DE19958980A1 - Verfahren zur Bestimmung von PCR-Produkten, sowie ein PCR-Detektions-Kit und eine Vorrichtung für ein solches Verfahren - Google Patents

Abstract

Zur Bestimmung von PCR-Produkten, wobei von mindestens einer Zielsequenz amplifizierte PCR-Produkte in einem Durchflußzytometer gemessen werden und in die PCR-Produkte zwei unterschiedliche Markierungen eingebaut werden, von denen die eine ein Partikel oder eine Bindungsstelle für Partikel ist und die andere Markierung ein in einem Durchflußzytometer detektierbarer Farbstoff oder eine Bindungsstelle für einen solchen Farbstoff ist, werden die zwei unterschiedlichen Markierungen während der PCR durch Verwendung unterschiedlich markierter Primer und/oder unterschiedlich markierter Nukleotide in die PCR-Produkte eingebaut.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspru­ ches 1. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf ein im Verfahren einsetzbares PCR-Detektions-Kit sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens erleichtert.

Der mengenmäßige Nachweis bestimmter DNA- oder RNA-Sequenzen (Zielsequenzen) in Probenmaterial, in aller Regel lebenden Zellen, kann als z. B. diagnostischer und/oder therapeutischer Parameter in den unterschiedlichsten Anwendungen herangezogen werden. Denkbar ist, daß über den Vergleich einer zu analysierenden Zellprobe mit bekannten Proben oder einem normierten Stan­ dard auf den Grad einer infektiösen oder onkologischen Erkrankung geschlossen wird.

Ein weiteres Anwendungsgebiet sind humangenetische Untersuchungen, bei de­ nen aus dem Vorhandensein bestimmter Zielsequenzen in unüblichen Mengen auf eventuell vorliegende Erbkrankheiten geschlossen wird. Schließlich finden gattungsgemäße Verfahren auch in der Forensik Anwendung, wenn es z. B. darum geht, das Erbmaterial verschiedener Menschen zu unterscheiden. Die vorstehende Aufzählung ist nicht abschließend. Sie dient lediglich dazu, die Zielrichtung gat­ tungsgemäßer Verfahren zu verdeutlichen. Es lassen sich durchaus noch weitere Anwendungsbeispiele, z. B. Qualitätskontrollen von Lebensmitteln, denken.

Gattungsgemäße Verfahren können auch lediglich qualitativ zur Prüfung einge­ setzt werden, ob eine bestimmte Zielsequenz in Zellen vorliegt oder nicht (Ja/Nein-Aussage). Hauptanwendung ist jedoch die quantitative Bestimmung.

Da eine direkte Bestimmung bestimmter Zielsequenzen in z. B. lebenden Zellen aufgrund der geringen Ausgangsmengen oftmals nicht möglich ist, muß die ge­ suchte Sequenz zunächst vermehrt (amplifiziert) werden, damit überhaupt eine Analyse möglich ist. Die Amplifizierung erfolgt in aller Regel mittels PCR bzw. RT-PCR, falls eine RNA-Sequenz (Genexpression, RNA-Virus) untersucht wer­ den soll. Die amplifizierten Zielsequenzen sollen im folgenden als PCR-Produkte bezeichnet werden.

Mittels PCR lassen sich aus den Zielsequenzen in ausreichender Menge PCR- Produkte herstellen, um sie anschließend qantifizieren zu können. Eine "relative" Quantifizierung der PCR-Produkte kann z. B. über Vergleich mehrerer unter­ schiedlicher PCR-Ansätze erfolgen. Denkbar ist aber auch, daß man eine Stan­ dardsequenz mit bekannter Menge an Zielsequenz als Referenz zugrundelegt und die Meßergebnisse (Menge an PCR-Produkten) für absolute Berechnungen der Menge an Zielsequenz aus derselben Probe zugrundelegt.

Geeignete gattungsgemäße Verfahren zur durchflußzytometrischen Detektion von PCR-Produkten sind z. B. von Yang et. al. (1995), Cytometry 21: 197-202 oder Vlieger et. al. (1992) Anal. Biochem. 205: 1-7 beschrieben worden. Bei der einen beschriebenen Methode (Yang et al.) wird an dem während der PCR gebildeten PCR-Produkt durch Einbau entsprechend markierter Nukleotide eine erste Mar­ kierung vorgenommen. Das fertige PCR-Produkt wird dann thermisch in Einzel­ stränge getrennt. An die Einzelstränge werden weitere DNA-Sonden hybridisiert, die eine zweite von der ersten abweichende Markierung aufweisen. In einem weiteren Schritt wird dann an die erste Markierung des PCR-Produktes ein Mi­ kropartikel gekoppelt und an die zweite Markierung ein fluoreszenzmarkierter Antikörper. Die gefärbten PCR-Produkte können dann aufgrund ihrer Partikel­ bindung im Durchflußzytometer bestimmt werden.

Die andere bekannte Methode (Vlieger et al.) funktioniert relativ ähnlich. Einzi­ ger Unterschied besteht darin, daß hier nicht während der PCR markierte Nu­ kleotide angeboten werden, sondern daß einer der beiden eingesetzten Amplifi­ kationsprimer die erste Markierung trägt.

Die beschriebenen Verfahren erfordern folgende separate Schritte: 1. PCR- Reaktion zur Einführung der ersten Markierung, 2. Hybridisierung zur Einfüh­ rung der zweiten Markierung, 3. Anbindung an die Partikel, 4. Färbung der PCR- Produkte mit fluoreszenz-markierten Antikörpern und 5. Messung der Partikel im Durchflußzytometer.

Die Verfahren sind damit relativ arbeits- und zeitaufwendig.

Aufgabe der Erfindung ist es, ausgehend von dem Stand der Technik ein Verfah­ ren zu schaffen, das eine schnellere und sicherere Bestimmung von PCR- Produkten ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das die kenn­ zeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß beide Markierungen schon während der PCR durch Verwendung unterschiedlich markierter Primer und/oder Einbau un­ terschiedlich markierter Nukleotide in die PCR-Produkte erfolgt.

Vorzugsweise werden Primer eingesetzt, die jeweils mit einer Markierung verse­ hen sind. Denkbar ist aber auch, pro Zielsequenz einen Primer einzusetzen, der die erste Markierung trägt und ein Nukleotid, das die zweite Markierung trägt bzw. mit unterschiedlichen Nukleotiden zu arbeiten, die jeweils mit den Markie­ rungen versehen sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden also in besonders einfacher Wei­ se an jedem im Zuge der Amplifizierung aus der Zielsequenz gebildeten PCR- Produkt die beiden unterschiedlichen Markierungen vorgesehen.

Der zusätzliche im "Stand der Technik"-Verfahren erforderliche Hybridisierungs­ schrift (bei dem nach Abschluß der PCR eine DNA-Sonde an die DNA hybridi­ siert wird, die die zweite Markierung trägt) entfällt.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil bei der bevorzugten Verwendung von markier­ ten Primern ist, daß über die Primer die Anzahl der Markierungen eindeutig fest­ gelegt ist. Verwendet man markierte Nukleotide, die während der PCR in das gebildete Produkt eingebaut werden, dann kann es dazu kommen, daß z. B. meh­ rere Markierungen pro DNA-Strang auftreten, die einer exakten Quantifizierung entgegenstehen.

Es gibt unterschiedliche Möglichkeiten, wie die beiden bevorzugt eingesetzten markierten Primer (sinngemäß gilt das Folgende auch für markierte Nukleotide) ausgestaltet sein können.

Eine Möglichkeit ist, daß die an den Primern vorgesehenen Markierungen ledig­ lich spezifische Bindungsstellen sind, an die in aller Regel nach Abschluß der PCR jeweils die im Durchflußzytometer detektierbaren Partikel bzw. Farbstoffe mit entsprechenden komplementären Gegenstücken gebunden werden können. Solche Bindungsstellen könnten z. B. folgende Verbindungen sein: Digoxigenin, Biotin, Dinitrophenol, Cholesterol, Amine, Psoralen etc. Die Kopplung an die Partikel und/ oder den Farbstoff erfolgt über Antikörper oder Adaptoren wie z. B. Streptavidin. Denkbar sind auch andere dem Fachmann geläufige spezifisch bin­ dende Systeme. Wichtig ist lediglich, daß über die Markierungen eine spezifische "Fluorochromierung" bzw. Partikelbindung an jeweils einem der beiden Primer erfolgen kann.

Ein geeigneter Farbstoff zur Fluorochromierung der PCR-Produkte wäre z. B. Phycoerythrin, der im Rahmen der Erfindung z. B. in Form eines Konjugats mit Streptavidin eingesetzt werden kann. Dabei erfolgt, im Unterschied zu den "Stand der Technik"-Verfahren, die Färbung gleichzeitig mit der Partikelanbindung. Als weitere Farbstoffe kommen u. a. in Betracht: Cy5, Cy3, Cy2, TAMRA, Rhoda­ min, HEX, ROX, Texas Red, IRD40, IRD41 und AMCA.

Denkbar ist selbstverständlich auch, daß die Fluorochromierung bereits an dem für die PCR eingesetzten Primer vorgesehen ist. Man würde so bereits mit der Amplifizierung Produkte erhalten, die gefärbt sind und könnte auf den sonst gleichzeitig mit der Partikelbindung durchgeführten Färbeschritt verzichten.

Theoretisch denkbar wäre auch, daß bereits Partikel-gekoppelte Primer eingesetzt werden. Auf diese Weise könnte man PCR-Produkte direkt an die Partikel ge­ bunden herstellen. Der Anbindungsschritt an die Partikel würde entfallen.

Wie oben ausgeführt, soll das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Quantifizierung von PCR-Produkten eingesetzt werden.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß gleichzeitig (d. h. im selben Ansatz) eine zusätzliche von der zu analysierenden unterschiedli­ che Zielsequenz bestimmt wird, deren Ausgangskonzentration in einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung bekannt ist (Einführung eines internen Standards). Es versteht sich, daß die aus dieser bekannten Zielsequenz amplifizierten PCR- Produkte wiederum erfindungsgemäß markiert werden, wobei jedoch sicherge­ stellt sein muß, daß die Markierungen eine Differenzierung zu den markierten PCR-Produkten aus der zu analysierenden Zielsequenz ermöglichen.

Im einfachsten Fall kann dies dadurch geschehen, daß für die beiden unter­ schiedlichen Sequenzen Primer eingesetzt werden, die jeweils eine Partikelpopu­ lation mit unterschiedlicher Größe binden. Auf diese Weise ist eine besonders einfache Differenzierung durch Partikelgrößenmessungen im Durchflußzytometer möglich. Denkbar wäre auch, Primer mit unterschiedlichen Farbstoffen zu ver­ wenden und dann eine Differenzierung über die Farbsignale vorzunehmen. Bei Verwendung unterschiedlicher Farbstoffe können jedoch farbstoffbedingte Überlagerungen auftreten, die ggf. die Meßergebnisse verfälschen.

Die Erfindung bezieht sich nicht nur auf ein erfindungsgemäßes Verfahren son­ dern betrifft auch ein PCR-Detektions-Kit, das in dem Verfahren eingesetzt wer­ den kann. Das Kit kann neben den erfindungsgemäß eingesetzten markierten Primern und/oder Nukleotiden alle für den durchflußzytometrischen Nachweis von PCR-Produkten notwendigen Komponenten enthalten wie z. B.: Lösungen und Kunststoffgefäße für die Entfernung nicht eingebauter Nukleotide, Mikropar­ tikel zur Anbindung der PCR-Produkte sowie eventuell Färbelösungen.

Außerdem betrifft die Erfindung auch eine Vorrichtung, mit der aus den PCR- Gefäßen Probeflüssigkeit entnommen wird und alle eventuell notwendigen Schritte zur Vorbereitung für die Durchflußzytometrie wie PCR-Aufreinigung, Anbindung der PCR-Produkte an Partikel, ggf. Färbung und Waschen der Parti­ kel automatisch durchgeführt werden. Die Vorrichtung kann weiterhin so ausge­ legt sein, daß sie die vorbereitete Probe automatisch in ein Durchflußzytometer zur Messung einspeist. Es kann sich dabei um Pipettiervorrichtungen handeln, die z. B. über einen speziellen Eingang Flüssigkeit ansaugen, die erforderlichen Schritte zur Vorbereitung der Messung durchführen und dann über einen ge­ trennten Ausgang die vorbereitete Probe wieder abgeben.

Die Vorrichtung kann so ausgelegt sein, daß sie mit einem PCR-Gerät, z. B. ei­ nem Cycler kombinierbar ist. Denkbar wäre weiterhin, daß in die Vorrichtung ein PCR-Gerät integriert ist.

Im folgenden soll die Erfindung anhand mehrerer Abbildungen und Beispiele näher erläutert werden.

Dabei zeigt:

Fig. 1 schematisch die erfindungsgemäße Herstellung von PCR- Produkten, die im Durchflußzytometer detektierbar sind,

Fig. 2 zeigt ebenfalls schematisch eine erfindungsgemäß einsetzba­ re Vorrichtung zur Verbindung von Cycler und Durchfluß­ zytometer,

Fig. 3 dient zur Illustration des nachfolgend angegebenen Beispie­ les 3.

Fig. 1 zeigt das erfindungsgemäße Verfahren ausgehend von einer zu analysie­ renden Zielsequenz 10 (schematisch als Doppelstrang dargestellt) die mittels PCR (dargestellt durch Pfeil 11) amplifiziert werden soll. Im Rahmen der PCR 11 werden spezifische Primer 12 und 13 eingesetzt, die jeweils Markierungen 14 und 15 aufweisen. Im gezeigten Fall enthalten die Markierungen 14 und 15 spezi­ fische Bindungsstellen 16 und 17 (z. B. Biotin/Streptavidin etc.).

Die PCR 11 unter Verwendung der Primer 12 und 13 führt zu einem PCR- Produkt 18 mit jeweils einem gebundenen Primer 12 und 13.

In einem weiteren Schritt, schematisch mit 20 bezeichnet, wird die Färbung bzw. Partikelbindung des PCR-Produktes 18 vorgenommen. Dazu werden Mikroparti­ kel 21 und Farbstoff (z. B. ein Phycoerythrin-Streptavidin Konjugat) 22, die je­ weils an unterschiedliche Bindungsmoleküle 23 und 24 gekoppelt sind, zugege­ ben. Die Bindungsmoleküle 23 und 24 passen dabei exakt jeweils zu den Bin­ dungstellen 16 und 17 der Primer 12 und 13. Es kommt daher zu entsprechenden Anlagerungen von PCR-Produkten an die Mikropartikel und den Farbstoff. Ein fertiges, entsprechend gefärbtes und partikelgebundenes Produkt ist schematisch mit 25 dargestellt. Tatsächlich wird natürlich nicht nur ein Produkt (sondern eine deutlich größere Anzahl von Produkten) an einen Partikel gebunden. Das Produkt 25 kann in einfacher dem Fachmann geläufiger Weise in einem Durch­ flußzytometer analysiert werden.

Hierbei kann die in Fig. 2 gezeigte Vorrichtung 30 hilfreich sein, die eine in un­ terschiedliche Positionen verfahrbare (angedeutet durch die Pfeile) Halterung 31 für eine Ansaugkanüle 32 aufweist. Mit der Ansaugkanüle 32 kann aus PCR- Reaktionsgefäßen 33, die sich in einem Cycler 34 befinden, Probenflüssigkeit 35 entnommen werden. In der Vorrichtung 30 kann dann eine automatische Be­ handlung der in der Probenflüssigkeit 35 enthaltenen PCR-Produkte (Partikelbindung, Färbung, Waschen) etc. erfolgen und nach Behandlung kann die Probenflüssigkeit über eine separate Ausgangsleitung 36 in die nicht dargestellte Meßzelle eines Durchflußzytometers 37 transferiert werden.

Durch die Erfindung kann auch in einer weiteren nicht gezeigten Ausführung eine Einrichtung abgedeckt sein, bei der ein PCR-Gerät, wie z. B. der gezeigte Cycler 34, in die Vorrichtung 30 integriert ist.

Wie angegeben soll die Erfindung auch noch durch einige Beispiele näher erläu­ teil werden:

Beispiel 1 Bestimmung der Nachweisgrenze von PCR-Produkten mit Hilfe der Durchflußzytometrie

Um die Anwendbarkeit und die Sensitivität der vorliegenden Methode zu prüfen, wurde eine 163 Basenpaare lange Sequenz des p21/WAF1-Gens amplifiziert. Dazu wurde ein Plasmidklon verwendet, der die komplette cDNA enthielt (Clone ID: 309881). Für eine 25-µl-PCR-Reaktion (in einem Autogene-II-Thermocycler, Grant Instruments; Cambridge, UK) wurden 1 ng Plasmid, 25 µmol des Oligonu­ kleotids Biotin-5'-GTGGACCTGTCACTGTCTTGTAC-3' (Primer 1) und 25 pmol Digoxigenin-5'-CTTCCTCTTGGAGAAGATCAG3-3' (Primer 2) einge­ setzt.

Es wurden 2 units Taq-DNA-Polymerase (QIAGEN, Hilden), 100 µmol eines jeden Nukleotids und Pufferlösungen nach Angaben des Herstellers verwendet.

Die PCR-Bedingungen waren:
Primäre Denaturierung bei 94°C für 4 min., 35 Zyklen bei 60°C für 40 sec., 72°C für 1 min. und 92°C für 40 sec. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification-Kits (QIAGEN, Hilden) von nichteingebauten Primern und Nukleotiden gereinigt und anschließend im Spektralphotometer bei A₂₆₀ nm quantifiziert. Zur Anbindung an die magnetischen Partikel wurden 10 ng, 1 ng, 100 pg, 80 pg, 60 pg, 40 pg, 20 pg und 10 pg des PCR-Produktes in ei­ nem Volumen von jeweils 1 µl eingesetzt.

Von den Anti-Digoxigenin-abgedeckten magnetischen Partikeln (Roche, Mann­ heim), die vor dem Test zweimal in 500 µl 3 × Bindungspuffer (15 mM Tris pH 7,5; 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl) äquilibriert wurden, wurde 1 µl einge­ setzt. Nach Zugabe von 1 µl (90 pg) Streptavidin-Phycoerythrin-Färbelösung (Sigma, St. Louis) wurde für 10 min rotierend bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 500 µl Waschpuffer (PBS plus 0,02% Tween 20) hinzu­ geben und das Reaktionsgefäß in einen Magnetständer transferiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurden die Partikel 1,5 ml TE-Puffer resuspendiert und im Durchflußzytometer analysiert.

Hierzu wurde das PAS 3 (Partec, Münster) verwendet, wobei ein Argonlaser das Anregungslicht von 488 nm erzeugte. Die Orangeemission wurde mit Hilfe eines 590-EM-Filters ermittelt.

Es wurden folgende Einstellungen verwendet: SSC 350 V, FSC 250 V und FL-II 685 V. Die Empfindlichkeit des Gerätes wurde unter Verwendung von Phyco­ erythrin-markierten Kontrollpartikeln (FluoroSphere; DAKO, Kopenhagen) ein­ gestellt. Die Daten wurden als Fluoreszenzhistogramm dargestellt und mit Hilfe der FlowMax-Software (Partec) analysiert. Dazu wurde in FL-II ein maximaler Bereich (Range) eingestellt und die darin vorhandenen Signale für die Berech­ nung des Mittelwertes herangezogen.

Es wurde gezeigt, daß bis zu 40 pg (0,6 fmol) PCR-Produkt nachweisbar sind und erst bei 20 pg die Fluoreszenzintensität nicht mehr von der Hintergrundfluo­ reszenz der Partikel unterscheidbar ist. Das bedeutet, daß mit dieser Methode kleinste Mengen PCR-Produkt detektierbar und quantifizierbar sind.

Beispiel 2 Messung der PCR-Kinetik mit Hilfe der Durchflußzytometrie

Zur Analyse von PCR-Kinetiken wurden Amplifikationen des p21/WAF1-Gens durchgeführt. Dazu wurden als Ausgangsmenge 1 ng (2,4 × 10 g Moleküle), 100 pg (2,4 × 10⁷ Moleküle), 10 pg (2,4 × 10⁶ Moleküle) und 1 pg (2,4 × 10⁵ Moleküle) des p21/WAF1-cDNA-Plasmids verwendet. Zwischen 10 und 25 Zyklen der oben beschriebenen PCR-Reaktionen wurden nach jedem Zyklus PCR-Produkte entnommen und wie beschrieben analysiert.

Es konnte gezeigt werden, daß bei einer Ausgangsmenge von 1 ng Plasmid das PCR-Produkt bereits nach 12 Zyklen detektierbar war, nach 22 Zyklen ist die stationäre Phase erreicht. Bei einer Ausgangsmenge von 1 pg Plasmid läßt sich das Amplifikat nach 20 Zyklen nachweisen.

Die "real-time"-Detektion von PCR mit dem ABI PRISM zeigt einen sehr ähnli­ chen Verlauf und eine vergleichbare Empfindlichkeit (Freemann et. al., 1999).

Beispiel 3 Nachweis der differentiellen Genexpression mit Hilfe der RT-PCR in Kombination mit der Durchflußzytometrie

Um strahlungsinduzierte bzw. -supprimierte Genexpression nachzuweisen, wur­ den humane Keratinozyten (HaCat-Zellie) mit UVB (0,16 minimale Erythemdo­ sis; 280-370 nm) bestrahlt. Aus Zellen, die für 1, 3, 5 und 7 h nach Bestrahlung kultiviert wurden, sowie aus unbestrahlten Zellen wurde mit Hilfe des RNeasy- Kits (QIAGEN, Hilden) Gesamt-RNA isoliert. Diese wurde photometrisch quan­ tifiziert und hinsichtlich ihrer Qualität im Agarosegel kontrolliert. 2 µg der RNA wurden für die reverse Transkription, die mit der "Omniscript Reverse Transcriptase" (QIAGEN, Hilden) und einem Oligo dT₁₈ durchgeführt wurde, eingesetzt. Von diesen reversen Transkriptions-Ansätzen wurde jeweils 1 µl für die PCR eingesetzt. Es wurden das β-Actin-Gen (Primer: Biotin-5'- CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3' und Digoxigenin-5'-GCTCATTGCCAA­ TGGTGATGA-3'), das p21/WAF1-Gen (Primer siehe oben) und das PCNA-Gen (Primer: Biotin-5'-CTGAGGTACCTGAACTTCTTTAC-3' und Digoxigenin-5'- AGATCCTTCTTCATCCTCGATC-3') analysiert und wie oben beschrieben, pro PCR zwei Proben analysiert. Für das β-Actin wurden Amplifikate bei 15 Zyklen, für PCNA bei 20 Zyklen und für p21/WAF1 bei 25 Zyklen entnommen. Die Messung der jeweiligen PCR-Produktmenge erfolgte wie beschrieben am Durch­ flußzytometer und die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

Fig. 3 zeigt eine deutliche Abnahme an p21/WAF1-mRNA nach 3 h UV- Behandlung, wohingegen die PCNA-Expression bereits 1 h nach Bestrahlung hoch reguliert wurde.

Es konnte gezeigt werden, daß mit der vorgestellten Methode bereits geringe Veränderungen einer Gen-Expression detektiert werden (Abb. 4).

Claims (10)

1. Verfahren zur Bestimmung von PCR-Produkten, bei dem von mindestens einer Zielsequenz amplifizierte PCR-Produkte in einem Durchflußzyto­ meter gemessen werden, wobei in die PCR-Produkte zwei unterschiedliche Markierungen eingebaut werden, von denen die eine ein Partikel oder eine Bindungsstelle für Partikel ist und die andere Markierung ein in einem Durchflußzytometer detektierbarer Farbstoff oder eine Bindungsstelle für einen solchen Farbstoff ist, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei unter­ schiedlichen Markierungen während der PCR durch Verwendung unter­ schiedlich markierter Primer und/oder unterschiedlich markierter Nukleo­ tide in die PCR-Produkte eingebaut werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden unterschiedlichen Markierungen durch Verwendung unterschiedlich mar­ kierter Primer in das PCR-Produkt eingebaut werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des einen Primers eine Fluorochromierung oder eine Bin­ dungsstelle für ein fluorochromassoziiertes Molekül ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die fluorochromassoziierten Moleküle zur Bindung an die PCR-Produkte An­ tikörper, Streptavidin oder andere spezifisch bindende Moleküle sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß mehrere unterschiedliche Ausgangssequenzen gleichzeitig bestimmt werden, wobei die pro Sequenz eingesetzten Markierungen so gewählt sind, daß eine getrennte Analyse der jeweils aus den Sequenzen amplifizierten PCR-Produkte des gleichen Ansatzes im Durchflußzyto­ meter möglich ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge einer der zu analysierenden Ausgangssubstanzen bekannt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die je­ weils für unterschiedliche Ausgangssequenzen eingesetzten Markierungen Bindungsstellen für unterschiedliche Partikelpopulationen bereitstellen.

8. PCR-Detektionskit für das Verfahren gemäß der Ansprüche 1-7, da­ durch gekennzeichnet, daß es die entsprechend Anspruch 1 markierten Primer und/oder Nukleotide enthält.

9. Vorrichtung zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Einrichtung zur Entnahme von Probeflüssigkeit aus in einem PCR-Gerät befindlichen Re­ aktionsgefäßen und Einrichtungen aufweist, mit denen die entnommene Probenflüssigkeit derart behandelt werden kann, daß die in ihr enthaltenen PCR-Produkte im Durchflußzytometer detektiert werden können.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das PCR- Gerät in die Vorrichtung integriert ist.