KR20120068995A

KR20120068995A - 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정법

Info

Publication number: KR20120068995A
Application number: KR1020127013518A
Authority: KR
Inventors: 코지 스에마츠; 고우이치 하세가와
Original assignee: 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2003-07-29
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2012-06-27
Also published as: TWI351436B; ATE544852T1; US8492087B2; WO2005010183A1; TW200516152A; KR20060040600A; CN100482794C; EP2275539A3; ES2379811T3; EP2275539A2; EP1650300B1; KR101176194B1; EP1650300A1; KR101176191B1; CA2530168A1; US20070264631A1; EP1650300A4; CN1833023A; CA2530168C; US20140186826A1

Abstract

사람의 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 리스크의 존재를 판정수단을 제공한다.
피검자의 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 유전자 다형을 검출하고, 이를 지표로 하여 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 리스크의 존재를 판정하는 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정법.

Description

약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정법 {METHOD OF JUDGING RISK FOR ONSET OF DRUG INDUCED GRANULOCYTOPENIA}

본 발명은 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 유전자 다형의 존재를 지표로서 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정하는 방법, 상기 리스크 판정의 지표가 되는 유전자 다형의 검출 방법, 이러한 방법에 이용되는 올리고뉴클레오티드 및 판정 및/또는 검출용 키트에 관한다.

현대의료는 각종 가지의 질환의 치료·진전 예방에 약제를 이용하는 약물요법이 주체로 되어 있다. 약물요법에 이용되는 저분자화합물을 비롯한 약제의 거의 모두는 본래 사람에게 이물질이며, 그의 투여에 의해 치료효과에 반해 각종 부작용이 발현한다. 이 부작용은 종종 약물치료를 단념하지 않을 수 없는 경우를 야기한다. 어느 질환을 갖고 있는 환자에게 있어 유용한 약제로 여겨지면서, 위독한 부작용에 의해 개발 중지가 된 약제도 있으며, 또한 그 약제의 투여 방법이나 부작용의 발현의 엄격한 체크가 요구되는 약제도 있다.

미합중국의 통계에서는 약제에 의한 부작용 발현의 보고는 연간 200만 건에 상회한다. 또한, 10만 명 이상이 부작용에 의해 사망했다고 보고되어 있다(JAMA, 279, 1200(1998)). 일본에서도의약품의 부작용 보고는 중복 보고를 포함해 2만 6545 증례도 있으며, 사망 보고도 2000년도의 1년간에만 1239건 보고되어 있다(일본, 후생노동성, 평성 15년 6월 6일, 중의원 답변 제 55호 답변서).

약제 투여에 기인하는 부작용중에서도, 과립구 감소증은 치사적인 부작용이다. 특히, 과립구가 감소하면 감염되기 쉽고, 무과립구증의 상태에 이른 경우에는 폐렴, 패혈증 등의 위독한 감염증에 빠질 위험성이 매우 높다. 이 과립구 감소증을 야기하는 원인 약제의 주된 것으로 해서는 진통해열약(아미노피린), 항생물질(클로로마이세틴), 항갑상선약(메르카졸), 항경련약, 항당뇨병약, 이뇨약 등이 알려져 있다. 이들 약제에 의한 부작용의 발증은 그의 투여량과는 그다지 관련이 없고, 환자의 체질, 예를 들면 알레르기 체질, 특이체질 등에 관련된다고 한다. 그 때문에, 부작용 발증의 예측은 거의 곤란하다. 부작용 발증을 미리 막기 위해서는 개개 환자의 타과를 포함한 약력 등의 상세한 문진과 혈액검사 등에 의한 충분한 주의가 필요하다. 항상, 일단 부작용으로서의 과립구 감소증이 발병했을 경우는 입원 등에 의한 신속한 대응이 요구된다.

또한, 과립구 감소증을 야기하는 원인 약제 이외의 약제로서 항정신병약의 디벤조디아제핀(클로자핀)이 알려져 있다. 이 약제는 높은 유효성이 기대됨에도 불구하고, 일본에서의 치료가 중단된 것이다.

더욱이, 다른 약제로서 PDE3 저해작용과 K채널에 대한 작용을 가지는 베스나리논이 있다. 이 약제는 부정맥의 발현이 낮고, 심장사고(심부전 발증, 입원 등)의 발생률도 적어 강심약으로서 유효한 것이지만, 그의 투여 중에 백혈구 감소, 과립구 감소에 계속되는 무과립구증을 일으키는 부작용 때문에, 그의 사용이 엄격하게 제한되고 있다.

사람 게놈 해석에 있어서, 1염기다형(Single nucleotide polymorphisms: SNPs)은 가장 빈도가 높은 유전자 다형 마커이다. 어느 지금까지, 이 SNP는 흔한 질환, 약제 응답 등에 관련한 사람게놈 해석에 있어서, 유용한 것으로 나타나 있다(비특허 문헌 1, 2 및 3 참조). 또한, 복수의 SNPs를 이용한 하플로 타입(haplotype) 해석이 유전적으로 복잡한 질환의 질환 감수성을 해석하는데 있어서 유용한 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 4 및 5 참조). 실제로, 알츠하이머 병 및 고혈압증과 같은 질환은 이 방법으로 이미 집중적으로 해석되고 있다(Jeunemaitre, X., et a1., Am. J. Hum. Genet., 60, 1448-1460(1997); Martin, E. R., Am. J. Hum. Genet., 67, 383-394(2000)).

근년, 게놈 해석의 진보와 함께, 약제 개발 과정에 있어서, 약물 대사 효소인 시토크롬 P450(CYP)에 대한 약제 작용을 연구하는 톡시코게노믹스가 발전해 오고 있다. 그 중에서, 전술한 바와 같은 약제 기인성 부작용과의 관계에 있어서, 특정 유전자 다형과 약제 감수성/응답성과의 관련을, 개개 환자의 연구에 의해 밝히는 연구가 제안되고, 이리하여 소위 오더 메이드의 치료법을 확립하는 것이 요망되고 있다.

비특허문헌 1: Brookes, A. J., The essence of SNPs", Gene, USA, (1999), 234, 177-186

비특허문헌 2: Cargill, M, et al., "Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes", Nature Genet., USA, (1999), 22, 231-238

비특허문헌 3: Evans, W. E., & Relling, M. V.,“Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics", Science, USA, (1999), 286, 487-491

비특허문헌 4: Stephens, J. C., et al.,“Dating the origin of the CCR5-Delta32 AIDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes", Am. J. Hum. Genet., USA, (1998), 62, 1507-1515

비특허문헌 5: Tishkoff, S. A., et al.,“The accuracy of statistical methods for estimation of haplotype frequencies: an example from the CD4 locus" Am. J. Hum. Genet., USA, (2000), 67, 518-522

본 발명은 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 존재를 지표로서 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정하는 수단 또는 상기 리스크 판정의 지표가 되는 유전자 다형을 검출하는 수단을 제공하는 것을 그의 주된 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서, 우선 다형 해석용 유전자로서 사이토카인 관련, MHC 영역, G-CSF 관련, TNF-α관련, NFκ관련, cAMP 관련, K-채널 관련 등의 115에 이르는 후보 유전자를 선택하고, 일본인의 다형 데이터-베이스로부터 이들 후보 유전자의 SNPs를 검색하여 188의 후보 SNPs를 선택했다.

이어서, 이들 선택된 SNPs에 대하여 특정 약물 투여에 의해 발병한 과립구 감소증 발증 환자군과 비발증 환자군의 2군의 검체 게놈 DNA에 나타나는 그들 SNPs의 빈도를 결정했다. 그 결과, 상기 2군 사이에서, 통계학적으로 가장 유의한 차이를 나타내는 SNPs가 인슐린 수용체 기질-2 유전자(Insulin receptor substrate 2: IRS-2) (J-SNP ID:IMS-JST040476) (이하, "IRS-2 유전자"라 한다) 상에 존재하는 것을 확인했다.

본 발명자들은 다시 사람 IRS-2 유전자의 다형과 약제 기인성 과립구 감소증과의 관련에 대해서 검토를 거듭한 결과, 특정 약제의 복용에 의해 유발되는 과립구 감소증과 강하게 관련하는 합계 6개의 사람 IRS-2 유전자의 SNPs를 확인했다.

이들 특정 SNPs의 해석에 의하면, 사람의 각종 질환에 대한 약제 기인성 부작용, 특히 약제 기인성 과립구 감소증의 발증 리스크를 판정(예측 진단)할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 기초로 하여 완성된 것이다.

본 발명은 하기 (1)～(19)에 나타낸 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 존재를 판정하는 방법 또는 상기 리스크 판정의 지표가 되는 유전자 다형 마커의 검출 방법 및 이들의 방법에 이용되는 올리고뉴클레오티드 및 키트를 제공한다.

(1) 피검자의 사람 IRS-2 유전자의 유전자 다형을 검출하고, 이것을 지표로 하여 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 리스크의 존재를 판정하는 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정법.

(2) 사람 IRS-2 유전자의 유전자 다형의 존재를 지표로 하여 피검자의 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 존재를 판정하기 위한 당해 유전자의 유전자 다형의 검출 방법.

(3) 피검자의 사람 IRS-2 유전자의 유전자 다형을 검출하고, 이것을 지표로서 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 검사하는 방법.

(4) 사람 IRS-2 유전자의 하기 (a) - (f)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개의 유전자 다형의 존재를 지표로서 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 리스크의 존재를 판정하는 상기 (1)～(3)에 기재의 방법;

(a) 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 4587번째의 야생형(C)이 A로 변이한 다형,

(b) 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 2510번째의 야생형(AT)이 결실한 다형,

(c) 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 1164번째의 야생형(A)이 C로 변이한 다형,

(d) 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 15870번째의 야생형(A)이 G로 변이한 다형,

(e) 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 야생형(A)이 G로 변이한 다형 및

(f) 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 31532번째의 야생형(C)이 결실된 다형

(5) 유전자 다형의 검출이, 뉴클레오티드 직접 염기배열 결정법, 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO)-닷 블롯 분석, 1염기 프라이머 신장법, PCR-단쇄 고차 구조다형(SSCP) 분석, PCR-제한효소 단편 장다형(RFLP) 분석, 인베이더법, 정량적 리얼타임 PCR 검출법 및 질량 분석계를 이용한 유전자 다형 검출법 (mass array)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개의 방법에 의해 행해지는 상기 (1)～(4) 기재의 방법.

(6) 유전자 다형의 검출이 뉴클레오티드 직접 배열 결정법에 의해 행해지는 상기 (5) 기재의 방법.

(7) 유전자 다형의 검출이 PCR-제한효소 단편 장다형(RFLP) 분석에 의해 행해지는 상기(5) 기재의 방법.

(8) PCR-제한효소 단편 장다형(RFLP) 분석이 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 A로부터 G로의 변이를 검출하기 위해서 제한효소 Afa I를 이용하여 행해지는 것인 상기 (7) 기재의 방법.

(9) 사람 IRS-2 유전자에 하이브리다이즈할 수 있는 유전자 다형 검출용 프라이머 또는 프로우브로서 올리고뉴클레오티드이며, 이하의 (a)-(f)로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오티드;

(a) 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 4587번째의 C가 A로 변이한 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드,

(b) 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 2510번째의 AT가 결실된 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드,

(c) 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 1164번째의 A가 C로 변이한 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드,

(d) 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 15870번째의 A가 G로 변이한 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드,

(e) 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 A가 G로 변이한 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드, 및

(f) 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 31532번째의 C가 결실된 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드.

(10) 사람 IRS-2 유전자에 하이브리다이즈할 수 있는 유전자 다형 검출용 프라이머이며, 이하의 (a)-(d) 및 (f)로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오티드;

(a) 배열번호: 3으로 나타나는 배열의 올리고뉴클레오티드,

(b) 배열번호: 6으로 나타나는 배열의 올리고뉴클레오티드,

(c) 배열번호: 9로 나타나는 배열의 올리고뉴클레오티드,

(d) 배열번호: 12로 나타나는 배열의 올리고뉴클레오티드,

(f) 배열번호: 17로 나타나는 배열의 올리고뉴클레오티드.

(11) 상기 (9)에 기재된 올리고뉴클레오티드를 사람 IRS-2 유전자의 다형 검출용 프라이머 또는 사람 IRS-2 유전자의 다형 검출용 프로우브로서 함유하는 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정용 키트.

(12) 상기 (10)에 기재의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 상기 (11) 기재의 키트.

(13) 상기 (9)의 (e)에 기재된 올리고뉴클레오티드와 제한효소 Afa I를 포함한 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 A로부터 G 로의 변이를 검출하기 위한 상기 (11) 기재의 키트.

(14) 상기 (9) 또는 (10)에 기재의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 베스나리논 투여에 의한 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정하는 상기 (1) 기재의 방법.

(15) 상기 (9)의 (e)에 기재된 올리고뉴클레오티드와 제한효소 Afa I를 이용하여 베스나리논 투여에 의한 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정하는 상기 (1) 기재의 방법.

(16) 상기 (9)에 기재된 올리고뉴클레오티드를 사람 IRS-2 유전자의 다형 검출용 프라이머 또는 사람 IRS-2 유전자의 다형 검출용 프로우브로서 포함한 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 존재를 판정하기 위한 당해 유전자의 유전자 다형 검출용 키트.

(17) 상기 (10)에 기재의 올리고뉴클레오티드를 포함한 상기 (16) 기재의 키트.

(18) 상기 (9)의 (e)에 기재된 올리고뉴클레오티드와 제한효소 Afa I를 포함한 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 A에서 G로의 변이를 검출하기 위한 상기 (16) 기재의 키트.

(19) 상기 (9) 또는 (10)에 기재의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 베스나리논 투여에 의한 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정하기 위한 유전자 다형을 검출하는 상기 (2) 기재의 방법.

(20) 상기 (9)의 (e)에 기재된 올리고뉴클레오티드와 제한효소 Afa I를 이용하여 베스나리논 투여에 의한 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정하기 위한 유전자 다형을 검출하는 상기 (2) 기재의 방법.

(21) 상기 (9) 또는 (10)에 기재의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 베스나리논 투여에 의한 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 검사하는 상기 (3) 기재의 방법.

(22) 상기 (9)의 (e)에 기재의 올리고뉴클레오티드와 제한효소 Afa I를 이용하여 베스나리논 투여에 의한 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 검사하는 상기 (3) 기재의 방법.

본 발명에 의하면, 사람에서의 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 판정 방법, 상기 판정의 지표가 되는 유전자 다형의 검출 방법, 이를 위한 키트, 이를 이용하는 변이 검출용 프라이머 및 프로우브, 및 사람에 있어서의 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 위험 인자에 관련하는 유전자가 제공된다. 이들은

사람 약제 기인성 과립구 감소증의 발증 리스크의 검사, 판정에, 특히 약제 투여에 의해 약제 기인성의 과립구 감소증(무과립구증도 포함한다)의 부작용이 이미 보고되어 있는 약제의 투여 전에 있어서의 당해 과립구 감소증 발증 리스크의 검사, 판정에 유용하다.

도 1은 사람 IRS-2 유전자의 구조 및 유전자 다형의 존재 위치를 나타내는 개략도이다.

본 명세서에 있어서, 아미노산, 펩티드, 염기배열, 핵산 등의 약호에 의한 표시는 IUPAC-IUB의 규정[IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)], "염기배열 또는 아미노산 배열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드라인"(일본특허청편) 및 당해 분야에 있어서의 관용 기호에 따르는 것으로 한다.

또, 본 명세서중에 나타낸 사람 IRS-2 유전자의 게놈 배열은 상가 센터 (Sanger Center)의 모하 마디(Mohammadi, M.)에 의해 GenBank 악세션 번호: AL162497(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL162497?report=GenBank로부터 입수 가능)로서 보고된 전체 길이 143,409 염기 길이(bp)의 배열 내에 포함되어 있다.

GenBank(accession number XM 007095)으로부터 입수한 IRS-2 mRNA의 배열 정보와 상기 AL162497의 배열 정보를 기초로 하여 얻어진 게놈 배열로부터 추정되는 IRS-2 유전자는 2개의 엑손으로 구성되어 있으며, 인트론을 포함한 유전자의 전체 길이는 32,730bp이다. 이 유전자는 AL162497의 배열에서는 93673-126402bp에 상당한다. 이 유전자의 구조의 개략을 도 1에 나타낸다. 도 1 중, "Ex. 1" 및 "Ex. 2"는 2개의 엑손을 나타낸다. 화살표를 부쳐 나타낸 약호는 각각 이하의 변이 (SNP)를 나타낸다. 또, 이들은 모두 동의적 치환(단백산물의 배열에 변화를 일으키지 않는 것)이다. 본문 중 또는 도면 중에 나타낸 SNP의 존재 위치 번호는 단백질을 코드하는 코드 영역의 번역 개시 코돈 ATG의 위치 A로부터의 존재 위치 번호로서 나타난다.

C-4587A; 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 4587번째의 C로부터 A로의 변이,

AT-2510del; 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 2510번째의 AT의 결실

A-1164C; 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 1164번째의 A로부터 C로의 변이,

A15870G; 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 15870 번째의 A로부터 G로의 변이,

A29793G; 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793 번째의 A로부터 G로의 변이,

*C31532del; 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 제 2 엑손의 31532 번째의 C의 결손.

본 명세서에 있어서, "유전자"란 2본쇄 DNA뿐만 아니라, 이를 구성하는 각 1본쇄 DNA(센스쇄 및 안티센스쇄)를 포함한다. 즉, 본 발명 유전자(DNA)는 특히 언급하지 않는 한, 사람 게놈 DNA를 포함한 2본쇄 DNA, cDNA를 포함한 1본쇄 DNA(센스쇄), 이 센스쇄와 상보적인 배열을 가지는 1본쇄 DNA 및 이들의 단편을 포함한다. 또 상기 유전자(DNA)는 조절 영역, 코드 영역, 엑손 및 인트론을 포함할 수가 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함한다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. 폴리펩티드는 그의 단편, 동족체, 유도체 및 변이체를 포함한다. 또한, 변이체는 천연에 존재하는 대립유전자 변이체, 천연에 존재하지 않는 변이체, 개변(결실, 치환, 부가 및 삽입)된 변이체 및 코드하는 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는 폴리뉴클레오티드 배열을 의미한다. 또, 아미노산 배열에 있어서의 개변은 천연에 있어서, 예를 들면 돌연변이, 번역 후의 수식 등에 의해 생기는 것도 있으며, 천연 유래의 유전자를 이용하여 인위적으로 이것을 행할 수도 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, SNP(Single nucleotide polymorphism: 1염기 다형)란 어떤 유전자 내지 유전자군에서의 1염기의 핵산의 변이로서 표현되어 복수 곳에 존재하는 상기 1염기의 핵산의 변이(SNP)를 SNPs로서 나타낸다. 하플로 타입이라는 것은 연속한 유전자 영역 또는 유전자군 중의 복수 곳의 변이 부위에 있어서의 대립유전자의 종류와 수에 의해 나타내지는 상기 변이(SNPs)의 타입을 나타낸다.

본 발명은 사람 IRS-2 유전자(전사 조절에 관한 프로모터 영역을 포함한 IRS-2 유전자 전체)의 특정 위치에 있어서의 변이를 포함한 다형, 특히 SNP 또는 SNPs가 사람의 약제 기인성 과립구 감소증과 강하게 상관하고 있어, 특정 위치에 있어서의 SNP를 유전자 다형 마커로서 검출함으로써 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정(예측 진단)할 수 있다는 사실의 발견에 근거해 완성되었다. 본 발명 판정 방법은 검체(피검자 유래)에 있어서의 사람 IRS-2 유전자의 다형, 즉, 사람 IRS-2 유전자의 SNP 또는 SNPs를 검출하는 것에 관한다.

본 발명 방법에 의해 검출, 해석되는 SNPs(즉, 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 지표가 되는 유전자적 변이)에는 전술한 C-4587A, AT-2510del, A-1164C, A15870G, A29793G 및 C31532del의 6개의 변이가 포함된다. 이들이 존재하는 IRS-2 유전자상의 위치는 상기 도 1에 나타난 바와 같다. 단, 핵산에 끼워진 SNPs의 존재 위치 번호는 IRS-2 유전자의 단백질을 코드하는 코드 영역의 번역 개시 코돈의 ATG의 A로부터 SNPs의 존재 위치 번호를 나타낸다.

본 발명에 의하면, 사람 IRS-2 유전자의 다형 (SNPs 및 하플로 타입)을 검출할 수 있으며, 이것에 의해, 사람에 있어서의 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 기능 해명, 파악, 진단 및 예방에 유용한 정보 내지 수단을 부여할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 약제 기인성 과립구 감소증 발증의 리스크를 가지는 환자를 판정하여 이 환자에게 약제 투여를 회피함으로서 약제 기인성 과립구 감소증의 발증을 미연에 방지할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 약제 투여 시에 부작용 발현을 고려한 여러 차례의 검사를 치료 또는 처치에 병행하여 행함으로서 부작용 대책을 유효하게 행할 수 있다.

본 발명 방법에 대해서, 이하에 상술한다.

본 발명 방법은 피험자의 사람 IRS-2 유전자의 유전자 다형을 검출해 이것을 지표로서 약제 기인성 과립구 감소증의 리스크의 존재를 판정하는 것이다.

사람 IRS-2 유전자의 유전자 다형의 검출은 예를 들면, 피험자로부터 사람 IRS-2 유전자의 게놈 배열 또는 그의 상보쇄를 조제하고, 필요에 따라서 당해 게놈 배열 또는 그의 상보쇄의 DNA 배열을 결정한 후, 당해 유전자 다형을 검출함으로써 행해진다.

사람 IRS-2 유전자(SNPs)의 조제

검체로서 피검자 유래의 사람 IRS-2 유전자를 조제한다. 이 다형(SNPs)을 가지는 유전자의 구체적인 예는 전술한 바와 같다. 이 유전자에는 상기 예시의 사람 IRS-2 유전자의 DNA 배열의 상보쇄도 포함된다.

유전자 다형을 가지는 사람 IRS-2 유전자 또는 그의 상보쇄는 본 명세서에 개시된 사람 IRS-2 유전자의 구체적 배열 정보에 의하여 일반적 유전자 공학적 수법에 의해 용이하게 조제할 수 있다[Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harboar Lab. Press(1989); 續生化學實驗講座 "遺傳子硏究法 I, II, III", 日本生化學會編 (1986) 등 참조〕

구체적으로는 사람 IRS-2 유전자의 SNPs를 가지는 사람 약제 기인성 과립구 감소증 환자로부터 통상의 방법에 따라서 cDNA 또는 게놈 DNA를 추출하고, 사람 IRS-2 유전자의 특정의 변이를 함유해도 좋은 적당한 프로우브, 제한효소, 항체 등을 이용한 통상의 방법[Proc. Nat 1. Acad. Sci., U. S. A., 78, 6613(1981); Science, 222, 778(1983) 등 참조]에 따라서, 소망의 클론을 선택함으로써 소망의 IRS-2 유전자의 게놈 배열을 조제할 수 있다.

상기에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA의 기원으로서는 IRS-2 유전자 (SNPs)를 가지는 각종 세포, 조직, 이들에 유래하는 배양 세포 등을 예시할 수 있다. 또한, 혈청, 혈장 등의 혈액, 타액, 림프액, 기도점액, 뇨, 정액 등의 체액을 예시할 수가 있다. 또, 검체로서의 상기 기원 재료는 사람의 약제 투여전(특히, 약제 기인성 과립구 감소증이 과거에 보고되어 있는 약제를 투여하기 전)의 환자 유래의 DNA 또는 게놈 DNA인 것이 바람직하다. 이들 기원 재료로부터의 RNA의 분리, mRNA의 분리 및 정제, cDNA의 취득, 그의 클로닝 등은 모두 통상의 방법에 따를 수가 있다. 또, cDNA 라이브러리는 시판되고 있으며, 본 발명에서는 이들 cDNA 라이브러리, 예를 들면 클론텍사(Clontech Lab. Inc.) 등으로부터 시판되고 있는 각종 cDNA 라이브러리 등을 이용할 수도 있다.

소망 유전자를 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법도, 특히 제한되지 않고, 통상의 방법에 따를 수 있다. 구체적으로는, 목적하는 SNPs의 DNA 배열에 선택적으로 결합할 수 있는 변이 부분을 포함한 프로우브를 작성하고, 이를 이용하여 플라크 하이브리다이제이션, 콜로니 하이브리다이제이션 등 을 행하던가, 이들을 조합하여 실시하면 좋다.

스크리닝용 프라이머로서는 소망의 사람 IRS-2 유전자의 염기배열 정보에 의하여 설정한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용할 수 있다. 이들은 통상의 방법에 따라, 예를 들면 자동 합성장치를 이용하여 합성할 수 있다. 이 스크리닝용 프로우브는 통상, 표지한 프로우브이지만, 직접적 또는 간접적으로 표지한 리간드와 특이적 결합할 수 있는 것이면, 비표지의 것이어도 좋다. 프로우브 및 리간드의 표지제 및 표지법은 이미 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 그 예로서는 예를 들면, 니크 트랜슬레이션, 랜덤 프라이밍, 키나제 처리 등의 기존의 방법에 의해 취입할 수 있는 방사성 표지제, 비오틴, 형광성 색소, 화학 발광제, 루시페라제 등의 효소, 항체 등을 예시할 수 있다.

추출한 유전자 또는 mRNA는 유전자 증폭법에 의해 증폭시킬 수가 있다. 이 증폭에 의하면, 본 발명 검출 방법에 있어서의 검출을 보다 용이하고도, 정밀도가 높은 것으로 할 수 있다. 유전자 증폭법의 예로서는 PCR법(Saiki, R. K., Bugawan, T. L., et al., Nature, 324, 163-166 (1986)), NASBA법(Comptom, J., Nature, 650, 91-92 (1991)), TMA법(Kacian, D.L., and Fultz, T. J., 미국특허제 5,399,491호 (1995)), SDA법(Walker, G. T., Little, M. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 89, 392-396 (1992)) 등을 들 수 있다.

또, PCR법 등으로 증폭시킨 유전자 단편의 분리 정제는 통상의 방법, 예를 들면, 겔 전기 영동법 등에 의하면 좋고, 또한, 컬럼에서 정제해도 좋다. 그의 확인은 예를 들면, 매스 스펙트로법에 의할 수 있다. 이들 방법에 의해 증폭시킨 유전자는 그 증폭물의 특성에 따라, 본 발명과 관련되는 사람 IRS-2 유전자(SNPs)의 검출에 제공된다.

사람 IRS-2 유전자 다형의 검출

본 발명 방법에서는 이어서 상기 검체의 다형의 유무를 검출한다. 이 검출은 구체적으로는, 예를 들면, 하기 (1)-(8) 나타내는 각종의 방법으로 따라서 실시할 수가 있다.

(1) 뉴클레오티드 직접 염기배열 결정법

IRS-2 유전자의 검출은 이런 종류의 유전자의 염기배열의 결정에 관용되고 있는, 예를 들면, 다이데옥시법 (Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 74, 5463-5467 (1977)), 맥섬-길버트법[Methods in Enzymology, 6 5, 499 (1980)] 등의 뉴클레오티드 직접 염기배열 결정법에 따라서 실시할 수가 있다. 이 방법과 PCR법 등의 DNA 증폭법을 조합한 방법에 따라서 실시할 수 있다. 특히, 소량의 DNA 시료를 이용해 간편하고도 용이하며, 또한 감도 및 정밀도가 높은 검출이 가능한 관점으로부터는 PCR법 또는 그에 준한 DNA 증폭법을 조합한 방법이 바람직하다.

이 바람직한 방법은, 기본적으로는, 예를 들면, PCR법으로 증폭시킨 유전자 단편 또는 그의 정제물을 플라스미드로 클로닝하고, 이어서, 다이데옥시법, 막섬-일버트법 등에 따라서 직접 염기배열을 시퀀싱함으로써 실시할 수 있다. 또한, 간편하게는 시판의 시퀀스 키트 등을 이용해 뉴클레오티드 배열을 결정함으로써 실시할 수 있다. 이렇게 하여 사람 IRS-2 유전자의 전술한 특정 부위에 있어서의 변이의 존재의 유무를 검출할 수 있다.

상기 방법 및 이하에 나타낸 각 방법에 있어서, 검체로서의 PCR법으로 증폭시킨 DNA 단편은 전술한 변이의 존재가 상정되는 특정 부위의 적어도 하나를 포함하는 한, 특히 한정되는 것은 아니다. 통상, 약 50 내지 수천 염기의 길이, 바람직하기로는 50 내지 수백 염기의 길이를 가지는 것인 것이 좋다.

(2) 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드-닷 블롯법

IRS-2 유전자 검출의 별법으로서는 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 닷 블롯법(Conner, B. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 80, 278-282 (1983))에 따르는 방법을 들 수 있다. 이 방법은, 예를 들면, 목적으로 하는 SNP를 끼우도록 설계한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 유전자 단편에 대한 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로우브에 하이브리다이즈하는 DNA 단편을 닷 블롯 분석함으로서 실시할 수 있다. 이렇게 하여 이 단편 중에 SNP가 존재하는지 아닌지를 결정할 수 있다.

(3) 1염기 프라이머 신장반응법

IRS-2 유전자의 검출은 스냅 쇼트법, 피로시퀀스법, 일본국 특개평 2000-279197호에 개시된 점변이 검출법과 같은 1염기 신장반응법에 의해 실시할 수 있다. 이들 방법에서는 목적의 변이(SNP)의 직전의 염기 또는 수염기전의 염기에 대응하도록 설정한 프로우브, 즉, 그의 3' 말단을 검출 목적인 변이의 1염기 상류 또는 근방에 설정한 프로우브를 DNA 검체에 어닐링시킨다. 각 방법은 시판의 SNPs 검출용 키트 및 이 키트에 첨부의 소프트웨어를 이용하여 실시할 수 있다.

예를 들면, 스냅 쇼트법은 ABI PRISM SNaPshot ddKTP Primer Extension Kit(ABI Biosystems)를 이용하여 실시할 수 있다. SNPs는 반응 후에 생성한 형광 프라그먼트를, ABI PRISM310/377/3100/3700DNA Analyzer(모두 ABI Biosystems)와 GeneScan 소프트웨어를 이용하여 검출 해석할 수 있다.

피로시퀀스법은, 예를 들면, 아래와 같이 하여 실시할 수 있다. 즉, 혈액 샘플 등에서 통상의 방법에 의해 게놈 DNA를 분리하고, 비오틴 표지한 프라이머를 이용하여 변이를 포함한 수십 내지 수백 염기를 PCR 증폭시키고, 마그넷 비드를 이용하여 1본쇄 DNA를 정제하고, 이 정제 DNA를 검체로 한다. 이 검체에 소망의 변이의 몇개의 염기 상류로부터 시퀀스하도록 설정한 프라이머를 어닐링시키고, 이어서, 소프트웨어에 입력된 변이 부근의 시퀀스에 따라서 장치에 1종류씩 dNTP를 첨가한다. DNA 폴리메라제가 염기 신장반응하면 피롤린산(PPi)을 생성하므로, 이 PPi를 술푸릴라제(Sulfurylase)에 의해 ATP로 반환시키고, 이를 루시페라제(luciferase)의 기질로서 발광 검출기, CCD 카메라 등을 이용하여 화학 발광을 검출한다. 이렇게 하여, 첨가한 dNTP에 의해 얻어지는 발광 피크를 해석함으로서 유전자의 제노타이핑이 가능하게 된다. 이 방법을 이용하면, 96 샘플을 15분 정도에서 제노타이핑할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 시약 및 장치로서는 통상의 것, 예를 들면 DNA 폴리메라제, ATP-술푸릴라제, 루시페라제 및 아피라제(apyrase)의 4종의 효소 혼합액, 루시페린 및 APS(아데노신 5'-황산인산)로 이루어진 기질액, dATP(데옥시아데노신· 3인산), dCTP, dGTP 및 dTTP로부터 되는 dNTP를 구성요소로 하는 시판의 SNP Reagent Kits(Pyrosequencing AB사제) 등의 시약 및 자동 DNA 배열 분석을 위한 PSQ96 시스템(Pyrosequencing AB사제) 및 그의 사용을 위한 SNP 소프트웨어 (Pyrosequencing AB사제)를 이용할 수 있다.

또, 피로시퀀스법은 예를 들면, 미국 특허 제 6,159,693호 기재에 따라서, 핵산을 분리한 후, 증폭하고, 증폭한 PCR 산물을 정제한 후, READITTM System(Promega Corporation)를 이용하고, 이것에 피로인산을 반응시켜 얻어진 데이터를 분석함으로서도 실시할 수 있다. 이 데이터 분석에는, 예를 들면, 시판의 READIT 기술(Promega Corporation)을 이용한 Excel 분석을 채용할 수 있다.

(4) PCR-단쇄 고차 구조 다형(SSCp) 분석법

본 발명의 검출법에는 PCR 증폭 산물(1본쇄 DNA)을 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여, 그의 이동도의 차이에 의해 1염기 변이의 유무를 식별하는 PCR-SSCP법(Orita, M., Iwahara, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., C. S. A., 86, 2776-2770 (1989))을 채용할 수도 있다.

(5) PCR 제한효소 단편 장다형(RFLP) 분석법

본 발명 사람 IRS-2 유전자의 SNPs 또는 하플로 타입의 검출에 있어서, 예를 들면, 검출 목적으로 하는 변이를 포함한 핵산배열이 제한효소 인식 부위를 포함하고 있는 경우에, 이 검출은 제한효소 단편 장다형 분석법(RFLP법: Botstein, D. R., et al., Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980))에 의해 행할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면, 사람 IRS-2 유전자의 제 2엑손에 존재하는 단백질의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 핵산 배열이 야생형(A)이던가 또는 변이형(G)인가를 검출하기 위해서, 변이 부위를 포함하여 그의 전후 배열을 인식할 수 있는 제한효소를 이용한다. 이러한 RFLP법에 이용되는 효소는 목적으로 하는 변이 부위의 전후 배열을 인식할 수 있는 각종 공지의 제한효소이면 좋다. 그의 구체적인 예로서는, 예를 들면, Afa I를 예시할 수 있다.

이 RFLP법은 보다 바람직하기로는 PCR-RFLP법, 즉, 미리 PCR법 또는 그의 변법 등에 의해 검체 DNA를 증폭, 조제한 후, 다량으로 조제된 검체 DNA에 대해서 실시하는 방법에 따를 수 있다. 이렇게 하여, 특이적 절단 사이트의 존재 유무로서 변이의 존재의 유무를 검출할 수가 있다.

PCR-RFLP법에 의한 사람 IRS-2 유전자의 SNP의 검출은 보다 구체적으로는, 예를 들면, 이하의 방법으로 따라서 행해진다. 즉, 우선, 사람 생체 시료로부터 사람 IRS-2 유전자의 게놈 DNA를 추출하고, 이 유전자의 변이 부위를 포함한 영역의 DNA 단편을 증폭시켜 다량으로, 그리고 농축된 검체 샘플을 얻는다. 여기서, 이용되는 포워드 프라이머 및/또는 리버스 프라이머에는 그의 배열이 게놈의 배열과 완전하게 일치하지 않는 것도 포함되며, 바람직하기로는 제한효소 인식 부위를 도입하기 위한 배열이 도입된 것이 포함된다. 이어서, 증폭 DNA 검체를 특정의 제한효소(즉, 야생형 또는 변이형의 어느 한쪽만을 소화할 수 있는 효소)를 이용하여 소화하고, DNA의 절단 양식(절단의 유무, 절단 프라그먼트의 염기 길이 등)을 통상의 방법에 따라서 확인한다.

본 발명에서 특정된 사람 약제 기인성 과립구 감소증과 연쇄 불평형을 나타내는 사람 IRS-2 유전자의 변이(A29793G)의 경우, 사람 IRS-2 유전자의 염기배열 29793～29796 위치의 영역에 제한효소 Afa I의 특이적 절단 사이트(GTAC)가 생기기 때문에, 이 변이는 RFLP법에 의해 검출할 수 있다.

(6) 인베이더법

IRS-2 유전자의 SNPs의 검출은 인베이더(Invader)법에 의해서도 실시할 수가 있다. 인베이더법의 실시에는 이하의 문헌을 참조할 수 있다.

·Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17 (3) 292-296 (1999) 및

·국제특허공개 WO9823774호(일본국 특표 2001-526526호).

이 방법은 게놈 DNA의 SNPs를 분석하기 위해서 미리 표적 DNA를 증폭시키지 않고 행할 수 있는 방법이며, 예를 들면, 이하와 같이 하여 실시될 수 있다.

목적으로 하는 사람 IRS-2 유전자의 SNPs가 존재하는지 여부를 검출하기 위해서, 먼저 게놈 DNA를 분리한다. 이어서, 15 내지 50의 염기 길이로 되는 5' 플랩(flap)과 검출하고자 하는 핵산(본 발명에서는 SNP)을 5' 플랩의 3' 끝에 배치하고, 변이 핵산 이외는 표적 게놈 DNA에 상보하도록 합성된 30 내지 수백 염기의 올리고뉴클레오티드로 되는 제 1 표적 프로우브와 검출하고자 하는 핵산에 상보적인 핵산을 3' 끝에 배치하는 이외는 표적 게놈 DNA에 상보하도록 합성된 15 내지 수십 염기 길이의 올리고뉴클레오티드로 되는 인베이더·올리고뉴클레오티드·프로우브를, 예를 들면, 자동 합성기에 의해 합성한다. 이들 프로우브에, 분리한 게놈 DNA 및 제 1 프로우브의 검출하고자 하는 핵산에 상보적인 핵산을 3' 끝으로 하여 절단하는 효소, 본 발명에 이용하는 인베이더법에서는 효소 Cleavase를 첨가하여 적당한 반응액 중에서 반응시킨다.

만약 검체중의 게놈 DNA가 소망의 변이 핵산(SNP)을 가지고 있는 경우는 변이 핵산을 3' 끝에 가지는 5' 플랩을 유리하는 제 1 반응이 일어난다. 만약, 검체중의 게놈 DNA가 변이 핵산 배열을 가지고 있지 않은 경우는 상기 효소에 의한 절단은 일어나지 않는다.

효소로 절단된 제 1 프로우브로부터 유리한 5' 플랩은 표적으로서 형광 공명 에너지 전이(FRET) 프로우브에 상보적으로 결합하여 5' 플랩의 3' 끝이 FRET 프로우브 내에 침입(invasion)한다. 동일하게, 효소에 의한 반응이 일어나 형광색소가 유리한다.

이 제 ２반응에 이용되는 각 FRET 프로우브는 검출되는 표적에 의존하지 않고, 이하의 본질적으로 2개의 엘리먼트를 포함하도록 구축된다.

(1) 제 1 반응으로부터 찢어진 산물에 상보하는 3' 영역, 및 (2) 1본쇄 프로우브를 모방하기 위해서 복식을 형성하여 표적이 모두 하이브리다이즈하여 그것들이 리포터 형광색소와 퀀처(quencher) 형광색소를 포함하고 있는 자가 상보적 영역.

상기 리포터 형광색소는 이 리포터 형광색소가 상기 퀀처 형광색소와 동일한 프로우브에 결합되어 있는 경우에는 형광 공명 에너지 전이에 의해 그의 형광강도가 억제되지만, 상기 퀀처 형광색소와 동일 프로우브에 결합되어 있지 않은 상태에서는 형광강도는 억제되지 않는다. 절단된 제 1 프로우브로부터 유리한 5' 플랩이, FRET 프로우브에 하이브리다이즈했을 때, 그것은 제 ２ 반응에서 인베이더·올리고뉴클레오티드로서 작용하여, 효소에 의해 인식되는 침입 복합물을 생산한다. 이렇게 하여 FRET 프로우브의 상기 효소에 의한 절단이 2개의 형광색소를 분리하여 검출 가능한 형광 시그널을 산생한다. 이 시그널은 예를 들면, 표준 형광 마이크로타이터 플레이트 리딩 기기에 의해 읽어낼 수가 있으며, 이것에 의해, 소망의 SNPs의 유무 또는 하플로 타입을 검출할 수 있다. 제 1 및 제 2반응의 조합에 의해, 시그널을 1에서 1 ×10⁶배까지 증폭할 수 있다. 또한, 형광색소가 다른 2 종류의 프렛 프로우브를 이용함으로서 SNP의 유무를 검출(제노타이핑)할 수도 있다.

(7) 정량적 리얼타임 PCR 검출법

사람 IRS-2 유전자 다형의 검출은 정량적 리얼타임 PCR 검출법(TaqMan법)으로 따라 간편하게 실시할 수가 있다.

이 방법은 예를 들면, 이하와 같이 실시할 수 있다. 즉, 우선, 목적으로 하는 변이의 유무를 검출해야할 핵산 부위를 포함한 DNA 단편을, 예를 들면, 15～39염기로부터 되는 포워드측 프라이머 및 리버스측 프라이머로서 작성한다. 다만, 포워드측 플라스마 및 리버스측 프라이머에는 목적으로 하는 변이는 포함하지 않도록 작성한다. 이어서, 예를 들면, 15～50 염기로 이루어진 염기배열을 가지는 올리고뉴클레오티드로서, 리포터 형광색소와 퀀처 형광색소가 결합된 프로우브를 작성한다. 다만, 이 프로우브의 염기배열로서는 포워드측 프라이머가 하이브리다이즈하는 영역과 이 프로우브가 하이브리다이즈하는 영역이 서로 중복하지 않는 조합을 선택하는 것으로 한다. 이 프로우브는, 목적으로 하는 1염기의 핵산 변이의 유무를 검출하기 위한 대립 유전자 특이적 배열에 상보적인 배열을 가지도록 작성한다. 이 프로우브를 이용하여 검체 중의 측정해야 하는 IRS-2 유전자의 소망의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켜, 반응액으로부터의 형광을 리얼타임에 측정한다. 이렇게 하여 변이의 유무를 검출할 수 있다. 또한, 형광색소가 다른 2 종류의 프로우브를 이용함으로서 SNP의 유무의 검출(제노타이핑)을 실시할 수도 있다.

상기 인베이더 앗세이나 TaqMan법에 이용되는 리포터 형광색소로서는, FAM(6-카르복시-플루오레세인)와 같은 플루오레세인계 형광색소가 바람직하고, 퀀처 형광색소로서는 TAMRA(6-카르복시테트라메틸로다민)와 같은 로다민계 형광색소가 바람직하다. 이들의 형광색소는 공지이고, 시판의 리얼타임 검출 PCR용 키트에 포함되어 있으므로 그것들을 이용할 수가 있다. 리포터 형광색소 및 퀀처 형광색소의 결합 위치는 특히 한정되지 않지만, 통상, 프로우브의 올리고뉴클레오티드부의 일단(바람직하기로는 5' 말단)에 리포터 형광색소가, 타단에 퀀처 형광색소가 결합된다. 또, 올리고뉴클레오티드에 형광색소를 결합하는 방법은 공지이고, 예를 들면 Noble et al., (1984), Nuc. Acids Res., 12: 3387-3403 및 Iyer et al., (1990), J. Am. Chem. Soc., 112: 1253-1254에 기재되어 있다.

TaqMan법 자체는 공지이고, 이를 위한 장치 및 키트도 시판되고 있으므로, 본 발명에서는 이러한 시판의 장치 및 키트를 이용할 수도 있다. 예를 들면, 일본국 특허 제 2,825,976호에 기재된 방법을 따르던가, PE Biosystems 사제의 ABI PRISM 7700 배열 결정 시스템·유저 매뉴얼에 따르면 좋다.

(8) 질량 분석계를 이용한 유전자 다형 검출법(mass array)

Mass array법은 다형에 의해 생기는 질량의 차를 검출하는 방법이다. 구체적으로는, 검출하고자 하는 다형을 포함한 영역을 PCR로서 증폭시킨 후, SNP 위치 직전에 신장반응용 프라이머를 하이브리다이즈시키고, ddNTP/dNTP 혼합물을 포함한 반응액, 예를 들면, ddATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 반응액을 이용하여 신장반응을 행함으로서 SNP에 따라 길이가 다른 단편이 생성된다. 이 생성 산물을 정제하고, MALDI-TOF 질량 분석계 등에 의해 분석함으로서 질량수와 유전자형과의 대응을 해석할 수 있다(Pusch, W., Wurmbach, JH., Thiele, H., Kostrzewa, M., MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping, Pharmacogenomics, 3 (4): 537-48 (2002)). 이 방법은, 예를 들면, Sequenom Mass ARRAY 하이 쓰루풋(high throughput) SNP 해석 시스템을 이용하여 간편하게 실시할 수가 있다 (http://www.sequenom.com/Files/applications/hme_assay.html).

(9) 그 외의 검출법

사람 IRS-2 유전자의 SNPs의 검출은 종래부터 DNA에 대해서 그의 염기배열의 결정법으로서, 또한 변이 검출법으로서 알려져 있는 이하에 드는 바와 같은 방법에 의해도 실시할 수가 있다.

(a) 배열 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR-SSO법;

각 변이에 대한 프로우브를 담체에 고상화하고, 이것에 검체(유전자 증폭 산물)를 하이브리다이즈시켜, 미스매치의 유무에 의한 하이브리다이제이션의 효율의 차를 판정하는 것.

(b) 점변이를 검출하는 PCR-SSP법;

점변이에 대응하는 염기를 3' 말단에 설정한 유전자 증폭용 배열 특이적 프라이머를 이용하여 프라이머의 3' 말단이 상보적인지 아닌지에 의해 PCR에 의한 증폭 효율에 현저한 차가 생기는 것을 이용한 것.

(c) PCR-DGGE(변성제 농도 구배 겔 전기영동)법;

변이 DNA 단편과 정상 DNA 단편을 혼합하여 하이브리드 결합시킨 후, 요소, 포름아미드 등의 변성제의 농도가 서서히 높아지고 있는 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동하면, 미스매치가 없는 호모 2본쇄에 비해, 보다 낮은 농도의 변성제의 위치에서 1본쇄로 해리한다. 이 1본쇄 DNA는 2본쇄 DNA에 비해 영동속도가 빠르기 때문에, 이동도의 차를 비교함으로서 1염기의 변이를 검출할 수 있다.

(d) PCR-DGGE/GC 클램프법(Shefield, V. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 232-236 (1989));

상기 PCR-DGGE법에 더하여, GC함량의 높은 영역을 변이 핵산의 검출대상인 DNA 단편에 연결함으로서 복수의 염기치환, 결손, 부가 및 삽입이 있는 경우의 검출의 결점을 보충한 방법이다. 이 방법은 특히 변이 검출의 대상 DNA 단편에 GC 클램프를 부가하는 공정을 필요로 한다.

(e) RNase 보호 앗세이법(Finkelstein, J., et al., Genomics, 7, 167-17 2(1990))

(f) in situ RT-PCR(Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166(1993))

(g) in situ 하이브리다이제이션

(h) 서던 블롯(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press: NY.(1989))

(i) 닷 하이브리다이제이션법(Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503-517(1975) 등 참조),

(j) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH: Takahashi, E., et al., Hum. Genet., 86, 1416 (1990))

(k) 경합적 게노믹·하이브리다이제이션(Comparative Genomic Hybridization: CGH: Kallioneimi, A., et al., Science, 258, 818-821 (1992)), (Spectral karyotyping: SKY: Rowley, J. D., et al., Blood, 93, 2038-20 42(1999))

(l) 효모 인공 염색체(YAC) 벡터의 클론을 프로우브로 하는 방법(Lengauer, C., et al., Cancer Res., 52, 2590-2596 (1992)).

이렇게 하여 사람 IRS-2 유전자의 다형(SNPs) 및 할로 타입을 검출할 수 있다.

본 발명에 따르는 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 판정은 상기에 따라서 검출된 사람 IRS-2 유전자 다형의 존재를 지표로서 다형의 존재가 확인되는 검체의 경우에, 이 검체는 그의 리스크가 높은 것으로 판정한다.

이와 같이 리스크가 높으면 판정된 환자는 약제를 투여하기 전에, 약제 기인성 과립구 감소증을 일으키는 리스크의 존재를 확인할 수 있기 때문에, 약제 투여 등에 의한 과립구 감소증의 발증을 미연에 방지할 수가 있다.

특히, 본 발명에 따르는 사람 IRS-2 유전자의 SNPs의 검출은 사람에 있어서의 약제 기인성 과립구 감소증 발증 위험 인자의 존재의 검출에 유효하고, 이 SNPs의 검출에 의해 사람 약제 기인성 과립구 감소증의 발증 위험 인자의 검출이 가능하다.

따라서, 본 발명은 사람 IRS-2 유전자의 SNPs 검출의 대상이 되는 피검자의 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 존재를 사람 IRS-2 유전자의 유전자 다형의 존재를 지표와해 판정하기 위한 당해 유전자의 유전자 다형의 검출 방법을 제공할 수가 있다.

올리고뉴클레오티드

본 발명은 PCR법을 채용하는 본 발명 판정(검출) 방법에서 이용되는 유전자 다형 검출용 프라이머 또는 프로우브로서의 올리고뉴클레오티드도 제공한다. 이 올리고뉴클레오티드는 사람 IRS-2 유전자의 변이 부분(SNPs)을 포함한 특정 배열 부분을 특이적으로 증폭할 수 있는 것인 한, 특히 제한은 없다. 이 올리고뉴클레오티드는 사람 IRS-2 유전자의 배열 정보에 의하여 통상의 방법에 따라서 적당히 합성, 구축할 수가 있다.

그 합성은, 보다 구체적으로는, 통상의 포스포로아미다이트법, 인산트리에스테르법 등의 화학 합성법에 의할 수도 있으며, 또한 시판되고 있는 자동 올리고뉴클레오티드 합성 장치, 예를 들면(Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: Pharmacia제) 등을 사용하여 합성할 수도 있다. 2본쇄 단편은 화학 합성한 1본쇄 생성물과 그 상보쇄를 합성하고, 양자를 적당한 조건하에서 어닐링시키던가 또는 적당한 프라이머 배열과 DNA 폴리메라제를 이용하여 상기 1본쇄 생성물에 상보쇄를 부가시킴으로서 얻을 수 있다.

상기 프로우브 또는 프라이머로서 이용되는 올리고뉴클레오티드의 매우 적합한 것으로는 사람 IRS-2 유전자의 변이를 함유하도록 설정된 DNA 단편에 대응하는 부분 올리고뉴클레오티드로서, 적어도 10개, 통상 10～35개 정도가 연속한 염기를 가지는 것을 예시할 수 있다. 프라이머 1쌍으로서는 사람, IRS-2 유전자(게놈 배열)의 SNP를 끼우도록 설계, 합성된 2개의 올리고뉴클레오티드 배열을 가지는 것일 수 있다. 프로우브로서 이용되는 올리고뉴클레오티드는 양성 클론 그 자체를 이용할 수도 있다.

상기 프로우브 또는 프라이머로서 이용되는 올리고뉴클레오티드의 바람직한 것으로서는 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 4587 번째의 C로부터 A로의 변이(C-4587A), 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 2510번째의 AT가 결실한 변이(AT-2510del), 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 1164번째의 A로부터 C로의 변이 (A-1164C), 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 15870번째의 A로부터 G로의 변이(A15870G), 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 29793번째의 A로부터 G로의 변이(A29793G) 및 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 31532번째의 C가 결실한 변이(C31532del)의 적어도 어느 1개를 포함하도록 설정된 DNA에 대응하는 부분 올리고뉴클레오티드로서, 적어도 10개, 바람직하기로는 적어도 15개가 연속한 염기를 가지는 것을 들 수 있다.

그 구체적인 예로서는 후기 실시예에 나타낸 배열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 및 13-16으로 표시되는 포워드·프라이머 및 리버스·프라이머 및 배열번호 3, 6, 9, 12 및 17로 표시되는 다이렉트 시퀸스용 올리고뉴클레오티드·프라이머를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자 특이적 프로우브로서는 상기 C-4587A, AT-2510del, A-1164C, A15870G, A29793G 및 C31532del의 어느 하나를 검출할 수 있는 것이면 좋다.

판정용 키트

본 발명 판정(검출) 방법은 검체중의 사람 IRS-2 유전자의 SNPs의 검출을 위한 시약 키트를 이용함으로서 보다 간편하게 실시할 수 있다. 본 발명은 이러한 판정용 키트도 제공한다.

본 발명 키트의 1개는 적어도 사람 IRS-2 유전자의 6개의 SNPs의 DNA 단편인 염기배열 또는 그의 상보적 염기배열의 일부 또는 모두에, 또는 변이 부위의 1 염기전 또는 수염기전의 배열로 되는 배열에 하이브리다이즈하는 DNA 단편을 필수 구성 성분으로서 포함한다. 또한, 본 발명 키트의 다른 1개는 상기 변이 부위를 포함한 수개의 염기의 핵산 배열을 인식하는 제한효소, 예를 들면 Afa I를 필수 구성 성분으로서 포함한다.

본 발명 키트에 있어서의 다른 성분으로서는 표지제, PCR법으로 필수적인 시약(예를 들면, TaqDNA 폴리메라제, 데옥시뉴클레오티드 3인산, DNA 증폭용 프라이머 등)을 예시할 수가 있다. 표지제로서는 방사성 동위 원소, 발광 물질, 형광 물질 등의 화학 수식 물질 등을 들 수 있으며, DNA 단편 자신이 미리 이 표지제로 콘쥬게이트되어 있어도 좋다. 또한, 당해 키트에는 측정의 실시의 편익을 위해서 적당한 반응 희석액, 표준 항체, 완충액, 세제, 반응 정지액 등이 함유되어 있어도 좋다.

본 발명의 상기 판정 방법을 이용하면, 사람에 있어서의 약제 기인성 과립구 감소증을 일으킬 가능성이 있는 유전자의 다형을 검출하고, 이것을 지표로서 사람 약제 기인성 과립구 감소증 리스크를 검사하는 방법, 특히 베스나리논 등의 약제 투여에 의해 약제 기인성의 과립구 감소증(무과립구증도 포함한다)의 부작용이 보고되고 있는 약제의 투여전에, 그의 투여에 의한 과립구 감소증 발증 리스크를 검사하는 방법 및 이 방법으로 이용하는 진단제 및 진단용 키트를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 l

(a) 약제 복용에 의해 생긴 과립구 감소증에 대한 관련 유전자 다형의 탐색

약제 복용에 의해 생긴 과립구 감소증에 대한 관련 유전자 다형을 탐색하기 위해서, 베스나리논(3,4-디히드로-6-[4-(3,4-디메톡시벤조일)-1-피페라니딜]-2(1H)-퀴놀린)를 복용한 환자를 대상으로 했다.

베스나리논은, 일본에서는 만성 심부전(경증～중등증)에 적응증을 가지지만, 시판 후에 이 약제의 투여에 의해 약제 기인성의 부작용으로서 백혈구 감소, 과립구 감소, 무과립구증 등이 보고되고 있으므로, 약제 투여에 대해서는 이들의 부작용에 대한 관찰과 빈번한 과립구의 검사를 실시하는 것이 필요로 되어 있다.

베스나리논을 복용하여, 1991년 5월부터 1996년 10월 사이에 베스나리논의 과립구 감소증 원인 구명에 협력하기로 구두로 동의를 얻고, 혈액 검체 제공의 허락을 받은 환자 가운데, 윤리 지침에 따라 2001년 7월부터 2001년 12월 사이에, 유전자 해석에 협력하기로 재동의를 얻은 환자 84명(남성 : 여성비=1.21 : 1)을 대상 환자로 했다. 상기 재동의를 한 환자의 혈액 검체 또는 그에 유래하는 세포 검체로부터, 통상의 방법에 의해 게놈 DNA를 추출하여 이하의 시험에 제공했다.

(b) 대상 환자 분류기준

대상 환자를 이하의 기준으로 과립구 감소증 발증 환자군과 비발증 환자군의 2군으로 분류했다.

대상 환자 중, 베스나리논 투여전의 백혈구 또는 호중구 수가 투여 후에 반수 이하로 저하한 환자로서 백혈구 수 또는 호중구 수가 각각 2000 또는 1000/㎣ 이하로 된 환자를 발증예(과립구 감소증 발증 환자군)로 했다. 한편, 베스나리논을 90 일 이상 복약해도 투여전에 비교하여 과립구 감소가 인정되지 않는 환자를 비발증예(비발증 환자군)로 했다.

이들 각 군을 성별에 의해, 다시 2군으로 분류하여 전체 4군을 작성했다. 즉, 과립구 감소증 발증 환자 남성 13명(A 군) 발증 환자 여성 17명(B 군) 비발증 환자 남성 33 명(C 군), 비발증 환자 여성 21 명(D 군)으로 했다.

(c) 해석 대상 유전자 및 다형 (SNP)

사이토카인 관련, MHC 영역, G-CSF 관련, TNF-α관련, NF-κ관련, cAMP 관련, 칼륨·채널 관련 등의 유전자로부터 115의 후보 유전자를 선택했다.

이들 유전자의 일본인에 있어서의 다형의 유무를 검색하기 위해서 일본인의 다형 데이터베이스(JSNP:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.htmL)로부터, 이들 후보 유전자의 SNPs를 검색하여 188의 후보 SNPs를 선택했다.

(d) 해석 수법

SNP의 해석은 인베이더법을 이용하여 실시했다. 이 인베이더법은 이하의 문헌 (1) 및 (2)을 참조하여 실시했다.

(1) Lyamichev, V. et al., Nat. Biotechnol. 17: 292-296 (1999), 및

(2) 국제특허 공개 WO9823774호(98/6/4)

후보 SNP의 게놈 DNA 영역을 PCR법으로 증폭하기 위해서, JSNP로 검색한 SNP를 포함한 게놈 DNA 배열 정보에 의해 각 SNP 영역을 증폭하는 프라이머·세트를 설정하여 각 프라이머를 합성하였다.

후보 SNP의 유전자 다형을 판정하기 위한 인베이더·앗세이 시약은 JSNP 로 검색한 SNP를 함유하는 게놈 DNA 배열 정보에 의해 통상의 방법에 의해 작성했다.

각 PCR 반응은 1 ng 게놈 DNA를 주형으로 하여 실시했다. 15 μL의 반응액은 dNTPs(0.25mM), TaKaRa Ex Taq(Takara 사)에 첨부되어 있는 PCR 반응용 버퍼를 총반응량의 1/10양, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 각 세트(각 130 nM) 및 TaKaRa Ex Taq(Takara 사) (0.5U)를 함유하고 있었다. 각 샘플은 DNA Engine PTC-0200(MJ Research 사제)에 의해 증폭했다. PCR 반응은 94℃ 2분 후, 94℃ 30초, 56℃ 또는 58℃ 또는 60℃ 30초 및 72℃ 90초를 50사이클 행했다.

인베이더·앗세이 반응은 얻어진 PCR 산물을 10～1000배로 희석한 것에, 인베이더·앗세이 시약을 혼합하여 실시했다. 15 μL의 반응액은 5.5×Invader 버퍼 (2.75 μL), 10×Bioplex FRET Probe Mix(0.75 μL), Cleavase VIII 효소(200 ng/μL) (1 μL), PPI Mix(3 μL) 및 PCR 산물 희석물(7.5 μL)을 함유하고 있다. 반응은 62℃, 60～120분간의 조건으로 실시했다.

(e) 유전자형 판정법

유전자형은 인베이더·앗세이 반응 결과, 검출되는 2색의 형광강도에 의해 판정했다. 이렇게 하여 인베이더·앗세이에 의해 115 유전자에 존재하고 있는 188 개의 SNPs에 대해서, 대상 환자의 유전자형을 결정했다.

(f) 통계적 분석 방법

과립구 감소증 발증 환자군과 비발증 환자군에 있어서의 대립 유전자 빈도를, contingency χ제곱 테스트에 의해 비교했다. 오드 비는 브라운(Brown)법에 따라 평가했다(Brown, C. C., Am. J. Epidemiol., 113: 474-480(1981)) 오드 비의 95% 신뢰 구간은 Woolf 방법으로 산출했다.

(g) 결과

115 유전자에 존재하고 있는 188개의 SNPs에 대하여 상기 방법을 이용하여 분석한 결과, 통계학적으로 가장 유의한 차를 가진 다형은 Insulin receptor substrate 2(IRS-2)에 존재하고 있었다(SNP ID IMS-JST040476). 이 SNP는 대상 환자군에 있어서 하디-와인버그(Hardy-Weinberg) 평형 법칙에 따르는 것을 확인하였다.

이 결과로부터, 사람 IRS-2 유전자에 있어서의 SNP는 베스나리논 투여에 의한 과립구 감소증의 발증에 강하게 관련하며, 사람 IRS-2 유전자가 과립구 감소증의 발증에 중요한 역할을 가질 가능성을 시사하고 있다.

사람 IRS-2 유전자의 발현 산물은 인슐린 수용체 기질 단백 패밀리(IRSs; IRS-l, IRS-2, IRS-3, IRS-4)에 속하고 있다. 인슐린 수용체의 티로신 키나제가 활성화되면 티로신인산화된다. 인산화된 IRSs는 PI-3 키나제를 활성화 하여, 글루코오스 트랜스포터 4(GLUT-4)의 세포질로부터 세포막에의 수송을 촉진하고, 글루코오스의 취입을 촉진시키는 작용을 가지는 인슐린 작용을 발현시키는 것이 알려져 있다. 거기서, 사람 IRS-2 유전자와 베스나리논에 의한 과립구 감소증과의 관련을 다시 조사하기 위하여 사람 IRS-2 유전자의 다형 해석시험을 실시했다.

실시예 2 사람 IRS-2 유전자 다형과 약제 기인성 과립구 감소증과의 관련 해석

실시예 1에 기재된 환자 샘플을 사용하여 사람 IRS-2 유전자의 다형 해석을 아래와 같이 행했다.

(a) 사람 IRS-2 유전자의 스크리닝과 다형의 검출

전사 조절에 관련이 있는 프로모터 영역을 함유하는 IRS-2 유전자 전체를 스크리닝하기 위하여 GenBank(accession number XM_007095)로부터 입수한 사람 IRS-2 mRNA의 배열정보를 검색하여 얻어진 IRS-2 유전자를 함유하는 게놈배열을 GenBank(accession number AL162497 전장 14309bp)로부터 입수했다. 사람 IRS-2 mRNA의 배열과 IRS-2 유전자를 함유하는 게놈 배열의 상세한 비교를 행하여 사람 IRS-2 유전자 구조를 추정했다. 다만, 유전의 방향을 5'측에서 3'측으로 통일시키기 위하여 입수한 게놈배열은 그의 상보쇄를 이용하여 비교했다.

그 결과, 사람 IRS-2 유전자는 2개의 엑손으로 구성되어 있으며, 인트론을 함유하는 이 유전자의 전장은 32730bp인 것으로 해석되었다.

이 배열정보에 기초로 하여 프라이머를 설계하여 합성했다.

검체로서는 실시예 1의 대상 환자 중의 과립구 감소증의 발증예 12예 및 비발증예 12예의 각 게놈 검체를 이용했다.

각 PCR 반응은 5 ng의 게놈 DNA를 이용하여 실시했다. 10 ㎕의 반응액은 dNTPs(1.25 mM), 염화마그네슘(3.9 mM), 황산암모늄(16.6 mM), 트리스염산(67 mM, pH 8.8), β-메르캅토에탄올(10 mM), 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 각 세트(1.25 mM) 및 TaKaRa Ex Tag(Takara사)(0.5 U)를 함유하고 있다. 반응액에는 필요에 따라 최종 농도 10%가 되도록 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 가했다.

각 샘플은 DNA Engine PTC-0200 (MJ Research사제) 또는 Gene AmpPCR 시스템9700(PE Applied Biosystems)으로 증폭시켰다. PCR 반응은 95℃ 2분후, 94℃ 30초, 58℃ 또는 60℃ 30초, 72℃ 3분을 37사이클 행한 후, 72℃ 10분간에서 최종 신장반응을 행했다.

얻어진 PCR 산물을 빅다이 터미네이터 RR 믹스(BigDye^TM Terminator mix: PE Applied Biosystems)를 이용하여 반응시켰다.

유전자 다형은 ABI Prism 3700 DNA Analyzer(PE Applied Biosystems)로 염기배열 정보를 기초로, SEQUENCHER 3.1(Gene Codes 사제)를 이용하여 검출하여 사람 IRS-2 유전자 상의 위치를 확인했다.

(b) 검체의 증폭과 유전자형 판정법

상기 검출법으로 분류된 다형이, 대상 환자에 있어서 어떠한 유전자형의 분포를 나타내는지를 조사하기 위해서, 모든 게놈 DNA 검체에 대해서, 각 PCR 산물이 상기에서 분류한 유전자 다형을 포함하고 있도록 각 프라이머 세트를 이용하여 상기 기재와 동일하게 반응시켜, 해석을 행했다.

(c) 통계적 분석

실시예 1과 동일한 방법에 가하여, 톰슨 등의 방법(Thompson, E. A., et al., Am. J. Hum. Genet. 42: 113-124(1988))에 따라, 페어 와이즈 연쇄 불평형 계수(D' =D/Dmax 또는 D/Dmin)를 계산했다.

(d) 결과

상기 해석 결과, 본 실시예에 기초로 하여 해석한 모든 다형은 대상 환자군에서 하디-와인버그 평형 법칙에 따르는 것이 확인되었다.

본 해석의 결과, 베스나리논의 복용에 의해 유발되는 과립구 감소증과 강한 관련이 인정되는 6개의 다형과 그 통계 값을 표 1 내지 표 6에 나타낸다.

다형 유전자형	발증 N(%)	비발증 N(%)	χ²(df=1)	P	OR (95%CI)
C-4587A CC CA+AA 합계	7(25.0) 21(75.0) 28	29(59.2) 20(40.8) 49	8.36	0.0038	4.35 (1.56-12.16)

다형 유전자형	발증 N(%)	비발증 N(%)	χ²(df=1)	P	OR (95%CI)
AT-2510del AT ATdel+del 합계	7(24.1) 22(75.9) 29	28(57.1) 21(42.9) 49	8.02	0.0046	4.19 (1.51-11.64)

다형 유전자형	발증 N(%)	비발증 N(%)	χ²(df=1)	P	OR (95%CI)
A-1164C AA AC+CC 합계	8(26.7) 22(73.3) 30	29(59.2) 20(40.8) 49	7.90	0.0049	3.99 (1.48-10.73)

다형 유전자형	발증 N(%)	비발증 N(%)	χ²(df=1)	P	OR (95%CI)
A15870G AA AG+GG 합계	10(37.0) 17(63.0) 27	36(73.5) 13(26.5) 49	9.67	0.0019	4.71 (1.72-12.88)

다형 유전자형	발증 N(%)	비발증 N(%)	χ²(df=1)	P	OR (95%CI)
A29793G AA AG+GG 합계	11(36.7) 19(63.3) 30	39(73.6) 14(26.4) 53	10.90	0.00096	4.81 (1.84-12.56)

다형 유전자형	발증 N(%)	비발증 N(%)	χ²(df=1)	P	OR (95%CI)
C31532del CC Cdel+del 합계	9(33.3) 18.(66.7) 27	34(70.8) 14(29.2) 48	9.93	0.0016	4.86 (1.76-13.39)

표 중, "del"로 표시되는 다형은 결실 다형을 나타내고, "다형"으로 나타내고 있는 숫자는 IRS-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈 ATG의 A를 +1 로서 카운트한 것이다. 또, 숫자에 마이너스 (-)가 붙어 있는 것은 IRS-2 유전자의 코드, 영역의 번역 개시 코돈 ATG의 A로부터 5' 상류 측에 위치하고 있는 것을 나타내고 있다.

표1-6에 나타낸 바와 같이, 사람 IRS-2 유전자의 코드, 영역의 번역 개시 코돈으로부터 상류 4587번째의 C가 A에 변이한 다형 "C-4587 A"와 상류 2510번째의 AT가 결실한 다형 "AT-2510del"와 상류 1164번째의 A가 C로 변이한 다형 "A-1164C"와, 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 15870번째의 A가 G로 변이한 다형 "A15870G"와 29793번째의 A가 G로 변이한 다형 "A29793G"와 31532번째의 C 가 결실한 다형 "C31532del"의 6종의 다형의 몇개의 다형을 1개라도 가지는 환자의 경우는 베스나리논 복용 후의 과립구 감소증의 발증과 강한 관련이 관찰되었다. 이들 6개의 다형의 사람 IRS-2 유전자에 있어서의 위치 관계를 도 1에 나타낸다. 또, 도 1 중, +1은 번역개시 코돈 ATG의 A를 나타낸다.

이들 다형 사이에 연쇄 불평형이 성립되는지의 여부를 검토한 결과를 표 7 에 나타낸다.

SNP	D’
SNP	C-4587A	AT-2510del	A-1164C	A15870G	A29793G
AT-2510del	1.000	-	-	-	-
A1164C	1.000	1.000	-	-	-
A15870G	1.000	1.000	1.000	-	-
A29793G	0.956	0.956	0.957	1.000	-
C31532del	0.952	0.953	0.953	1.000	1.000

표 7로부터, 베스나리논 복용 후의 과립구 감소증 발증에 강하게 관련하고 있던 다형은 모든 다형이 거의 완전한 연쇄 불평형에 있는 것으로 판단된다. 즉, 사람 IRS-2 유전자의 코드 영역의 상류 4587번째의 대립유전자가 변이형 A를 가지면, 베스나리논 복용 후의 과립구 감소증 발증에 강하게 관련하고 있는 다른 5개소에 존재하고 있는 다형도 변이형을 가지는 것으로 판단된다.

*이들 결과는 사람 IRS-2 유전자에 있어서의 이들 6개소의 변이가, 베스나리논 복용 후의 과립구 감소의 발증에 중요한 역할을 가지고 있는 것을 강하게 시사하고 있다.

최근, 스캇처(Schacher, D. H., et al., J. Immunol., 164:113-120(2000)) 등은 골수아계 세포 HL-60 세포가 DMSO 자극으로 과립구로 분화할 때에 IRS-2 단백질의 발현 레벨이 상승하는 것을 보고했다. 이 보고는 IRS-2가 과립구분화에 강하게 관련되고 있는 것을 시사하고 있다. 본 발명자들이 발견한 사람 IRS-2 유전자 변이 중 3개의 변이(C-4587A, AT-2510del 및 A-1164C)는 사람 IRS-2 유전자의 전사량의 조절을 담당하고 있는 프로모터 영역에 위치하고 있는 것으로부터, 이들 변이가 인정되는 경우는 IRS-2의 전사량이 억제되어 과립구에의 분화가 유도되기 어려워진다는 생각이 지지를 받을지도 모른다.

실시예 3

본 실시예는 본 발명의 사람 IRS-2 유전자의 6개의 다형을 검출하는 별법에 관한 예로서 하기 (a) 및 (b)에 나타난 바와 같이 실시되었다.

(a) 직접 염기 결정법

PCR 산물이 본 발명과 관한 6개의 다형을 포함되도록, 표 8에 나타나는 포워드 프라이머(배열번호: 1, 4, 7, 10, 13 및 15) 및 리버스 프라이머 (배열번호: 2, 5, 8, 11, 14 및 16)를 이용하여 DNA Engine PTC-0200(MJ Research) 또는 GeneAmpPCR 시스템 9700(PE Applied Biosystems)으로 각 DNA 단편을 증폭시켰다. 각 PCR 반응은 95℃ 2분 후, 94℃ 30 초, 표 8에 나타내는 각 어닐링 온도에서 30 초, 72℃에서 표 8에 나타내는 각 신장반응 시간을, 37사이클 행한 후, 72℃ 10분간에서 최종 신장반응을 행했다. 어닐링, 온도 및 신장 반응 시간은 하기 표 8에 나타낸 바와 같으며, 각 DNA 단편에 대해서, 각각 58℃～60℃의 온도 및 0.5분～3분간의 시간이다.

	포워드 프라이머	AL162497 에 대응하는 배열번호	리버스 프라이머	AL162497 에 대응하는 배열번호	어닐링 온도(℃)	신장시간 (min)	DMSO
C-4587A	배열번호: 1	131420-131399	배열번호: 2	130318-130339	60	3	-
AT-2510del	배열번호: 4	128930-128911	배열번호: 5	127491-127510	60	3	-
A-1164C	배열번호: 7	127837-127818	배열번호: 8	126460-126479	60	3	+
A15870G	배열번호: 10	110260-110240	배열번호: 11	109859-109879	60	3	-
A29793G	배열번호: 13	96209-96190	배열번호: 14	96070-96091	60	3	-
C21532del	배열번호: 15	94616-94595	배열번호: 16	93139-93159	60	3	-

반응 용액의 조성은 실시예 2-(a)에 나타낸 바와 같다. 다만, "A-1164C"를 검출하기 위한 반응 용액에는 최종 농도 10%가 되도록 DMSO를 가했다(표 8의 DMSO의 항 참조).

표 8 중, "A29793G"의 검출에 이용한 리버스 프라이머(배열번호: 14)의 23 번째의 G는 제한효소 Afa I 인식 부위를 도입하기 위해서 넣어진 변이이다.

"A29793G"의 변이 검출 이외는 뉴클레오티드 직접 염기배열 결정법 [다이데옥시법(Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977) 또는 Maxam-Gilbert method(Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]로 다형 검출을 행했다. 이용한 프라이머를 표 9에 나타낸다(배열번호:3, 6,9, 12 및 17).

	시퀀스 반응에 이용한 프라이머	AL162597에 대응하는 배열번호
C-4587A	배열번호: 3	130343-130363
AT-2510del	배열번호: 6	128581-128562
A-1164C	배열번호: 9	126912-126929
A15870G	배열번호: 12	110249-110231
C31532del	배열번호: 17	94556-94537

(b) PCR-RFLP (제한효소 단편 장다형) 분석법

"A29793G"의 검출에는 PCR-RFLP(제한효소 단편 장다형) 분석법을 이용하였다. 즉, 20 μL의 반응용액은 10 μL의 PCR 산물, 2단위의 제한효소 Afa I(10 units/ mL; Takara사제) 및 제한효소에 첨부의 2 μL의 10 × Buffer T로 되어 있으며, 이것의 최종 농도 0.01%가 되도록 BSA를 가하고, 37℃에서 16시간 인큐베이션한 후, 4%의 아가로스 겔로 제한효소 처리산물을 분리했다.

이렇게 하여 환자 검체로부터 추출한 DNA를 상기 실시예에 나타낸 사람 IRS-2 유전자의 6개의 다형의 몇 개의 검출 방법으로 적응하면, 미리 약제를 투여하기 전에, 약제투여에 의해 약제 기인성의 과립구 감소증(무과립구증도 포함한다)이 생길 가능성의 유무, 즉 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크를 판정 할 수가 있다. 이와 같이, 본 발명에 의하면, 특히 환자 검체의 DNA를 조사함으로서 베스나리논 투여에 의한 과립구 감소증 발증 리스크를 검사, 판정할 수가 있다.

<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> METHOD OF JUDGING RISK FOR ONSET OF DRUG-INDUCED GRANULOCYTOPENIA <130> OP0046 <150> JP-P-2003-281937 <151> 2003-07-29 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 1 accactgtat ttgtgacaac tc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 2 aaatatggat cagtctcttt cc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 3 atgttcattt tatgagggag g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 4 aactgccaat ccagagctgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 5 tctcaccaca ccgcttcaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 6 ccacattttc ttcaagcacc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 7 gagcttgctg ggatctgaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 8 atgtgactcg gcgttacgca 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 9 ccttgcagtg gaagcatg 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 10 ctatcccgat tcctagatgt c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 11 gactcatctg tgactaactc c 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 12 cctagatgtc agcttgccc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 13 tctggaactc cagagattgc 20 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 14 tgctgagcgt cttcttttaa tggta 25 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 15 gaggcttttt tagaggaaga cc 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 16 catgtcatgg agggagcatt c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for amplification of SNPs of Insulin receptor substance-2 (IRS-2) <400> 17 gcaaaagtct tcctgcttcc 20

Claims

사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자에 하이브리다이즈할 수 있는 유전자 다형 검출용 프라이머 또는 프로우브로서의 올리고뉴클레오티드로, 이 올리고뉴클레오티드는 이하의 (f)인 올리고뉴클레오티드;
(f) 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 코드 영역의 번역 개시 코돈으로부터 31532번째의 C가 결실된 유전자 다형 부위를 포함한 배열인 올리고뉴클레오티드.
사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자에 하이브리다이즈할 수 있는 유전자 다형 검출용 프라이머로, 이하의 (f)인 올리고뉴클레오티드;
(f) 배열번호: 17로 나타나는 배열의 올리고뉴클레오티드.
청구항 제1항에 기재된 올리고뉴클레오티드를 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 다형 검출용 프라이머 또는 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 다형 검출용 프로우브로서 함유하는 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정용 키트.
청구항 제3항에 있어서, 청구항 제2항 기재의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 키트.
청구항 제1항에 기재된 올리고뉴클레오티드를 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 다형 검출용 프라이머 또는 사람 인슐린 수용체 기질-2 유전자의 다형 검출용 프로우브로서 포함하는 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크의 존재를 판정하기 위한 당해 유전자의 유전자 다형 검출용 키트.
청구항 제5항에 있어서, 청구항 제2항 기재의 올리고뉴클레오티드를 포함한 키트.