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Die
Klinische Transplantation solider Organe und allogener Stammzellen
beinhaltet die Transplantation von einer funktionellen Einheit allogenen
Ursprungs auf einen kranken Patienten. Diese funktionelle Einheit
kann vom Transplantat-Empfänger
entweder akzeptiert oder rejektiert werden. Es gibt multiple Parameter
wie der funktionelle Status eines Organs, die immunologische Kompatibilität etc. die
die finale Akzeptanz des Organ- oder Stammzell-Engraftments (Verpflanzung) beeinflussen.
Pharmakologische Unterstützung
kann nach der Transplantation das Immunsystem des Empfängers modulieren und
dabei die Transplantat Rejektion reduzieren.
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Wegen
akuter Knappheit von geeigneten Spenderorganen oder Stammzellspendern
ist es extrem wichtig, den Verlust durch Rejektion zu vermindern.
Das Transplantationsergebnis wird durch ein extensives Prä-Transplantat-Kompatibilitäts-Testprogramm und
durch ein kontinuierliches Monitoring des funktionellen Status des
Transplantats und jedes Zeichens von Rejektion verbessert. Diese
Form des Monitoring ist auch nützlich
bei der Adjustierung der notwendigen Dosierung der Immunsuppressionsbehandlung
zur Transplantat-Akzeptanz.
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Eine
relevante Frage in diesem Monitoring ist nicht nur was gemessen
werden sollte, sondern auch, wo es gemessen werden sollte.
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Eine
Strategie die entwickelt wurde ist, die spezifischen Immunantworten
auf fragliche Antigene, wie die fremde Klasse I und Klasse II MHC
von Allotransplantaten, am Ort des Transplantats (Gewebebiopsie)
zu messen. Dieses invasive Diagnoseverfahren hat die folgenden Nachteile:
- – Es
beeinflusst die Lebensqualität
des Patienten negativ (Spitalaufenthalt).
- – Es
ist assoziiert mit Komplikationen wie Hämaturie, Anurie, perirenaler
Hämatome,
Blutung und Schock, arteriovenöser
Fistel und Transplantat-Verlust im Fall von renaler Transplantation.
In Leber und Herztransplantationen wurden ähnliche Komplikationen berichtet.
- – Es
existiert eine limitierte Menge von biologischem Material und von
benötigten
Reagentien und es ist nur eine limitierte Anzahl von Biopsien möglich.
- – Die
Rejektion kann ein zentrales Problem in einem Organ werden: Probenentnahme-Fehler können falsch
negative Resultate liefern. Deshalb müssen mehrfache Biopsieproben
genommen werden um die diagnostische Richtigkeit zu erhöhen, die
mit einem hohen Risiko des Transplantatverlustes assoziiert ist.
- – Sehr
hohe Gesamtkosten der invasiven Verfahren.
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Basierend
auf diesem Wissen wurde eine andere Strategie entwickelt die zur
Entwicklung von nicht-invasiven diagnostischen Verfahren zur Messung
der Rejektion geführt
hat. Solche Verfahren beinhalten:
- a) Monitoring
der Typen von Immun-Zellen die zu einer bestimmten Zeit im Kreislauf
vorhanden sind.
- b) Messung von Verschiebungen in Cytokin Mustern.
- c) Messung der mRNA die für
Perforin und Granzym B kodiert, Messung cytotoxischer Proteine die
mit Organ-Rejektion assoziiert sind.
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Die
Vorteile dieser nicht-invasiven Diagnosetechniken sind, dass sie
nicht in die Lebensqualität der
Transplantatempfänger
eingreifen, im Allgemeinen nur eine Blut- oder Urinprobe benötigt wird,
und die Tests standardisiert und/oder automatisiert werden können. Weiter
sind kaum Verfahrenskomplikationen mit den nicht-invasiven Testmethoden
verbunden, und diese Testmethoden sind kostengünstig im Vergleich zu invasiven
Verfahren.
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Die
Nachteile der bekannten nicht-invasiven Tests sind, dass sie, um
gültige
Resultate zu erhalten spezialisierte Technologen benötigen, dass
die Tests basierend auf mRNA-Analysen
beeinflusst sind durch die sehr kurze Lebensdauer dieses Moleküls und deshalb
eine sehr schnelle Verarbeitung der Proben verlangen, dass das Monitoring
der Immun-Zellen und oder der inflammatorischen Cytokinproteine durch
mögliche
Infektionen, die ähnliche Änderungen hervorrufen
können
wie sie bei einer Transplantat-Rejektion vorhanden sind, behindert
wird, und dass keines dieser Merkmale als nützlich in der Identifikation
früher
Stadien der Transplantat-Rejektion erwiesen ist.
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Nebst
Spender-spezifischen Proteinen und genomischer DNA, ist es auch
bekannt, dass durch Gewebeschädigung
des Spendertransplantats mitochondriale DNA (mtDNA) in den Kreislauf
freigesetzt wird. Mit der Ausnahme von reifen Erythrozyten beinhalten
alle zellulären
Blutkomponenten Mitochondrien. Tausende von Mitochondrien pro Zelle
sind in Leukozyten vorhanden, und ein Durchschnitt von 3-4 Mitochondrien
ist auch in Thrombozyten vorhanden. Jeder dieser Mitochondrien enthält mindestens
eine Kopie von mtDNA. Mitochondriale DNA kodiert für ein komplettes
Set von ribosomaler RNA und transfer RNA so wie auch für 13 Polypeptide
der Oxidativen Phosphorylation. Diese zirkuläre 16,6 kb humane mtDNA wurde
1981 vollständig
sequenziert.
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TRANSFUSION
vol. 37, 1997, p. 1012–1019 und
EUR. J. IMMUNOGENETICS vol. 28, no. 2, April 2001, p.201; und 15th
European Histocompatibility Conference, Granada, Spain, March 27.30,
2001, beschreiben SSP-PCR um spenderspezifische mtDNA in einem in
vitro System, das die Blutzusammensetzung des Empfängers nach
Thrombozytentransfusion nachahmt, nachzuweisen, die sequenzspezifischen
Primer ASF und BSF sind in den hypervariablen Regionen der mtDNA
lokalisiert.
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TRANSFUSION
vol. 41/42, Dezember 2001, p. 1531–1538; und BRIT.J.HAEMATOL,
vol. 112, no. 4, March 2001, p. 995–1003 beschreiben die Analyse von
HVR1 und HVR2 Regionen von mtDNA Polymorphismen mit Hilfe von SSCP-PCR
oder Sequenzanalyse, beide Methoden werden als nützlich für die Diagnose von Transfusion
mit Hilfe von spenderspezifischen mtDNA Detektion genannt und wurden
in einem in vitro System getestet.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Methode oder ein
Verfahren zur Messung der Menge von zellfreier zirkulärer mtDNA
in Körperflüssigkeiten
als ein Indikator oder Marker für
Gewebeschädigung
vorzuschlagen und mtDNA Polymorphismen zur Unterscheidung zwischen
Spender- und Empfänger-Gewebeschaden
in einer Transplantations-Anberaumung zu nutzen. Darüber hinaus
sollte die Methode keine Markierung von zellulären Blutprodukten beinhalten
weil dies potentiell die Produkte modifizieren und/oder ihre Qualität beeinträchtigen könnte, und
die Methode sollte einfach auszuführen sein. Diese dargelegte
Aufgabe der Erfindung wird durch die Methode gemäss Anspruch 1 erreicht.
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Die
Methode gemäss
der Erfindung ist ein nicht-invasives diagnostisches Verfahren charakterisiert
durch die folgenden Schritte:
- a) Extraktion
von zellfreier, zirkulärer
mitochondrialer DNA (mtDNA) aus einer Probe zellfreier Körperflüssigkeiten
von einem Transplantations- oder Transfusionsempfänger.
- b) Nachweis, Analyse und Quantifizierung von mtDNA aus der Probe.
- c) Vergleich der mtDNA von der Probe mit mtDNA die vom Spender
und Empfänger
vor der Transplantation oder Transfusion erhalten wurde
- d) Nutzung des mtDNA Polymorphismus in den hypervariablen Regionen
zur Unterscheidung zwischen Spender-Gewebeschädigung und Empfänger-Gewebeschädigung in
einer Transplantat-Anberaumung oder um das Überleben von zellulären Blutkomponenten
in einer Transfusion zu bestimmen.
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Vorteile
dieses Verfahrens im Vergleich zu anderen nicht-invasiven Methoden
sind:
- – Es
detektiert spezifisch eine Schädigung
des Zielorgans da keine andere Quelle von mtDNA mit dem spezifischen
Polymorphismus vorhanden ist.
- – Es
nützt Doppelstrang-DNA
welche in der Zirkulation viel stabiler ist als mRNA.
- – Es
benützt
mtDNA welche in über
10'000 Kopien, auf
einer Basis pro Zelle, vorhanden ist. Dies erhöht die Sensitivität um 2-3
log im Vergleich zu einem in einer einzelnen Kopie vorliegenden,
nuklearen, genomischen, in einem einzelnen Nukleotid vorhandenen
Polymorphismus-Marker.
- – Es
verwendet die hypervariable Region von mitochondrialer DNA. Diese
D-loop Region ist in einer Anzahl von Kopien pro einzelnes mtDNA
Molekül
vorhanden. Dies ermöglicht
eine zusätzliche Anzahl
von Kopien der Zielsequenz pro Zelle.
- – Die
Mutationsrate von mitochondrialer DNA ist 10–20mal höher als diejenige von genomischer DNA
und erhöht
dadurch die Wahrscheinlichkeit einen informativen Polymorphismus
zu finden.
- – Die
mtDNA Sequenz wurde beschrieben und viele Polymorphismen wurden
charakterisiert.
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Es
ist bekannt, dass humane mtDNA ein einmaliges Ziel zur Detektion
von allogen transfusionierten Thrombozyten darstellt. Durch Sequenzieren
von 100 Thrombozyten-Apherese-Spendern
wurden über 20
häufige
Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP's) in der Kontrollregion
von mtDNA gefunden. Die vorliegende Erfindung offenbart die Möglichkeit
der Zielansprache dieser Polymorphismen mit PCR und dem Verwenden
von sequenzspezifischen Primern (SSP) und auf diese Weise, eine adaptierte
neue Technik zur Unterscheidung von allogenen von autologen Zellen.
Im Speziellen wurden neue sequenzspezifische Primer-Paare entworfen und
PCR-Konditionen
optimiert.
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Deshalb
ist eine andere Aufgabe der Erfindung die Bereitstellung einer Methode
mit einem SSP-PCR System für häufige DNA
Polymorphien, mit sequenzspezifischen Primer-Paaren und einem Amplifikations-Kontrollprimer-Paar
zur Feststellung, ob die PCR-Reaktion stattfand.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein SSP-PCR Kit bereit zu
stellen, welches häufige
Polymorphien in humaner mtDNA detektiert. Dieses Kit kann benutzt
werden, um informative Marker für
Chimärismus
und Überlebensstudien
von zellulären Blutkomponenten
nach Transfusionen zu identifizieren.
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Vorteilhafte
Ausführungsformen
der Erfindung werden aus den abhängigen
Ansprüchen
ersichtlich.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun detaillierter durch die folgende
Beschreibung in Zusammenhang mit den beigelegten Zeichnungen illustriert.
In der Zeichnung, zeigt die Figur einen schematischen Überblick
der Lokalisation der SNP's
innerhalb der humanen mtDNA,
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Tabelle
1 zeigt die Oligonukleotid-Primer für HVR1 Mitotyping durch PCR-SSP,
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Tabelle
2 zeigt Oligonukleotid-Primer für HVR2
Mitotyping durch PCR-SSP,
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Tabelle
3 offenbart die Oligonukleotid-Primer für COXI Mitotyping und Kontrollprimer
durch PCR-SSP,
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Tabelle
4 zeigt die thermischen Profile und PCR-Konditionen für HVR1 Primer-Paare,
und
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Tabelle
5 zeigt die thermischen Profile und PCR-Konditionen für HVR2 Primer-Paare.
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Durch
das Benutzen von zwei gut bekannten mtDNA Polymorphien ist es möglich, ein
sequenzspezifisches Primer-PCR (SSP-PCR) System zur Detektion von
transfusionierten allogenen Thrombozyten zu etablieren. Jedoch weisen
diese zwei Primer nicht-häufige
mtDNA Polymorphien in der kaukasischen Population nach und sind
nicht sehr informativ in der Praxis. Um die Anzahl von informativen
Primern zu erhöhen,
müssen
zwei hochpolymorphe Regionen (HVR1 und HVR2) innerhalb der 1024
bp D-loop Region detektiert werden. Diese D-loop Region ist eine
nicht-kodierende Region welche regulatorische Elemente für die Replikation
und die Transkription beinhalten.
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Die
Figur in den Zeichnungen gibt einen schematischen Überblick über die
Lokalisation der SNP's
innerhalb der humanen mtDNA, auf die die sequenzspezifischen Primer
gerichtet sind. Das ringförmige
mitochondriale Genom ist links unten in der Figur gezeigt. L steht
für „light
strand" und H steht
für „heavy
strand". Unten links
in der Figur ist die kodierende Region für Cytochrom C Oxidase 1 (COX1)
gezeigt (zwischen 7000–7500
bp), die das Primer Paar 20 enthält.
Oben rechts in der Figur ist die D-loop Region schematisch dargestellt.
Das D-loop ist durch die Gene für
die tRNA von Prolin (tRNAPro) und die tRNA von Phenylalanin (tRNAPhe)
gebunden. Die Positionen der verschiedenen hypervariablen Regionen
sind gezeigt. 13 Primer Paare sind innerhalb der ersten hypervariablen
Region (HVR1) der D-loop
Region lokalisiert. Sechs Primer Paare sind in der zweiten hypervariablen
Region (HVR2) angesiedelt und ein Primer Paar ist innerhalb der
Sequenz, die für
die Cytochrom C Oxidase 1 (COX 1) kodiert, lokalisiert.
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Die
SNP's sind basierend
auf einer Nukleotid Sequenzanalyse von 100 Thrombozyten-Apherese Spendern
selektiert worden.
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Alle
selektierten SNP's
werden in über
10 Prozent der Spendern exprimiert. Darüber hinaus wurde der Polymorphismus
bei np 7025 gewählt,
weil er in über
34% der Kaukasier exprimiert ist. Beide, vorwärts und rückwärts Primer können mit
Hilfe der Primer Design Software, erhältlich auf dem Internet unter
http//www.williamstone.com gestaltet werden. Oligonukleotid Primer
können
auf mögliche
potentielle interferierende Sekundärstrukturen analysiert werden,
wie hairpin loops und Unterschiede in der Schmelztemperatur. Die
Nukleotidsequenzen und die Lokalisation der Primer die für das PCR-SSP
benutzt wurden wird in den Tabellen 1 bis 3 präsentiert.
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In
den Tabellen ist die Lokalisation, die Fragment Grösse und
die Sequenz der Primer, die für
die sequenzspezifische Amplifikation der mitochondrialen Templat-DNA
benutzt wurden, gezeigt. F steht für Vorwärts Primer und R steht für Rückwärts Primer. Die
Primer sind entsprechend der Lokalisation ihrer 5' Enden in der Referenzsequenz
(Anderson et al. Nature, 1981, 290, 457–465) nummeriert. H steht für „heavy
strand", welcher
reich an Purin ist. L steht für „light
strand" (reich an
Pyrimidin). * kennzeichnet die Allel-differenzierende Base. Die
Basen die zu ihrem Ziel-Templat falsch zugeordnet wurden sind unterstrichen.
Jede PCR-Reaktion beinhaltet ein Primer Paar das eine konservierte
Sequenz in der mtDNA amplifiziert und das als Amplifikations-Kontrollprimer
fungiert. Die Konzentration des Kontrollprimer Paares wird 4–20 mal
tiefer gehalten als die Konzentration der allelspezifischen Primer,
um die Spezifität
zu erhöhen
und um falsch negative Typisierungsresultate wegen des kompetitiven
Primings zu verhindern. Die spezifischen Amplifikationskonditionen
und die Reaktionsgemische für
jede PCR-SSP Reaktion sind in den Tabellen 4 und 5 beschrieben.
Das komplette PCR-Reaktionsvolumen
ist 10 μl.
Jedes PCR-Reaktionsgemisch enthält
ein SSP-Primer Paar (Tabellen 1–3)
und ein Primer Paar für
die interne positive Kontrolle (Tabelle 3). Für spezifische Konzentrationen der
Primer Paare siehe Tabellen 4 und 5. Zusätzlich zu den Primern enthalten
die PCR-Reaktionsmischungen
auch mtDNA Templat, PCR-Puffer, dNTPS, Dimethylsulfoxid, Taq Polymerase
und Magnesiumchlorid. Weil jede PCR Reaktion für jede dieser Komponenten optimiert
werden muss, variieren die Konzentrationen der verschiedenen Komponenten und
die Annealing Temperatur. Die exakten Konzentrationen der verschiedenen
Komponenten können
in den Tabellen 4 und 5 gefunden werden. Das Reaktionsvolumen von
10 μl wird
durch Zugabe von bidestilliertem Wasser vervollständigt.
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Die
PCR kann mit einem programmierbaren Thermo-Cycler durchgeführt werden.
Weiter können 10 μl amplifiziertes
Produkt visualisiert und auf die Präsenz oder Absenz von PCR Produkten
mit Hilfe von 2 Prozent Agarose Gel und ultraviolettem Licht, nach
Ethidiumbromid-Färbung,
analysiert werden.
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Die
Resultate der Experimente gemäss
den oben beschriebenen Konditionen sind hier nachfolgend weiter
beschrieben: In vierzig Fällen
wurden positive PCR-SSP Reaktionen im mtDNA Templat von vorgängig nicht
getesteten Individuen gefunden und bestätigt durch automatische Sequenzierung
der mtDNA Template in einer unabhängigen Sequenzier-Anlage.
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Detektion
von allogenen Leukozyten
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Jede
kernhaltige Zelle beinhaltet Tausende von Mitochondrien. Theoretisch
würde dies
bedeuten, dass mehr mtDNA Templat als genomische DNA, auf einer
Basis pro Zelle, vorhanden ist. Um zu untersuchen ob dies bestätigt werden
kann, wurden zwei SSP-PCR Systeme miteinander verglichen. Das eine
ist ein SSP-PCR System für
genomische DNA (HLA-B low Kit, Genovision, Wien, Österreich)
und das andere ist ein Mitotyping SSP-PCR System für mtDNA
entsprechend der vorliegenden Erfindung. Mononukleare Zellen von
6 Individuen wurden isoliert durch Dichtegradienten-Zentrifugation
von welchen genomische Polymorphien (HLA-B Typ) und mitochondriale
Polymorphien (Mitotyping) bekannt waren. Um die Spender/Empfänger Kombinationen
simulieren zu können,
wurden sechs Paare mit einer 10-fachen Serienverdünnung der
Spenderzellen vorbereitet. Der Startpunkt waren 106 mononukleare Zellen.
DNA wurde mit einem kommerziellen Kit extrahiert (Puregene, gentra
systems) und dann die PCR ausgeführt.
Die DNA-Menge und die Zyklus Konditionen (30 Zyklen) wurden für beide
Systeme ähnlich
gehalten. 10 μl
vom amplifizierten Produkt wurden visualisiert und auf die Präsenz oder
Absenz von PCR-Produkten analysiert, mittels einem 2 Prozent Agarose
Gel mit ultraviolettem Licht, nach Ethidiumbromid Färbung. Es
wurde gefunden, dass in allen sechs Kombinationen spenderspezifische
Sequenzen 102- bis 103-mal
sensitiver durch mtDNA spezifische Primer detektiert werden, verglichen
mit Primern die HLA-Polymorphismus detektieren.
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Detektion von transfusionierten
allogenen Thrombozyten
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Thrombozyten
enthalten nur eine sehr kleine Anzahl von Mitochondrien. Dies wird
durch die grosse Menge an transfusionierten Thrombozyten (1012/unit) vollständig kompensiert. Um die Nachweisgrenze
des entwickelten SSP-PCR Systems für mitochondriale DNA in dieser
Applikation zu untersuchen, wurde eine Verdünnungsreihe von isolierten einzelnen
Spender-Thrombozyten von 6 Individuen mit bekanntem mtDNA Polymorphismus
vorbereitet. Um Spender/Empfänger
Kombinationen zu simulieren wurden sechs Paare mit einer 10-fachen
Serienverdünnung
der Spenderzellen vorbereitet. Startpunkt war 108 Thrombozyten.
DNA wurde mit einem kommerziellen Kit extrahiert und PCR wurde mit
einem, den informativen Polymorphismus anzeigenden Primer Paar durchgeführt. Zyklus
Konditionen sind mit den zuvor genannten identisch. 10 μl vom amplifizierten
Produkt wurden visualisiert und auf die Präsenz oder Absenz von PCR-Produkten
analysiert, mittels einem 2 Prozent Agarose Gel mit ultraviolettem
Licht, nach Ethidiumbromid Färbung.
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Bei
108 Thrombozyten wurde ein Reaktionsendpunkt
von 102–103 für
verschiedene informative Primer ermittelt, was bedeutet, dass mit
dem Verfahren gemäss
der Erfindung 100-1000
allogene Thrombozyten vor einem Hintergrund aus 100 Millionen Thrombozyten
detektiert werden können.
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In
zwei Fällen
wurde das oben genannte zweite Experiment durch das Mischen von
vorgezählten
Mengen von Thrombozyten (10-fach Verdünnungsserien, Startpunkt 106 Thrombozyten) in einem Röhrchen mit
EDTA Empfängerblut
erweitert. Dies um die Thrombozyten Transfusion zu imitieren. Nach 15
Minuten Mischen auf einer Laufrolle, wurde an Thrombozyten reiches Blut
durch Dichte-Zentrifugation isoliert. DNA wurde mit einem kommerziellen
Kit isoliert und PCR wurde mit einem Primer Paar, das den informativen
Polymorphismus anzeigt, durchgeführt.
Die Zyklus Konditionen sind identisch zu den oben genannten. 10 μl vom amplifizierten
Produkt wurden visualisiert und auf die Präsenz oder Absenz von PCR-Produkten analysiert,
mittels einem 2 Prozent Agarose Gel mit ultraviolettem Licht, nach
Ethidiumbromid Färbung. Ähnlich zu
den Thrombozyten Mischungen konnte eine Sensitivität von 102 oder 103 allogener
Thrombozyten in den Mischungen aus ganzem Blut erzielt werden.
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Die
Spezifität
wurde auch durch 10 zufällig selektierte
Individuen getestet die für
die 20 häufigen mtDNA
Polymorphien überprüft wurden.
Der nächste Schritt
war es, Paarungen aus diesen Individuen zu machen und zu sehen,
ob man, basierend auf den Screening Resultaten, sie unterscheiden
könnte.
Mit dem erfinderischen Set von Mitotyping Primern konnten sie in
94% der Kombinationen unterschieden werden.
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Wie
oben demonstriert, ist der Gebrauch von SNP's in mitochondrialer DNA als potentielles
Ziel gemäss
der Erfindung möglich
und deckt die meisten der bereits genannten Sachverhalte ab. Zusätzlich zum
Ziel ist auch die Selektion der molekulargenetischen Amplifikationstechnik
von extremer Wichtigkeit. Gemäss
der Erfindung wurde die sequenzspezifische Primer-PCR Technik ausgewählt. PCR-SSP Systeme
weisen multiple, kleine Volumina-PCR Reaktionen auf in denen jede
Reaktion spezifisch für
einen einzelnen Nukleotid-Polymorphismus ist. Die PCR-SSP Spezifität ist abgeleitet
vom Übereinstimmen
der terminalen 3' Nukleotide
der Primer mit der Ziel DNA-Sequenz. Taq Polymerase kann 3' übereinstimmende Primer verlängern aber
keine nicht- übereinstimmende
3' Primer, konsequenterweise
wird nur Ziel DNA komplementär
zu beiden Primern effizient amplifiziert. PCR-SSP funktioniert,
weil Taq Polymerase keine 3' zu
5' exonukleotid
Proof-Reading Aktivität
besitzt. Somit kann das Prinzip des 3' Nicht-Übereinstimmens benützt werden,
um nahezu jede Punktmutation innerhalb einer oder zwei PCR-SSP Reaktionen
zu identifizieren. Diese Technik wurde auch ausgewählt weil
sie grosse Vorteile im Vergleich zu anderen molekulargenetischen
Techniken hat: sie ist einfach mit minimalem technischen Aufwand
auszuführen,
und der Post-Amplifikation
Nachweis ist minimal. Zudem kann das System einfach auf neue Polymorphien
adaptiert werden.
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Das
erfindungsgemässe
Verfahren hat auch seine Grenzen: Wegen der mütterlichen Vererbung der mtDNA
können
Zellen die von gleichen mütterlichen
Individuen abstammen nicht voneinander unterschieden werden. Ausserdem
tragen reife Erythrozyten keine Mitochondrien und müssen von
der Analyse ausgeschlossen werden.