TWI351436B - Method for detecting a risk of the development of - Google Patents

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1351436 九、發明說明： f發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種將人類胰島素受體基質々基因之基因 夕型性的存在作為指標用以判定藥劑起因性顆粒球減少症 發症風險的方法，檢測成為上述風險判定指標之基因多型 性的方法，以及制於該等方法之寡核㈣以及判定及/或 檢測用套組。 【先前技術】 現代醫療中’對於各種疾病之治療•進展預防以使用藥劑 之藥物療法為主。以藥物療法中所使用之低分子化合物為 主的藥劑原本對於人類來說幾乎全㈣—種異物，並發現 經由其投藥會產生與治療效果相反之各種副作用。該副作 用屢屢造成不得不放棄藥物治療之情形。亦存有對於罹患 某種疾病之患者雖為有用藥劑’❻因嚴重副作用而中止開 發之藥劑，又亦存有要求嚴格檢查該藥劑之投藥方法或發 現副作用的藥劑。 據美國的統計，發現藥劑所帶來之副作用的報告亦上升 至-年200萬件…有報告指出1〇萬人以上死於副作用 (jama，279，12_携)）。在日本，醫藥品之副作用報告 亦含有重複報告，存有2萬6545件病例，死亡報告亦僅於 2000年度一年間報告即有1239件（厚生勞動省、平成Η年6 月6曰、眾議院答辯第55號答辯書）。 起因於藥劑投藥之副作用中，顆粒球減少症係致死性副 作用。特別是’若顆粒球減少則易感染，達到無顆粒球症 95105.doc 1351436 、之If形時入肺炎、敗血症等之嚴重感染症之危險 ‘非常高。作為造成該顆粒球減少症之原因藥劑，眾所周 知主要有解熱鎮痛藥（胺基比林）、抗生物質（氣黴素）、抗甲 狀腺藥（memkaz〇le)、抗痙攣藥、抗糖尿病藥以及利尿藥 等。有人認為該等藥劑所造成之副作用的發症與其投藥量 並無太大關聯，而與患者體質例如過敏體質、特異體質等 有關聯。因此’副作用發症之預測較為困難。為將副作用 發症防範於未然，有必要充分注意對包含各個患者之盆他 科的藥物以詳細問診與血液檢查等。再者…旦作為副 作用之顆粒球減少症發症之情形時，有要求住院等之快速 對應。 •又，作為造成顆粒球減少症之原因藥劑之其他藥劑，眾 所周知有抗精神病藥二苯幷二氮平（氣&平該藥劑儘管期 待有較高的有效性，但於日本國内之臨床試驗已中斷。 進而，作為其他藥劑，存有包含PDE3阻礙作用與針對於 K通道之作用的維司力農。該藥劑係有效作為心律不整發現 率較低且心臟病（心力衰竭發症、住院等）之發症率亦較低之 強心藥者，但因於其投藥中繼白血球減少、顆粒球減少之 後產生無顆粒球症的副作用，故而被嚴格限制使用。 於人類基因組解析中，一鹼基多型性（single nucle〇tide polymorphisms : SNPs，單核苷酸多態性）係頻率最高之基 因多型性標定物。至今為止，該SNP顯現有於關聯於常見 、 之疾患、藥劑反應等之人類基因組解析中係有用者之情形 VJ (參照非專利文獻1、2以及3)。又，眾所周知有複數個使用 95105.doc 1351436 SNPs之單體型解析，其於解析遺傳性較為複雜的疾病中之 疾病感受性方面係有用者之情形（參照非專利文獻4以及 5)。實際上，如阿茲海默氏病以及高血壓症之類疾病已經 使用該方法正在集中性解析（Jeune maitre，X., et al.，Am. J. Hum. Genet., 60, 1448-1460(1997) ； Martin, E.R., Am. J. Hum. Genet” 67，383-394(2000)) ° 近年來，隨著基因組解析之進步，於藥劑開發過程中， 毒理基因組學日益發展，該毒理基因組學係研究對於作為 藥物代謝酶之細胞色素P450(CYP)的藥劑作用》其中，提出 有藉由研究各個患者，與如上所述之藥劑起因性副作用之 關係中明確特定基因多型性與藥劑感受性/反應性之間關 聯的研究，從而期待確立所謂最適當治療法之情形。 [非專利文獻 1] Brookes, A.J.，"The essence of SNPs", Gene，USA, (1999)，234, 177-186 [非專利文獻2] Cargill，M，et al·，"Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes", Nature Genet., USA, (1999), 22, 231-238 [非專利文獻 3] Evans, W.E., & Relling, M.V.， "Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics", Science, USA, (1999), 286, 487-491 [非專利文獻 4] Stephens，J.C·，et al·，"Dating the origin of the CCR5-Delta32 AIDS-resistance allele by the coalescence . of haplotypes", Am. J. Hum. Genet., USA, (1998), 62, 'V 1507-1515 [非專利文獻 5] Tishkoff，S.A.，et al·，"The accuracy of statistical methods for estimation of haplotype frequencies: an example from the CD4 locus", Am. J. Hum. Genet., USA, (2000), 67, 518-522 [發明所欲解決之問題] 本發明之主要目的在於提供一種將人類胰島素受體基質 -2基因之存在作為指標從而判定藥劑起因性顆粒球減少症 發症風險的方法，或檢測成為上述風險判定指標之基因多 型性的方法。 【發明内容】 本發明者們為解決上述課題，首先選擇涉及115種細胞因 子關聯、MHC區域、G-CSF關聯、TNF-α關聯、NFk關聯、 cAMP關聯以及K-通道關聯等之候補基因作為多型性解析 用基因，且自日本人之多型性資料庫檢索該等候補基因之 SNPs，並已選擇188個候補SNPs » 其次，關於該等所選擇之SNPs，測定出由於特定藥物投 藥而造成發症之顆粒球減少症發症患者群與非發症患者群 兩個群體之檢測體基因組DNA中所顯現的該等SNPs之頻 率。其結果為，確認有於上述兩個群體間表示統計學上有 意義差的SNPs係存在於胰島素受體基質-2基因（Insulin receptor substrate 2 : IRS-2)(J-SNP ID : IMS-JST040476)(以 下，稱為「IRS-2基因」）上之情形。 本發明者們進一步針對於該人類IRS-2基因多型性與藥 劑起因性顆粒球減少症之關聯反覆研討，其結果為確認有 95105.doc 1351436 與由於服用特定藥劑所誘發之顆粒球減少症關聯較強的合 計六個人類IRS-2基因之SNPs。 根據該等所特定之SNPs解析，發現有可判定（預測診斷） 針對於人類各種疾病的藥劑起因性副作用、特別是藥劑起 因性顆粒球減少症的發症風險。本發明係將相關知識作為 基礎而完成者。 本發明係提供一種於下述（1)〜〇9)中所示之判定藥劑起 因性顆粒球減少症發症風險之存在的方法，或檢測成為上 述風險判定指標之基因多型性標定物的方法，以及使用於 該等方法的寡核苷酸以及套組。 (1) 一種藥劑起因性顆粒球減少症發症風險判定方法，其 係檢測人類鮮2基因之基因多型性，並將其作為指標從: 判定藥劑起因性顆粒球減少症發症風險之存在者。 (2) -種檢測基因之基因多型性的方法，該基因係將人類 心2基因之基因多型性之存在作為指標，用以判定受檢者 之藥劑起因性顆粒球減少症發症風險之存在者。 (3) —種檢查方法’其係檢測人類胰島素受體基質-2基因 因多錄’並將其作為指標從而檢查藥劑起因性顆粒 球減少症發症風險者。 (4) 如上述⑴〜（3)之方法，其係將人類胰島素受體 =選：包含下述(aMf)之群之至少一個基因多型性之 險之存払’従而判定藥劑起因性顆粒球減少症發症風

⑷自編碼區域之轉_始密碼子上游第4587號 中之野生 95105.doc 1351436 型（C)突變為A之多型性， (b)自編碼區域之轉譯起始密碼子上游第251〇號中之野生 型（AT)缺失之多型性， («0自編媽區域之轉譯起始密碼子上游第1164號中之野生 型（A)突變為C之多型性， (d) 自編碼區域之轉譯起始密碼子之第ι587〇號中之野生 型（A)突變為g之多型性， (e) 自編碼區域之轉譯起始密碼子之第29793號中之野生 型（A)突變為G之多型性，以及 (f) 自編碼區域之轉譯起始密碼子之第31532號中之野生 型（C)缺失之多型性。 (5)如上述⑴〜⑷之方法，其中基因多型性之檢測係藉由 選自包含核芽酸直接驗基序列測定法、對立基因特異性寡 核苷酸（ASG)·斑點雜交分析、—驗基引子延伸法、卩⑶(聚 合酶鍵反應法）-單鏈高次構造多態性（sscp)分析、pcR限 制酶片段長度多型性（RFLp)分析、異物入侵法、同步定量 咖檢測法以及使用f譜儀之基因多型性檢測法 array ’質量陣列）之群之至少一種方法而實行。 /6)如上述（5)之方法，其中基因多型性之檢測係藉由㈣ 鲅直接驗基序列測定法而實行。 ⑺如上述（5)之方法，其中基^魏之檢測 限制酶片段長度多型性（RFLp)分析而實行。 _ (:)如上述⑺之方法，其”CR•限制酶片段 ⑽⑺分析係使用用讀測人類騰島素受體基h基因中 95I05.doc v 1351436 自編碼區域之轉譯起始密碼子之第29793號中之A突變為G 之限制酶Afa I而進行者。 (9) 一種寡核苷酸，其係作為於人類胰島素受體基質_2基 因中可雜交的基因多型性檢測用引子或探針者，且係選自 包含下述（a)-(f)之群者： (a) —種寡核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質_2基因 中自編碼區域之轉譯起始密碼子上游第4587號中之c突變 為A之基因多型性部位的序列； (b) —種寡核苷酸’其係包含人類胰島素受體基質_2基因 0 中自編碼區域之轉譯起始密碼子上游第251〇號中之AT缺失 之基因多型性部位的序列； (c) 一種寡核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質_2基因 中自編碼區域之轉譯起始密碼子上游第1164號中之A突變 為C之基因多型性部位的序列； (d) —種寡核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質_2基因 中自編碼區域之轉譯起始密碼子之第1587〇號中之A突變為 G之基因多型性部位的序列； _ (e) —種寡核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質_2基因 中自編碼區域之轉譯起始密碼子之第29793號中之a突變為 G之基因多型性部位的序列；以及 (0—種寡核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質_2基因 中自編褐區域之轉譯起始密碼子之第31532號中之C缺失之 基因多型性部位的序列。 (10) —種寡核苷酸’其係於人類胰島素受體基質_2基因中 95105.doc 12· 1^51436 可雜交的基因多型性檢測用引子者，且係選自包含下述 U)-(d)以及⑺之群者： (a) —種寡核苷酸，係以序列號：3表示之序列， (b) —種募核苷酸，係以序列號：6表示之序列， (C) 一種寡核苷酸’係以序列號：9表示之序列， (d) —種寡核苷酸，係以序列號：丨2表示之序列， (f)一種募核苷酸，係以序列號：17表示之序列。 (11) 一種藥劑起因性顆粒球減少症發症風險判定用套 組，其係包含如上述（9)之寡核苷酸，作為人類胰島素受體 基質_2基因之多型性檢測用引子或人類胰島素受體基質_2 基因之多型性檢測用探針者。 ()如上述（1丨）之套組’其中包含如上述（1〇)之寡核苷酸。 (13)如上述(11)之套组，其㈣含上述⑺中⑷之募核苷 酸與限制酶仏1而用以檢測人類騰島素受體基質·2基因中

自編碼區域之轉譯起始密碼子之第29793號中Α突變為G 者0 (⑷如上述⑴之方法，其中使用上述（9)或⑽之寡核普 酸，判定由於維司力農投藥所造成之藥劑起因性顆粒球減 少症發症風險。 ()述⑴之方法，其巾使用上述（9)巾⑷之寡核芽酸 與限制酶Afa I，判定由於祕 ;維司力農投藥所造成之藥劑起因 性顆粒球減少症發症風險。 (16) —種基因之基因多型^ ^ ^ 注才欢測用套組，其係包含上述

(9)之寡核苷酸作為人類腌 類姨島素受體基質-2基因之多型性檢 95105.doc 測用引子或人類姨島素受體基質_2基因之多型性檢測用探 針用以判疋藥劑起因性顆粒球減少症發症風險之存在者。 ()如上述（16)之套紅，其令包含如上述（ι〇)之寡核苦酸。 (18) 如上述⑽之套组’其係包含上述⑺争⑷之寡核苦 酸”限制酶Afa I用以檢測人類胰島素受體基質_2基因中自 編碼區域之轉譯起始密碼子之第29793號中A突變為g者。 (19) 如上述(2)之方法，其中使用上述(9)或(1〇)之寡核苷 酸’檢測用以判定由於維司力農投藥所造成之藥劑起因性 顆粒球減少症發症風險的基因多型性。 (20) 如上述（2)之方法，其中使用上述（9)中⑷之寡核苦酸 與限制酶Afa I’檢測用以判定由於維司力農投藥所造成之 藥劑起因性顆粒球減少症發症風險的基因多型性。 (21) 如上述（3)之方法，其中使用上述或（1〇)之寡核苷 酸’檢查由於維司力農投藥所造成之藥劑起因性顆粒球減 少症發症風險。 (22) 如上述（3)之方法，其中使用上述（9)中（e)之寡核苷酸 與限制酶Afa I，檢查由於維司力農投藥所造成之藥劑起因 性顆粒球減少症發症風險。 【實施方式】 本說明書中之胺基酸、肽、鹼基序列以及核酸等之簡碟 表示法係遵照IUPAC-IUB之規定 〔IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. j. Biochem.，138 : 9(1984)〕、「用以作成包含鹼基序列或胺基 酸序列的說明書等之指南」（專利靡編）以及於該領域中慣用 95105.doc -14- 1351436 記號者。 再者，示於本說明書中之人類IRS-2基因之基因組序列係 包含於藉由桑格測序中心（Sanger Center)之默罕默德 (Mohammadi，M.)作為GenBank(國際核酸序列數據庫）許可 號碼：AL162497所報告的全長143, 409鹼基長度（bp)之序列 中。 自基因組序列所推測之IRS-2基因係包含兩個外顯子，且 包含内含子之基因全長為32,730 bp者，該基因組序列係依 據經由GenBank(登記號XM 007095，許可號碼）所取得之 ® IRS-2 mRNA之序列資訊與上述AL162497之序列資訊所獲 得。該基因於AL162497序列中相當於93673-126402 bp。將 該基因構造之概略示於圖1。圖1中「Ex.l」以及「Ex.2」 表示兩個外顯子。附有箭頭標記表示之簡碼分別表示以下 之突變（SNP)。再者，該等全部係同義取代（於蛋白產物之 序列未產生變化者示於本文中或圖中之SNP之存在位置 序號係將蛋白質作為存在位置序號而表示，該存在位置序 號來自所編碼之編碼區域之轉譯起始密碼子ATG之位置A。 ® C-45 87A :人類IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼 子上游第4587號中之C突變為A ; AT-2510del :人類IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密 碼子上游第25 10號中之AT缺失； A-1164C :人類IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼 子上游第1164號中之A突變為C ; A15870G :人類IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼 95105.doc • 15· 子之第15870號中之A突變為G ; A29793G ··人類IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼 子之第29793號中之A突變為G ; C3 1532del :人類IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密 碼子之第二外顯子之第3 1532號中之C缺失。 本說明書中之所謂「基因」不僅僅包含雙鏈DNA，還包 含構成其之各單鏈DNA(正義鏈以及反義鏈）。即，本發明 基因（DNA)除特別提及以外，係包含具有人類基因組DNA 之雙鏈DNA，具有cDNA之單鏈DNA(正義鏈）、具有與該正 義鏈互補性序列之單鏈DNA以及該等之片段。又，上述基 因（DNA)係可包含調節區域、編碼區域、外顯子以及内含 子。聚核苷酸係包含RNA以及DNA。DNA係包含cDNA、基 因組DNA以及合成DNA。多肽係包含其片段、同族體、衍 生物以及突變體。進而，突變體係指未實質性變更天然存 在之等位基因突變體、非天然存在之突變體、經改變（刪 除、取代、加入以及插入）之突變體以及所編碼之多肽功能 的聚核苷酸序列。再者，胺基酸序列中之改變於天然中例 如亦有藉由突然突變，轉譯後之修飾等而產生之情形，亦 可利用源自天然之基因藉人為實行。 又，本說明書中之所謂SNP(Single nucleotide polymorphism ·· —驗基多型性），係作為某種基因乃至基因 群中之一鹼基核酸之突變而表示，並將存在於複數個位置 之上述一鹼基核酸之突變（SNP)作為SNPs表示。所謂單體 型，係表示藉由所連續之基因區域或基因群中之複數個位 95I05.doc -16- 1351436 置之突變部位的等位基因種類與數量所表示之上述突變 (SNPs)類型。 本發明係藉由含有人類IRS-2基因（包含相關轉錄調節之 啟動子區域的IRS-2基因全體）特定位置中之突變的多型， 特別是SNP或SNPs與人類藥劑起因性顆粒球減少症較具相 關性，並將特定位置中之SNP作為基因多型性標定物檢測 之處理，根據可判定（預測診斷）藥劑起因性顆粒球減少症發 症風險之事實發現所完成者。本發明判定方法係關於檢測 檢體中（源自受檢者）之人類IRS_2基因多型性，即人類irs_2 基因之SNP或SNPs之情形。 於根據本發明方法所檢測、解析之3紙（即，成為藥劑起 因性顆粒球減少症發症風險之指標的基因性突變）中，包含 上述 C-4587A、AT-2510del、A七6化、A1587〇g、a29793g 以及C31532del六個突變。該等所存在之脱_2基因上的位 置如上述圖1所不。但是’受核酸央持之SNPs的存在位置序 號’係自將ms-2基因蛋白質編媽之編碼區域之轉譯起始密 碼子ATG之A表示SNPs的存在位置序號。 ”根據本發明’可檢測人類irs.2基因之多型性（SNps以及 單體型）’並藉此，可提供對人類之藥劑起因性顆粒球減少 症發症之功能明確、㈣、診斷以及預防為有用的資訊乃 至方法。又’根據本發明，因可判定具有藥劑起因性顆粒 求咸v症發症風險的患者從而避免對該患者投藥該種藥 ::故而可將藥劑起因性顆粒球減少症之發症防範於未 、而Μ據本發明’將於藥劑投藥時考慮到發現副作 95105.doc 叫436 用之頻繁檢查與治療或處置一併進行，藉此可有效實行副 作用對策。 以下就本發明方法，加以詳細敍述。 本發明方法係檢測受驗者之人類1113_2基因之基因多型 性，並將其作為指標判定藥劑起因性顆粒球減少症發症風 險之存在者。 人類IRS-2基因之基因多型性之檢測可藉由例如自受驗 者調製人類IRS-2基因之基因組序列或其互補鏈，並根據需 要測定該基因組序列或其互補鍵之Dna序列後，檢測該基 因多型性而進行。 人類IRS-2基因（SNPs)的調製 調製源自受檢者之人類IRS-2基因作為檢體。具有該多型 性（SNPs)之基因的具體例如上所述。該基因中亦包含有上 述例示之人類IRS-2基因之DNA序列的互補鏈。 具有基因多型性之人類IRS-2基因或其互補鏈可根據揭 示於本說明書之人類IRS-2基因的具體序列資訊，並藉由一 般基因工程方法較易調製而得〔Molecular Cloning 2d Ed， Cold Spring Harbor Lab. Press( 1989);參照續生化學實驗講 座「基因研究法I、II、III」、曰本生化學會編（1986)等〕。 具體是’自具有人類IRS-2基因SNPs之人類藥劑起因性顆 粒球減少症患者身上，根據常法萃取cDNA或基因組DNA， 並根據使用有亦可包含人類IRS-2基因之特定突變之適當 探針、限制酶、抗體等之一般方法〔參照proc. Natl. Acad.

Sci·，U.S.A” 78，6613 (1981) ; Science，222，778 (1983)等 95I05.doc •18- 1351436 之情形時，該檢測亦可藉由限制酶片段長度多型性分析法 (RFLP法；B〇tstein，D.R，et al，Am j Hum 如，从 314-331(1980))而實行。 具體是，例如為檢測存在於人類IRS 2基因之第二外顯子 的蛋白質自編碼區域之轉譯起始密碼子之第29793號中之 核酸序列係野生型（A)或係突變型（G)，使用包含突變位置 且可識別其前後序列的限制酶。使用於相關RFLp&之酶若 係可識別作為目的之突變位置之前後序列的各種眾所周知 的限制酶即可。作為其具體例，可例示有例*Afal。 該RFLP法更好是可藉由pcR_RFLp法，即預先pCR法或其 變法等，將檢體DNA擴增·調製後，對於多量調製且經濃縮 之檢體DNA所實施之方法。如此，作為有無存在特異性切 斷部位’可檢測有無突變之存在。 藉由PCR-RFLP法所進行之人類1113_2基因之SNp檢測更 具體的是根據例如以下方法而實行。即，首先自人類生體 試料萃取人類IRS-2基因之基因組DNA，使包含該基因之突 變部位的區域DNA片斷擴增，從而獲得多量且經濃縮之檢 體樣本。此處使用之正向引子及/或反向引子中，亦可包含 其序列與基因組序列完全不一致者，較好是包含導入有用 以導入限制酶識別部位之序列者。接著，使用特定限制酶 (即，僅可消化野生型或突變型任一者的酶）消化該擴增之 DNA檢體，並根據一般方法確認DNA之切斷樣式（有無切 斷、切斷片斷之鹼基長度等）。 表示於本發明中所特定之人類藥劑起因性顆粒球減少症 95I05.doc -24· 與連鎖不平衡之人類IRS-2基因突變（A29793G)之情形時， 因於人類IRS-2基因之鹼基序列29793〜29796位之區域中 產生限制酶Afa I之特異性切斷部位（GTAC)，故而該突變可 藉由RFLP法檢測。 (6)異物入侵法 檢測IRS-2基因之SNPs亦可藉由異物入侵（Invader)法實 施。於異物入侵法之實施中，可參照以下之文獻。 •Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17(3) 292-296 (1999)以及 •國際專利公開\¥〇9823774號（特表2001-526526號）。 該方法係用以分析基因組DNA之SNPs，可無需預先擴增 標的DNA而實行之方法，例如可如下所述實施。 為檢測是否存在有作為目標之人類IRS-2基因之SNPs，首 先離析基因組DNA。其次，例如藉由自動合成機合成第一 標的探針與異物入侵寡核苷酸探針，該第一標的探針係將 包含15至50鹼基長度之Y片狀物與欲檢測之核酸（於本發明 中係SNP)配於V片狀物之Γ端，除突變核酸以外包含以互補 於標的基因組DNA之方式所合成的30至數百鹼基之寡核苷 酸，該異物入侵寡核苷酸探針係除將與欲檢測之核酸互補 的核酸配於3'端以外，包含以互補於標的基因組DNA之方 式所合成之15至數十鹼基長度之寡核苷酸。於該等探針 中，添加將與經離析之基因組DNA以及第一探針之欲檢測 之核酸互補的核酸以3'端切斷之酶，於使用於本發明之異物 入侵法中係酶Cleavase，於適當反應液中使其反應。 95105.doc •25- 1351436 若檢體中之基因組DNA包含所期望之突變核酸（SNp)之 情形時，利起第-反應，其使於3,端上包含突變核酸的y 片狀物游離。若檢體令之基因組DNA未包含突變核酸序列 之情形時，則不會引起因上述酶所產生之切斷。 自以酶所切斷之第一探針游離出的5，片狀物互補性結合 於螢光共振能量轉移（FRET)探針内作為標的，從而5，片狀 物之3,端侵入（invasi〇n)至FRET探針内。同樣地引起藉由 酶所生成之反應，螢光染劑產生游離。 使用於該第二反應之各FRET探針無需依存於所檢測之 標的，而以如下本質上包含兩個元素之方式構築。 (1)互補於自第一反應所斷裂之產物的3,區域，以及為 模仿單鏈探針而形成複式且與標的一併雜交化，從而該等 包含有螢光發射基團與螢光淬滅基團的自家互補區域。 上述螢光發射基團於該螢光發射基團與上述螢光淬滅基 團結合於同一探針内之情形時，可藉由螢光共振能量轉移 抑制其螢光強度，但於與上述螢光淬滅基團未結合於同一 探針内之狀態下，則無法抑制螢光強度。自所切斷之第一 探針游離之5,片狀物於FRET探針内雜交時，其於第二反應 中作為異物入侵募核苷酸發揮作用，從而產生藉由酶所識 別之侵入複合物。如此，藉由FRET探針之上述酶所進行之 切斷分離兩個螢光染劑並產生可檢測的螢光訊號。該訊號 可藉由例如標準螢光微量滴定盤讀取機器讀取，藉此可檢 測有無所期望之SNPs或單體型。藉由第一與第二反應之組 δ ’可將訊號自1擴增至lxl〇6倍為止。又，亦可藉由使用 95105.doc •26- 1351436 營光染劑不同的兩種螢光共振能量移轉探針，檢測（分型） 有無SNP。 (7)同步定量PCR檢測法 .檢測人類IRS-2基因多型性亦可藉由同步定量pcR檢測法 (TaqMan法）而簡便實施。 該方法可例如如下實施。#’首先將包含應檢測有無作 為目的之突變之核酸部位的DNA片斷，作為例如包含15至 39鹼基之正向側引子以及反向側引子而作成。但是，於正 向側引子以及反向側引子中，以未包含作為目的突變之方_ 式作成。其次，作成探針，其係具有例如包含15至5〇鹼基 之鹼基序列的寡核苷酸且結合有螢光發射基團與螢光淬滅 基團。但是，作為該探針之鹼基序列，設為選擇正向側引 子雜交的區域與該探針雜交的區域未互相重複之組合者。 該探針以於用以檢測有無作為目的之一驗基核酸突變的對 立基因特異性序列中包含互補性序列之方式作成。使用該 探針，藉由PCR使檢體中之應測定之IRS_2基因之所期望 DNA片斷擴增，從而同步測定來自反應液的勞光。如此，籲 可檢測有無突變。X，亦可藉由使用螢光染劑不同之兩種 探針之處理，進行有無SNP的檢測（分型 作為使用於上述異物入侵試驗或τ叫Man法的螢光發射 基團’較好是如FAM(6-羧基-螢光素）之類的螢光素系螢光 染劑，作為螢光淬滅基團，較好是如TAMRA(6羧基四甲 基-右丹明）之類的若丹明系螢光染劑。因該等螢光染劑眾所 周知，且包含於市售之同步檢測pCR用套組内故而可使 95I05.doc -27- 1351436 sequenom.com/Files/applications/hme_assay.html)。 (9)其他檢測法 檢測人類IRS-2基因之SNPs亦可藉由自先前以來關於 DNA作為其鹼基序列之測定法，或作為突變檢測法所眾所 周知的以下列舉之各種方法而實施。 (a) 使用序列特異性寡核苷酸的PCR-SS0法： 係將相對於各突變之探針於載體中固相化，對此使檢體 (基因擴增產物）雜交’從而判定根據不匹配之有無而產生的 雜合效率差者。 (b) 檢測點突變的PCR-SSP法： 係使用將對應於點突變之鹼基設定於3'末端的基因擴增 用序列特異性引子，根據引子之3'末端是否為互補’利用藉 由PCR所產生之擴增效率中產生顯著差之情形者。 (c) PCR-DGGE(變性劑濃度梯度凝膠電泳）法： 混合突變DNA片斷與正常DNA片斷從而使其雜種結合 後，若於尿素、甲醯胺等之變性劑濃度逐漸升高之聚丙烯 醯胺凝膠中電泳，則於與無不匹配之同源雙鏈相比濃度更 低之變性劑位置中解離為單鏈。該單鏈DNA因與雙鏈DNA 相比泳動速度較快，故而可藉由比較移動度差檢測一驗基 的突變。 (d) PCR-DGGE/GC 夾鉗法（Shefield，V.C·，et al_，Proc. Natl. Acad. Sci·，U.S.A.，86，232-236(1989)): 係除上述PCR-DGGE法以外，藉由將GC含量較高之區域 連接於作為突變核酸檢測對象之DNA片斷’彌補存有複數 95105.doc -29· 1351436 個鹼基取代、刪除、附加以及插入之情形時的檢測缺點之 方法。該方法特別需要於突變檢測對象之DNA片斷中附加 GC炎甜的步驟。 (e) RNase保護試驗法（Finkelstein，J_，et al.，Genomics, 7, 167-172(1990)) (f) 就地RT-PCR(Nucl. Acids Res·，21，3159-3166(1993)) (g) 就地雜合 (h) 南方墨點分析（Sambrook，J·，et al.，Molecular Cloning a Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press ： NY.(1989)) ⑴點潰雜配法（參照 Southern, E.M.，J. Mol. Biol·，98: 503-517(1975)等） (j) 勞光就地雜合（FISH : Takahashi，E.，et al.，Hum· Genet·，86, 1416(1990)) (k) 競爭性染色體雜交（Comparative Genomic Hybridization : CGH : Kallioneimi，A.，et al·，Science, 258, 818-821(1992))、（Spectral karyotyping : SKY : Rowley，J.D.， et al., Blood, 93, 2038-2042(1999)) (l) 將酵母人造染色體（YAC)媒介物之純系設為探針的方 法（Lengauer，C.，et al·，Cancer Res·，52，2590-2596(1992))。 如此，可檢測人類IRS-2基因之多型性（SNPs)以及單倍體 基因型》 依據本發明之藥劑起因性顆粒球減少症發症風險的判定 係將根據上述所檢測之人類IRS-2基因多型性的存在作為 95105.doc •30- 1351436 才曰標，確認有存在該多型性之檢體之情形時，該檢體即判 定為其風險較高。 如此判定為風險較高之患者因可於投藥藥劑前，確認弓丨 起藥劑起因性顆粒球減少症之風險的存在，故而可將由於 藥劑投藥等所造成之顆粒球減少症發症防範於未然。 特別是，依據本發明之人類IRS-2基因之SNPs檢測可有效 檢測人類的藥劑起因性顆粒球減少症發症危險因子之存 在，故而藉由該SNPs檢測，可檢測出人類藥劑起因性顆粒 球減少症之發症危險因子。 因此，本發明可提供一種該基因之基因多型性檢測方 法，該基因係用以將人類IRS-2基因之基因多型性存在作為 指標，判定成為人類IRS-2基因之SNPs檢測對象，即受檢者 之藥劑起因性顆粒球減少症發症風險之存在者。 寡核苷酸 本發明亦提供有作為於採用PCR法之本發明判定（檢測） 方法中所使用之基因多型性檢測用引子或探針的寡核苷 酸。該养核苷酸只要係可特異性擴增包含人類IRS _2基因之 突變部分（SNPs)的特定序列部分者，則無特別限制。該寡 核苷酸可依據人類IRS-2基因之序列資訊，並根據一般方法 適宜地合成、構築。 更具體的是，該合成亦可藉由通常之亞磷醯胺法 '磷酸 二酯法等之化學合成法，又亦可使用市售之自動寡核苷酸 合成裝置，例如（Pharmacia LKB Gene Assembler Plus :

Pharmacia公司製造）等而合成。雙鏈片斷可藉由合成經化學 95105.doc 1351436 1、2、4、5、7、8、10、11及13-Ιό所表示的正向引子及反 向引子’以及以序列號3、6、9、12及17所表示的直接序列 用募核苷酸引子。 又’作為本發明之基因特異性探針’若係可檢測上述 C-4587A、AT-2510de卜 A-1164 C、A15870G、A29793G以 及C31532del中任一者即可。 判定用套組 本發明判定（檢測）方法藉由利用用以檢測檢體中人類 IRS-2基因之SNPs的試藥套組，而可更簡便地實施。本發明 _ 亦提供相關判定用套組。 本發明套組之一係於至少作為人類IRS_2基因之六個 SNPs之DNA片斷的鹼基序列或其互補性鹼基序列之一部分 或全部中，或於包含突變部位之一鹼基前或數鹼基前之序 列的序列中，包含所雜交之DNA片斷作為必須構成成分。 又，本發明套組之其他之一包含可識別含有上述突變部位 的數個驗基之核酸序列之限制酶，例如Afa I作為必須構成 成分者。 春 作為本發明套組中之其他成分，可例示有標識劑、pcR 法中必要的試藥（例如，TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三 磷酸、DNA擴增用引子等）。作為標識劑，可列舉出放射性 同位素、發光物質以及螢光物質等之化學修飾物質等，dna 片斷自身亦可預先以該標識劑連接。進而，於該套組中為 便於實施測定，亦可包含適當的反應稀釋液、標準抗體、 緩衝液 '洗淨劑以及反應停止液等。 95105.doc -33- 1351436 若利用本發明之上述狀方法，則可提供_種方法，立 引起人類之藥劑起因性顆粒球減少症的某種基因： =性，並將其作為指標檢查人類㈣起因性顆粒球減少 症發症風險，特別是可提供一種方法，其於投藥已經報告 :因維司力農等之藥劑投藥而造成藥劑起因性顆粒球減少 症包含無顆粒球症）之副作用的藥劑前’檢查由於該投藥 所造成之顆粒球減少症發症風險， ^ M及杈供一種使用於該 万法之診斷劑及診斷用套組。 [發明之效果] 根據本發明，可提供判定人類之藥劑起因性顆粒球減少 症發症風險的方法’檢測成為上述判定指標之基因多型性 的方法’用於該等之套組，利用於該等之突變檢測用弓η 及探針，以及關聯於人類之藥劑起因性顆粒球減少症發症 之危險因子的基因。該笨於Λ # #、人類樂劑起因性顆粒球減少症 發症風險之檢査、判定中，特別是投藥已經報告有由於藥 劑投藥而造成藥劑起因性顆粒球減少症（亦包含無顆粒球 症）之副作用的藥劑前，對於該顆粒球減少症發症風險的檢 查、判定係有用的。 以下’為更加詳細說明本發明，列舉有實施例，但本發 明並非限定於此。 [實施例1] 實施例1 ⑷對於因服用藥劑所產生之顆粒球減少症之關聯基因 多型性的探索 95105.doc -34- 1351436 為探索對於因服用藥劑所產生之顆粒球減少症的關聯基 因^型性’將已服用維司力農（3,4-二氫-6-〔 4-(3,4-二f氧 基苯f酿基）-1•狐畊基〕-2(1H)_唾啉）的患者作為對象。 於日本國中，維司力農對於慢性心力衰竭（輕症至中等症 狀）具有適應症’但上市後，因投予該藥劑而造成藥劑起因 眭之剔作用，報告有白血球減少、顆粒球減少以及無顆粒 球症等，故而於藥劑投藥中，有必要實行對於該等副作用 的觀察與頻繁的顆粒球檢查。 自1991年5月至1996年10月間口頭同意對查明維司力農 顆粒球減少症原因給予協助，服用維司力農並同意提供血 液檢體的患者中，遵循倫理標準，將自2001年7月至2001年 12月間再次同意對基因解析給予協助之84名患者（男性：女 性= 1.21: 1)作為對象患者。自獲得上述再次同意之患者的 血液檢體或源自於其之細胞檢體’藉由通常之方法，萃取 基因組DNA，將其供給於以下試驗。 (b)對象患者分類基準 根據以下基準，將對象患者分類為顆粒球減少症發症患 者群與非發症患者群兩個群體。 對象患者中，將維司力農投藥前之白血_球數或嗜中性球 數於投藥後減少至半數以下的患者且白企球數或嗜中性球 數各成為2000或1〇〇Ο/mm3以下的患者作為發症例（顆粒球 減少症發症患者群）。另外，將即使服用維司力農9〇天以 上’與投藥前相比亦無法確認顆粒球減少的患者作為非發 症例（非發症患者群）。 95105.doc -35- 進而，將該等各群體根據性別分類為兩個群體，從而作 成全部四個群體。即，設為顆粒球減少症發症患者男性13 名（A群）、發症患者女性17名（B群）、非發症患者男性33名（C 群）以及非發症患者女性21名（D群）。 (c) 解析對象基因以及多型性（SNP) 自細胞因子關聯、MHC區域、G-CSF關聯、TNF-α關聯、 NF-κ關聯、cAMP關聯以及鉀通道關聯等之基因，選擇115 個候補基因。 為檢索於曰本人中有無該等基因之多型性，自日本人之 多型性資料庫（JSNP : http : //snp.ims.u-tokyo.ac.jp/ index」a.html)檢索該等候補基因之SNPs，並選擇188個候補 SNPs。 (d) 解析方法 SNP之解析係使用異物入侵法實施。該異物入侵法係參 照以下文獻（1)以及（2)實施。 (1) Lyamichev、V. et al.、Nat. Biotechnol. 17 : 292-296 (1999)、以及 (2) 國際專利公開W09823774號（98/6/4) 為了以PCR法擴增候補SNP之基因組DNA區域，根據包含 以JSNP所檢索之SNP的基因組DNA序列資訊，設定擴增各 SNP區域的引子組，合成各引子。 用以判定候補SNP基因多型性之異物入侵試驗試藥，其 根據包含以JSNP所檢索之SNP的基因組DNA序列資訊，藉 由通常方法作成。 95105.doc -36· 1351436 各PCR反應係將1 ng基因組DNA鑄型後實施。15 μι反應 液包含dNTPs(0.25 mM)，添加於TaKaRa Ex Taq(Takara公 司）的PCR反應用緩衝劑為總反應量之1/10量，正向引子與 反向引子之各組（各130 nM)以及TaKaRa Ex Taq(Takara公 司）(0.5 U)。各樣本藉由 DNA Engine PTC-0200(MJ Research 公司製造）擴增。PCR反應於94°C2分鐘後，進行94°C30秒、 56°C或58°C或60°C30秒以及72°C90秒之50次循環》 異物入侵試驗反應於將所得之PCR產物稀釋為10-1000倍 者中，混合異物入侵試驗試藥從而實施。15 mL反應液包含 _ 5.5xlnvader 緩衝劑（2.75 ^L) ' 10><Bioplex FRET Probe Mix(0.75 μΐ)- Cleavase VIIIS|(200 ng/^L)(l/iL) ' PPI Mix(3 弘1〇以及？011產物稀釋物（7.5]^)。反應於62°(：、60-120分鐘 間之條件下實施。 (e) 基因型判定法 基因型藉由異物入侵試驗反應結果、所檢測之兩色螢光 強度判定。如此，針對於藉由異物入侵試驗而存在於115基 因中的188個SNPs，測定對象患者中之基因型。 (f) 統計性分析方法 藉由contingency χ二次方測試，比較顆粒球減少症發症 患者群與非發症患者群中之對立基因頻率。風險指數係根 據直接法結腸雙對比造影（Brown)法評估（81*〇评11，（：.(：_，八111· J. Epidemiol.，113 : 474-480(1981)) » 風險指數之 95% 可靠 區間係使用Woolf方法算出。 (g) 結果 95I05.doc • 37· 1351436 關於存在於U5基因中的188個SNPs ,使用上述方法分析 後，具有統計學上有意義差的多型性係存在於胰島素受體 基質 2(IRS-2)内（JSNP ID IMS_JST〇4〇476)。可確認該請 係於對象患者群中依據Hardy_Weinberg平衡法則之情形。 自該結果表示，人類IRS_2基因中之SNp與因維司力農投 藥所造成之顆粒球減少症發症有較強關聯，該人類irs_2基 因對於顆粒球減少症發症可能具有重要作用。 人類IRS-2基因之表現產物係屬於胰島素受體基質蛋白 族（IRSs ; IRS·!、IRS_2、IRS_3、IRS 4)。若胰島素受體之 酪胺酸激酶活性化則會使酪胺酸磷酸化。眾所周知發現胰 島素作用之情形，該胰島素作用係具有經磷酸化之汛以將 PI-3激酶活性化，促進自葡萄糖轉運蛋白4(GLUT-4)之細胞 質向細胞膜的輸送，且促進葡萄糖取得之作用者。因此， 為進一步調查人類IRS_2基因與因維司力農所造成之顆粒 球減少症間的關聯，從而實施人類IRS 2基因之多型性解析 試驗。 實施例2 解析人類IRS-2基因多型性與藥劑起因性顆粒球減少症 間的關聯 使用實施例1中所揭示之患者樣本，如下進行人類lRs_2 基因之多型性解析。 (a)人類IRS-2基因之篩選與多型性之檢測 為篩選包含轉錄調節相關之啟動子區域的IRS_2基因全 體，自GenBank(登記號AU62497全長143409 bp)取得基因 95105.doc -38· 組序列，其包含將自GenBank(登記號XM_007095)所取得之 人類IRS-2 mRNA序列資訊作為基礎所檢索而得之IRS-2基 因。進行人類IRS-2 mRNA序列與包含IRS-2基因之基因組 序列的詳細比較，從而推定人類IRS-2基因構造。但是，用 以將基因方向自5'側統一至3'側所取得之基因組序列，使用 其互補鏈比較。 其結果為，解析得出人類IRS-2基因係由兩個外顯子構 成，且包含内含子的該基因全長係32730 bp。 根據該序列資訊從而設計、合成引子。 作為檢體，可利用實施例1之對象患者中顆粒球減少症之 12例發症例以及12例非發症例的各基因組檢體。 各PCR反應利用5 ng基因組DNA從而實施。10 /xL反應液 包含dNTPs( 1.25 mM)、氣化鎂（3.9 mM)、硫酸敍（16.6 mM)、 三鹽酸（Tris-HCl)(67 mM、pH值 8.8)、/3-巯基乙醇（10 mM)、 正向引子與反向引子之各組（1.25 mM)以及TaKaRa Ex Taq(Takara公司）(0.5 U) »根據需要，以成為最終濃度10% 之方式於反應液中添加DMSO(二曱亞砜）。 各樣本藉由 DNA Engine PTC-0200(MJ Research公司製 造）或GeneAmpPCR系統9700(PE阿普萊德生物系統公司製 造）使其擴增。PCR反應係於95°C2分鐘後，進行94°C30秒、 58°C或60°C30秒以及72°C3分鐘之37次循環後，於72°C10分 鐘條件下進行最終延伸反應。 使用 BigDye Terminator RR mix(BigDyeTM Terminator RR mix : PE阿普萊德生物系統公司製造）以使所得之各PCR產 95105.doc 39- 1351436 物反應。 基因多型性將於ABI Prism 3700 DNA分析儀（PE阿普萊 德生物系統公司製造）中所得之鹼基序列資訊為基礎，使用 定序儀（SEQUENCHER) 3_l(Gene Codes公司製造）檢測，從 而確認人類IRS-2基因上之位置。 (b) 檢體之擴增與基因型判定法 為調查以上述檢測法所鑒定之多型性於對象患者中是否 表示分佈有何種基因型，故而對於全部基因組DNA檢體， 以各PCR產物包含以上述方法所鑒定之基因多型性之方式 使用各引子組，並與上述揭示内容同樣地使其反應從而進 行解析。 (c) 統計性分析 除與實施例1相同之方法以外，根據Thompson方法 (Thompson, E.A.， et al·， Am. J. Hum. Genet. 42 : 113-124(1988))，計算出配對連鎖不平衡係數（D'=D/Dmax 或 D/Dmin) 〇 (d) 結果 上述解析之結果可確認，根據本實施例所解析之全部多 型性係於對象患者群中遵循Hardy-Weinberg平衡法則者。 本解析結果確認與因服用維司力農所誘發之顆粒球減少 症有較強關聯的六個多型性與其統計值示於表1至表6中。 [表1] 表1 多型性 發症 非發症 OR 基因型 N(%) N(%) X2(df=l) P (95%C1) 95105.doc -40- 1351436 C-4587A CC 7(25.0) 29(59.2) 8.36 0.0038 4.35 CA+AA 合計 21(75.0) 28 20(40.8) 49 (1.56-12.16) [表2] 表2 多型性 基因型 發症 N(%) 非發症 N(%) 爾=1) P OR (95%C1) AT-2510del AT ATdel + del 合計 704.1) 22(75.9) 29 28(57.1) 21(42.9) 49 8.02 0.0046 4.19 (1.51-11.64) [表3] 表3 多型性 基因型 發症 N(%) 非發症 N(%) _f=l) P OR (95%C1) A-1164C AA 8(26.7) 29(59.2) 7.90 0.0049 3.99 AC + CC 合計 22(73.3) 30 20(40.8) 49 (1.48-10.73) [表4] 表4 多型性 基因型 發症 N(%) 非發症 N(%) X2(df=l) P OR (95%C1) A15870G AA AG + GG 合計 10(37.0) 17(63.0) 27 36(73.5) 13(26.5) 49 9.67 0.0019 4.71 (1.72-12.88) [表5] 表5 多型性 基因型 發症 N(%) 非發症 N(%) X2(df=l) P OR (95%C1) A29793G AA AG + GG 合計 11(36.7) 19(63.3) 30 39(73.6) 14(26.4) 53 10.90 0.00096 4.81 (1.84-12.56) 95105.doc -41 - 1351436 [表6] 表6 多型性 基因型 發症 N(%) 非發症 N(%) 师 f=l) ------1 P OR (95%CH C31532del CC Cdel + del 合計 9(33.3) 18(66.7) 27 34(70. 8) 14(29.2) 48 9.93 0.0016 4.86 (1.76-13.39) 表中以「del」表示之多型性係表示刪除多型性，示於「多 型陡」之數子係將IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼 子ATG之A作為+ 1所計算者。又，數字中帶有減號㈠者係 表示IRS-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼子atg之a起 始而位於5,上游側之情形。 如表1-6所示，於至少具有人類IRS_2基因中自編碼區域 之轉譯起始密碼子於上游第4587號中之c突變為A的多型 性「C-4587A」，上游第2510號中之Ατ缺失的多型性 「AT-2510del」，上游第1164號中之A突變為c的多型性 「A-1164C」，自編碼區域之轉譯起始密碼子於第1587〇號中 之A突變為G的多型性「A1587〇G」，第29793號中之a突變 為G的多型性「A29793G」以及第31532號中之c缺失的多型 性「C31532del」之六種多型性中任一多型性的患者之情形 時’可觀察到與服用維司力農後之顆粒球減少症發症有較 強的關聯》該等六種多型性之人類„^_2基因辛之位置關係 示於圖1。再者，圖1中，+1係表示轉譯起始密碼子ATG之 A 〇 將研討於該等多型性間是否成立連鎖不平衡之結果示於 95105.doc -42- 1351436 表7。 [表7] 表7 SNP D, C-4587A AT-2510del A-1164C A15870G A29793G AT-2510del 1.000 - - - - A-1164C 1.000 1.000 - - - A15870G 1.000 1.000 1.000 - - A29793G 0.956 0.956 0.957 1.000 -· C31532del 0.952 0.953 0.953 1.000 1.000 根據表7可判定以下情形：與服用維司力農後之顆粒球減 少症發症有較強關聯之多型性，其全部多型性處於大致完 全的連鎖不平衡。即，可判定如下情形：若人類IRS-2基因 之編碼區域之上游第4587號中的等位基因持有突變型A，則 存在於與服用維司力農後之顆粒球減少症發症有較強關聯 之其他五處的多型性亦具有突變型。 該等結果強烈暗示人類IRS-2基因中之該等六處突變於 服用維司力農後之顆粒球減少發症中具有重要角色。 最近，Schacher(Schacher，D.H·，et al.，J. Immunol·，164 : 113-120(2000))報告有如下情形：骨髓芽系細胞之HL-60細 胞因DMSO刺激向顆粒球分化時，IRS-2蛋白質之表現等級 上升。該報告暗示IRS-2與向顆粒球分化關聯較強之情形。 由於本發明者們所發現之人類IRS-2基因突變中之三個突 變（C-45 87A、AT-2510del以及A-1164C)係位於掌管人類 IRS-2基因之轉錄量調節的啟動子區域内，故而於確認該等 突變時，也許會支持抑制IRS-2之轉錄量且難以誘導向顆粒 球分化的想法。 95105.doc •43- 1351436 實施例3 本例係關於檢測本發明之人類IRS-2基因之六種多型性 之其他方法的範例，如下述（a)以及（b)所示實施。 (a)直接鹼基測定法 以PCR產物包含本發明之六種多型性之方式，使用示於 表8之正向引子（序列號：1、4、7、10、13及15)以及反向引 子（序列號：2、5、8、11、14及 16)，藉由 DNA Engine PTC-0200(MJ Research 公司製造）或 GeneAmpPCR 系統 9700(PE阿普萊德生物系統公司製造）使各DNA片斷擴增。 各PCR反應於95°C2分鐘後，將94°C30秒、示於表8之各退火 溫度下30秒、72°C下示於表8之各延伸反應時間之循環進行 37次後，於72°C10分鐘條件下進行最終延伸反應。退火溫 度以及延伸反應時間如示於下表8，對於各DNA片斷，分別 係58°C〜60°C的溫度以及0.5分鐘〜3分鐘的時間。 [表8] 表8 正向 引子 對應於 AL162497 的序列號 反向 引子 對應於 AL162497 的序列號 退火 溫度 CC) 延伸 時間 (min) DMSO C-4587A 序列號：1 131420-131399 序列號：2 130318-130339 60 3 AT-2510del 序列號：4 128930-128911 序列號：5 127491-127510 60 3 A-1164C 序列號：7 127837-127818 序列號：8 126460-126479 60 3 + A15870G 序列號：1〇 110260-110240 序列號：11 109859-109879 60 3 A29793G 序列號：13 96209-96190 序列號：14 96070-96091 58 0.5 _ C31532del 序列號：15 94616-94595 序列號：16 93139-93159 60 3 - 反應溶液之組成如實施例2-(a)所示。但是’以最終濃度 成為10%之方式於用以檢測「A_1164C」之反應溶液中添加 DMSO(參照表8之DMSO項）。 95I05.doc -44 - 1351436 表8中用於檢測「A29793G」之反向引子（序列號：14)之 第23號的G係用以導入限制酶Afa I識別部位所加入的突 變。 除檢測「A29793G」之突變以外，藉由核苷酸直接鹼基 序列測定法〔雙脫氧法（Sanger，et al.，Proc· Natl_ Acad. Sci·， U.S.A.，74, 5463-5467(1977)或 Maxam-Gilbert法（Methods in Enzymology, 65，499(1980)〕，進行多型性之檢測。將所使 用之引子示於表9(序列號：3，6，9，12以及17)。 [表9] 表9 使用於 序列反應的引子 對應於AL162497的序列號 C-4587A 序列號：3 130343-130363 AT-2510del 序列號：6 128581-128562 A-1164C 序列號：9 126912-126929 A15870G 序列號：12 110249-110231 C31532del 序列號：17 94556-94537 (b)PCR-RFLP(限制酶片段長度多型性）分析法 於「A29793G」之檢測中使用PCR-RJFLP(限制酶片段長度 多型性）分析法。即，20 mL反應溶液包含10 之PCR產物、 兩單位之限制酶Afa 1(10單位/mL ; Takara公司製造）以及添 加於限制酶之2 /iL之lOxBuffer T，於此中以最終濃度成為 0.01°/❶之方式添加BSA，以37°C培養16小時後，以4%瓊脂糖 凝膠分離限制酶處理產物。 如此，若將自患者檢體所萃取之DNA適應於上述實施例 中所示之人類IRS-2基因之六種多型性中任一檢測方法，則 95105.doc -45· 1351436 於預先投藥藥劑之前，可判定有無因藥劑投藥而產生藥 起因性顆粒球減少症（亦包含無顆粒球症）之可能性即' 定藥劑起因性顆粒球減少症發症風險。如此，根 特別是藉由調查患者檢體之DNA，可檢查、判定因維司力 農投藥所造成的顆粒球減少症發症風險。 [產業上之利用領域] 本發明對於檢查、判定人類藥劑起因性顆粒球減少症發 =風險，特別是對於於投藥已經報告有因藥劑投藥而造成 藥劑起因性顆粒球減少症（亦包含無顆粒球症）之副作用的 藥劑引檢查、判疋該顆粒球減少症發症風險係有用的。 【圖式簡單說明】 圖1係表示人類IRS-2基因之構造以及基因多型性之存在 位置的概略圖。

95105.doc -46- 1351436 序列表 <110〉奥芝加藥物有限公司 <120〉一種測定藥劑起因性顆粒球減少症發症風險的方法 <130> 0P0046 < 140 > 093122778 < 141 > 2004-07-29

<150> JP2003-281937 <151> 2003-07-29 <160> 17 <170>專利2.1版本 <210> 1 <211〉 22

<212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (丨RS—2)之SNPs的引子序列

<400〉 1 accactgtat ttgtgacaac tc 22

<210〉 2 <211〉 22 <212> DNA 95105.doc 1351436 <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS-25之SNPs的引子序列 <400> 2 aaatatggat cagtctcttt cc 22 <210〉 3

<2Π> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 3 atgttcattt tatgagggag g 21

<210〉 4 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 95105.doc • 2- 1351436 <400> 4 aactgccaat ccagagctgc 20 <210〉 5 <211〉 20 <212> ONA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述··用以擴增胰島素受體基質一2 (丨RS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 5 tctcaccaca ccgcttcaag 20 <210〉 6 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS-2)之SNPs的引子序列 <400〉 6 ccacattttc ttcaagcacc 20 <210〉 7 95105.doc 1351436 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 7 gagcttgctg ggatctgaac 20

<211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 8 atgtgactcg gcgttacgca 20

<210〉 9 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 95105.doc -4- <220> <220>1351436 <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400> 9 ccttgcagtg gaagcatg 18 <210〉 10 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴増胰島素受體基質_2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 10 ctatcccgat tcctagatgt c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 95105.doc 1351436 <400〉 11 gactcatctg tgactaactc c 21 <210〉 12 <211〉 19 <212> DMA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 12 cctagatgtc agcttgccc 19 <210〉 13 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一 2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400> 13 tctggaactc cagagattgc 20 <210〉 14 95105.doc -6- 1351436 <211〉 25 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 14 tgctgagcgt cttcttttaa tggta 25 <210> 15 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：用以擴增胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 15 gaggcttttt tagaggaaga cc 22 <210〉 16 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 95105.doc <220〉1351436 <223〉人工序列之描述： 用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 16 catgtcatgg agggagcatt c 21 <210〉 17 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述： 用以擴増胰島素受體基質一2 (IRS—2)之SNPs的引子序列 <400〉 17 gcaaaagtct tcctgcttcc 20 95105.doc

Claims (1)

1. 該藥劑起因性顆粒球減少症發症風險之存在係將人類 胰島素受體基質_2基因中選自由下述⑷〜⑴所組成之群 至少個基因多型性之存在作為指標而判定者： ⑷自編碼區域之轉譯起始密碼子起上游第4587號之野 生型（C)突變為A的多型性； (b)自編碼區域之轉譯起始密碼子起上游第251〇號之野 生型（AT)缺失的多型性； ⑷自編碼區域之轉譯起始密碼顿上游第ιΐ64號之野 生型（A)突變為c的多型性； W自編碼區域之轉譯起始密碼子起第15請號之野生 型（A)突變為g的多型性； (e)自編碼區域之轉譯起始密碼子起第29793號之野生 型（A)突變為G的多型性；以及 (0自編碼區域之轉譯起始密碼子起第3仙號之野生 型（C)缺失的多型性。 2·如請求们之檢測方法，其中基因多型性之檢測係藉由選 自由核苦酸直接驗基序列測定法、等位基因特異性寡核 普酸（AS〇)·斑點雜交分析、一鹼基引子延伸法rPCR單 鍵高次構造多態性（SSCP)分析、PCR.限制酶片段長度多 95105-1000817.doc 1351436 型性（RFLPV刀析、異物入侵法、同步定量pcR_法以及 使用質譆儀之基因多型性檢測法（mass以㈣所組成之群 中至少一種方法而實行。 3. 如請求項2之檢測方法，其中基因多型性之檢測係藉由核 苷酸直接鹼基序列測定法而實行。 如清求項2之檢測方法，其中基因多型性之檢測係藉由 PCR-限制酶片段長度多型性（RFLp)分析而實行。 5. 如請求項4之檢測方法，其中pcR限制酶片段長度多型性 (RFLP)分析係使用限制酶AfaI所進行者，該限制酶A” 係用以檢測人類姨島素受體基質-2基因中自編碼區域之 轉譯起始密碼子起第29793號之A突變為G。 6. 如請求項1之檢測方法，其係使用募核苷酸及限制酶Afai 進行檢制以判定因維司力農投藥所造成之藥劑起因性 顆粒球減少症發症風險的基因多㈣，其中該寡核苷酸 為包含人類胰島素受體基質_2基因令自編碼區域之轉譯 起始密碼子起第29793號之A突變為G之基因多型性部位 的序列》 如請求項1之檢測方法，其十人類胰島素受體基質·2基因 係相當於GenBank(國際核酸序列數據庫）許可號碼： AL162497之序列中之93673〜126402 bp者。 8. —種寡核苷酸，其係於人類胰島素受體基質_2基因中作為 可雜交之具有至少10〜35個連續性鹼基的基因多型性檢 測用引子或探針，且係選自由下述（a)〜⑺所組成之群者： (a)—種寡核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質基 95105-1000817.doc =自編碼區域之轉譯起始密碼子起上游第4⑻號之C 大變為A之基因多型性部位的序列； ()種寡核普酸，其係包含人類騰島素受體基質·2基 自編碼區域之轉譯起始密碼子起上游第25 1()號之ΑΤ 、失之基因多型性部位的序列； ⑷核㈣’其係包含人類姨島素受體基質_2基 :中自編碼區域之轉譯起始密碼子起上游第1164號之A 突變為C之基因多型性部位的序列； ⑷種募核苦酸，其係包含人類肤島素受體基質_2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子起第1587〇號之A突變 為G之基因多型性部位的序列； (e)一種募核苷酸，其係包含人類胰島素受體基質_2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子起第29793號之A突變 為G之基因多型性部位的序列；以及 (0種秦核苷酸，其係包含人類姨島素受體基質_2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子起第31532號之c缺失 之基因多型性部位的序列。 9·如請求項8之寡核苷酸，其係於人類胰島素受體基質_2基 因中可雜交之基因多型性檢測用探針者，且係選自由下 述（a)〜（d)以及（f)所組成之群者： (a) —種寡核苷酸’其係以序列號：3表示之序列； (b) —種寡核苷酸’其係以序列號：6表示之序列； (c) 一種寡核苷酸，其係以序列號：9表示之序列； (d) —種寡核苷酸，其係以序列號：12表示之序列； 95105-10008l7d〇c 10 (f)一種寡核苷酸，其係以序列號：17表示之序列。 -種用以判定藥劑起因性顆粒球減少症發症風險之存在 之基因之基因多型性檢測用套組，其係包含選自由下述 ⑷〜(f)所組成之群之具有至少1()〜35個連續性驗基的寡核 苷酸作為人類胰島素受體基質_2基因之多型性檢測用引 子、或人類胰島素受體基質_2基因之多型性檢測用探針: ⑷種募核苦酸，其係包含人類騰島素受體基質_2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子ATG之A起上游第 4587號之C突變為A之基因多型性部位的序列； ⑻一種寡核皆酸’其係包含人類胰島素受體基質-2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子ATG之A起上游第 2 5 10號之AT缺失之基因多型性部位的序列； (c)-種寡核苷酸’其係包含人類胰島素受體基質_2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子ATG之A起上游第 1164號之A突變為C之基因多型性部位的序列； ⑷種寡核苷酸’其係包含人類騰島素受體基質-2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子ATG之A起第15870號 之A突變為G之基因多型性部位的序列； (e)種寡核芽酸，其係包含人類姨島素受體基質-2基 因甲自-扁碼區域之轉譯起始密碼子之a起第29793號 之A突變為G之基因多型性部位的序列；以及 ⑺種寡核#酸，其係、包含人類騰島素受體基質-2基 因中自編碼區域之轉譯起始密碼子綱之八起第⑴魏 之C缺失之基因多型性部位的序列。 95105-1000817.doc 1351436 11 ·如請求項ίο之基因多型性檢測用套組，其係包含選自由 下述（a)〜(d)以及⑴所組成之群之寡核苷酸作為於人類胰 島素受體基質-2基因中可雜交之基因多型性檢測用探針： (a) —種寡核苷酸，其係以序列號：3表示之序列； (b) —種募核苷酸’其係以序列號：6表示之序列； (c) 一種募核苷酸’其係以序列號：9表示之序列； (d) —種募核苷酸，其係以序列號：丨2表示之序列； (0—種募核苷酸，其係以序列號：17表示之序列。 12.如請求項10之基因多型性檢測用套組，其中包含如請求 項8中（e)項之寡核苷酸與限制酶Afa I，而用以檢測人類胰 島素受體基質-2基因中自編碼區域之轉譯起始密碼子起 第29793號之A突變為〇者。 95105-1000817.doc