ES2274861T3 - Metodo para el diagnostico no-invasivo de transplantes y transfusiones. - Google Patents
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Abstract
Método para el diagnóstico no-invasivo de trasplantes y transfusiones caracterizado por a) extracción de ADN mitocondrial (ADNmt) no celular circulante de una muestra de fluidos corporales no celulares procedente del receptor del trasplante o transfusión; b) detección, análisis y cuantificación del ADNmt de la muestra; c) comparación del ADNmt de la muestra con el ADNmt que se obtiene del donante y del receptor antes del trasplante o transfusión; d) utilización de polimorfismos de ADNmt en regiones hipervariables para distinguir entre el daño del tejido del donante y el daño del tejido del receptor en el contexto del trasplante o para determinar la supervivencia de componentes de células sanguíneas en una transfusión.
Description
Método para el diagnóstico
no-invasivo de trasplantes y transfusiones.
El trasplante de órganos sólidos y de células
madre alogénicas implica el trasplante de una unidad funcional de
origen alogénico a un paciente enfermo. Esta unidad funcional puede
ser aceptada o rechazada por el receptor del trasplante. Existen
múltiples parámetros tales como el estado funcional del órgano, la
compatibilidad inmunológica, etc., que influyen en la aceptación
final del órgano o de las células madre implantadas. El apoyo
farmacológico después del trasplante puede modular el sistema
inmunológico del receptor y con ello reducir el rechazo del
trasplante.
trasplante.
Debido a la escasez aguda de órganos compatibles
o de células madre de donantes, es extremadamente importante
minimizar las pérdidas a causa del rechazo. El resultado del
trasplante se mejora mediante un extenso programa de pruebas de
compatibilidad pre-trasplante y mediante control
continuo del estado funcional del trasplante y de cualquier signo
de rechazo. Esta forma de control es también útil para ajustar la
dosis del tratamiento de inmunosupresión necesario para la
aceptación del injerto.
Un factor relevante en este control no sólo es
lo que debe ser medido sino también dónde debe ser medido.
Una estrategia desarrollada consiste en medir
las respuestas inmunitarias específicas para los antígenos en
cuestión, tales como las clases foráneas MHC I y II para el caso de
trasplantes alogénicos, en el lugar del injerto (biopsia del
tejido). Este procedimiento de diagnóstico invasivo presenta las
desventajas siguientes:
- -
- Influye negativamente sobre la calidad de vida del paciente (permanencia hospitalaria).
- -
- Se asocia con complicaciones tales como hematuria, anuria, hematoma perirrenal, hemorragia y shock, fístula arteriovenosa y pérdida del injerto en el caso de trasplante renal. En el trasplante de hígado y de corazón se han descrito complicaciones semejantes.
- -
- Existe una cantidad limitada de material biológico y de reactivos necesarios, y únicamente hay un número limitado de biopsias posibles.
- -
- El rechazo puede ser un problema focal en un órgano: errores de muestreo causan resultados falsos negativos. Para aumentar la certeza del diagnóstico, por lo tanto, se tienen que tomar múltiples muestras de biopsia, que se asocia con un alto riesgo de pérdida del trasplante.
- -
- Coste general de procedimientos invasivos muy elevado.
En base a estos conocimientos se ha ideado otra
estrategia y se ha llegado al desarrollo de procedimientos de
diagnóstico no-invasivos para controlar los
rechazos. Tales procedimientos incluyen:
- a)
- Control de los tipos de células inmunes presentes en la circulación en un momento dado.
- b)
- Medida de los cambios en patrones de citoquina.
- c)
- Medida de la codificación del ARNm para la perforina y el granzima B, las proteínas citotóxicas asociadas con el rechazo del órgano.
Las ventajas de estas técnicas de diagnóstico
no-invasivas son, que no interfieren en la calidad
de vida del receptor del trasplante, que en general sólo se necesita
una muestra de sangre o de orina y que las pruebas se pueden
estandarizar y/o automatizar. Además, apenas se asocian
complicaciones de proceso con los métodos de ensayo
no-invasivos, que son menos costosos en comparación
con los procedimientos invasivos.
Las desventajas de los ensayos
no-invasivos conocidos son, que requieren tecnólogos
especializados para obtener resultados válidos, que los ensayos
basados en el análisis del ARNm están influenciados por la cortísima
vida de esta molécula y por ello requieren un procesado de muestras
muy rápido, que el control de las células inmunes y/o de las
citoquinas implicadas en la inflamación está amparado por posibles
infecciones que pueden causar alteraciones similares a las que se
presentan bajo condiciones de rechazo del trasplante, y que ninguno
de estos hechos ha demostrado ser útil en la identificación de
rechazo del injerto en etapas tempranas.
Aparte de proteínas específicas y del ADN
genómico del donante, también se sabe que cuando el tejido del
injerto donante está dañado se libera ADN mitocondrial (ADNmt) a la
circulación del receptor. A excepción de los eritrocitos maduros,
todos los componentes sanguíneos celulares contienen mitocondrias.
Miles de mitocondrias por célula están presentes en los leucocitos,
y una media de 3-4 mitocondrias están también
presentes en las plaquetas. Cada una de estas mitocondrias contiene
por lo menos una copia de ADNmt. El ADN mitocondrial codifica un
conjunto completo o ARN ribosomal y ARN de transferencia así como
13 polipéptidos de fosforilación oxidativa. Este ADNmt humano
circular de 16,6 kb fue completamente secuenciado en 1981.
TRANSFUSION vol. 37, 1997, p.
1012-1019 y EUR. J. IMMUNOGENETICS vol. 28, no. 2,
abril 2001, p. 209; y 15th European Histocompatibility Conference,
Granada, España, 27-30 de marzo de 2001, describen
el método PCR-SSP para detectar ADNmt específico
del donante en un sistema in vitro que imita la composición
sanguínea del receptor después de la transfusión de plaquetas,
siendo los cebadores específicos de secuencia ASF y BSF localizados
en las regiones hipervariables del ADNmt.
TRANSFUSION vol. 41/12, diciembre 2001, p.
1531-1538; y BRIT. J. HAEMATOL. vol. 112, no. 4,
marzo 2001, p. 995-1003 describen el análisis de
las regiones HVR 1 y HVR 2 del ADNmt para polimorfismos por medio de
PCR-SSP o análisis de secuencia, siendo ambos
métodos útiles para el diagnóstico de transfusiones mediante la
detección del ADNmt específico del donante y habiendo sido probados
en un sistema in vitro.
El objetivo de la presente invención es sugerir
un método o proceso para medir la cantidad de ADNmt no celular
circulante en fluidos corporales como indicador o marcador de daños
del tejido y utilizar los polimorfismos de ADNmt para distinguir
entre el daño del tejido de donante y de receptor en el contexto del
trasplante. Además, el método no debe incluir el marcado de
productos sanguíneos celulares ya que esto podría modificar
potencialmente los productos y/o afectar a su calidad, y el método
debe ser fácil de realizar.
El objetivo indicado de la presente invención se
alcanza mediante el método según la reivindicación 1.
El método según la presente invención consiste
en un procedimiento de diagnóstico no-invasivo
caracterizado por los siguientes pasos:
- a)
- extracción de ADN mitocondrial (ADNmt) no celular circulante de una muestra de fluidos corporales no celulares del receptor del trasplante o transfusión;
- b)
- detección, análisis y cuantificación del ADNmt de la muestra;
- c)
- comparación del ADNmt de la muestra con el ADNmt que se obtiene del donante y del receptor antes del trasplante o transfusión;
- d)
- utilización de polimorfismos de ADNmt en regiones hipervariables para distinguir entre el daño del tejido del donante y el daño del tejido del receptor en el contexto del trasplante o para determinar la supervivencia de componentes de células sanguíneas en una transfusión.
Las ventajas de este procedimiento comparado con
otros métodos no-invasivos son:
- -
- Detecta específicamente el daño del órgano objeto como si no hubiera ninguna otra fuente de ADNmt que contenga los polimorfismos específicos.
- -
- Utiliza ADN bicatenario que es mucho más estable en circulación que el ARNm. Utiliza el ADNmt que está presente en más de 10.000 copias sobre la base de una célula. Esto aumenta la sensibilidad 2-3 logs cuando se compara con una sola copia del marcador de polimorfismo de un solo nucleótido del genoma nuclear.
- -
- Utiliza la región hipervariable del ADN mitocondrial. Esta región D-bucle está presente en varias copias para una sola molécula de ADNmt. Esto proporciona un número adicional de copias de la secuencia objeto por célula.
- -
- La tasa de mutación del ADN mitocondrial es 10-20 veces superior a la del ADN genómico con lo que aumenta la probabilidad de encontrar los polimorfismos informativos.
- -
- Se ha descrito la secuencia del ADNmt y se han caracterizado muchos polimorfismos.
Se sabe que el ADNmt humano representa un
objetivo extraordinario para detectar plaquetas transfundidas
alogénicas. Mediante la secuenciación de 100 donantes de aféresis
de plaquetas se han encontrado más de 20 polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP) en la región de control del ADNmt. La presente
invención da a conocer la posibilidad de utilizar estos
polimorfismos mediante PCR utilizando cebadores específicos de
secuencia (SSP) y de esta manera, una nueva técnica adaptada para
diferenciar células alogénicas de células autólogas. Dicho más
específicamente, se han diseñado nuevos pares cebadores específicos
de secuencia y se han optimizado las condiciones para PCR.
Por lo tanto, otro objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar un método con un sistema
PCR-SSP para polimorfismos de ADN frecuentes, pares
cebadores específicos de secuencia y un control de la amplificación
del par cebador para indicar si la reacción PCR ha sucedido.
Un objetivo adicional de la presente invención
consiste en proporcionar un conjunto SSP-PCR que
detecte los polimorfismos frecuentes en el ADNmt humano. Este
conjunto se puede utilizar para identificar marcadores informativos
de quimerismo y estudios de supervivencia después de transfusiones
de componentes sanguíneos celulares.
Las realizaciones preferentes de la presente
invención quedan reflejadas en las reivindicaciones
dependientes.
La presente invención se describe con más
detalle a continuación mediante la siguiente explicación y en
relación con el dibujo adjunto. En el dibujo,
La Figura muestra una vista general esquemática
de la localización de los SNP dentro del ADNmt humano,
la Tabla 1 muestra los oligonucleótidos
cebadores de HVRI Mitotyping mediante PCR-SSP,
la Tabla 2 muestra los oligonucleótidos
cebadores de HVRI Mitotyping mediante PCR-SSP,
la Tabla 3 muestra los oligonucleótidos
cebadores de COXI Mitotyping y el cebador de control mediante
PCR-SSP,
la Tabla 4 muestra el perfil térmico y las
condiciones de PCR para pares cebadores de HVRI, y
la Tabla 5 muestra el perfil térmico y las
condiciones de PCR para pares cebadores de HVR2.
Utilizando dos polimorfismos bien conocidos del
ADNmt, es posible establecer un sistema cebador específico de
secuencia-PCR (PCR-SSP) para la
detección de trombocitos alogénicos de transfusiones. Sin embargo,
estos dos cebadores detectan polimorfismos de ADNmt poco frecuentes
en la población caucásica y en la práctica, no son muy
informativos. Para aumentar el número de cebadores informativos, es
necesario cambiar a dos regiones altamente polimórficas (HVRI y
HVR2) dentro de la región D-bucle de 1.024 bp. Esta
región D-bucle es una región de
no-codificación que contiene los elementos
reguladores para la replicación y la trascripción.
La figura del dibujo muestra una vista general
esquemática de la localización de los SNP dentro del ADNmt humano
objeto de los cebadores específicos de secuencia. El genoma
mitocondrial circular se muestra en la parte inferior izquierda de
la figura. La letra L representa la hebra ligera y la letra H la
hebra pesada. Leyendo en el sentido de las agujas del reloj, en la
parte inferior izquierda de la figura se muestra la región de
codificación de la citocromo c oxidasa I (COXI) (entre bp
7000-7500), que contiene el par cebador 20. En la
parte superior derecha de la figura se representa la región
D-bucle esquemáticamente. El
D-bucle está unido a los genes a través de la
prolina del ARNt (tRNAPro) y de la fenilalanina del ARNt (tRNAPhe).
Se muestran las posiciones de las diferentes regiones
hipervariables. Trece pares cebadores se localizan dentro de la
primera región hipervariable (HVR1) de la región
D-bucle. Seis pares cebadores se sitúan en la
segunda región hipervariable (HVR2) y un par cebador se localiza
dentro de la secuencia de codificación de la citocromo c oxidasa I
(COXI).
Los SNP se seleccionan en base a un análisis de
secuencia de nucleótidos de 100 donantes de aféresis de plaquetas.
Todos los SNP seleccionados se expresan sobre el 10 por ciento de
los donantes. Además, el polimorfismo a 7025 np se escoge porque es
expresado por un 34% de caucásicos. Ambos cebadores, el directo y el
inverso, se pueden diseñar con la ayuda de un software para el
diseño de cebadores disponible en Internet bajo
http//www.williamstone.com. Los oligonucleótidos cebadores se pueden
analizar para potencialmente interferir en estructuras secundarias,
tales como los bucles en horquilla (hairpin loops) y para
diferencias de punto de fusión. Las secuencias de nucleótido y la
localización de los cebadores utilizados para
PCR-SSP mitotyping se muestran en las tablas 1 a
3.
En la localización de las tablas, se muestra el
tamaño del fragmento y la secuencia de los cebadores utilizados
para la amplificación específica de secuencia de patrones de ADN
mitocondrial. La letra F indica el cebador directo y la letra R
indica el cebador inverso. Los cebadores se numeran según su
posición en el extremo 5' en la secuencia de referencia (Anderson y
otros, Nature, 1981, 290, 457-465). La letra H se
utiliza para la hebra pesada, que es rica en purina. La letra L se
utiliza para la hebra ligera (rica en pirimidina). * indica la base
que diferencia el alelo. Las bases que no se complementan con su
correspondiente patrón objeto están subrayadas.
En cada reacción PCR se incluye un par cebador,
que amplifica una secuencia conservada del ADNmt y así funciona
como cebador de control de la amplificación. La concentración del
par cebador de control se mantiene de 4 a 20 veces más baja que la
concentración de los cebadores específicos de alelo para aumentar la
especificidad y evitar resultados falsos negativos debidos a la
cebación competitiva.
Las condiciones de amplificación específicas y
las mezclas de reacción para cada reacción PCR-SSP
se muestran en las tablas 4 y 5. El volumen total de la reacción de
PCR es de 10 \muL. Cada mezcla de reacción de PCR contiene un par
cebador SSP (tablas 1-3) y el par cebador de control
positivo interno (tabla 3). Para concentraciones específicas de los
pares cebadores ver tablas 4 y 5. Además de los cebadores, las
mezclas de reacción de PCR contienen también patrón de ADNmt, PCR,
tampón, dNTP, dimetilsulfóxido, Taq polimerasa y cloruro de
magnesio. Dado que cada reacción de PCR se tiene que optimizar para
cada uno de los componentes, la concentración de los diferentes
componentes y las temperaturas de alineación varían. Las
concentraciones exactas de los diferentes componentes se pueden
encontrar en las tablas 4 y 5. El volumen de reacción de 10 \muL
se completa por adición de agua bidestilada.
La PCR se puede realizar utilizando un
secuenciador térmico programable. Otros 10 \muL de producto
amplificado se pueden visualizar y analizar mediante la presencia o
ausencia de productos PCR utilizando un 2 por ciento de gel de
agarosa con luz ultravioleta después de tinción con bromuro de
etidio.
Los resultados de los experimentos según las
condiciones descritas con anterioridad se describen a
continuación.
En cuarenta casos, se encontraron reacciones
PCR-SSP positivas en el patrón de ADNmt de
individuos previamente no probados y se confirmaron mediante
secuenciación automatizada del patrón de ADNmt en una instalación de
secuenciación independiente.
Cada célula nucleada contiene miles de
mitocondrias. Teóricamente, esto indicaría que hay más patrones de
ADNmt que de ADN genómico disponibles sobre la base de una célula.
Para investigar si esto se podía demostrar, se compararon dos
sistemas PCR-SSP. Uno corresponde a un sistema de
PCR-SSP para ADN genómico (HLA-B low
kit, Genovision, Viena, Austria), y el otro a un sistema mitotyping
PCR-SSP para ADNmt según la presente invención. Se
aislaron las células mononucleares de 6 individuos mediante
centrifugación en gradiente de densidad, de las cuales se conocían
los polimorfismos genómicos (HLA tipo B) y los polimorfismos
mitocondriales (mitotyping). Para simular las combinaciones
donante/receptor, se prepararon seis pares con una dilución en serie
de 10 veces de células de donante. El punto de partida fue de
10^{6} células mononucleares. El ADN se extrajo utilizando un
conjunto comercial (Puregene, gentra systems) y se realizó la PCR.
La cantidad de ADN y las condiciones de secuenciación (30 ciclos)
se mantuvieron semejantes para ambos sistemas. 10 \muL del
producto amplificado se visualizaron y se analizaron según la
presencia o la ausencia de productos PCR utilizando un 2 por ciento
de gel de agarosa con luz ultravioleta después de tinción con
bromuro de etidio.
Se encontró que, en las seis combinaciones, las
secuencias específicas del donante detectadas mediante cebadores
específicos de ADNmt eran de 102 a 103 veces más sensibles que los
cebadores para la detección de polimorfismos HLA.
Las plaquetas sólo contienen un número muy
pequeño de mitocondrias. Esto está completamente compensado por la
gran cantidad de plaquetas que se transfunden (10^{12}/unidad).
Para investigar el límite de detección del sistema
PCR-SSP desarrollado para el ADN mitocondrial en
esta aplicación, se prepararon una serie de diluciones de plaquetas
de donante aisladas de 6 individuos con polimorfismos conocidos de
ADNmt. Para simular las combinaciones de donante/receptor, se
prepararon seis pares con una dilución en serie de 10 veces de
células de donante. El punto de partida fue de 10^{8} plaquetas.
El ADN se extrajo utilizando un conjunto comercial y se realizó la
PCR con un par cebador indicador del polimorfismo informativo. Las
condiciones de secuenciación fueron idénticas a las mencionadas con
anterioridad. 10 \muL del producto amplificado se visualizaron y
se analizaron según la presencia o la ausencia de productos PCR
utilizando un 2 por ciento de gel de agarosa con luz ultravioleta
después de tinción con bromuro de etidio.
Utilizando 10^{8} plaquetas se determinaron
los límites de reactividad en 10^{2}-10^{3} para
cebadores informativos diferentes, lo que significa que con el
método según la presente invención se pueden detectar
100-1000 plaquetas alogénicas sobre un fondo de 100
millones de plaquetas.
En dos casos el segundo experimento
anteriormente mencionado fue ampliado mezclando cantidades
preestablecidas de plaquetas alogénicas (series de dilución de 10
veces, punto de partida de 10^{6} plaquetas) en un tubo de sangre
EDTA de un receptor. Esto para simular una transfusión de plaquetas.
Después de mezclar durante 15 minutos con un rodillo, el plasma
rico en plaquetas se aisló mediante centrifugación de densidad. El
ADN se extrajo utilizando un conjunto comercial y se realizó la PCR
con un par cebador indicador del polimorfismo informativo. Las
condiciones de secuenciación fueron idénticas a las mencionadas con
anterioridad. 10 \muL del producto amplificado se visualizaron y
se analizaron según la presencia o la ausencia de productos PCR
utilizando un 2 por ciento de gel de agarosa con luz ultravioleta
después de tinción con bromuro de etidio. De manera similar a las
mezclas de plaquetas, se pudo alcanzar una sensibilidad de 10^{2}
o 10^{3} plaquetas alogénicas en todas estas mezclas
sanguíneas.
La especificidad también se ensayó tomando 10
individuos seleccionados aleatoriamente y analizando los 20
polimorfismos de ADNmt más frecuentes. El siguiente paso consistió
en complementar estos individuos y determinar si se podían
distinguir entre ellos en base a los resultados del análisis. En un
94% de las combinaciones se pudieron identificar utilizando el
conjunto de cebadores mitotyping de la presente invención.
Como se ha demostrado con anterioridad, según la
presente invención, el uso de SNP con ADN mitocondrial como
objetivo potencial es posible y cubre la mayor parte de los asuntos
ya mencionados. Además del objetivo, la selección de la técnica de
amplificación de la genética molecular es también de suma
importancia. La presente invención ha elegido la técnica cebador
específico de secuencia-PCR. Los sistemas
PCR-SSP presentan múltiples y pequeños volúmenes de
reacción PCR en los que cada reacción es específica para un
polimorfismo de un solo nucleótido. La especificidad de
PCR-SSP deriva de complementar el nucleótido del
extremo 3' de los cebadores con la secuencia de ADN objetivo. La
Taq polimerasa puede extender los cebadores
3'-complementados pero no los cebadores
3'-no complementados, por lo que únicamente el ADN
objetivo complementario a ambos cebadores se amplifica
eficientemente. El PCR-SSP funciona porque la Taq
polimerasa carece de actividad exonucleolítica de 3' a 5'. Por
ello, la no-complementariedad de 3' se puede
utilizar para identificar virtualmente cualquier simple punto de
mutación dentro de una o dos reacciones PCR-SSP.
Esta técnica también ha sido escogida porque presenta importantes
ventajas con respecto a otras técnicas de genética molecular: es
fácil de realizar con el mínimo gasto técnico, y la detección
post-amplificación es mínima. Además, el sistema se
puede adaptar fácilmente a nuevos polimorfismos.
El método según la presente invención también
tiene sus limitaciones: debido a la herencia maternal del ADNmt, las
células que derivan de individuos maternalmente relacionados no
pueden ser discriminadas entre sí. Además los eritrocitos maduros no
contienen mitocondrias por lo que se tienen que excluir del
análisis.
Claims (4)
1. Método para el diagnóstico
no-invasivo de trasplantes y transfusiones
caracterizado por
- a)
- extracción de ADN mitocondrial (ADNmt) no celular circulante de una muestra de fluidos corporales no celulares procedente del receptor del trasplante o transfusión;
- b)
- detección, análisis y cuantificación del ADNmt de la muestra;
- c)
- comparación del ADNmt de la muestra con el ADNmt que se obtiene del donante y del receptor antes del trasplante o transfusión;
- d)
- utilización de polimorfismos de ADNmt en regiones hipervariables para distinguir entre el daño del tejido del donante y el daño del tejido del receptor en el contexto del trasplante o para determinar la supervivencia de componentes de células sanguíneas en una transfusión.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la detección, el análisis y la
cuantificación del ADNmt de la muestra del receptor se realizan
mediante sondas Taqman, molecular beacons u otros medios para PCR en
tiempo real, serie de genes, o densitometría SSCP.
3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado por el análisis de las regiones hipervariables
HVR1, HVR2, HVR3 del ADNmt.
4. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el fluido corporal no celular es orina,
plasma o suero.
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