ES2391076T3 - Un kit para juzgar el riesgo de granulocitopenia inducida por fármacos - Google Patents

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Abstract

Un kit para detectar un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana empleado para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por fármacos, en el que el kit comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de 10 a 35 bases como se define a continuación en (a) a (f) como cebadores o sondas para detectar polimorfismos del gen del sustrato 2 del receptor de insulina: (a) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de C en A en la posición 4.587 en 5' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; (b) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es deleción de AT en la posición 2.510 en 5' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; (c) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de A en C en la posición 1.164 en 5' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; (d) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de A en C en la posición 15.870 en 3' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; (e) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de A en C en la posición 29.793 en 3' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; y (f) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es deleción de C en la posición 31.532 en 3' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana. en el que los números de posición corresponden a los números de posición contando desde A de ATG como codón para Met al extremo N de la proteína cuando se traduce el ARNm en la proteína.

Description

Un kit para juzgar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos.
Campo de la tecnica
La presente invencion se refiere a un procedimiento para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos mediante el uso, como indice, de un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana; a un procedimiento de detectar el polimorfismo genetico empleado como indice de la evaluacion del riesgo mencionada anteriormente; a oligonucleotidos empleados para estos procedimientos; y a un kit para la evaluacion y/o la deteccion.
Tecnica anterior
El pilar principal de la medicina moderna es la terapia farmacologica, que emplea farmacos para tratar o prevenir diversas enfermedades. Casi todos los farmacos empleados en la terapia farmacologica (p. ej., compuestos de bajo peso molecular) son, intrinsecamente, sustancias extranas para el cuerpo humano y, por tanto, la administracion de dichos farmacos proporciona eficacia terapeutica pero puede producir diversos efectos secundarios. Dichos efectos secundarios a menudo hacen que se abandone la terapia farmacologica. Asimismo, algunos farmacos se han encontrado una situacion en la que la investigacion y el desarrollo se tienen que suspender debido a efectos secundarios graves, aunque se ha demostrado que los farmacos son utiles para pacientes con una enfermedad determinada. Ademas, el uso de algun otro farmaco esta estrictamente regulado con el fin de detectar el signo de sus efectos secundarios mediante exploraciones obligatorias.
De acuerdo con las estadisticas publicadas en EE.UU., los casos de efectos secundarios inducidos por farmacos constituyen dos millones o mas al ano y mas de 100.000 debido a dichos efectos secundarios (JAMA, 279, 1200 (1998)). En Japon, se han notificado 26.545 de efectos secundarios inducidos por farmacos (incluidos casos notificados de forma redundante) y 1.239 muertes por dichos efectos secundarios solo en el ano 2000 (Ministry of Health, Labor and Welfare, June 6, 2003, House of Representatives, Responsive Pleading No. 55).
Entre los efectos secundarios debidos a la administracion de farmacos, la granulocitopenia es un efecto secundario mortal. En particular, una disminucion en los granulocitos tiende a producir una infeccion y el inicio de agranulocitosis implica un riesgo muy alto de enfermedad infecciosa grave, tal como neumonia o sepsis. Ejemplos de farmacos que en general se sabe que inducen granulocitopenia incluyen farmacos analgesicos-antipireticos (aminopirina), antibioticos (cloromicetina), farmacos antitiroideos (merazol), farmacos anticonvulsivos, farmacos antidiabeticos y farmacos diureticos. Es menos probable que la aparicion de efectos secundarios causados por dicho farmaco este relacionada con su dosis y se considera que esta relacionada con la predisposicion de un paciente (p. ej., predisposicion alergica o idiosincrasia). Por tanto, la aparicion de dichos efectos secundarios es casi imposible de predecir. Con el fin de evitar la aparicion de dichos efectos secundarios, los medicos deben manejar sus respectivos casos cuidadosamente, mediante entrevistas detalladas con pacientes individuales con respecto a, por ejemplo, los registros de administracion de farmacos en otros departamentos, un analisis de los resultados de analisis de sangre etc. Es notable el hecho de que si y cuando un paciente presenta un inicio de un efecto secundario de granulocitopenia, los medicos deberan tomar medidas inmediatas, incluida la hospitalizacion.
Se conocen otros farmacos que inducen granulocitopenia, entre los que se incluye dibenzodiazepina (clozapina), que es un farmaco antipsicotico. Cabe esperar que este farmaco tenga una eficacia alta, pero los ensayos clinicos del farmaco en Japon se han suspendido. Otros farmacos que inducen granulocitopenia incluyen vesnarinona, que tiene actividades inhibidoras sobre PDE3 y los canales de K. Este farmaco es un farmaco inotropico eficaz que es menos probable que produzca arritmias y otros acontecimientos cardiacos (p. ej., inicio de insuficiencia cardiaca y hospitalizacion). No obstante, la administracion de este farmaco puede producir efectos secundarios, por ejemplo leucopenia, granulocitopenia y la posterior agranulocitosis. Por tanto, el uso de este farmaco esta estrictamente limitado.
Los polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) son los marcadores geneticos mas usados en los analisis geneticos humanos. Ya se ha demostrado que los SNP son marcadores utiles para un estudio de asociacion entre los antecedentes geneticos y las enfermedades habituales o respuestas farmacologicas (veanse los documentos no patentes 1, 2 y 3). Como se sabe, el analisis del haplotipo, construido con multiples SNP, es util para analizar la susceptibilidad de enfermedades poligenicas (veanse los documentos no patentes 4 y 5). En la practica, algunas enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer y la hipertension, ya han sido analizados intensamente mediante dicho procedimiento de analisis (Jeunemaitre, X., y col., Am. J. Hum. Genet., 60,1448-1460 (1997); Martin, E. R., Am. J. Hum. Genet., 67, 383-394 (2000)).
En los ultimos anos, los avances en el analisis del genoma han conducido al desarrollo de la toxicogenomica, que estudia la relacion entre genes y toxicidades, tales como el efecto de un farmaco sobre el citocromo P450 (CYP) (es decir, una enzima de metabolismo de farmacos). En concreto, los estudios de asociacion de antecedentes geneticos individuales y la sensibilidad/respuesta se han propuesto como una herramienta potente para acarar la causa de los efectos adversos. Cabe esperar que la denominada terapia adaptada se realice a traves de estos enfoques.
Documento no patente 1: Brookes, A. J., "The essence of SNPs," Gene, USA, (1999),234,177-186
Documento no patente 2: Cargill, M, y col., "Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes," Nature Genet., USA, (1999),22,231-238
Documento no patente 3: Evans, W. E., & Reiling, M. V., "Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics," Science, USA, (1999),286,487-491
Documento no patente 4: Stephens, J. C., et al., "Dating the origin of the CCRS-Delta32 AlDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes," Am. J. Hum. Genet., USA, (1998), 62,1507-1515
Documento no patente 5: Tishkoff, S. A., y col., "The accuracy of statistical methods for estimation of haplotype frequencies: an example from the CD4 locus," Am. J. Hum. Genet., USA, (2000), 67, 518-522
Divulgacion de la invencion
Problemas que ha de resolver la invencion
Un objetivo principal de la presente invencion es proporcionar medios para evaluar el riesgo de garnulocitopenia inducida por farmacos mediante el uso, como indice, de polimorfismos del gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana o medios para detectar los polimorfismos geneticos empleados como indice para el medio de evaluacion del riesgo. Medios para resolver los problemas
Con el fin de resolver los problemas mencionados anteriormente, en primer lugar, los presentes inventores han seleccionado, como genes para el analisis de los polimorfismos, 115 genes candidatos, incluidos los genes relacionados con las citocinas, genes de la region del MHC, genes relacionados con G-CSF, genes relacionados con el TNF-, genes relacionados con NF , genes relacionados con AMPc y genes relacionados con los canales de K, en los que se buscaron SNP en estos genes candidatos de la base de datos de polimorfismos de un solo nucleotido japoneses y se escogieron 188 SNP candidatos para analisis.
Posteriormente, los presentes inventores han determinado la frecuencia de esos SNP en el ADN genomico de las muestras de los siguientes dos grupos: un grupo de sujetos con granulocitopenia inducida por la administracion de un farmaco especifico y un grupo de sujetos sin granulocitopenia que han recibido el mismo farmaco. Como resultado, los presentes inventores han confirmado que los SNP con la diferencia mas estadisticamente significativa entre los dos grupos mencionados anteriormente estan presentes en el gen del sustrato 2 del receptor de insulina (J-SNP 10: lMS-JST040476) (en lo sucesivo se hara referencia al gen como "gen lRS-2").
Ademas, los presentes inventores han realizado amplios estudios sobre la relacion entre los polimorfismos en el gen lRS-2 humano y la granulocitopenia inducida por farmacos, y, como resultado, han confirmado que seis SNP del gen de lRS-2 humano estan estrechamente relacionados con la granulocitopenia inducida por la administracion del farmaco. Los presentes inventores han descubierto que el analisis de estos SNP especificados permite la evaluacion (diagnostico predictivo) del riesgo de efectos secundarios inducidos por farmacos para varias enfermedades humanas, en particular el riesgo de inicio de granulocitopenia inducida por farmacos. La presente invencion se ha conseguido sobre la base de este hallazgo.
La presente invencion proporciona un procedimiento para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos y un procedimiento de detectar marcadores de polimorfismos geneticos empleados como indice para la determinacion del riesgo mencionado anteriormente y describe oligonucleotidos y un kit empleado para estos procedimientos, que se resumen mas adelante en (1) a (19).
(1)
Un procedimiento para evaluar el riesgo de granulocitopenoa inducida por farmacos, en el que el procedimiento comprende detectar polimorfismos del gen lRS-2 humano de un sujeto y determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos del sujeto mediante el uso de los polimorfismos geneticos como indice.
(2)
Un procedimiento de detectar polimorfismos del gen lRS-2 humano de un sujeto para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, en el que el polimorfismo genetico se usa como indice.
(2)
Un procedimiento como se ha descrito en (1) anteriormente, en el que los polimorfismos geneticos se detectan mediante al menos una tecnica seleccionada del grupo que consiste en secuenciacion directa de nucleotidos, analisis de transferencia de puntos de oligonucleotidos especificos de alelo (ASO), polimorfismo de la longitud completa del fragmento sometido a PCR con enzimas de restriccion, ensayo invasor, PCR cuantitativa en peso real y un ensayo de polimorfismo genetico empleando un espectrometro de masas (ensayo de masas).
(3)
Un proceimiento de examen del riesgo de granulocitopenoa inducida por farmacos, que comprende detectar un polimorfismo del gen lRS-2 humano de un sujeto y llevar a cabo un examen usando los polimorfismos geneticos como indice del riesgo.
(4)
Un procedimiento como se ha descrito en cualquiera de (1) a (3) anteriormente, en el que la presencia de la granulocitopenoa inducida por farmacos se determina mediante el uso, como indice, de al menos un polimorfismo
genetico seleccionado del grupo constituido por los polimorfismos del gen lRS-2 humano descritos a continuacion en
(a)
a (f):
(a)
un polimorfismo que es conversion de C (Silvestre) en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion;
(b)
un polimorfismo que es una delecion de AT (Silvestre) en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion;
(c)
un polimorfismo que es conversion de A (Silvestre) en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion;
(d)
un polimorfismo que es conversion de A (Silvestre) en G en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion;
(e)
un polimorfismo que es la conversion de A (Silvestre) en G en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion; y (f) un polimorfismo que es un a delecion de C (silvestre) en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion.
(5)
Un procedimiento como se ha descrito en cualquiera de (1) a (4), en el que los polimorfismos geneticos se detectan mediante al menos una tecnica seleccionada del grupo constituido por secuenciacion directa de nucleotidos, analisis de transferencia puntual de oligonucleotidos especifico de alelos (ASO), ensayo de extension por cebadores de un solo nucleotido, analisis del polimorfismo de conformacion de una sola hebra-PCR, analisis de polimorfismo de linngitud del fragmento con enzimas de restriccion (RFLP)-PCR, ensayo lnvader, ensayo de PCR en tiempo real-cuantitativa y ensayo de polimorfismo genetico usando un espectrometro de masas (matriz de masas).
(6)
Un procedimiento como se ha descrito en (5) anteriormente, en el que los polimorfismos geneticos se detectan mediante secuenciacion nucleotidica directa.
(7)
Un procedimiento como se ha descrito en (5) anteriormente, en el que los polimorfismos geneticos se detectan mediante analisis del polimorfismo de longitud de fragmento (RFLP) de enzimas de restriccion-PCR.
(8)
Un procedimiento como se ha descrito en (7) anteriormente, en el que el analisis del polimorfismo de longitud de fragmento (RFLP) de enzimas de restriccion con PCR se realiza mediante el uso de la enzima de restriccion Afa l para detectar la conversion de A en G en la posicion 29.793 en 3' desde el codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano.
(9)
un oligonucleotido que puede hibridar con el gen lRS-2 humano y se emplea como cebador o sonda para la deteccion de polimorfismo genetico, seleccionandose el oligonucleotido del grupo que consiste en oligonucleotidos descritos mas adelante en de (a) a (f):
(a)
un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
(b)
un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
(c)
un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
(d)
un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en G en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
(e)
un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un sitio de polimorfismo genetico que es la conversion de A en G en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano; y
(f)
un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano
(10)
Un oligonucleotido que puede hibridar con el gen lRS-2 humano y se emplea como cebador o sonda para la deteccion de polimorfismo genetico, seleccionandose el oligonucleotido del grupo que consiste en oligonucleotidos descritos mas adelante en de (a) a (d) y (f):
(a)
un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 3;
(b)
un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 6;
(c)
un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 9;
(d)
un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 12; y
(f)
un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 17
(11)
Un kit para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, en el que el kit comprende un oligonucleotido como se describe en (9) anteriormente que sirve como cebador o sonda para detector un polimorfismo del gen lRS-2 humano.
(12)
Un kit como se ha descrito en (11) anteriormente, que comprende oligonucleotidos como se describe en (10) anteriormente.
(13)
Un kit como se ha descrito en (11) anteriormente, que comprende oligonucleotidos como se describe en (e) de
(9)
anterior y la enzima de restriccion Afa 1, empleandose el kit para detectar la conversion de A en G en la posicion
29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano.
(14)
Un procedimiento como se ha descrito en (1) anteriormente, que evalua el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos atribuida a la administracion de vesnarinona mediante el uso de oligonucleotidos como se describe en
(9)
o (10) anteriormente.
(15)
Un procedimiento como se ha descrito en (1) anteriormente, que evalua el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos atribuida a la administracion de vesnarinona mediante el uso de los oligonucleotidos como se describe en (1) de (9) anteriormente y la enzima de restriccion Afa l.
(16)
Un kit para detectar un polimorfismo del gen lRS-2 humano empleado para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, comprendiendo el kit oligonucleotidos como se ha descrito en (9) anteriormente como cebadores o sondas para detectar polimorfismos del gen lRS-2.
(17)
Un kit como se ha descrito en (16) anteriormente, que comprende oligonucleotidos como se describe en (10) anteriormente.
(18)
Un kit como se ha descrito en (16) anteriormente, que comprende los oligonucleotidos como se describe en (e) de (9) anteriormente y la enzima de restriccion Afa l, empleandose el kit para detectar la conversion de A en G en la posicion 29.793 en 3' desde el codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano.
(19)
Un procedimiento como se ha descrito en (2) anteriormente, que detecta un polimorfismo genetico empleado para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos atribuida a la administracion de vesnarinona mediante el uso de oligonucleotidos como se describe en (9) o (10) anteriormente.
(20)
Un procedimiento como se ha descrito en (2) anteriormente, que detecta un polimorfismo genetico empleado para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos atribuida a la administracion de vesnarinona mediante el uso de oligonucleotidos como se describe en (e) de (9) anteriormente y la enzima de restriccion Afa l.
(21)
Un procedimiento como se ha descrito en (3) anteriormente, en el que el examen se lleva a cabo sobre el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos atribuida a la administracion de vesnarinona mediante el uso de oligonucleotidos como se describe en (9) o (10) anteriormente.
(22)
Un procedimiento como se ha descrito en (3) anteriormente, en el que el examen se lleva a cabo sobre el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos atribuida a la administracion de vesnarinona mediante el uso de oligonucleotidos como se describe en (e) de (9) anteriormente y la enzima de restriccion Afa l.
Efectos de la invencion
De acuerdo con la invencion se proporcionan procedimientos para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano; un procedimiento de detectar un polimorfismo genetico empleado como indice para le avaluacion mencionada anteriormente; se describen kit para estos procedimientos; cebadores y sondas para la deteccion del polimorfismo, que se emplean en estos procedimientos; y un gen relacionado con un factor de riesgo para la granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano, particularmente util para examinar o evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano antes de la administracion de un farmaco que ha se ha notificado que induce granulocitopenia (incluida agranulocitosis). Estos son utiles para examinar o evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano, particularmente utiles para examinar o evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano antes de la administracion de un farmaco que ya se ha notificado que induce granulocitopenia (incluida agranulocitosis).
Breve descripcion de las figuras
[Fig. 1] Representacion esquematica que muestra la estructura del gen lRS-2 humano y las posiciones de los polimorfismos del gen.
Mejor modo para llevar a cabo la invencion
Como se usa en el presente documento, las abreviaturas de los aminoacidos, los peptidos, las secuencias de nucleotidos, los acidos nucleicos etc. se usan de conformidad con la nomenclatura de la lUPAC-lUB [lUPAC-lUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)], "Guideline for preparation of a specification, etc. including nucleotide sequences or amino acid sequences" (editado por la Oficina de patentes japonesa) y los simbolos de uso habitual usados en el campo.
Como se usa en el presente documento, la secuencia genomica del gen lRS-2 humano esta incluida en la secuencia comunicada por Mohammadi, M. en el Sanger Center (numero de registro en GenBank: AL162497), que tiene una longitud completa de 143.409 pb.
El gen lRS-2, cuya estructura se estima mediante la secuencia genomica sobre la base de los datos de secuencia de la secuencia del ARNm de lRS-2 obtenida en GenBank (numero de registro XM 007095) y los datos de la secuencia de AL162497 mencionados anteriormente, es 32.730 pb compuesta por dos exones y un intron. El gen lRS-2 corresponde a 96.673 a 126.402 pb en la secuencia de AL162497. La Fig. 1 muestra esquematicamente la estructura del gen lRS-2. En la Fig. 1. "Ej. 1" y Ej. 2" corresponde a los dos exones mencionados anteriormente. Las abreviaturas con flechas corresponden a las alteraciones descritas mas adelante (SNP). Es notable el hecho de que los SNP son sinonimos, es decir, los SNP no producen sustituciones de aminoacidos y, por tanto, la secuencia proteica no se va a cambiar. Los numeros de posicion de los SNP como se describe en la especificacion o la figura corresponden a los numeros de posicion que cuentan desde A a ATG que se usa como codon para Met en el extremo N de la proteina cuando el ARNm se traduce en proteina (codon de inicio de la traduccion).
conversion de C-4587A:C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
delecion de AT-2510:AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
conversion de A-1164C:A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano; conversion de A15870G:A en G en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano;
conversion de A29793G:A en G en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano; y delecion C31532del:C en la posicion 31.532 (en el ej. 2) desde el codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano.
Como se usa en el presente documento, el termino "gen" abarca ADN bicatenario, asi como ADN monocatenario (hebra sentido o hebra antisentido) que constituye el ADN monocatenario o ADN bicatenario. A menos que es especifique lo contrario, el gen (ADN) empleado en la presente invencion abarca ADN bicatenario, incluido ADN genomico humano, ADN monocatenario que incluye ADNc (hebra sentid), ADN monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la hebrea sentido, y fragmentos de los mismos. El gen mencionado anteriormente (ADN) puede incluir regiones reguladoras, regiones de codificacion, exones e intrones. El termino "polinucleotido" abarca ARN y ADN. El termino "ADN" abarca ADNc, ADN genomico y ADN. Sintetico. El termino "polipeptido" abarca sus fragmentos, homologos, derivados y mutantes. El termino "mutante" se refiere a un mutante del alelo natural, un mutante que se produce de forma no natural, un mutante obtenido mediante alteracion (delecion, sustitucion, adicion o insercion) y una secuencia de polinucleotidos que no cambia sustancialmente la funcion del polipeptido codificado por la secuencia de polinucleotidos. La alteracion de una secuencia de aminoacidos, que se puede producir de forma natural mediante, por ejemplo, mutacion o modificacion postraduccional, se puede realizar artificialmente introduciendo mutaciones en el gen.
Como se usa en el presente documento, el termino "SNP (polimorfismo de un solo nucleotido)" se refiere a la alteracion de un solo nucleotido en un gen o grupo de genes y "SNP" se refiere a la forma en plural. El termino "haplotipo" se refiere al tipo de marcador monocatenario mencionado anteriormente construido de multiples sitios polimorficos de una region genica continua o un grupo genico.
La presente invencion se ha realizado en base al hallazgo de que un(os) polimorfismo(s) que incluyen la alteracion en un sitio especifico del gen lRS-2 humano (la totalidad del gen lRS-2, incluida la region promotora implicada en la regulacion transcripcional), en particular el SNP o los SNP estan estrechamente correlacionados con la granulocitopenia inducida por farmacos y el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos se puede evaluar (prediagnostico) detectando los SNP como marcador de polimorfismo genetico en el sitio especifico. El procedimiento de evaluacion de la presente invencion implica la deteccion de un(os) polimorfismo(s) (es decir SNO) del gen lRS-2 humano de una muestra (derivada de un sujeto).
Los SNP detectados y analizados mediante el procedimiento de la presente invencion (es decir, alteraciones geneticas que sirven como indice para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos) incluyen seis polimorfismos mencionados anteriormente; es decir C-4587A, AT-2510del, A-1164C, A15870G, A29793G, and C31532del. Las posiciones de lo SNP en el gen lRS-2 como se muestran en la Fig. 1. Es notable que los numeros de posicion de los SNP corresponden a los numeros de posicion que cuentan desde A a ATG que se usa como codon para Met en el extremo N de la proteina cuando el ARNm se traduce en proteina (codon de inicio de la traduccion).
La presente invencion permite la deteccion de polimorfismos (SNP y haplotipo) del gen lRS-2 humano, que proporciona datos o medios utiles para aclarar y entender el mecanismo de la granulocitopenia inducida por farmacos en seres humanos y para el diagnostico y prevencion de la enfermedad. De acuerdo con la presente invencion, cuando se determina un sujeto que tiene el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos y se evita la administracion de un farmaco al sujeto, se puede prevenir la granulocitopenia inducida por farmacos. Ademas, cuando se realizan otros ensayos con frecuencia ademas de la presente invencion para monitorizar los efectos secundarios tras la administracion de un farmaco, se pueden tomar medidas eficaces contra dichos efectos secundarios.
El procedimiento de la presente invencion se describira con detalle a continuacion. En el procedimiento de la presente invencion se detectan los polimorfismos del gen lRS-2 humano y la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos se determina mediante el uso de polimorfismos geneticos como indice. La deteccion de los polimorfismos del gen lRS-2 humano se realiza mediante, por ejemplo, el procedimiento siguiente: Se prepara la secuencia genomica del gen lRS-2 humano de un sujeto, o su hebra complementaria, y, si se desea se determina la secuencia genomica o su hebra complementaria, seguido de la deteccion de os polimorfismos genicos.
Preparacion del gen lRS-2 humano que incluye SNP
El gen lRS-2 humano derivado de un sujeto se prepara como muestra para un analisis de ADN. Ejemplos especificos del gen que tiene polimorfismos (SNP) son como se ha descrito anteriormente. El gen lRS-2 humano abarca la hebra complementaria de ejemplo anterior de la secuencia de ADN del gen lRS-2 humano.
El gen lRS-2 humano, que tiene polimorfismos geneticos, o su hebra complementaria, se puede preparar facilmente mediante una tecnica de ingenieria genetica empleada habitualmente en base a los datos de secuencia especifica del gen lRS-2 humano, como se divulga en el presente documento [vease, por ejemplo, , Molecular Cloning 2a Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); o Zoku Seikagaku Jikken Koza "ldenshi Kenkyuho l, ll, lll" editado por The Japanese Biochemical Society (1986)] .
Especificamente, mediante un procedimiento conocido, se extrae el DNDC o ADN genomico de un sujeto (p, ej., un paciente con granulocitopenia inducida por farmacos que tiene SNP del gen lRS-2 human) y se selecciona un clon diana mediante un procedimiento habitual que emplea, or ejemplo, un anticuerpo, enzima de restriccion o sonda adecuado, que puede incluir un polimorfismo del gen lRS-2 humano [vease, por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78, 6613 (1981); o Science, 222, 778 (1983)], para preparar de este modo una secuencia genomica diana del gen lRS-2.
Ejemplos de la fuente del ADNc o ADN genomico mencionados anteriormente incluyen varias celulas y tejidos que tienen el gen lRS-2 que incluye SNP y celulas cultivadas derivadas del mismo. Otros ejemplos de la fuente incluyen fluidos corporales, como sangre (p. ej., suero o plasma), saliva, linfa, moco de las vias respiratorias, orina y semen. El material fuente mencionado anteriormente (que sirve como muestra) es, preferentemente, ADN o ADN genomico derivado de un sujeto humano antes de la administracion de un farmaco (en concreto, un farmaco que anteriormente se ha notificado que induce granulocitopenia). El aislamiento del ARN de dicho material fuente, el aislamiento y la purificacion del ARNm, la preparacion del ADNc, la clonacion del mismo, etc., se pueden llevar a cabo mediante un procedimiento habitual. En la presente invencion se pueden usar varias bibliotecas de ADNc disponibles comercialmente (p. ej., bibliotecas de ADNc disponibles en Clontech Lab. lnc.).
No reimpone ninguna limitacion concreta al procedimiento de deteccion selectiva de un gen diana de las bibliotecas de ADNc y la deteccion selectiva se puede realizar mediante un procedimiento habitual. Especificamente, se prepara una sonda que incluye un sitio polimorfico que puede unirse selectivamente a la secuencia de ADN de la secuencia diana alrededor de los SNP, e hibridacion de placas, hibridacion de colonias etc. Estos procedimientos se realizan por si solos o en combinacion mediante el uso de la sonda preparada de este modo.
Los cebadores empleados para la deteccion selectiva pueden ser un cebador directo o un cebador inverso disenados sobre la base de los datos de la secuencia de nucleotidos diana del gen lRS-2 humano. Dichos cebadores se pueden sintetizar mediante un procedimiento habitual mediante el uso de, por ejemplo, un aparato de sintesis adecuado. En general, la sonda para la deteccion selectiva es una sonda marcada. No obstante, la sonda para la deteccion selectiva puede ser una sonda sin marcar, siempre que se pueda unir especificamente a un reactivo marcado directa o indirectamente. El reactivo de marcaje y la tecnica de marcaje, tal como una sonda o ligando, ya se conocen en el campo. Ejemplos del reactivo de marcaje incluyen reactivos de marcaje radioactivo, biotina, pigmentos fluorescentes, reactivos quimioluminiscentes, enzimas (p. ej., luciferasa) y anticuerpos, que se pueden incorporar mediante una tecnica de marcaje conocida, como traduccion en muescas, cebado aleatorio o tratamiento con quinasa.
El ADN genomico o ARNm extraidos de este modo, incluido el gen lRS-2 humano, se puede amplificar a traves de un procedimiento de amplificacion genica. Esta amplificacion genica permite una deteccion precisa y mas facil mediante el procedimiento de deteccion de la presente invencion. Ejemplos del procedimiento de amplificacion genica incluyen PCR (Saiki, R. K., Bugawan, T L., y col., Nature, 324,163-166 (1986)), NASBA (Comptom, J., Nature, 650, 91-92 (1991)), TMA (Kacian, D. L., and Fultz, T J., patente de EE.UU. 5.399.491 (1995)), y SDA (Walker, G. T, Little, M. C., y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89, 392-396 (1992)).
Los fragmentos genicos amplificados por medio de, por ejemplo, PCR se pueden aislar y purificar mediante una tecnica frecuente, tal como electroforesis en gel. Como alternativa, la purificacion de dichos fragmentos genicos se puede realizar mediante el uso de una columna. La purificacion del fragmento genico se puede confirmar mediante, por ejemplo, espectrometria de masas. De acuerdo con las propiedades de los fragmentos genicos amplificados de este modo, los fragmentos genicos se aplican para la deteccion del gen lRS-2 humano (SNP) empleados en la presente invencion.
Deteccion de los polimorfismos del gen lRS-2 humano
En el procedimiento de la presente invencion, despues se detecta la presencia de un(os) polimorfismos de la muestra mencionada anteriormente. Especificamente, esta deteccion se puede realizar mediante, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos descritos mas adelante (1) a (8).
(1) Secuenciacion directa de nucleotidos
La deteccion del (los) polimorfismo(s) del gen lRS-2 se puede realizar mediante secuenciacion directa de los nucleotidos, que habitualmente se ha empleado para secuenciar dicho gen; por ejemplo, el procedimiento de didesoxi (Sanger, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)) o el metodo de Maxam-Gilbert [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]. La deteccion del polimorfismo genetico se puede realizar mediante una combinacion de dicho procedimiento de secuenciacion directa de los nucleotidos y un procedimiento de amplificacion de ADN (p. ej., PCR). En particular, se prefiere una combinacion de dicho procedimiento de secuenciacion directa de los nucleotidos y PCR o un procedimiento de amplificacion de ADN similar, ya que esta combinacion solo necesita una cantidad pequena de una muestra de ADN y permite la deteccion simple y sencilla con una sensibilidad y una precision altas.
Basicamente, este procedimiento preferido se puede realizar mediante, por ejemplo, el procedimiento siguientes: Un fragmento de gen amplificado por PCR o un producto purificado del mismo se clona en un plasmido, seguido de secuenciacion directa de nucleotidos mediante el procedimiento didesoxi, el metodo de Maxam-Gilbert o un procedimiento similar. Por comodidad, el procedimiento preferido se puede realizar mediante secuenciacion de nucleotidos mediante el uso de, por ejemplo, un kit de secuenciacion disponible comercialmente. Por tanto, se puede detectar la presencia de polimorfismos en los sitios especificos mencionados anteriormente del gen lRS-2 humano.
En el procedimiento mencionado anteriormente y en los procedimientos que se describen mas adelante, no se impone ninguna limitacion concreta al fragmento de ADN amplificados por PCR (es decir, la muestra), siempre que el fragmento de ADN incluya al menos uno de los sitios especificos mencionados anteriormente en los que cabe esperar que se produzcan polimorfismos. En general, el fragmento de ADN tiene una longitud de aproximadamente 50 a varios miles de pb, preferentemente de 50 a varios cientos de pb.
(2)
Procedimiento de transferencia puntual de oligonucleotidos especificos de alelo
Como alternativa, la deteccion del o los polimorfismos del gen lRS-2 se puede realizar mediante el procedimiento de transferencia puntual de oligonucleotidos especificos de alelo (ASO) Conner, B. J., y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S .A. , 80, 278-282 (1983)). Este procedimiento se puede realizar mediante, por ejemplo, analisis de transferencia puntual en el que el fragmento genico amplificado por PCR mediante el uso de un cebador directo o cebador inverso disenados para formar un sandwich con la diana, se hibrida con una sonda de oligonucleotidos especificos de alelo que contiene el sitio del SNP. Por tanto, se puede determinar la presencia de Ans en el fragmento genico.
(3)
Ensayo de extension del cebador nucleotidico sencillo
La deteccion del o los polimorfismos del gen lRS-2 se puede tambien realizar mediante un ensayo de extension de un solo nucleotido, tal como el ensayo SNaPshot, pirosecuenciacion o el ensayo de deteccion de mutacion puntual, una sonda disenada para corresponder a un nucleotide inmediatamente (o varios nucleotidos) antes de un polimorfismo Diana (SNP) (es decir, una sonda disenada de modo tal que el extreme 3' de la misma corresponde a uno (o varios nucleotidos en 5' del polimorfismo) se hibrida con una muestra de ADN. Cada uno de los ensayos mencionados anteriormente se puede realizar mediante el uso de un kit de deteccion de SNP disponibles comercialmente en el software del kit.
Por ejemplo, el ensayo SNaPshot se puede realizar mediante el uso del kit de extension de cebadores ABl PRlSM SNaPshot ddNTP. La deteccion de los SNP se puede realizar mediante fragmentos de deteccion y de fluorescencia generados tras la reaccion mediante el uso ABl PRlSM 31 0/377/31 00/3700 DNA Analyzer (PE Applied Biosystems) y el software.
La pirosecuenciacion se puede realizar mediante, por ejemplo, los procedimientos siguientes: Especificamente, el ADN genomico se aisla de, por ejemplo, una muestra de sangre a traves de un procedimiento habitual, varias decenas de varios cientos de nucleotidos (incluido un polimorfismo) se amplifican mediante PCR mediante el uso de un cebador marcado con biotina, el ADN monocatenario se purifica mediante el uso de perlas magneticas y el ADN purificado de este modo se emplea como muestra. Un cebador disenado para tener una secuencia complementaria correspondiente a varios nucleotidos en 5' de un polimorfismo diana se hibrida con la muestra y, despues, cada dNTP se anade a la mezcla uno tras otro de acuerdo con la secuencia en las proximidades de la entrada del polimorfismo en el software. El acido pirofosforico (PPi) liberado de la extension de nucleotidos de la ADN polimerasa se convierte en ATP mediante ATP sulfurilasa y la luciferasa genera luz detectable usando este ATP, que se puede detectar con un detector de quimioluminiscencia, una camara de CCD etc. Por tanto, se puede realizar el genotipado mediante analisis del pico de quimioluminiscencia obtenido mediante la adicion de los dNTP. Este procedimiento permite el genotipado en aproximadamente 15 minutos para 96 muestras.
El procedimiento mencionado anteriormente puede usar un reactivo y un aparato empleado generalmente. Ejemplos incluyen reactivos tales co o kit de reactivos para SNP disponibles comercialmente (Pirosecuenciacion AB) que contienen como componentes una mezcla de las cuatro enzimas siguientes: ADN polimerasa, ATP-sulfurilasa, luciferasa y apirasa, una solucion sustrato que contiene luciferina y APS (adenosina-5'-fosfosulfato) y dNTP que contienen dATP (desoxiadenosina-5'-trifosfato), dCTP, dGTP y dTlP; sistema PSQ96 para analisis automatico de la secuencia de ADN (Pirosecuenciacion AB); y el software SNP empleado para el analisis (Pirosecuenciacion AB).
Como alternativa, la pirosecuenciacion se puede realizar mediante, por ejemplo, el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. n° 6,159,693. Especificamente, un AND genomico aislando se amplifica; el producto de PCR amplificado de este modo se purifica y el producto resultante se hace reaccionar con acido pirofosforico mediante el uso de READlTp System (Promega Corporation), seguido del analisis de los datos resultantes.
(4)
Analisis del polimorfismo de conformacion monocatenario por PCR (SSCP)
El procedimiento de deteccion de la presente invencion puede emplear el procedimiento PCR-SSCP (Orita, M., lwahara, H., y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2776-2770 (1989)), en el que un producto amplificado por PCR (AND monocatenario) se somete a electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizado, y la presencia de polimorfismos de un solo nucleotido se determina en base a las diferencias de movilidad.
(5)
Analisis del polimorfismo de longitud de fragmento con enzimas de restriccion-PCR (RLFP)
En la presente invencion, en el caso en el que, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que incluye un polimorfismo, que estan dirigidos a la deteccion de SNP o haplotipos del gen lRS-2 humano, contiene un sitio de reconocimiento de encimas de restriccion, la deteccion se puede realizar mediante analisis del polimorfismo de longitud de fragmento con enzima de restriccion (analisis RFLP: Botstein, D. R., y col., Am. J. Hum. Gen., 32, 314331 (1980)).
Especificamente, por ejemplo, se emplea una enzima de restriccion que puede reconocer nucleotidos alrededor del polimorfismo, con el fin de detectar si el nucleotido en la posicion 29.793 es A (silvestre) o G (mutante), contandose la posicion desde el codon de inicio de la traduccion presente en el Ej. 2 de gen lRS-2 humano La enzima empleada en el analisis RFLP puede ser cualquier enzima de restriccion, siempre que la enzima pueda reconocer nucleotidos alrededor de los polimorfismos diana. Ejemplos especificos de la enzima de restriccion incluyen Afa l.
El analisis RFLP se realiza, mas preferentemente, como analisis PCR-RLFP; es decir, el analisis se realiza con una gran cantidad de ADN que se ha amplificado y preparado con antelacion mediante PCR o modificacion de la misma. Por tanto, se puede detectar la presencia de polimorfismos en base a la presencia de un sitio de escision especifico.
Mas especificamente, la deteccion de SNP del gen lRS-2 humano mediante PCR-RFLP se realiza mediante, por ejemplo, el procedimiento siguiente: En primer lugar, el ADN genomico del gen lRS-2 humano se extrae de una muestra biologica humana y un fragmento de ADN de la region que incluye un polimorfismo del gen se amplifica, de modo que se preparar una cantidad grande de una muestra de ADN. El cebador directo t/o cebador inverso que se van a emplear pueden ser un cebador cuta secuencia no es completamente identica a la secuencia genomica, siempre que sea un cebador que contiene una secuencia para introducir un sitio de reconocimiento para la enzima de restriccion. Posteriormente, la muestra de ADN amplificada anteriormente se digiere mediante el uso de una enzima de restriccion especifica (Es decir, una enzima que puede digerir un tipo silvestre o mutante) y patrones de escision de ADN (p. ej., la presencia de escision o la longitud de bases de los fragmentos escindidos) se confirman mediante un procedimiento habitual, tal como electroforesis en gel.
En el caso del polimorfismo (A29793G) del gen lRS-2 humano especificado por la presente invencion, que esta asociado con la granulocitopenia inducida por farmacos en el ser humano, el SNP genera un sitio de reconocimiento especifico (GTAC) de la enzima de restriccion Afa l en la region que incluye las posiciones 29.793 a 29.796 de la secuencia de nucleotidos del gen lRS-2 humano. Por tanto, este polimorfismo se puede detectar mediante el analisis RFLP.
(6) Ensayo lnvader
Tambien se puede realizar la deteccion de SNP del gen lRS-2 a traves del ensayo lnvader. El ensayo lnvader se puede realizar con referencia a las publicaciones siguientes.
. Lyamichev, V., y col., Nat. Bioltechnol., 17(3) 292-296 (1999); y
. Publicacion [de patente internacional WO 9823774 (publicacion de patente Kohyo japonesa n° 2001-526526).
El ensayo lnvader permite el analisis de los SNP de ADN genomico sin amplificacion del ADN diana. Por ejemplo, el ensayo lnvader se realiza del siguiente modo.
Con el fin de detectar la presencia de SNP diana del gen lRS-2 humano, primero se aisla el ADN genomico. Para realizar este ensato se prepararon dos oligonucleotidos mediante el uso de, por ejemplo, un aparato de sintesis de sintesis de ADN automatico. Un oligonucleotido, la sonda especifica del alelo, contiene la base complementaria del nucleotido de SNP que se va a analizar y se extiende en 5' del SNP. A esta sonda se anadieron en 5' los nucleotidos no complementarios adicionales, que estan compuestos por de 15 a 50 nucleotidos (ala 5'). El segundo oligonucleotido que tienen de 15 a varias decenas de nucleotidos, la sonda oligonucleotidica lnvader tiene una secuencia complementaria a la 3' del SNP y el extremo de la sonda es una base no apareada que se solapa con el nucleotido SNP que se va a analizar. Los dos oligonucleotidos y una enzima (es decir, Cleavase para el ensayo lnvader empleado en la presente invencion) se anaden al ADN genomico diana, que se extrae de lo descrito anteriormente. Esta enzima reconoce la estructura especifica compuesta por los dos oligonucleotidos y el ADN genomico diana. Esta mezcla de reaccion se hace reaccionar en las condiciones adecuadas. Cuando el ADN genomico de una muestra tiene un SNP diana, procede una primera reaccion; la enzima escinde el ala en 5'. Por otro lado, cuando el ADN genomico de una muestra no tiene un SNP diana, la enzima no lo escinde.
El ala en 5' liberada de la sonda especifica del alelo que la enzima ha escindido esta unida de forma complementaria a una sonda de transferencia de energia de resonancia de fluorescencia (FRET) que sirve como diana y el extremo 3' del ala en 5' esta invadida por la sonda FRET. De un modo similar al descrito anteriormente se produce la reaccion enzimatica (segunda reaccion) y se libera un pigmento fluorescente. La sonda FRET empleada en esta segunda reaccion se forma de un modo tal que no depende de una diana que se va a detectar y contiene los siguientes dos elementos esenciales:
(1)
una region en 3' que es complementara a un producto escindido a traves de la primera reaccion; y
(2)
una region autocomplementaria que forma un duplex para simular una sonda monocatenaria, que se hibrida con una diana y que contiene un pigmento fluorescente indicador y un pigmento fluorescente inactivador.
Cuando el pigmento fluorescente indicador y el pigmento fluorescente inactivador estan unidos a la misma sonda, la intensidad de fluorescencia del pigmento fluorescente indicador se inactiva mediante transferencia de energia de resonancia de fluorescencia. Mientras que el pigmento fluorescente indicador y el pigmento fluorescente inactivador no estan unidos a la misma sonda, la intensidad de fluorescencia del pigmento fluorescente indicador no se inactiva. Cuando el ala en 5' liberada de la primera sonda escindida se hibrida con la sonda FRET, el producto resultante actua como un oligonucleotido invasor en la segunda reaccion y se produce un complejo de invasion que es reconocido por la enzima. Por tanto, la escision de la sonda FRET por la enzima mencionada anteriormente separa los dos pigmentos fluorescente, de modo que da una senal fluorescente detectable. La senal se puede leer mediante el uso de, por ejemplo, un lector de placas de microtitulacion de fluorescencia estandar, de modo que se puede detectar la presencia de SNP diana. Una combinacion de las reacciones primera y segunda puede amplificar la senal por un factor de 1 x 106. El uso de dos sondas FRET que tienen pigmentos fluorescentes diferentes tambien permite la deteccion de la presencia de SNP.
(7)
Ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real
Tambien se puede realizar la deteccion de polimorfismos del gen lRS-2 a traves del ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real. Este ensayo se puede realizar mediante, por ejemplo, el procedimiento siguiente. Especificamente, en primer lugar, para confirmar la presencia de un polimorfismo se prepara un fragmento de ADN como cebador directo
o cebador inverso formado por, por ejemplo, de 15 a 39 nucleotidos. En este caso, el cebador directo o cebador inverso se prepara de modo que no contenga los polimorfismos. Posteriormente se prepara una sonda que tiene el pigmento fluorescente indicador y un pigmento fluorescente inactivador y la sonda contiene, por ejemplo, un oligonucleotido de 15 a 50 pb que corresponde a una secuencia parcial del fragmento amplificado. La secuencia de nucleotidos de la sonda se tiene que seleccionar de modo que no hibrida una region con tanto el cebador directo como el inverso. La sonda esta disenada de modo que tenga una secuencia complementaria a una secuencia especifica del alelo para detectar la presencia de un polimorfismo de un solo nucleotido diana. Mediante el uso de la sonda, un fragmento de ADN diana del gen lRS-2 de una muestra que se va a detectar se amplifica mediante PCR y fluorescencia a partir de la mezcla de reaccion resultante se mide en tiempo real. Por tanto, se puede detectar la presencia del polimorfismo. El uso de dos sondas que tengan dos pigmentos fluorescentes tambien permite la deteccion de ambos alelos.
El pigmento fluorescente indicador usado en el ensayo lnvader mencionado anteriormente o ensayo TaMan es, preferentemente, un pigmento fluorescente de fluoresceina como FM (6-carboxi-fluoresceina), mientras que el pigmento fluorescente inactivador es, preferentemente, un pigmento fluorescente de rodamina, tal como TAMRA (6carboxi-tetrametil-rodamina). Estos pigmentos fluorescentes se conocen y estan contenidos en los kit de deteccion de PCR en tiempo real disponibles comercialmente. En la presente invencion se puede usar dicho pigmento fluorescente disponible comercialmente. No se impone ninguna limitacion concreta en la posicion de union del pigmento fluorescente indicador ni del pigmento fluorescente inactivador, pero, en general, el pigmento fluorescente indicador esta unido a un extremo (preferentemente el extremo 5') del nucleotido que constituye la sonda y el pigmento fluorescente inactivador esta unido al otro extremo. El procedimiento para unir un pigmento fluorescente a un oligonucleotido se conoce y se describe en, por ejemplo, Noble, y col., (1984), Nuc. Acids Res., 12: 3387-3403 o lyer, y col., (1990), J. Am. Chem. Soc., 112: 1253-1254.
El ensayo TaqMan per se es conocido y los aparatos y kit para el ensayo TaqMan estan disponibles comercialmente. En la presente invencion se puede usar dicho aparatos o kit disponible comercialmente. Por ejemplo, el ensayo TaqMan se puede realizar de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente japonesa n°
2.285.976 o de acuerdo con el manual de usuario del sistema de secuenciacion ABl PRlSM 7700 (PE Applied Biosystems).
(8)
Ensayo de polimorfismo genetico usando un espectrometro de masas (matriz de masas)
El ensayo de matriz de masas detecta la diferencia en el peso molecular entre polimorfismos. Especificamente, una region que incluye un polimorfismo que se va a detectar se amplifica mediante PCR y, despues, se hibrida un cebador de extension con una secuencia inmediatamente antes de la posicion del SNP, seguido de una reaccion de extension mediante el uso de una mezcla de reaccion que contiene una mezcla de ddNTP/dNTP (p. ej., una mezcla de reaccion que contiene ddATP, dCTP, dGTP, y dTlP), de modo que da un fragmento que tiene una longitud dependiendo del tipo de SNP. El fragmento resultante se purifica y despues se somete a analisis mediante el uso de, por ejemplo, espectrometro de masas MALDl-TOFF, de modo que la relacion entre el peso molecular y el polimorfismo genetico se pueda analizar (Pusch, W., Wurmbach, JH., Thiele, H., Kostrzewa, M., MALDl-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping, Pharmacogenomics, 3 (4): 537-48 (2002)). Este ensayo se puede realizar facilmente mediante el uso de, por ejemplo, el sistema de analisis de SNP de alto rendimiento Sequenom Mass ARRAY (http://www.sequenom.com/ Files/applications/hme assay.html).
(9)
Otros procedimientos de deteccion
La deteccion de lo SNP del gen lRS-2 tambien se puede realizar mediante, por ejemplo, cualquiera de los diversos procedimientos descritos mas adelante que convencionalmente se han conocido como procedimientos de secuenciacion de ADN o procedimientos de deteccion de mutaciones.
(a)
Procedimiento PCR-SSO que usa oligonucleotido especifico de secuencia
Un procedimiento en el que una sonda para una mutacion se inmoviliza en un transportador; una muestra (producto amplificado genico) se hibrida con la sonda; y una diferencia en la eficiencia de hibridacion se determina en base a la presencia de apareamiento erroneo.
(b)
Procedimiento PCR-SSP para la deteccion de mutaciones puntuales
Un procedimiento mediante el uso de un cebador especifico de secuencia para amplificacion genica que esta disenado de un modo tal que un nucleotido correspondiente a una mutacion puntual se convierte en el nucleotido en el extremo 3', en el que el procedimiento usa que se produce una diferencia significativa en la eficiencia de la amplificacion por PCR en funcion del nucleotido en el extremo 3' del cebador.
(c)
PCR-DGGE (electroforesis en gel en gradiente de desnaturalizacion)
Cuando un fragmento de ADN que incluye una mutacion hibrida con un fragmento de ADN normal y, despues, el producto hibridado de este modo se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida con un desnaturalizante (p. ej., urea o formamida) a concentraciones gradualmente crecientes, el producto se convierte en fragmentos de ADN monocatenarios en una posicion de concentracion menor del desnaturalizante en comparacion con el caso de los fragmentos de ADN bicatenario homogeneo sin apareamiento erroneo. Los fragmentos de ADN monocatenario migran a una velocidad mas alta que la velocidad de migracion de los -fragmentos de ADN bicatenario y, por tano, se puede detector una mutacion en un solo nucleotide mediante comparacion de las movilidades de los fragmentos de ADN.
(d)
Procedimiento de pinzamiento PCR-DGGE/GC (Shefield, V. C., et al., Proc. Natl. Acad. ScL, U.S.A., 86, 232-236 (1989)).
Este procedimiento es una modificacion de la PCR-DGGE mencionada anteriormente en el que la region que tiene un contenido en GC alto se anade a un fragmento de ADN diana para la deteccion de una mutacion. Este procedimiento compensa la desventaja de la PCR-DGGE en la deteccion de sustitucion, delecion, adicion o insercion de multiples nucleotidos. Este procedimiento requiere una etapa de anadir una pinza de GC a un fragmento de ADN diana para la deteccion de mutacion.
(e)
Ensayo de proteccion con ARNasa (Finkelstein, J., y col., Genomics, 7, 167-172 (1990))
(f)
RT-PCR in situ (Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993))
(g)
Hibridacion in situ
(h)
Transferencia de tipo Southern (Sambrook, J., y col., Molecular Cloning a Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press: NY. (1989))
(i)Ensayo de hibridacion de punto (vease, por ejemplo, Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503-517 (1975))
(j)
Hibridacion de fluorescencia (FlSH: Takahashi, E., y col., Hum. Genet., 86, 1416 (1990))
(k)
Hibridacion genomica comparativa (CGH: Kallioneimi, A., y col., Science, 258, 818-821 (1992)), (Spectral karyotyping: SKY: Rowley, J. D., y col., Blood, 93, 2038-2042 (1999))
(l)
Procedimiento que usa un clon del vector del cromosoma artifical de levadura (YAC)como sonda (Lengauer, C., y col., Cancer Res., 52, 2590-2596 (1992)).
Por tanto, se pueden detectar los polimorfismos (SNP) o el haplotipo del gen lRS-2 humano.
De acuerdo con la presente invencion, cuando se confirma que una muestra de prueba tiene un polimorfismo(s) del gen lRS-2 mediante procedimientos de deteccion descritos anteriormente, se considera la muestra como sujeto con un alto riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos.
Por tanto, antes de administrar un farmaco, se determina si el sujeto tiene un riesgo alto de granulocitopenia inducida por farmacos Por tanto, la granulocitopenia atribuida a la administracion de farmacos o a otras causas se podra evitar mediante esta prueba.
Particularmente, la deteccion de SNP del gen lRS-2 humano de acuerdo con la presente invencion es eficaz en la deteccion de la presencia de un factor de riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano. Es decir, la deteccion selectiva de los SNP permite la deteccion de un factor de riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano. Por tanto, la presente invencion proporciona un procedimiento de detectar un polimorfismo(s) del gen lRS-2 humano de un sujeto que puede desarrollar granulocitopenia inducida por farmacos. Es decir, el(los) polimorfismo(s) geneticos del gen lRS-2 humano se puede usar como indice para detectar un sujeto que desarrolla granulocitopenia inducida por farmacos.
Oligonucleotido
La presennte invencion tambien proporciona un oligonucleotido que sirve como cebador o sonda para la deteccion de polimorfismo genetico, que se usa en el procedimiento de evaluacion (deteccion) de la presente invencion usando PCR. No se impone ninguna limitacion concreta sobre el oligonucleotido, siempre que se pueda amplificar especificamente una region especifica que incluya polimorfismos (SNP) del gen lRS-2 humano. El oligonucleotido se puede construir adecuadamente en base a los datos de la secuencia del gen lRS-2 humano y sintetizarse mediante procedimientos frecuentes.
Mas especificamente, el oligonucleotido se puede sintetizar mediante un procedimiento de sintesis quimica usado generalmente, tal como el procedimiento de fosforoamidita o el procedimiento de fosfotriester, o se puede sintetizar mediante el uso de un aparato automatico de sintesis de oligonucleotidos disponible comercialmente, tal como Pharmacia LKB Gene Assembler Plus (producto de Pharmacia). Un fragmento bicatenario se puede obtener hibridando un oligonucleotido monocatenario sintetizado quimicamente y su hebra complementaria en las condiciones adecuadas, o sintetizarse usando un cebador adecuado y la ADN polimerasa.
Ejemplos preferidos del oligonucleotido mencionado anteriormente que sirve como sonda o cebador incluyen oligonucleotidos parciales correspondientes a un fragmento de ADN disenado para contener un polimorfismo del gen lRS-2 humano. Estos oligonucleotidos tienen al menos una secuenciad de 10 bases (en general, aproximadamente de 10 a 35 secuencia de bases). El oligonucleotido como par de cebadores puede ser oligonucleotidos que tienen dos secuencias que estan disenadas y sintetizadas para formar un sandwich de SNP del gen lRS-2 humano (secuencia genomica). El oligonucleotido que sirve como sonda puede ser su clon positivo per se.
Ejemplos preferidos del oligonucleotido mencionado anteriormente que sirve como sonda o cebador incluyen secuencias parciales correspondientes a un fragmento de ADN disenado para contener al menos uno de los siguientes polimorfismos: Conversion de C an A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano (C-4587A) ; delecion de AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano (AT-251 Odel) ; conversion de A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano (A-1164C) ; conversion de A en G en la posicion 15. 870 del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano (A15870G); conversion de A en G en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano (A29793G); y delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano (C31532del). Este cebador o sonda tiene al menos una secuencia de 10 bases (preferentemente al menos una secuencia de 15 bases).
Ejemplos especificos del oligonucleotido incluye cebadores directos y cebadores inversos de las SEC lD N° 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 y 13 a 16, y cebadores oligonucleotidicos para secuenciacion directa de las SEC lD N° 3, 6, 9, 12 y 7, que se describen mas adelante en los Ejemplos.
No se impone una limitacion concreta en la sonda especifica del gen empleada en la presente invencion, siempre que se pueda detectar cualquiera de los C-4587A, AT-251 Odel, A-1164C, A15870G, A29793G, y C31532del mencionados anteriormente.
Kit de evaluacion
El procedimiento de evaluacion (deteccion) de la presente invencion puede realizarse mas facilmente mediante el uso de un kit de reactivos para detectar SNP del gen lRS-2 humano de una muestra. La presente invencion tambien proporciona un kit para dicha evaluacion
Un kit de la presente invencion incluye, como componente esencial, al menos un fragmento de ADN que hibrida con una secuencia nucleotidica parcial o completa o sus secuencias complementarias, incluidos seis SNP del gen lRS-2
o que hibrida con una secuencia que contiene un oligonucleotido con una base o varias bases antes de un sitio polimorfico. Otro kit incluye, como componente esencial, una enzima de restriccion (p. ej., Afa l) que reconoce especificamente una secuencia formada de varios nucleotidos (incluido el sitio polimorfico mencionado anteriormente).
Otros componentes del kit de la presente invencion son, por ejemplo, un reactivo de marcaje, y reactivos requeridos para PCR (p. ej., ADN polimerasa Taq, desoxinucleotido trifosfato o un cebador para amplificacion de ADN). Ejemplos del reactivo de marcaje incluye sustancias de modificacion quimica, tales como un isotopo radioactivo, una sustancia emisora de luz y una sustancia fluorescente. El fragmento de ADN per se puede conjugar con antelacion con dicho reactivo de marcaje. Elo kit puede incluir ademas, por ejemplo, diluyentes de reaccion adecuados, anticuerpos estandar, tampones, detergentes o soluciones de deteccion de la reaccion, para realizar la medida de forma conveniente.
El uso del procedimiento de evaluacion mencionado anteriormente de la presente invencion permite la provision de un procedimiento de exploracion del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos mediante el uso, como indice, de un polimorfismo genetico detectado que puede producir granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano, particularmente un procedimiento de exploracion del riesgo de granulocitopenia atribuida a la administracion de un farmaco (p. ej., vesnarinona) que ya se ha notificado que induce granulocitopenia (incluida agranulocitosis) antes de la administracion del farmaco, asi como un reactivo diagnostico y un kit diagnostico empleados para dicho procedimiento de exploracion.
La presente invencion se describira a continuacion con detalle mediante Ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes de la invencion.
Ejemplo 1
Ejemplo 1
(a)
Deteccion selectiva de polimorfismo genetico en relacion con granulocitopenia atribuida a la administracion de farmacos
Con el fin de encontrar polimorfismos geneticos en relacion con la granulocitopenia atribuida a la administracion de farmacos se usaron sujetos que habian recibido vesnarinona (3,4-dihidro-6-[4-(3,4-dimetoxibenzoil)-1-piperazinil]-2(1 H) -quinolina). En Japon, se ha notificado que la vesnarinona, que es un farmaco disponible comercialmente aplicable a la insuficiencia cardiaca cronica (insuficiencia cardiaca de leve a moderada) induce efectos secundarios, incluidos leucopenia, granulocitopenia y agranulocitosis, y, por tanto, la administracion de este farmaco requiere observacion de dichos efectos secundarios y analisis frecuentes de los granulocitos. Entre los sujetos que habian recibido vesnarinona, habian acordado oralmente colaborar en la investigacion de la causa de la granulocitopenia inducida por vesnarinona entre mayo de 1991 y octubre de 1996 y habian aceptado proporcionar una muestra de sangre, se usaron 85 sujetos (proporcion varones/mujeres= 1,21: 1) que habian acordado de nuevo por escrito colaborar en el analisis genetico de acuerdo con las guias eticas entre julio de 2001 y diciembre de 2001. El ADN genomico se extrajo de una muestra de sangre (o una muestra celular derivada de la misma) de cada uno de los sujetos que de nuevo habian aceptado como se ha descrito antes mediante un procedimiento habitual y se uso para las pruebas descritas mas adelante.
(b)
Criterios de clasificacion de los sujetos
En base a los criterios que se describen mas adelante, los sujetos se clasificaron en los dos grupos siguientes: Un grupo de sujetos con granulocitopenia y un grupo de sujetos sin granulocitopenia. Entre los sujetos, los sujetos que tenian leucocitos o neutrofilos que habian disminuido a la mitad o menos tras la administracion de vesnarinona y que tienen el numero de leucocitos de 2.000/mm3 o menor, o el numero de neutrofilos de 1.000/mm3 o menor, se clasificaron como "sujetos con granulocitopenia". Por otro lado, los sujetos en los que no habia disminuido el numero de neutrofilos tras la administracion de vesnarinona durante 90 dias o mas se clasificaron como "sujetos con granulocitopenia" Cada uno de estos grupos se clasifico ademas en dos grupos de acuerdo con el sexo para pasar, de este modo, a cuatro subgrupos; es decir, un grupo de 13 varones con granulocitopenia (grupo A), un grupo de 17 mujeres con granulocitopenia (grupo B), un grupo de 33 varones sin granulocitopenia (grupo C) y un grupo de 21 mujeres sin granulocitopenia (grupo D).
(c)
Gen y polimorfismo (SNP) que se va a analizar
115 genes candidatos se seleccionaron de entre, por ejemplo, genes relacionados con citocinas, genes de la region del MHC, genes relacionados con G-CSF, genes relacionados con TNF-, genes relacionados con NF-, genes relacionados con AMPc y genes relacionados con los canales de potasio. Los polimorfismos (SNP) de estos genes candidatos se buscaron en la base de datos de polimorfismos de un solo nucleotido japoneses (JSNP: http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/indexja.html), y se seleccionaron 188 SNP candidatos.
(d)
Procedimiento de analisis
Los SNP se analizaron mediante el ensayo lnvader. El ensayo lnvader se realizo con referencia a las publicaciones
(1)
y (2) siguientes:
(1) Lyamichev, V., y col., Nat. Biotechnol., 17: 292-296 (1999); y
(2)Publicacion de patente internacional WO 9823774 (98/6/4).
Con el fin de amplificar las regiones de ADN genomico que incluyen cada uno de los SNP candidatos mediante PCR se diseno un conjunto de cebadores para amplificar estas regiones en base a los datos de secuencia del ADN genomico alrededor de los SNP que se han buscado en la JSNP y se sintetizo cada uno de los cebadores.
Un reactivo de ensayo lnvader para determinar los genotipos de los SNP candidatos se preparo mediante un procedimiento habitual en base a los datos de secuencia del ADN genomico alrededor de los SNP que se han buscado en la JSNP.
Cada PCR se realizo mediante el uso de ADN genomico (1 ng) como molde. Una mezcla de reaccion (15 1l ) contenia dNTP (0,25 mM), el tampon de PCR unido a TaKaRa Ex Taq (Takara) (1/10 de la cantidad total para reaccion), un conjunto de un cebador directo y uno inverso (130 nM cada uno) y TaKaRa Ex Taq (Takara) (0,5 U). Cada muestra se amplifico en DNA Engine PTC-0200 (MJ Research) La PCR se realizo a 94 °C durante2 minutos, despues 50 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 56 °C (0 58 °C o 60 °C) durante 30 segundos y 72 °C durante 90 segundos.
La reaccion del ensayo lnvader se llevo a cabo mezclando el reactivo del ensayo lnvader con el producto de la PCR que se diluyo con un intervalo de 10 a 1.000 veces. Una mezcla de reaccion (15 1l) contenia 5,5 x tampon de lnvader (2,75 1l ), 10 x Bioplex FRET Probe Mix (0,75 1l ), enzima Cleavase Vlll (200 ng/ 1l) (1 1l ), PPl Mix (3 1l),
y el producto de la PCR diluido descrito anteriormente (7,5 1l). La reaccion se realizo a 62 °C durante de 60 a 120 minutos.
(e)
Procedimiento de determinacion del genotipo
El genotipo de cada sujeto se determino en base a las intensidades de dos materiales fluorescentes diferentes detectados como resultado de la reaccion del ensayo lnvader. Por tanto, los genotipos de los 188 SNP localizados en los 115 genes de cada sujeto se determinaron mediante el ensayo lnvader.
(f)
Procedimiento de analisis estadistico
Las frecuencias de los alelos en el grupo de sujetos con granulocitopenia se compararon con las de los sujetos sin granulocitopenia mediante la prueba de cuadrado de contingencia. El cociente de posibilidades se estimo mediante el metodo de Brown (Brown, C. C., Am. J. Epidemiol, 113: 474-480 (1981 )). El intervalo de confianza del 95 % del cociente de posibilidades se calculo mediante el metodo de Woolf.
(g)
Resultados
Los resultados del analisis de los 188 SNP en los 115 genes mediante el procedimiento mencionado anteriormente revelaron que el polimorfismo con la asociacion mas estadisticamente significativa se localizo en el gen del sustrato 2 del receptor de insulina (lRS-2) (JSNP 10: lMS-JST040476). En estos sujetos, este SNP estaba en el equilibrio de Hardy-Weinberg. El resultado sugiere que el SNP en el gen lRS-2 humano esta estrechamente relacionado con la granulocitopenia atribuida a la administracion de vesnarinona y que el gen lRS-2 humano es probable que desempene un papel importante en la patogenia de la granulocitopenia. La proteina del lRS-2 humano (producto de la traduccion del gen lRS-2 humano) pertenece a la familia de proteinas del sustrato del receptor de insulina (lRS: lRS-1, lRS-2, lRS-3, y lRS-4). Las lRS son activadas por la tirosina quinasa del receptor de insulina que fosforila residuos de tirosina de lRS. Como se sabe, las lRS-fosforiladas estan relacionadas con la accion de la insulina que es estimular la captacion de glucosa mediante aceleracion de la translocacion del transportador de glucosa 4 (GLUT4) desde el citoplasma a la membrana celular mediante Pl-3 quinasa activada por las lRS fosforiladas. Con el fin de realizar estudios adicionales sobre la relacion entre el gen de lRS-2 humana y la granulocitopenia inducida por vesnarinona se analizaron otros polimorfismos del gen lRS-2 humano.
Ejemplo 2 Analisis de asociacion del gen lRS-2 humano y granulocitopenia inducida por farmacos
Mediante el uso de los sujetos descritos en el Ejemplo 1 se analizaron los polimorfismos del gen lRS-2 humano del siguiente modo.
(a) Descubrimiento de polimorfismos en el gen lRS-2 humano
Con el fin de seleccionar la totalidad del gen lRS-2 que incluye una region promotora implicada en su regulacion transcripcional, la secuencia genomica que incluye el gen lRS-2 se obtuvo en GenBank (numero de registro AL 162497, longitud completa: 143.409 pb) buscando la secuencia de ARNm de lRS-2, que esta registrada en GenBank (numero de registro XM 007095). La estructura del gen lRS-2 humano se estimo mediante comparacion detallada entre la secuencia de ARNm de lRS-2 y la secuencia genomica que incluye el gen lRS-2. Cabe destacar que se uso una hebra complementaria de la secuencia genomica obtenida anteriormente para la comparacion, de modo que las secuencias comparadas anteriormente estaban en la misma direccion (de 5' a 3'). Del resultado se deduce que el gen lRS-2 humano tiene una longitud completa de 32.730 pb, incluidos dos exones y un intron. En base a los datos de secuencia anteriores se disenaron y sintetizaron los cebadores. Para el descubrimiento del polimorfismo se usaron muestras genomicas de 12 sujetos con granulocitopenia y 12 sujetos sin granulocitopenia entre los sujetos descritos en el Ejemplo 1.
Cada PCR se realizo mediante el uso de ADN genomico (5 ng). Se preparo una mezcla de reaccion (10 1l ) que contuviera dNTP (1,25 mM), cloruro de magnesio (3,9 Mm), sulfato amonico amoniaco (16,6 mM),Tris-HCl (67 mM, pH 8,8), -mercaptoetanol (10 mM), un conjunto de un cebador directo y un cebador inverso (1,25 mM),y TaKaRa Ex Taq (Takara) (0,5 U). Si se desea, se anadio a la reaccion DMSO (dimetilsulfoxido) a la mezcla de reaccion de modo que la concentracion final fuera del 10%. Cada muestra se amplifico mediante el uso de DNA Engine PTC-0200 (MJ Research) o GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems). La PCR se realizo a 95 °C durante2 minutos, despues 37 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 56 °C (0 58 °C o 60 °C) durante 30 segundos y 72 °C durante 3 minutos con extension final a 72 °C durante 7 minutos.
Cada producto de la PCR se empleo para reaccionar con BigDyep Terminator RR mix (PE Applied Biosystems). En base a los datos de la secuencia de nucleotidos obtenida mediante ABl Prism 3700 DNA Analyzer (PE Applied Biosystems), se detectaron los polimorfismos geneticos y sus posiciones en el gen lRS-2 humano se confirmaron mediante el uso de SEQUENCHER 3.1 (producto de Gene Codes).
(b)
Procedimiento de determinacion del genotipo y amplificacion de la muestra
Con el fin de determinar la distribucion del genotipo, todos los polimorfismos identificados mediante el descubrimiento anterior se analizaron en todos los sujetos descritos en el Ejemplo 1 amplificando las regiones que contienen los polimorfismos con los conjuntos de cebadores y secuenciando los productos de la PCR en las condiciones descritas anteriormente.
(c)
Analisis estadistico
Ademas de los procedimientos estadisticos usados en el Ejemplo 1, se calculo un coeficiente de desequlibrio de union pareada (D' = D/Dmax o D/Dmin) mediante el uso del metodo de Thompson, y col. (Thompson, E.A., y col., Am. J. Hum. Genet. 42: 113-124 (1988))
(d)
Resultados
Los resultados del analisis revelaron que, en los grupos de los sujetos, todos los polimorfismos analizados en el presente Ejemplo estan en equilibrio de Hardy-Weinberg.
. Los resultados del analisis tambien revelaron que seis polimorfismos estaban estrechamente asociados con la granulocitopenia inducida mediante la administracion de vesnarinona. Las tablas 1 a 6 muestran los resultados del analisis estadistico en los seis polimorfismos respectivamente.
[Tabla 1]
Polimorfismo El numero del genotipo
Sujetos con agranulocitosis N (%) Sujetos sin agranulocitosis N (%) 2 (df= 1) P OR (lC del 95 %)
C-4587A CC CA+AA Total
7 (25,0) 21 (75,0) 28 29 (59,2) 20 (40,8) 49 8,36 0,0038 4,35 (1,56-12,16)
[Tabla 2]
Polimorfismo El numero del genotipo
Sujetos con agranulocitosis N (%) Sujetos sin agranulocitosis N (%) 2 (df= 1) P OR (lC del 95 %)
AT-2510del AT ATdel+del Total
7 (24,1) 22 (75,9) 29 28 (57,1) 21 (42,9) 49 8,02 0,0046 4,19 (1,51-11,64)
[Tabla 3]
Polimorfismo El numero del genotipo
Sujetos con agranulocitosis N (%) Sujetos sin agranulocitosis N (%) 2 (df= 1)2 P OR (lC del 95 %)
A-1164C AA AC+CC Total
8 (26,7) 22 (73,3) 30 29 (59,2) 20 (40,8) 49 7,9 0,0049 3,99(1,48 -10,73)
[Tabla 4] [Tabla 5]
Polimorfismo El numero del genotipo
Sujetos con agranulocitosis N (%) Sujetos sin agranulocitosis N (%) 2 (df= 1) P OR (lC del 95 %)
A15870G AA AG+GG Total
10 (37,0) 17 (63,0) 27 36 (73,5) 13 (26,5) 49 9,67 0,0019 4,71(1,72 - 12,88)
Polimorfismo El numero del genotipo
Sujetos con agranulocitosis N (%) Sujetos sin agranulocitosis N (%) 2 (df= 1) P OR (lC del 95 %)
A29793G AA AG+GG Total
11 (36,7) 19 (63,3) 30 39 (73,6) 14 (26,4) 53 10,9 0,00096 4,81 (1,84-12,56)
[Tabla 6]
Polimorfismo El numero del genotipo
Sujetos con agranulocitosis N (%) Sujetos sin agranulocitosis N (%) 2 (df= 1) P OR (lC del 95 %)
C31532del CC Cdel+del Total
9 (33,3) 18 (66,7) 27 34 (70,8) 14 (29,2) 48 9,93 0,0016 4,86 (1,76 -13,39)
5 En las Tablas, un polimorfismo con el simbolo "del" corresponde a un polimorfismo de delecion y el numero de posicion de cada " polimorfismo" corresponde al numero de posicion que cuenta desde A (numero de posicion: +1) de ATG (codon de inicio de la traduccion) del gen lRS-2. Un polimorfismo mostrado por el numero de posicion con el simbolo "-" se localiza en 5' de A de ATG (codon de inicio de la traduccion) del gen lRS-2.
Como se muestra en las Tablas 1 a 6, un sujeto que tenga al menos uno de estos seis polimorfismos ha mostrado la
10 asociacion con la granulocitopenia por administracion de vesnarinona. En otras palabras, estos resultados sugieren que uno de estos polimorfismos, C-4587A", que es un polimorfismo obtenido mediante la conversion de C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 humano; "AT-2510del", que es un polimorfismo obtenido mediante la delecion de AT en la posicion 2510 en 5' del codon de inicio de la traduccion de la region de codificacion; "A-1164C", que es un polimorfismo obtenido mediante la conversion de A a C en la posicion
15 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion de la region de codificacion; "A15870G", que es un polimorfismo obtenido mediante la conversion de A en G en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion de la region de codificacion; "A29793G", que es un polimorfismo obtenido mediante la conversion de A en G en la posicion
29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion de la region de codificacion; y "C31532del", que es un polimorfismo obtenido mediante la delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion de la region de
20 codificacion, esta asociado con granulocitopenia por la administracion de vesnarinona. La Fig. 1 muestra las posiciones de estos seis polimorfismos en el gen lRS-2 humano. En la Fig. 1, "+1" corresponde a A de ATG (codon de inicio de la traduccion). La Tabla 7 muestra los resultados del analisis del desequilibrio de union entre estos polimorfismos.
[Tabla 7]
SNP
D'
C-4587A
AT-251 Ode 1 0' A-1164C A15870G A29793G
AT-251 Odel
1,000 - - - -
A-1164C
1,000 1,000 - - -
A15870G
1,000 1,000 1,000 - -
A29793G
0,956 0,956 0,957 1,000 -
C31532del
0,952 0,953 0,953 1,000 1,000
Como queda claro en la Tabla 7, todos los polimorfismos, que estan estrechamente asociados con granulocitopenia por administracion de vesnarinona, estan en desequilibrio de union casi completo. Especificamente, cuando el alelo en la posicion 4587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen lRS-2 es A (tipo mutante), cada uno de los
5 polimorfismos en los otros cinco sitios polimorficos tiene el genotipo que muestra asociacion con granulocitopenia por administracion de vesnarinona. Los resultados sugieren fuertemente que estos seis polimorfismos del gen lRS-2 humano desempenan un papel importante en la granulocitopenia por administracion de vesnarinona.
Recientemente se ha notificado que cuando las celulas HL-60 (mieloblastos) se diferencian en granulocitos mediante estimulacion con DMSO, la cantidad de proteina lRS-2 aumenta (Schacher, D. H., y col., J. lmmunol., 164:
10 113-120 (2000)). Este informe sugiere que lRS-2 esta estrechamente asociado con la diferenciacion granulocitica. Entre los polimorfismos del gen lRS-2 analizados o identificados por los presentes inventores, tres polimorfismos (C4587A, AT-251 Odel, and A-1164C) se localizan en la region promotora, que regula la transcripcion del gen lRS-2 humano. Por tanto, puede indicarse que los niveles de transcripcion del gen lRS-2 son reducidos por estos polimorfismos localizados en la region promotora, de modo que tambien se reduce la diferenciacion en granulocitos.
15 Ejemplo 3
Este ejemplo esta relacionado con otros procedimientos para detectar los seis polimorfismos del gen lRS-2 humano de la presente invencion. En este ejemplo, estos polimorfismos se detectaron mediante los procedimientos descritos mas adelante (a) y (b).
(a) Secuenciacion directa
20 Los fragmentos de ADN se amplificaron mediante el uso de cebadores directos (SEC lD N° 1, 4, 7, 10, 13, y 15) y cebadores inversos (SEC lD N° 2, 5, 8, 11, 14 y 16) descritos en la Tabla 8, de modo que estos productos amplificados por PCR incluyeron los seis polimorfismos de acuerdo con la presente invencion. Esta operacion se realizo el uso de DNA Engine PTC-0200 (MJ Research) o GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems). Cada PCR se realizo a 95 °C durante2 minutos, despues 37 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, la temperatura de
25 hibridacion mostrada en la Tabla 8 durante 30 segundos, la reaccion de extension a 72 °C durante el tiempo que se indica en la Tabla 8 con una extension final a 72 °C durante 10 minutos. Para cada uno de los fragmentos de ADN, como se describe en la Tabla 8, la temperatura de hibridacion y el tiempo de reaccion de la extension son 58 °C a 60 °C y de 0,5 minutos a 3 minutos, respectivamente.
[Tabla 8]
Cebador directo
Numero de posicion del nucleotido en AL162497 Cebador inverso Numero de posicion del nucleotido en AL162497 Temperatura de hibridacion (0C) Tiempo de extension (min) DMSO
C-4587A
SEC lD N° 1 131420-131399 SEC lD N° 2 130318-130339 60 3 -
AT
SEC lD SEC lD
128930-128911
127491-127510 60 3 -
2510del
N°4 N°5
SEC lD
SEC lD
A-1164C
127837-127818 126460-126479 60 3 +
N° 7
N° 8
SEC lD
SEC lD
A15870G
110260-11 0240 109859-109879 60 3 -
N° 10
N° 11
A29793G
SEC lD N° 13 96209-96190 SEC lD N° 14 96070-96091 58 0,5 -
SEC lD
SEC lD
C31532de
94616-94595 93139-93159 60 3 -
N° 15
N° 16
El componente de una mezcla de reaccion es como se describe en el Ejemplo 2-(a). Cabe destacar que se anadio DMSO a la mezcla de reaccion para detectar "A-1164C" de modo que la concentracion final fuera del 10 % (vease la columna "DMSO" de la Tabla 8). G en la posicion 23 del cebador inverso (SEC lD N° 14) empleado para la deteccion de "A29793G" descrito en la Tabla 8 fue una base sustituida para crear un sitio polimorfico que es reconocido por la enzima de restriccion Afa l.
Los polimorfismos distintos a "A29793G" se detectaron mediante secuenciacion directa (metodo didesoxi (Sanger, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977) o el metodo de Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980). La Tabla 9 muestra cebadores para determinar el genotipo de cada polimorfismo (SEC lD N° 3, 6, 9, 12 y 17).
[Tabla 9]
Cebador para secuenciacion
Numero de posicion del nucleotido en AL162497
C-4587A
SEC lD N°3 130343-130363
AT-2510del
SEC lD N°6 128581-128562
A-1164C
SEC lD N°9 126912-126929
A15870G
SEC lD N°12 110249-110231
C31532del
SEC lD N°17 94556-94537
El analisis PCR-RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento con enzimas de restriccion) se realizo para detectar "A29793G". Especificamente, una mezcla de reaccion ((20 1l) contenia el producto de PCR (10 1l ), 2 unidades de la enzima de restriccion Afa l (10 unidades/ml, Takara), y 10 x de tampon T unido a la enzima de restriccion (2 1l ). A la mezcla de reaccion se anadio BSA de modo que la concentracion final fuera 0,01 % y la mezcla resultante se incubo a 37 °C durante 16 horas. Los fragmentos de ADN digeridos se separaron mediante el uso de gel de agarosa al 4% y se visualizo mediante tincion con bromuro de etidio y transiluminacion ultravioleta.
Cuando el ADN extraido de una muestra de un sujeto se aplica a cualquiera de los procedimientos de deteccion para los seis polimorfismos del gen lRS-2 humano, descrito antes en los Ejemplos antes de la administracion de un farmaco que puede inducir granulocitopenia, se puede determinar la posibilidad de una granulocitopenia inducida por farmacos (incluida agranulocitosis), es decir el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos. Por tanto, de acuerdo con la presente invencion, el riesgo de granulocitopenia atribuida a la administracion de vesnarinona se puede examinar o evaluar mediante el analisis del ADN de un sujeto.
La presente invencion es util para examinar o evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano, particularmente utiles para examinar o evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos en un ser humano antes de la administracion de un farmaco que ya se ha notificado que induce granulocitopenia (incluida agranulocitosis).
El contenido de la solicitud de patente europea n° 04 770 985.2 (caso padre), incluidos al descripcion completa, todas las reivindicaciones y las figuras, se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
LlSTADO DE SECUENClAS
�110� Otsuk Pharmaceutical Co., Ltd.
�120� Un procedimiento para determinar el riesgo de agranulocitosis inducida por farmacos
�130� OP0046
�140�
�141�
�160�17
�170� Patentln ver. 2.1
�210� 1 �211� 22 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 1 accactgtat ttgtgacaactc 22
�210� 2
�211� 22
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 2 aaatatggat cagtctctttcc 22
�210� 3
�211� 21
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 3 atgttcattt tatgagggag g 21
�210� 4
�211� 20
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 4 aactgccaat ccagagctgc 20
�210� 5
�211� 20 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 5 tctcaccaca ccgcttcaag 20
�210� 6
�211� 20
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 6 ccacamtc ttcaagcacc 20
�210� 7
�211� 20
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 7 gagcttgctg ggatctgaac 20
�210� 8
�211� 20
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 8 atgtgactcg gcgttacgca 20
�210� 9
�211� 18
�212� ADN
�213� Secuencia artificial �220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2 del receptor de insulina (lRS-2) �400� 9
ccttgcagtg gaagcatg 18
�210� 10
�211� 21
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 10 ctatcccgat tcctagatgtc 21
�210� 11
�211� 21
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 11 gactcatctg tgactaactcc 21
�210� 12
�211� 19
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 12 cctagatgtc agcttgccc 19
�210� 13
�211� 20
�212� ADN
�213� Secuencia artificial
�220�
�223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2
del receptor de insulina (lRS-2)
�400� 13 tctggaactc cagagattgc 20 �210� 14 �211� 25 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2 del receptor de insulina (lRS-2) �400� 14 tgctgagcgt cttcttttaatggta 25 �210� 15 �211� 22 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2 del receptor de insulina (lRS-2) �400� 15 gaggcttttt tagaggaagacc 22 �210� 16 �211� 21 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2 del receptor de insulina (lRS-2) �400� 16 catgtcatgg agggagcattc 21 �210� 17 �211� 20 �212� ADN �213� Secuencia artificial �220� �223� Descripcion de la secuencia artificial: secuencia del cebador para amplificacion de los SNP de la sustancia 2 del receptor de insulina (lRS-2) �400� 17 gcaaaagtct tcctgcttcc 20

Claims (5)

  1. REIvINDICACIONES
    1. Un kit para detectar un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana empleado para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, en el que el kit comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia de 10 a 35 bases como se define a continuacion en (a) a (f) como cebadores o sondas para detectar polimorfismos del gen del sustrato 2 del receptor de insulina:
    (a)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (b)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (c)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (d)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (e)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; y
    (f)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana.
    en el que los numeros de posicion corresponden a los numeros de posicion contando desde A de ATG como codon para Met al extremo N de la proteina cuando se traduce el ARNm en la proteina.
  2. 2. Un kit para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, en el que el kit comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia de 10 a 35 bases como se define mas adelante en (a) a (f) que sirve como cebador o sonda para detectar un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de la insulina:
    (a)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (b)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (c)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (d)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;
    (e)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; y
    (f)
    un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana.
    en el que los numeros de posicion corresponden a los numeros de posicion contando desde A de ATG como codon para Met al extremo N de la proteina cuando se traduce el ARNm en la proteina.
  3. 3. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que ademas comprende un oligonucleotido que puede hibridar con el gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana y que se usa como sonda para la deteccion de polimorfismos geneticos, seleccionandose dicho oligonucleotido del grupo constituido por los oligonucleotidos descritos en (a) a (d) y (f):
    (a)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 3;
    (b)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 6;
    (c)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 9;
    (d)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 12; y
    (f)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 17;
  4. 4. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ademas comprende oligonucleotidos que pueden hibridar con el gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana y que se usan como cebadores para la deteccion de polimorfismos geneticos, seleccionandose dichos oligonucleotidos del grupo constituido por combinaciones de los oligonucleotidos descritos mas adelante en (a) y (b), (c) y (d), (e) y (f), (g) y (h), (i) y (j), y (k) y (l):
    (a)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 1;
    (b)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 2;
    (c)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 4;
    (d)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 5;
    (e)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 7;
    (f)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 8;
    (g)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 10;
    (h)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 11;
    (i)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 13;
    (j)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 14;
    (k)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 15; y
    (l)
    un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 16
  5. 5. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en que dicho kit comprende oligonucleotidos como se describe en (e) de la reivindicacion 1 o 2 y la enzima de restriccion Afa l, usandose el kit para detectar la conversion de A en G en la posicion 29.793 en 3' desde el codon de inicio de la traduccion del sustrato 2 del receptor de la insulina humana.
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