを含む、ステップと、
    （ｂ）前記担体の前記プライマーを前記鋳型核酸分子の前記アダプターに付着させるのに十分な条件に前記混合物を供して、（ｉ）前記複数の鋳型核酸分子と会合されない非伸長担体と、（ｉｉ）前記鋳型核酸分子に結合されるキャプチャエンティティと会合される伸長担体とを含む結果として生じる混合物を生成するステップであって、前記キャプチャエンティティがキャプチャリングエンティティによって捕捉するように構成され、前記伸長担体が、前記鋳型核酸分子の配列に対して相補的な配列を含む核酸分子を含み、前記伸長担体上の前記複数のプライマーの少なくとも５０％が前記複数の鋳型核酸分子と会合されない、ステップと、
    （ｃ）前記キャプチャリングエンティティを使用して前記キャプチャエンティティを捕捉することによって前記結果として生じる混合物から前記伸長担体を単離するステップと、
    （ｄ）複数の伸長担体を複数の液滴に分割するステップであって、前記複数の伸長担体が前記伸長担体を含み、前記複数の液滴のうちの１つの液滴が前記伸長担体を含む、ステップと、
    を含む方法。
  82. 前記伸長担体上の前記複数のプライマーの少なくとも８０％が前記複数の鋳型核酸分子と会合されない、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記鋳型核酸分子を前記伸長担体から解離させるステップを更に含む、請求項８１から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記担体がビーズを含む、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. （ｉ）前記キャプチャエンティティがビオチンを含み、前記キャプチャリングエンティティがストレプトアビジンを含み、（ｉｉ）キャプチャ配列であって、前記キャプチャリングエンティティが前記キャプチャ配列に対して相補的なキャプチャ配列を含む、キャプチャ配列、（ｉｉｉ）磁性粒子であって、前記キャプチャリングエンティティが磁場系を含む、磁性粒子、又は、（ｉｖ）荷電粒子であって、前記キャプチャリングエンティティが電場系を含む、荷電粒子、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. （ｃ）は、
    （ｉ）前記キャプチャリングエンティティ及び（ｉｉ）二次キャプチャリングエンティティにより捕捉するように構成される二次キャプチャエンティティを含むキャプチャリング基を与えるステップと、
    前記キャプチャリングエンティティを使用して前記キャプチャエンティティを捕捉することによって前記キャプチャリング基を前記伸長担体と会合させるステップと、
    前記二次キャプチャリングエンティティを使用して前記二次キャプチャエンティティを捕捉することによって前記結果として生じる混合物から前記伸長担体を単離するステップと、
    を含む請求項８１から８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. （ａ）において、前記鋳型核酸分子が前記キャプチャエンティティを含む、請求項８１から８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. （ｂ）は、前記キャプチャエンティティを含むヌクレオチドを組み込むために前記プライマーを使用して伸長反応を行なうステップを含む、請求項８１から８６のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記液滴は、前記複数の伸長担体のうちの単一の伸長担体を含み、前記単一の伸長担体が前記伸長担体である、請求項８１から８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記複数の液滴の占有液滴の大部分が、前記複数の伸長担体のうちの単一の伸長担体を含む、請求項８１から８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記複数の液滴が非占有液滴を含み、前記非占有液滴が前記複数の伸長担体のいずれの伸長担体も含まない、請求項８１から９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. （ｄ）は、混合物を分割するステップであって、前記混合物が前記複数の伸長担体を含み、前記混合物が非伸長担体よりも多くの伸長担体を含む、ステップを含む、請求項８１から９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記混合物中の実質的に全ての担体が伸長担体である、請求項９２に記載の方法。
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