KR101960420B1 - 돼지의 수막뇌류 판단용 snp 마커 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지의 경제형질 중의 하나인 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 수막뇌류의 발생판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 수막뇌류의 발생판단용 키트 및 상기 SNP 마커의다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 수막뇌류의 발생 판단방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 파이로 시퀀싱 (Pyro-sequencing) 분석 방법은 번식형질인 돼지의 수막뇌류의 발생 여부를 조기에 판단할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 우수한 종돈을 확대 생산할 수 있는 시스템을 구축하여, 양돈 산업의 경쟁력을 높이는데 이바지할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 돼지의 수막뇌류 판단용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 수막뇌류 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 수막뇌류 판단용 키트, 상기 SNP 마커의다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 수막뇌류 판단방법 및 돼지의 수막뇌류의 발생이 정상 돼지 보다 상대적으로 적게 발생되는 돼지의 제조방법에 관한 것이다.
수막뇌류는 두개골 결손을 통하여 수막과 뇌척수액에 눌러 싸인 뇌조직이 탈출하는 선천성 질환이다. 인간에 있어서, 수막뇌류의 발생빈도는 3,000명 중 1명 정도로 빈번히 발생하는 유전질환으로 알려졌다. 한편 뇌수막염 은말, 돼지, 개, 고양이, 염소 등 다양한 동물에서 발생한다. 소, 고양이, 개 정도에서 사례 보고(case report) 형태로 보고 되어 있으나, 유전체 연구분야에서 연구는 전무하다. 돼지의 수막뇌류는 치사율이 80%이며, 뇌피가 터지면 3시간 이내에 폐사한다. 돼지의 수막뇌류의 해부학적 특징은 뇌의 정중앙 부분에 뼈가 없어 그 부분으로 뇌피 또는 뇌의 일부가 구멍으로 나와있는 상태이다. 돼지의 수막뇌류의 사례 보고는 2015년에 발표된 논문이 유일하다.
국내에서 사육되고 있는 거의 모든 돼지는 외래 종자를 이용하고 있다. 실제로 매년 1,000 두 이상의 종 돈들이 수입됨으로 인해, 외화 유출은 물론 악성 전염병의 국내 유입이 우려되고 있다. 따라서 국내 종돈에 대해 조속한 연구가 필요한 시점이다. 돼지 육종 연구에 있어, 우수 형질에 대한 분자표지를 이용하는 경우 표현형에 의존한 선발 방법보다 정확한 우수 종돈의 발굴이 가능하며, 기존의 방법에서 활용되던 후대 검정에 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있다. 이미 축산 선진국에서는 분자표지를 적극적으로 활용하여 종돈에 대한 유전적 개량사업을 진행하고 있으며, 육질, 번식형질, 성장형질 등에서 뛰어난 능력을 갖는 새로운 종돈들이 개발되고 있다.
최근 유전체 분석 기술의 발전으로 인하여, 유전체 정보를 활용한 유전체 선발 방법이 가능하게 되었다. 유전체 선발이란 가축의 경제형질과 연관되어 있는 유전형질을 확인하고 우수한 종축의 선발에 있어서 유전체 정보를 활용하는 것을 말한다. 대표적으로 유전체 선발에 이용되는 유전체 정보는 단일염기다형성(SNP)을 이용한 분자 마커를 예로 들 수 있는데, 최근 약 70만 개 이상의 SNP 정보를 집적시킨 칩이 개발되어 유전체 분석에 이용되고 있다. 한편, 수많은 유전체 정보를 분석하는 방법에도 발전적인 방법들이 제시되고 있는데, 그 중에서도 특정 형질과 연관된 유전체 정보를 포괄적으로 분석하는 GWAS(Genome-Wide Association Study)는 유전체 선발에 쓰일 분자 마커를 탐색하는데 유용한 도구로 활용되고 있다. 더욱이 GWAS 분석과 SNP 분자 마커를 결합한 종축 선발 방법은 특정 경제형질이 지닌 복잡한 유전형질을 이해하고 이를 활용하는데 많은 장점들을 제공한다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 돼지의 수막뇌류를 기준으로 하여 수막뇌류가 발생하는 돼지를 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, TLL1 유전자에서 돼지의 수막뇌류 결정에 관여하는 신규한 SNP 마커를 발굴하였으며, 상기 SNP 마커를 이용할 경우 유전적으로 결정되는 돼지의 수막뇌류를 판별하여, 상기 유전자 진단을 종돈단계에서 적용함으로써 돼지의 수막뇌류의 발생을 원천 방지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있는 SNP 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 수막뇌류 판단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지의 수막뇌류 판단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커의다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 수막뇌류를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 수막뇌류의 발생이 정상 돼지 보다 상대적으로 적게 발생하는 돼지의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 제주재래돼지와 랜드레이스 참조축군에서 2세대 자손까지 1400여두 시험 축에서 3두만이 수막뇌류가 발생하였다. 가계도 분석에서 동일한 부모에서 생산되었으며 구체적으로 1산차에서 1두, 2산차에서 2두만 생산됨에 따라 유전으로 추정하였다. 연구자들은 수막뇌류 발생 개체간 교배를 통해 가계를 조성하여 후대 축을 생산한 결과, 수막뇌류가 유전자에 의해 발생하며, 암 수 모두에게 발생한다는 점에서 상염색체에 의해 조절된다는 것을 알았다. 수막뇌류 발생에 대한 원인 유전자 구명을 위하여 수막뇌류의 발생 돼지의 가계를 대상으로 대용량 DNAchip으로 GWAS를 분석한 결과 8번 염색체 45 ~ 50Mbp 위치에서 유전자 좌위가 있음을 확인하였고, 세부적으로 8번 염색체를 대상으로 SNPchip을 제작하여 분석한 결과 44.4 ~ 45.2Mbp 영역에 원인 유전자 좌위가 있음을 확인하였다. 수막뇌류 발생 가계의 QTL(Quantitative trait locus)을 분석한 결과 TLL1 유전자가 수막뇌류에 관여하는 것으로 확인 되었다. 세부적으로 보면 수막뇌류 발생 가계 전체 567두를 대상으로 TLL1 g.110,075G>C에 대한 집단분석에서 232두의 수막뇌류 발생 돼지의 전수에서 C/C 대립유전자의 동형접합체가 확인되었다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 돼지의 수막뇌류의 발생을 판단할 수 있는 단일염기다형성(SNP, single Nucleotide Polymorphism, 단일염기다형성) 마커를 제공한다.
서열번호 1로 표시되는 TLL1 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 TLL1유전자인트론(intron) 5의 SNP 위치인 108,771, 109,016 또는 110,075번째 염기에 해당하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 45번째 염기가 T 또는 C이고,290번째 염기가 T 또는 G이며, 1347번째 염기가 C 또는 G이고, 상기45, 290, 또는 1347번째 염기에 위치한 SNP 위치를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "TLL1(Tolloid like 1) 유전자"란, 뼈 형성과 관련된 유전자이다. 상기 TLL1 유전자는 돼지의 8번 염색체상에 위치한다. 상기 TLL1 유전자의 인트론 5의 염기서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일염기다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일염기다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 돼지의 수막뇌류와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라 한다. 바람직한 다형성마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명의 “수막뇌류”이란, 수막류 또는 수막뇌류를 포함하는 것으로, 특징은 뇌의 정중앙 부분에 뼈가 없어 그 부분으로 뇌피 또는 뇌의 일부가 구멍으로 나와있는 상태(도 1)를 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "경제형질"이란, 돼지의 육종에 있어 자돈의 번식에 유리한 돼지의 표현형질을 의미하는데, 상기 표현형질은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 초분만일령, 종부횟수, 총산자, 생존산자, 생시복체중, 이유복체중, 수막뇌류 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 경제형질은 본 발명의 SNP 마커의 유전자형에 의해 영향을 받는데, 상기 SNP 마커에서 다형성 부위인 45번째 염기의 대립유전자가 C이고, 290번째 염기의 대립유전자가 G 또는 1347번째 염기의 대립유전자가 C인 경우경우 상기 SNP 마커에서 다형성 부위인 45번째 염기의 대립유전자가 T이고, 290번째 염기의 대립유전자가 T 또는 1347번째 염기의 대립유전자가 G를 갖는 개체에 비해 더 많은 수막뇌류가 발생되는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 수막뇌류가 발생되는 가계를 대상으로 대용량 SNP chip을 이용하여 돼지의 수막뇌류에 대한 QTL(Quantitative trait locus) 분석을 수행한 결과, 돼지의 수막뇌류에 관여하는 유전자가 8번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 2). 또한, 통계적 분석방법을 활용하여 수막뇌류 형질 조절 유전자 좌위에 대한 유전자 분석을 시행한 결과 TLL1를 포함하는 유전자군이8번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 3). 아울러, TLL1 유전자에 대한 서열 분석을 시행하여 신규 돌연변이 g.108,771T>C, g.109,016T>G 및 g.110,075G>C가 TLL1 유전자의 인트론 5상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 4). 상기 신규 돌연 변이 중 g.110,075G>C는 C/C 유전자형, C/G유전자형, G/G 유전자형이 존재하며, 수막뇌류가 발생한 돼지에서 전수 C/C 대립유전자의 동형접합체로 확인되었다(표 1). 19두의 SNP를 분석한 결과 g.108,771T>C 및 g.109,016T>G에서도, 수막뇌류가 발생한 돼지에서 전수 C/C (g.108,771T>C) 및 G/G(g.109,016T>G) 대립유전자의 동형접합체로 확인되었다 (도 4).
따라서, 본 발명의 SNP 마커의 유전자형을 증폭하고 파이로 시퀀싱 (Pyro-sequencing) 방법으로 상기 SNP 마커의 유전자형을 검출하면, 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있을 것으로 기대된다. 상기 SNP 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.
"파이로시퀀싱(pyrosequencing)"은 표지된 프라이머(labeled primer)가 필요하지 않으며 젤 전기영동 과정이 없이, DNA의 염기 서열을 30~40 염기쌍(bp) 정도만을 염기 서열 분석함으로써 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 파이로시퀀싱 방법은 실시간으로 수행되는, 전기영동을 하지 않고 이루어지는 시퀀싱 방법으로서, 프라이머-디렉티드 PCR에서 한번에 하나씩 순차적인 뉴클레오티드의 첨가와 병합에 의해 이루어지고 뉴클레오티드가 병합되면서 방출되는 파이로포스페이트는 ATP 설파릴레이즈(sulfurylase) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 효소와 짝지어져 빛을 방출시키며, 이 빛을 검출하는 방식으로 이루어진다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 뉴클레오티드의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 이 빛은 병합된 뉴클레오티드의 수와 비례하여 상대적 높이를 갖는 피크로 보여지고, 이를 보고 실시간으로 시퀀스를 결정할 수 있다.
피크의 패턴은 호모 및 헤테로, 야생형 및 돌연변이 시료 간 다르게 나타나므로, 야생형의 유전자 염기서열과 분석된 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이를 통해 돌연변이의 타입 및 정확한 위치를 확인, 결정할 수있으며, 빠르고, 간단하고, 경제적인 방식으로 다량의 시료를 처리할 수 있는 장점이 있다
종래의 직접적 DNA 시퀀싱 방법은 현재 자동화된 염기서열분석기기에 의해 수행됨에도 불구하고, 염기서열 분석할 PCR 산물과 같은 DNA 시료를 수득한 후에 정제하여 시퀀싱 반응을 수행한 후, 시퀀싱 반응으로 생성된 DNA를 침전시키고, 이를 자동화된 DNA 염기서열분석기기에 로딩하여 서열을 읽게 되므로 서열분석에 요구되는 시간이 훨씬 많은 단점이 있는 반면, 파이로시퀀싱은 염기서열 분석할 PCR 산물만 준비된다면 시퀀싱프라이머를 가지고 반응시키고, 이는파이로시퀀싱 기기에 의해 대략 10분 내에 염기서열의 분석이 가능하다.
또한, 뉴클레오티드 분배 순서 (nucleotide dispensation order)가 디자인될 수 있으므로 단일 뉴클레오티드에 의해 달라지는 염기서열 변이는 여러 피크에서 다른 양상으로 나타나는 뚜렷한 파이로그램으로 생성된다. 더욱이, 특정 뉴클레오티드 분배 전략을 사용함으로써 파이로시퀀싱 사이클의 수를 감소시킬 수 있고, 이에 따라 서열의 질과 검출 길이를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서 사용될 수 있는 공정을 간단히 설명하면 이하와 같다.파이로시퀀싱을 통해 변이(Mutation 혹은 Variation)를 검출하고자 하는 염기서열을 포함하는 유전자를 pyro-PCR 프라이머 세트(한쪽 가닥의 분리 정제를 위해 순방향 혹은 역방향 프라이머의 한쪽의 5' 말단에 바이오틴을 컨쥬게이션한다)를 이용하여 RT-PCR 및 PCR을 통해 증폭하고, 이렇게 증폭된 PCR 산물은 아비딘이 컨쥬게이션된비드와 반응 후 아비딘과 바이오틴의 친화력을 이용하여 PCR로 증폭된 DNA의 한쪽 가닥만 분리 비드에 고정한다. 이렇게 분리 정제된 한쪽 가닥의 DNA 주형을 이용하여 파이로시퀀싱프라이머와 어닐링 한 후 파이로시퀀서(pyro-sequencer)에서 뉴클레오티드 분배 순서에 따라 분주된 뉴클레오티드가 기질/효소와 함께 DNA 주형과 반응하여 나타난 파이로그램(pyrogram)을 이용하여 염기서열의 변이의 정도를 분석한다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 SNP 마커를 증폭 및 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 수막뇌류의 발생판단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "SNP 마커를증폭 및 검출할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 변이 부위, 즉 SNP 마커를 증폭 및 파이로 시퀀싱 (Pyro-sequencing) 방법을 통해 검출하여 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 PCR 방법에 이용되는 증폭용 조성물을 의미한다.
상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼 내에 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적합한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30bp의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해 상대적으로 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 서열과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 SNP 마커를 포함하는 TLL1 유전자의 서열을 증폭시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 프라이머의 서열 및 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 2로 표시되는 정방향프라이머 및 서열번호 3로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는프라이머 세트를 이용하여 돼지간에 존재하는 수막뇌류와 관련된 염기 변이 부분을 증폭할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지의 수막뇌류발생 판단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 돼지의 수막뇌류 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 검출함으로써 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나 PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트 일 수 있다.
본 발명의 키트는 돼지의 수막뇌류에 관여하는 유전자를 증폭시킨 후 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드의 양상을 확인함으로써 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있다. 상기 PCR 키트는,SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.
본 발명에서, “PCR-RFLP”방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자 형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.
또한, 구체적으로 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지의 수막뇌류 판단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구로서, 이를 이용하여 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있다
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계; 및 (b) a) 단계의 증폭된다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 수막뇌류의 발생 판단방법을 제공한다. 이때, 상기 SNP 마커로는 TLL1서열번호 1로 표시되는 TLL1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 45, 290, 또는 1347번째 염기가 될 수 있고, 상기 45번째 염기의 대립유전자가 C이고, 290번째 염기의 대립유전자가 G 또는 1347번째 염기의 대립유전자가 C인 경우 돼지의 수막뇌류가 상대적으로 많은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 수막뇌류를 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 시료를 이용하여, 상기 SNP 마커를 분석함으로써 상기 돼지의 수막뇌류를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 상기 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커를 검출하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, AffymetrixGeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
상기TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
상기시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보 결합할수있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로 본 발명은, 돼지의 수막뇌류에 관여하는 유전자의 SNP형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1로 표시되는 TLL1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서45번째 염기의 대립유전자를 T로 고정하거나, 290번째 염기의 대립유전자가 T를 고정하거나 또는 1347번째 염기의 대립유전자를 G로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지의 수막뇌류의 발생이 정상 돼지 보다 상대적으로 적게 발생되는 돼지를 제공한다.
상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 파이로 시퀀싱 (Pyro-sequencing) 분석 방법은 번식형질인 돼지의 수막뇌류를 조기에 판단할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 우수한 종돈을 확대 생산할 수 있는 시스템을 구축하여, 양돈 산업의 경쟁력을 높이는데 이바지할 수 있을 것이다.
도 1은 돼지의 수막뇌류 표현형 및 이의 MRI 및 CT 사진이다.
도 2은 대용량 SNP chip을 이용한 돼지 수막뇌류 관련 QTL 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도3는 8번 염색체의 수막뇌류 관련 QTL 영역에서 발견된 유전자군을 나타내는 그래프이다.
도 4은 TLL1 유전자의intron 5영역의g. 108,771T>C, g. 109,016T>G 및 g. 110,075G>C신규 돌연변이를 나타내는 서열분석 결과이다.
도 5는TLL1 유전자의intron 5영역을 포함하는 서열번호 1의 염기서열에서 110075번째 염기의 변이가 G 또는 C로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, C/G형 및 C/C형으로 나타남을 확인한 결과이다.
도 2은 대용량 SNP chip을 이용한 돼지 수막뇌류 관련 QTL 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도3는 8번 염색체의 수막뇌류 관련 QTL 영역에서 발견된 유전자군을 나타내는 그래프이다.
도 4은 TLL1 유전자의intron 5영역의g. 108,771T>C, g. 109,016T>G 및 g. 110,075G>C신규 돌연변이를 나타내는 서열분석 결과이다.
도 5는TLL1 유전자의intron 5영역을 포함하는 서열번호 1의 염기서열에서 110075번째 염기의 변이가 G 또는 C로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, C/G형 및 C/C형으로 나타남을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 돼지 수막뇌류 관련 GWAS(genome-wideassociationstudy)분석 결과
수막뇌류 발생 돼지 가계를 대상으로 대용량 SNP chip(Porcine 60K Beadchip, Illumina)을 이용하여 돼지의 번식형질인 수막뇌류에 대한 QTL 분석을 수행하였다(도 2). 도 2은 대용량 SNP chip을 이용하여 돼지 수막뇌류에 대한 QTL 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, 돼지의 수막뇌류 결정에 관여하는 유전자는 8번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다.
한편, 통계적 분석방법을(IBD mapping) 활용하여 QTL의 물리적 거리를 100kbp 단위로 압축하고, 수막뇌류 형질 조절 유전자 좌위에 대한 유전자 분석을 시행했다. 도 3는 돼지 수막뇌류 형질 조절에 관여하는 유전자 분석결과이다. 상기 도 3에서 알 수 있듯이, TLL1를 포함하는 유전자군이8번 염색체 상의 돼지 수막뇌류 관련 QTL에 존재함을 확인할 수 있었다. 염색체 8번 상에 위치한 QTL 인근 영역의 후보유전자군들에 대한 cDNA와 genomic DNA의 물리적 염기서열을 결정하고, 여기서 발견된 SNP들을 평가한 결과 TLL1 유전자의intron5영역의g. 110,075G>C변이가 돼지 집단의 수막뇌류와 가장 높은 연관을 나타내었다.도 4은 8번 염색체 상의 돼지 수막뇌류 관련 QTL의 TLL1 유전자에 대한 서열 분석 결과를 나타낸다. 상기 도 4에 나타난 바와 같이, 신규 돌연변이 g.108,771T>C, g.109,016T>G 및 g.110,075G>CdlTLL1 유전자의 intron 5 영역에 존재함을 확인할 수 있었다.따라서, 상기 TLL1 유전자의 신규 돌연변이 g.110,075G> C를 확인함으로써 돼지의 수막뇌류 형질을 판단할 수 있음을 알 수 있었다.ㅊ
실시예 2: 유전자형 분석
실시예 2-1: TLL1 유전자의 intron 5 영역에 대한 PCR 증폭
PCR-RFLP를 이용한 유전자형 분석을 수행하여 상기 TLL1 유전자의 돌연변이 형질을 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다:
TLL1_ex1F: 5' TGG-AAA-GCA-ACA-ACA-ACA-AAA3'(서열번호 2)
TLL1_ex1R: 5'biotin-TCA-CCC-ATG-CTG-TAG-TTT-TCA3'(서열번호 3)
TLL1_mini_seq: AGA-GAA-CGC-AGC-AGT-GGA-AA (서열번호 4)
상기 프라이머를 이용한 파이로-시퀀싱(pyro-sequencing) 분석 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 서열번호 1의 염기서열에서 110,075번째 염기의 변이가 C 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 C/C형, C/G형 및 G/G형으로 각각 나타나는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-2: TLL1 유전자형과 돼지 수막뇌류의 연관성 분석
수막뇌류 발생 가계 2세대를 대상으로 파이로 시퀀싱 (Pyro-sequencing)을 이용한 유전자형 분석을 수행하고, 각 유전자형을 갖는 돼지의 수막뇌류를 비교하였다(표 1).
| 표현형 | 두수 | TLL1 intron 5g.110,075G> C 유전자형 | 발생개체수 | 빈도 |
| 정상 | 335 | C/C | 151 | 0.450 |
| C/G | 139 | 0.414 | ||
| G/G | 45 | 0.134 | ||
| 수막뇌류가 발생된 돼지 | 232 | C/C | 232 | 1.000 |
| C/G | 0 | 0 | ||
| G/G | 0 | 0 |
상기 표 1은 TLL1 유전자의 g.110,075G> C돌연변이의 유전자형에 따른 수막뇌류의 차이를 GLM을 통해 분석한 결과이다. 표 1에 나타난 바와 같이,TLL1 intron 5 g.110,075G> C 위치에서 정상적인 유전자형은 G/G이며, 두개골 유전자형은 C/C이다. 지금까지 알려진 대다수의 유전성질환은 유전자 침투도가 낮아 열성 동형접합체를 보유하더라도 0.1 이내에서 발생하는데, 수막뇌류의 경우 유전자 침투도는 계산상에서 0.605로 매우 높은 편이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Novel SNP maker for discriminating the meningoencephalocele of
pigs and use thereof
<130> 1062293
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLL1 intron5
<400> 1
ttcacttaat ccatttccat gctgaatgca cagtgcatgt gaatctgtaa acctcacagc 60
catcaccatg gagactcaga taatcatcct ctcccaccag gtgtagatag agacccttat 120
ctattgagct tccacccttg ctcctcacag tttatgataa attatagaca actgcaatcc 180
ttccagtcct tcagtaatgt tatacatttt tccctttgcc tggattatct cttttgttta 240
ttattcttca atcctcacta caaaaatctt aaaattacag aatcaaaatg caaccttccc 300
tgagcttcaa ggagaatata atgccctcac ttagcctgcc aaagaaagaa aatatgacat 360
atgacaaaca taaaacaatg gtaagaccat catgaggaga aactagtcca aatatgtgct 420
tatttaaaga tctttgtaac actgaatcta aaaaacctat agtctcagaa ttctttcttt 480
tgttatcaca ccccaaaact gtgctgagct gattggcttt ttttttcctg cagtactatt 540
tttaagtttg tggtcataat ttgttccatt tatcttttta tgagtctact gatatcttcc 600
agactcttaa aaaagtcttc cttttgaaga agttacttgt tccctctaag tgtatttacc 660
ccttacactc ctctcaaatg tacatgtatt ctgagtattc aaacaaatag ttatggtcag 720
tcttattgag acattcttaa aattctcctt tccccataca cttggcatct tccactgtgg 780
ttgggtgatg ttgtgtgacc ctttgcaaca ttcttataca aatccaatca gtgaatatta 840
gaaagaaggc agtaattatt tgaggagtta aagtcataaa gatccaaaat gagtataata 900
aaaataaatt ttgagtttga aagattatta taagaaattc tgccacagga tcctttctta 960
ggcctaaaaa cctcacaagg attccccact ggaatttatt tcaatgacaa aaggttagca 1020
ttcacattcc aattcagaaa caccttcact ctaataaagt tgtaaaaaat gatttaaggg 1080
aaattatgct ctactgttaa ataaagagaa gtatataaat ggcattgtgt ccttgactaa 1140
actgagtgaa attcactctc ttcctttgca ccaaaaatat gacagaggga atgggtgacc 1200
tatctcaaag gtgtttttga tgataaataa ataccactgc agttaacatc tctgcaaatg 1260
gaaaaacaac aacaaaacca gctgggtgct gcagcatgag gcaatatata aatagatgct 1320
ccagggagag aacgcagcag tggaaaggca ggtagaagtt ggctcctggt gctgcagcat 1380
tggcacagtt aaccagactc cagatggaga agggaagctt gggggagc 1428
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLL1_ex1F
<400> 2
tggaaagcaa caacaacaaa a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLL1_ex1R
<400> 3
tcacccatgc tgtagttttc a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLL1_mini_seq
<400> 4
agagaacgca gcagtggaaa 20
Claims (9)
- 서열번호 1로 표시되는 TLL1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 45번째 염기가 T 또는 C이고, 290번째 염기가 T 또는 G이며, 1347번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 45, 290, 또는 1347번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 수막뇌류 발생 판단용 조성물.
- 제1항의 유전자를 증폭 및 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 수막뇌류 발생 판단용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 일부를 증폭시킬 수 있으며, 서열번호 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 3로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 세트인, 돼지의 수막뇌류 발생 판단용 조성물. - 제 2항 또는 제 3항의 조성물을 포함하는 돼지의 수막뇌류 발생 판단용 키트.
- 제 4항에 있어서,
상기 키트는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트 또는 DNA 분석용 키트인, 돼지의 수막뇌류 발생 판단용 키트. - (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 유전자 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드 부위 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위를 증폭 시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 수막뇌류 발생 판단방법. - 제6항에 있어서,
상기 유전자 마커에서 다형성 부위인 45번째 염기의 대립유전자가 C이고, 290번째 염기의 대립유전자가 G 또는 1347번째 염기의 대립유전자가 C인 경우, 돼지의 수막뇌류가 상대적으로 많이 발생되는 것으로 판단하는 방법. - 돼지의 수막뇌류에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1로 표시되는 TLL1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 45번째 염기의 대립유전자를 T로 고정하거나, 290번째 염기의 대립유전자가 T를 고정하거나 또는 1347번째 염기의 대립유전자를 G로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지의 수막뇌류의 발생이 정상 돼지 보다 상대적으로 적게 발생되는 돼지의 제조방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인, 돼지의 제조방법.
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| KR (1) | KR101960420B1 (ko) |
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2017
- 2017-07-24 KR KR1020170093379A patent/KR101960420B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
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| BMC Veterinary Research (2015) 11:89 |
| International Journal of Biological Sciences (2012) 8(6):870-881 |
| Journal of Morphological Sciences (2017) 34(3):152-155 |
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| KR20190011007A (ko) | 2019-02-01 |
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