CN1833023A - 药物性粒细胞过少症发病几率判定法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供是否存在人药物性粒细胞过少症发病危险的判定方法。所述药物性粒细胞过少症发病几率判定方法通过检测受试者的人胰岛素受体底物－2基因的基因多态，将其作为指标判定是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险。

Description

药物性粒细胞过少症发病几率判定法
技术领域
本发明涉及以人胰岛素受体底物-2基因的基因多态的存在为指标来判定药物性粒细胞过少症发病几率的方法、作为所述几率判定的指标的基因多态的检测方法、用于这些方法的寡核苷酸以及判定和/或检测用试剂盒。
背景技术
现代医疗以将药物用于各种疾病的治疗·预防的药物疗法为主体。用于药物疗法的以低分子化合物为代表的药物本质上对人而言几乎都是外源物，通过给药虽然产生治疗效果，但仍发现各种副作用。该副作用经常导致不得不放弃药物治疗。有些药物对于患有某种疾病的患者是有效的，但由于严重的副作用而停止了开发，而有些药物对于其给药方法和副作用的显现要求有严格的检验。
根据美国的统计，发现药物引起的副作用的报告每年超过200万件。此外，10万人以上被报道因为副作用而死亡(JAMA，279，1200(1998))。在日本，医药品副作用的报告，包括重复报告，有2万6545个病例，死亡报告在2000年度仅仅1年中也报告了1239件(厚生劳动省，平成15年6月6日，众议院答辩第55号答辩书)。
服用药物引起的副作用中，粒细胞过少症是致死的副作用。尤其是粒细胞的减少，变得容易感染，达到粒细胞缺乏症的状态时，导致肺炎、败血症等严重感染症的几率非常高。已知引起该粒细胞过少症的药物主要有镇痛解热药(氨基比林)、抗生素(氯胺苯醇)、抗甲状腺药(甲巯咪唑)、抗惊厥药、抗糖尿病药、利尿药等。这些药物引起的副作用的发病被认为与其给药量并没有太大关系，而与患者的体质，例如过敏体质、特异体质等相关。因此，副作用发病的预测几乎都很困难。为了事先预防副作用发病，必须对每个患者的包括其他科的病历等的详细询问和血液检查等非常注意。一旦出现作为副作用的粒细胞过少症发病，需要进行入院等迅速的应对。
此外，引起粒细胞过少症的其他药物已知的有抗精神病药二苯并二氮(氯氮平)。虽然期待该药物有高有效性，但在日本的治疗试验被中断。
另外，其他药物还有具有PDE3抑制作用和对于K通道起作用的维司力农。该药物可以用作心律不齐出现的几率低、心脏意外(心力衰竭的发病、入院等)的发生率也低的强心剂，但是由于其给药时引发持续的白细胞减少和粒细胞减少的粒细胞缺乏症的副作用，所以其使用受到严格限制。
在人类基因组分析中，单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphisms：SNPs)是频率最高的基因多态标记。至今，该SNP被揭示用于许多与疾病、药物应答等相关的人类基因组分析(参考非专利文献1，2和3)。此外，已知使用多个SNPs的单倍型分析在复杂疾病中的疾病易感性的遗传学分析方面是有用的(参考非专利文献4和5)。实际上，如阿尔茨海默氏症和高血压症这样的疾病已经用这种方法进行集中分析(Jeunemaitre，X.，等，Am.J.Hum.Genet.，60，1448-1460(1997)；Martin，E.R.，Am.J.Hum.Genet.，67，383-394(2000))。
近年来，随着基因组分析的进步，在药物开发过程中，发展了研究药物对于作为药物代谢酶的细胞色素P450(CYP)的作用的毒理基因组学。其中，对于同如上所述的药物性副作用的关系，提出了通过对每个患者的研究来了解特定的基因多态和药物感受性/应答性的关系的研究，因此希望建立所谓定制的治疗法。
非专利文献1：Brookes，A.J.，“The essence of SNPs”，Gene，USA，(1999)，234，177-186
非专利文献2：Cargill，M，等，“单核苷酸多态在人类基因的编码区中的识别(Characterization of single-nucleotide polymorphisms in codingregions of human genes)”，Nature Genet.，USA，(1999)，22，231-238
非专利文献3：Evans，W.E.，& Rell ing，M.V.，“药物基因组学：从功能性基因组学到合理的治疗学的翻译(Pharmacogenomics：translating functionalgenomics into rational therapeutics)”，Science，USA，(1999)，286，487-491
非专利文献4：Stephens，J.C.，等，“通过单倍型的合并寻找CCR5-Delta 32抗AIDS等位基因的起源(Dating the origin of the CCR5-Delta 32AIDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes)”，Am.J.Hum.Genet.，USA，(1998)，62，1507-1515
非专利文献5：Tishkoff，S.A.，等，“单倍型频率估测的统计学方法的精确性：一个来自CD4基因座的例子(The accuracy of statistical methods forestimation of haplotype frequencies：an example from the CD4 locus)”，Am.J.Hum.Genet.，USA，(2000)，67，518-522
发明的揭示
发明要解决的课题
本发明的主要课题是提供以人胰岛素受体底物-2基因的存在为指标判定药物性粒细胞过少症发病几率的方法、作为所述几率判定的指标的基因多态的检测方法。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题，首先作为多态分析的基因，选择了细胞分裂相关、MHC领域、G-CSF相关、TNF-α相关、NFκ相关、cAMP相关、K-通道相关等115个候选基因，从日本人类多态数据库检索了这些候选基因的SNPs，选择了188个候选SNPs。
接着，对于这些选出的SNPs，确定投与特定药物而发病的粒细胞过少症的发病患者组和未发病患者组2组的样本基因组DNA中这些SNPs的出现频率。其结果是，确认在上述2组之间在统计学上表现出最显著差异的SNPs是胰岛素受体底物-2基因(Insulin receptor substrate 2：IRS-2)(J-SNP ID：IMS-JST040476)(下称“IRS-2基因”)。
本发明人又对该IRS-2基因的多态与药物性粒细胞过少症的关系反复研究，结果发现一共6个与因服用特定药物而诱发的粒细胞过少症密切相关的人IRS-2基因的SNPs。
根据这些特定SNPs的分析，发现可以判定(预先诊断)对于人的各种疾病的药物性副作用、特别是药物性粒细胞过少症的发病几率。本发明是基于所述发现而完成的。
本发明提供下述(1)～(19)所示的药物性粒细胞过少症发病几率的判定方法或作为几率判定的指标的基因多态标记的检测方法，以及用于这些方法的寡核苷酸和试剂盒。
(1)药物性粒细胞过少症发病几率的判定方法，所述方法检测受试者的人IRS-2基因的基因多态，将其作为指标判定是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险。
(2)人IRS-2基因的基因多态检测方法，所述方法用于以该基因的基因多态的存在为指标、判定受试者是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险。
(3)药物性粒细胞过少症发病几率的检测方法，所述方法检测受试者的人IRS-2基因的基因多态，将其作为指标。
(4)上述(1)～(3)所述的方法，所述方法以是否存在人IRS-2基因的从下述(a)～(f)中选出的至少1个基因多态作为指标，判定是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险：
(a)自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的野生型(C)突变为A的多态，
(b)自编码区的翻译起始密码子起上游第2510位的野生型(AT)缺失的多态，
(c)自编码区的翻译起始密码子起上游第1164位的野生型(A)突变为C的多态，
(d)自编码区的翻译起始密码子起第15870位的野生型(A)突变为G的多态，
(e)自编码区的翻译起始密码子起第29793位的野生型(A)突变为G的多态，
(f)自编码区的翻译起始密码子起第31532位的野生型(C)缺失的多态。
(5)上述(1)～(4)所述的方法，基因多态的检测通过从以下述方法中选出的至少1种方法进行：核苷酸碱基序列直接测定法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析、单碱基引物延伸法、PCR-单链构象多态性(SSCP)分析、PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析、侵入物法、定量实时PCR检测法和使用质谱仪的基因多态检测法(mass array)。
(6)上述(5)所述的方法，基因多态的检测通过核苷酸序列直接测定法进行。
(7)上述(5)所述的方法，基因多态的检测通过PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析进行。
(8)上述(7)所述的方法，PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析使用限制性酶AfaI，用于检测人IRS-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变。
(9)作为可以与人IRS-2基因杂交的用于基因多态检测的引物或探针的寡核苷酸，所述寡核苷酸选自以下的(a)～(f)：
(a)包含人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的C突变为A的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(b)包含人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第2510位的AT缺失的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(c)包含人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第1164位的A突变为C的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(d)包含人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第15870位的A突变为G的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(e)包含人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A突变为G的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(f)包含人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第31532位的C缺失的基因多态位点的寡核苷酸序列。
(10)作为可以与人IRS-2基因杂交的用于基因多态检测的引物的选自以下的(a)～(d)和(f)的寡核苷酸：
(a)序列编号：3所示的寡核苷酸序列，
(b)序列编号：6所示的寡核苷酸序列，
(c)序列编号：9所示的寡核苷酸序列，
(d)序列编号：12所示的寡核苷酸序列，
(f)序列编号：17所示的寡核苷酸序列。
(11)药物性粒细胞过少症发病几率判定用试剂盒，包含上述(9)所述的寡核苷酸作为人IRS-2基因的多态检测用的引物或人IRS-2基因的多态检测用的探针。
(12)上述(11)所述的试剂盒，包含上述(10)所述的寡核苷酸。
(13)上述(11)所述的试剂盒，包含上述(9)的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶AfaI，用于检测人IRS-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变。
(14)上述(1)所述的方法，使用上述(9)或(10)所述的寡核苷酸判定因服用维司力农而引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
(15)上述(1)所述的方法，使用上述(9)的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶Afa I来判定因服用维司力农而引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
(16)人IRS-2基因的基因多态检测用试剂盒，包含上述(9)所述的寡核苷酸作为人IRS-2基因的多态检测用的引物或人IRS-2基因的多态检测用的探针，用于判定药物性粒细胞过少症的发病几率。
(17)上述(16)所述的试剂盒，包含上述(10)所述的寡核苷酸。
(18)上述(16)所述的试剂盒，包含上述(9)的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶AfaI，用于检测人IRS-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变。
(19)上述(2)所述的方法，使用上述(9)或(10)所述的寡核苷酸，检测用于判定因服用维司力农而引起的药物性粒细胞过少症的发病几率的基因多态。
(20)上述(2)所述的方法，使用上述(9)的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶AfaI，检测用于判定因服用维司力农而引起的药物性粒细胞过少症的发病几率的基因多态。
(21)上述(3)所述的方法，使用上述(9)或(10)所述的寡核苷酸来检查因服用维司力农而引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
(22)上述(3)所述的方法，使用上述(9)的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶AfaI来检查因服用维司力农而引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
发明的效果
根据本发明，提供对于人的药物性粒细胞过少症发病几率的判定方法、作为所述判定的指标的基因多态的检测方法、用于这些方法的试剂盒、用于这些方法的突变检测用引物和探针以及人的与药物性粒细胞过少症发病的危险因子相关的基因。这些可以用于人药物性粒细胞过少症发病几率的检查、判定，特别是被报道有所服用的药物引起的药物性粒细胞过少症(包括粒细胞缺乏症)副作用的给药前的该药物性粒细胞过少症发病几率的检查、判定。
附图的简单说明
[图1]表示人IRS-2基因的结构和基因多态的存在位置的简图。
实施发明的最佳方式
本说明书中的氨基酸、肽、碱基序列、核酸等的简略符号的表示是基于IUPAC-IUB的规定〔IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，138：9(1984)〕、《用于包含碱基序列或氨基酸序列的说明书等的制作的指南》(日本特许厅编)和该领域中的惯用符号。
本说明书中所示的人IRS-2基因的基因组序列包含在Sanger中心的Mohammadi，M.报告的GenBank登录号：AL162497的全长143409个碱基(bp)的序列中。
通过基于从GenBank(登录号XM 007095)获得的IRS-2的mRNA的序列信息和上述AL162497的序列信息得到的基因组序列推测的IRS-2基因由两个外显子构成，包括内含子的基因的全长为32730bp。该基因在AL162497序列中相当于93673～126402bp。该基因的结构大致如图1所示。图1中，“Ex.1”和“Ex.2”表示两个外显子。用箭头表示的简略符号分别表示以下的突变(SNP)。这些全部是同义置换(蛋白质产物的序列中不发生变化)。本说明书中或图中所表示的SNP的存在位置的编号以从编码蛋白质的编码区的翻译起始密码子ATG的A的位置开始的存在位置的编号表示。
C-4587A；人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的C到A的突变，
AT-2510del；人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第2510位的AT的缺失，
A-1164C；人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第1164位的A到C的突变，
A15870G；人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第15870位的A到G的突变，
A29793G；人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变，
C31532del；人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第2外显子的第31532位的C的缺失。
本说明书中，“基因”一词不仅包括双链DNA，还包括构成它的单链DNA(有义链和反义链)。即，本发明的基因(DNA)只要没有特别说明，包括含人基因组DNA的双链DNA、含cDNA的单链DNA(有义链)、具有与该有义链互补的序列的单链DNA以及它们的片断。此外，上述基因(DNA)可以包含调节区、编码区、外显子和内含子。多聚核苷酸包括RNA和DNA。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。多肽包括其片断、同源物、衍生物和突变体。另外，突变体是指自然中存在的等位基因突变体、自然中不存在突变体、发生改变(缺失、置换、添加和插入)的突变体和编码的多肽的功能实质上没有变化的多聚核苷酸序列。氨基酸序列中的改变可以是自然中由例如突变、翻译后的修饰等产生，或者利用来自天然的基因人工地进行改变。
此外，本说明书中，SNP(Single nucleotide polymorphism：单核苷酸多态)是指某个基因或一组基因中的单个核苷酸的突变，存在于多个位点的单核苷酸的突变(SNP)表示为SNPs。单倍型是指通过在连续的基因区域或基因簇中多处的突变位点上等位基因的种类和数量所表示的上述突变(SNPs)的类型。
本发明基于以下事实的发现而完成的：包括人IRS-2基因(包括与转录调节相关的启动子区域的整个IRS-2基因)的特定位点上的变异的多态、特别是SNP或SNPs与人药物性粒细胞过少症非常相关，通过将特定位点上的SNP作为基因多态标记进行检测，可以判定药物性粒细胞过少症发病几率(预先诊断)。本发明的判定方法涉及样本(来自受试者)中人IRS-2基因的多态、即人IRS-2基因的SNP或SNPs的检测。
通过本发明的方法检测、分析的SNPs(即作为药物性粒细胞过少症发病几率的指标的基因突变)中包括前述的C-4587A、AT-2510del、A-1164C、A15870G、A29793G、C31532del这6种突变。它们在IRS-2基因上的位置如图1所示。其中，夹在核酸之间的SNPs的所在位置的编号表示从编码IRS-2基因的蛋白质的编码区的翻译起始密码子ATG的A起的SNPs的所在位置的编号。
采用本发明，可以检测人IRS-2基因的多态(SNPs和单倍型)，由此可以提供有利于了解、掌握人药物性粒细胞过少症的机理、对其的诊断和预防的信息与方法。此外，采用本发明，通过判定存在药物性粒细胞过少症发病危险的患者，避免对该患者给药，可以预先防止药物性粒细胞过少症的发病。另外，采用本发明，通过在治疗或处理的同时考虑到给药时副作用的发生而不时地进行检查，可以有效地对副作用进行处置。
以下，对本发明的方法进行详细说明。
本发明的方法是检测受试者的人IRS-2基因的基因多态，将其作为指标判定是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险。
受试者的人IRS-2基因的基因多态的检测可以通过以下方法进行：例如，从受试者制备人IRS-2基因的基因组序列或其互补链，根据需要测定该基因组序列或其互补链的DNA序列后，检测该基因多态。
人IRS-2基因(SNPs)的制备
制备来自受试者的人IRS-2基因作为样本。具有该多态(SNPs)的基因的具体例子如前所述。该基因中也包括上述示例的人IRS-2基因的DNA序列的互补链。
具有基因多态的人IRS-2基因或其互补链可以容易地根据本说明书所揭示的人IRS-2基因的具体序列信息通过一般的基因工程方法制备〔参看MolecularCloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；续生化学实验讲座“基因研究方法I、II、III”，日本生化学会编(1986)等〕。
具体可以通过以下方法制备所需的人IRS-2基因的基因组序列：用常规方法从具有人IRS-2基因的SNPs的药物性粒细胞过少症患者提取cDNA或基因组DNA，通过使用可以含有人IRS-2基因的特定突变的适当的探针、限制性酶、抗体等的常规方法〔参看Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)等〕，选择所需的克隆来进行制备。
上述的cDNA或基因组DNA的来源可以例举具有IRS-2基因(SNPs)的各种细胞、组织、来自它们的培养细胞等。此外，可以例举血清和血浆等血液、唾液、淋巴液、呼吸道粘液、尿、精液等体液。作为样本的上述来源材料较好是来自给药前(特别是服用过去被报道过出现药物性粒细胞过少症的药物之前)的人类患者的DNA或基因组DNA。从这些来源材料的RNA分离、mRNA分离和纯化、cDNA的获取、其克隆等都可以通过常规方法进行。此外，cDNA库在市场上有售，本发明中也可以使用这些cDNA库，例如Clontech Lab.Inc.等的市场上销售的各种cDNA库等。
从cDNA库筛选所需基因的方法也没有特别限定，可以按照常规的方法进行。具体地如下进行即可：制作含有可以与目标SNPs的DNA序列选择性结合的突变部分的探针，使用它进行噬斑杂交、集落杂交等，或将它们组合。
筛选用引物可以使用根据所需的人IRS-2基因的碱基序列信息设定的正向引物和反向引物。它们可以按照常规方法，例如使用自动合成装置合成。该筛选用探针通常是标记了的探针，但如果可以直接或间接地与标记了的配体特异性结合，也可以使用未标记的探针。探针和配体的标记试剂和标记方法在本技术领域中已经是公知的。作为其例子，可以例举例如通过切口平移、随机引发、激酶处理等已知方法可以引入的放射性标记试剂、生物素、荧光性染料、化学发光剂、荧光素酶等酶、抗体等。
提取的基因或mRNA可以通过基因扩增方法进行扩增。通过该扩增，可以使本发明的检测方法中的检测更容易、而且精度高。基因扩增方法的例子可以例举PCR法(Saiki，R.K.，Bugawan，T.L.，等，Nature，324，163-166(1986))、NASBA法(Comptom，J.，Nature，650，91-92(1991))、TMA法(Kacian，D.L.，和Fultz，T.J.，美国专利第5,399,491号(1995))、SDA法(Walker，G.T.，Little，M.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，89，392-396(1992))等。
用PCR法等扩增的基因片断的分离纯化用常规方法，例如凝胶电泳法等即可，此外还可以使用色谱柱纯化。其验证可以用例如质谱法等进行。通过这些方法扩增的基因根据其扩增产物的特性供于本发明所述的人IRS-2基因(SNPs)的检测。
人IRS-2基因多态的检测
本发明的方法中，接着检测上述样本是否有多态。该检测具体可以按照例如下述(1)-(8)所示的各种方法进行。
(1)核苷酶碱基序列直接测序法
IRS-2基因的检测可以按照通常用于该种基因的碱基序列的测序的核苷酸碱基序列直接测序法进行，其中包括例如双脱氧法(Sanger，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467(1977))、Maxam-Gilbert法〔Methodsin Enzymology，65，499(1980)〕等。也可以按照组合该方法和PCR法等DNA扩增方法的方法进行。尤其是从可以使用少量的DNA试样、简便且容易地、而且灵敏度和精度高地检测的角度来看，较好是组合PCR法或以它为基础的DNA扩增方法的方法。
该优选的方法基本上可以如下进行：例如将用PCR法扩增的基因片断或其纯化产物在质粒中进行克隆，接着按照双脱氧法、Maxam-Gilbert法等进行碱基序列直接测序。此外，可以简便地使用市场上销售的测序试剂盒等测定核苷酸序列来进行。由此，可以检测人IRS-2基因的所述特定位点上是否存在突变。
在上述方法和以下所示的方法中，作为样本的用PCR法扩增的DNA片断只要包含至少1个所述的假设存在突变的特定位点即可，没有特别限定。通常具有约50到数千碱基的长度，较好是50到数百碱基的长度。
(2)等位基因特异性寡核苷酸-斑点印迹法
其它的IRS-2基因检测方法可以例举根据等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-斑点印迹法(Conner，B.J.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，80，278-282(1983))的方法。该方法可以通过如下方法进行：例如，使用夹住作为目标的SNP而设计的正向引物和反向引物PCR扩增基因片断，与对于PCR扩增的基因片断等位基因特异性的寡核苷酸探针杂交，对杂交的DNA片断进行斑点印迹分析。由此，可以确定该片断中是否存在SNP。
(3)单碱基引物延伸法
IRS-2基因的检测也可以通过如SnaPshot法、焦磷酸测序法、日本专利特开2000-279197号所揭示的点突变检测法等单碱基引物延伸法进行。这些方法中，对应于目标突变(SNP)的前一个碱基或数个碱基前的碱基设定探针，即将其3’末端设定在作为检测目标的突变的上游1个碱基或附近，将所述探针退火到DNA样本上。各方法可以使用市场上销售的SNPs检测用试剂盒及该试剂盒附带的软件进行。
例如SnaPshot法可以使用ABI PRISM SnaPshot ddNTP Primer ExtensionKit(ABIバイオシステムズ公司制)来进行。SNPs可以对反应后合成的荧光片断使用ABI PRISM310/377/3100/3700DNA Analyzer(都是ABIバイオシステムズ公司制)和GeneScan软件来进行检测、分析。
焦磷酸测序法例如可以如下进行。即，从血液样本等通过常规方法分离基因组DNA，使用生物素标记的引物PCR扩增含有突变的数十到数百碱基，用磁珠纯化单链DNA，将该纯化DNA作为样本。在该样本上退火设定为自目标突变的上游数碱基起的序列的引物，接着按照在软件中输入的突变附近的序列向装置中1种1种地加入dNTP。DNA聚合酶使碱基延伸则生成焦磷酸(PPi)，所以将该PPi通过磺酰化酶(Sulfurylase)转化到ATP中，将其作为荧光素酶的底物，用发光检测器、CCD照相机等检测化学发光。由此，可以通过分析对应于添加的dNTP而得到的发光峰值进行基因的分型。采用该方法，可以在15分钟左右对96个样本进行分型。
在上述方法中，可以使用通常的试剂和装置，例如以DNA聚合酶、ATP-磺酰化酶、荧光素酶和腺苷酸双磷酸酶(apyrase)这4种酶的混合液，荧光素和APS(腺苷5’磷酸酰硫酸)构成的底物溶液，dATP(脱氧腺苷三磷酸)、dCTP、dGTP和dTTP构成的dNTP作为主要构成的市场上销售的SNP Reagent Kits(Pyrosequencing AB公司制)等试剂以及用于自动DNA序列分析的PSQ96系统(Pyrosequencing AB公司制)和其使用中所用的SNP软件(Pyrosequencing AB公司制)。
此外，焦磷酸测序法也可以如下进行：例如，按照美国专利第6,159,693号的记载，将核酸分离后进行扩增，将扩增的PCR产物纯化后，用READITTMSystem(プロメガ·コ一ポレ一シヨン公司制)将其与焦磷酸反应，分析得到的数据。该数据分析可以采用例如使用市场上销售的REATIT技术(プロメガ·コ一ポレ一シヨン公司制)的Excel分析。
(4)PCR-单链构象多态性(SSCP)分析法
本发明所述的检测方法中，还可以采用PCR-SSCP法(Orita，M.，Iwahara，H.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，2776-2770(1989))，即，将PCR扩增产物(单链DNA)进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过其迁移率的差异判定是否存在单碱基突变。
(5)PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析法
本发明的人IRS-2基因的SNPs或单倍型的检测中，例如在包含作为检测目标的突变的核酸序列含有限制性酶识别位点的情况下，该检测还可以通过限制性酶切片段长度多态性分析法(RFLP法：Botstein，D.R.，等，Am.J.Hum.Gen.，32，314-331(1980))来进行。
具体地，例如为了检测存在于人IRS-2基因第2外显子的自蛋白质编码区的翻译起始密码子起核酸序列第29793位是野生型(A)，还是突变型(G)，使用可以识别包含突变位点的其前后的序列的限制性酶。用于所述RFLP法的酶只要是可以识别作为目标的突变位点的前后序列的各种公知限制性酶即可。其具体例子可以例举例如AfaI。
可以采用比该RFLP法更好的PCR-RFLP法，即预先通过PCR法或其改良方法等扩增·制备样本DNA后，对大量制备且浓缩的样本DNA进行的方法。由此，可以通过是否存在特异性剪切位点来检测是否存在突变。
采用PCR-RFLP法的人IRS-2基因的SNP的检测更具体地可以按照例如以下方法进行。即，首先从人活体试样抽提人IRS-2基因的基因组DNA，扩增含有该基因突变位点的区域的DNA片断，得到大量且浓缩的检测样本。这里所用的正向引物和/或反向引物中，含有其序列与基因组的序列不完全一致的部分，较好是含有导入了用于导入限制性酶识别位点的序列的部分。接着，将扩增DNA样本用特定的限制性酶(即，可以只消化野生型或突变型中一种的酶)进行消化，按照常规方法对DNA的剪切方式(是否有剪切、剪切片断的碱基长度等)进行确认。
与本发明中特定的人药物性粒细胞过少症表现出连锁不平衡的人IRS-2基因的突变(A29793G)的情况下，由于人IRS-2基因的碱基序列29793～29796位区域中产生限制性酶AfaI的特异性剪切位点(GTAC)，所以该突变可以通过RFLP法检测。
(6)侵入物法
IRS-2基因的检测也可以通过侵染(Invader)法进行。侵入物法的实施可以参看以下的文献。
·Lyamichev，V.，等，Nat.Bioltechnol.，17(3)292-296(1999)
·国际专利公开WO9823774号(日本专利特表2001-526526号)
由于分析基因组的SNPs，该方法可以不预先扩增目标DNA而进行，例如如下地进行实施。
为了检测作为目标的人IRS-2基因的SNPs是否存在，首先分离基因组DNA。接着，将第一目标探针和侵入物寡核苷酸探针例如用自动合成机合成，第一目标探针由15到50碱基长度的5’翼(5’flap)和将要检测的核酸(本发明中为SNP)配置在5’翼的3’端、除突变核酸外与目标基因组DNA互补地合成的30到数百碱基长度的寡核苷酸构成，侵入物寡核苷酸探针由除了将与要检测的核酸互补的核酸配置在3’端外、与目标基因组DNA互补地合成的15到数十碱基长度的寡核苷酸构成。使这些探针、分离的基因组DNA和将第一探针的与要检测的核酸互补的核酸作为3’端剪切的酶在适当的反应液中反应，本发明所用的侵入物法中加入裂解酶(Cleavase)作为酶。
在样品中的基因组DNA具有所要的突变核酸(SNP)的情况下，则发生第一反应，即，将在3’端具有突变核酸的5’翼游离。在样品中的基因组DNA不具有突变核酸序列的情况下，则不发生所述酶的剪切。
从被用酶剪切的第一探针游离的5’翼与作为靶的荧光共振能量转移(FRET)探针互补地结合，5’翼的3’端侵入(invasion)到FRET探针内。同样地，发生酶引起的反应，荧光染料游离。
该第二反应所用的各FRET探针由被检测的靶决定，由以下的两个基本元件构成。
(1)与从第一反应分离的产物互补的3’区域；(2)含有报道荧光染料和猝灭荧光染料的自体互补区域，为了模仿单链探针形成双链体，并与靶一起杂交。
在所述报道荧光染料和所述猝灭荧光染料结合在同一探针上时，该报道荧光染料由于荧光共振能量转移而其荧光强度受到抑制，未和所述猝灭荧光染料结合在同一探针上的状态下，荧光强度不受抑制。从被用酶剪切的第一探针游离的5’翼杂交到FRET探针上时，它在第二反应中作为侵入物寡核苷酸作用，产生被酶识别的侵入复合物。由此，FRET探针的上述酶引起的剪切将两个荧光染料分离，产生可以检测的荧光信号。该信号可以通过例如标准荧光微量滴定板读取仪器读取，由此可以检测是否存在所要的SNPs或单倍型。通过组合第一和第二反应可以将信号放大至1×106倍。此外，通过使用荧光染料不同的两种FRET探针可以检测(分型)是否有SNP。
(7)定量实时PCR检测法
人IRS-2基因多态的检测也可以通过定量实时PCR检测法(TaqMan法)简便地进行。
该方法例如可以如下地进行实施。即，将含有要检测是否存在作为目标的突变的核酸位点的DNA片断制成例如15～39碱基构成的正向引物和反向引物。其中，制成的正向引物和反向引物不含有作为目标的突变。接着，制成结合了报道荧光染料和猝灭荧光染料的探针，例如为具有15～50碱基构成的碱基序列的寡核苷酸。其中，该探针的碱基序列选择正向引物杂交的区域和该探针杂交的区域相互不重复的组合。制成的该探针具有与等位基因特异性序列互补的序列，用于检测是否存在作为目标的单碱基核酸突变。使用该探针，将样本中要测定的IRS-2基因中所要的DNA片断用PCR扩增，实时地测定反应液中的荧光。由此，可以检测是否存在突变。此外，通过使用荧光染料不同的两种探针可以检测(分型)是否有SNP。
上述侵入物分析和TaqMan法所用的报道荧光染料较好是FAM(6-羧基-荧光素)等荧光素类荧光染料，猝灭荧光色素较好是TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明)等罗丹明类荧光染料。这些荧光染料是公知的，包含在市场上销售的实时检测PCR用试剂盒中，所以可以使用它们。报道荧光染料和猝灭荧光染料的结合位点没有特别限定，通常报道荧光染料结合在探针的寡核苷酸部分的一端(较好是5’端)，猝灭荧光染料结合在另一端。在寡核苷酸上结合荧光染料的方法是公知的，记载于例如Noble等，(1984)，Nuc.Acids Res.，12：3387-3403和Iyer等，(1990)，J.Am.Chem.Soc.，112：1253-1254。
TaqMan法本身是公知的，用于它的装置和试剂盒在市场上有售，所以本发明中可以使用这样的市场上销售的装置和试剂盒。按照例如日本专利第2,825,976号所记载的方法、或PEバイオシステムズ公司制的ABI PRISM7700序列测定系统的用户手册进行实验即可。
(8)使用质谱仪的基因多态检测法(mass array)
Mass array法是检测由于多态产生的质量差的方法。具体是，在用PCR扩增含要检测的多态的区域后，通过在SNP位点前杂交延伸用引物，使用含ddNTP/dNTP混合物的反应液、例如含ddATP、dCTP、dGTP和dTTP的反应液来进行延伸反应，对应于SNP生成长度不同的片断。通过纯化该生成产物，用MALDI-TOF质谱仪等进行分析，可以分析质量数和基因型的对应关系(pusch，W.，Wurmbach，JH.，Thiele，H.，Kostrzewa，M.，基于MALDI-TOF质谱的SNP基因分型(MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping)，Pharmacogenomics，3(4)：537-48(2002))。该方法可以使用例如Sequenom Mass ARRAY海量SNP分析系统(high throughput SNP analysis system)简便地实施(http：//www.sequenom.com/Files/applications/hme_assay.html)。
(9)其它检测方法
人IRS-2基因的SNPs的检测还可以通过以往对于DNA作为其碱基序列测序方法或突变检测方法已知的如下例举的各种方法进行。
(a)使用序列特异性寡核苷酸的PCR-SSO法：
将对于各突变的探针固定化在载体上，向其杂交样本(基因扩增产物)，判定由是否存在错配产生的杂交效率的差。
(b)检测点突变的PCR-SSO法：
使用将对应于点突变的碱基设定在3’端的基因扩增用特异性引物，利用引物3’端是否互补而产生的PCR扩增效率的显著差异。
(c)PCR-DGGE(变性剂浓度梯度凝胶电泳)法：
将突变DNA片断和正常DNA片断混合并杂交结合后，在尿素、甲酰胺等变性剂的浓度逐渐升高的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，则与没有错配的同源双链相比，在变性剂浓度较低的位置解离成单链。该单链DNA比双链DNA泳动速度更快，因此可以通过比较迁移率的差来检测单碱基突变。
(d)PCR-DGGE/GC封条法(Shefield，V.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，232-236(1989))：
该方法在上述PCR-DGGE法的基础上，通过将GC含量高的区域连接到作为突变核酸检测对象的DNA片断上，从而弥补存在多碱基置换、缺失、添加和插入时的检测的不足。该方法特别重要的是在作为突变检测对象的DNA片断上添加GC封条的工序。
(e)RNase保护分析法(Finkelstein，J.，等，Genomics，7，167-172(1990))
(f)原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))
(g)原位杂交
(h)Southern印迹(Sambrook，J.，等，Molecular Cloning a LaboratoryManual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：NY.(1989))
(i)斑点杂交法(参看Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98：503-517(1975)等)
(j)荧光原位杂交(FISH：Takahashi，E.，等，Hum.Genet.，86，1416(1990))
(k)比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization：CGH：Kallioneimi，A.，等，Science，258，818-821(1992))、(Spectral karyotyping：SKY：Rowley，J.D.，等，Blood，93，2038-2042(1999))
(l)将酵母人工染色体(YAC)载体的克隆作为探针的方法(Lengauer，C.，等，Cancer Res.，52，2590-2596(1992))
由此，可以检测人IRS-2基因的多态(SNPs)和单倍型。
根据本发明的药物性粒细胞过少症的判定中，将按照上述检测的人IRS-2基因多态是否存在作为指标，在样本中发现该多态存在时，判定该样本发病几率高。
这样判定为几率高的患者由于在给药前能够发现引起药物性粒细胞过少症的危险存在，因此可以预先防止因给药等引起的粒细胞过少症的发病。
尤其是本发明的人IRS-2基因的SNPs的检测对于检测人的药物性粒细胞过少症发病危险因子是否存在是有效的，通过该SNPs的检测可以检测人药物性粒细胞过少症的发病危险因子。
因此，本发明可以提供人IRS-2基因的基因多态的检测方法，用于将人IRS-2基因的基因多态是否存在作为指标，判定作为人IRS-2基因的SNPs检测对象的受试者是否存在药物性粒细胞过少症发病的几率。
寡核苷酸
本发明也提供寡核苷酸，作为在采用PCR法的本发明判定(检测)方法中所使用的基因多态检测用引物或探针。该寡核苷酸只要是可以特异性地扩增含有人IRS-2基因的突变部分(SNPs)的特定序列部分即可，没有特别限定。该寡核苷酸可以基于人IRS-2基因的序列信息按照常规方法适当地合成、构成。
其合成具体地可以通过常规的硫酸亚酰胺法、磷酸三酯法等化学合成法进行，也可以使用市场上销售的自动寡核苷酸合成装置、例如(Pharmacia LKBGene Assembler Plus：フアルマシア公司制)等进行合成。双链片断可以通过如下方法得到：合成化学合成的单链生成物及其互补链，将它们在适当的条件下退火、或使用适当的引物序列和DNA聚合酶在上述单链生成物上添加互补链。
用作所述引物或探针的寡核苷酸较好是对应于设定为含有人IRS-2基因的突变的DNA片断的部分寡核苷酸，可以例举具有至少10个、通常10～35个左右连续碱基的寡核苷酸。引物可以是具有夹着人IRS-2基因(基因组序列)中的SNP地设计、合成的两条寡核苷酸序列的引物。用作探针的寡核苷酸可以使用正克隆本身。
用作所述引物或探针的寡核苷酸较好是对应于设定为含有人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的C到A的突变(C-4587A)、人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第2510位的AT的缺失突变(AT-2510del)、人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第1164位的A到C的突变(A-1164C)、人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第15870位的A到G的突变(A15870G)、人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变(A29793G)和人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起第31532位的C的缺失突变(C31532del)中的至少一种的DNA的部分寡核苷酸，可以例举具有至少10个、较好是至少15个连续碱基的寡核苷酸。
其具体例子可以例举后述实施例所示的序列编号1、2、4、5、7、8、10、11和13-16所示的正向引物和反向引物，以及序列编号3、6、9、12和17所示的直接测序用寡核苷酸引物。
此外，本发明的基因特异性探针只要是可以检测所述的C-4587A、AT-2510del、A-1164C、A15870G、A29793G和C31532del中的任一个即可。
判定用试剂盒
本发明的判定(检测)方法可以通过使用用于检测样本中人IRS-2基因的SNPs的试剂盒更简便地实施。本发明也提供所述的判定用试剂盒。
本发明的一种试剂盒至少包含以下必要构成成分：与作为人IRS-2基因的6个SNPs的DNA片断的碱基序列或其互补碱基序列的一部分或全部、或者由突变位点的1个碱基或数个碱基前的序列构成的序列杂交的DNA片断。此外，本发明的另一种试剂盒至少包含以下必要构成成分：识别包含上述突变位点的数个碱基的核酸序列的限制性酶，例如AfaI。
本发明的试剂盒中的其它成分可以例举标记试剂、PCR法所需的试剂(例如，Taq DNA聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸、DNA扩增用引物等)。标记试剂可以例举放射性同位素、发光物质、荧光物质等化学修饰物质等，DNA片断本身可以预先结合该标记试剂。另外，为了方便测定的进行，该试剂盒中可以包括适当的反应液、标准抗体、缓冲液、洗净剂、反应中止液等。
如果采用本发明的所述判定方法，则可以提供检测会引起人药物性粒细胞过少症的基因多态、将其作为指标检查人药物性粒细胞过少症发病几率的方法，特别是被报道由服用维司力农等药物引起的药物性的粒细胞过少症(包括粒细胞缺乏症)副作用的给药前，对其给药所引起的粒细胞过少症的发病几率的检查方法和用于该方法的诊断剂以及诊断用试剂盒。
以下，为了更详细地说明本发明，例举实施例，但本发明并不局限于这些
实施例。
实施例
实施例1
(a)与服用药物所产生的粒细胞过少症相关的基因多态的研究
为了研究与服用药物产生的粒细胞过少症相关的基因多态，将服用维司力农(3，4-二氢-6-[4-(3，4-二甲氧基苯甲酰)-1-吡嗪基]-2(1H)-喹啉)的患者作为对象。
维司力农在日本将慢性心力衰竭(轻度～中度)作为适应症，但因为在市场上销售后报道了白血球减少、粒细胞减少、粒细胞缺乏症等由于服用该药物而产生的药物性副作用，所以在给药时，必须对这些副作用进行观察，并进行频繁的粒细胞检查。
在服用维司力农、于1991年5月到1996年10月期间口头上同意协助调查维司力农引发粒细胞过少症的原因、许诺提供血液样本的患者中，将遵循伦理规范在2001年7月到2001年12月期间再次得到协助基因分析的同意的84名患者(男性∶女性比＝1.21∶1)作为受试患者。从上述再次得到同意的患者的血液样本或来自它的细胞样本通过常规方法提取基因组DNA，供于以下的试验。
(b)受试患者分类标准
将受试患者按以下标准分成粒细胞过少症发病患者组和未发病患者组2类。
受试患者中，将维司力农给药前的白血球数或中性白细胞数在给药后下降到半数以下、而且白血球数或中性白细胞数分别为2000或1000/mm3以下的患者作为发病病例(粒细胞过少症发病患者组)。另一方面，将服用维司力农90天以上也没有发现粒细胞相比给药前减少的患者作为未发病病例(未发病患者组)。
这些组按照性别再分成2组，共编成4组。即，粒细胞过少症发病患者男性13名(A组)、发病患者女性17名(B组)、未发病患者男性33名(C组)、未发病患者女性21名(D组)。
(c)作为分析对象的基因和多态(SNP)
从细胞分裂相关、MHC领域、G-CSF相关、TNF-α相关、NF-κ相关、cAMP相关、K-通道相关等基因选择了115个候选基因。
为了检索日本人中这些基因是否有多态，从日本人类多态数据库(JSNP：http：//snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)检索了这些候选基因的SNPs，选择了188个候选SNPs。
(d)分析方法
SNP的分析使用侵入物法进行。该侵入物法参照以下的文献(1)和文献(2)进行。
(1)Lyamichev，V.，等，Nat.Biotechnol.，17：292-296(1999)和(2)国际专利公开WO 9823774号(98/6/4)
为了用PCR法扩增候选SNP的基因组DNA区域，根据在JSNP检索到的含有SNP的基因组DNA序列信息，设定扩增各SNP区域的引物组合，合成各引物。
用于判定候选SNP的基因多态的侵入物分析试剂根据在JSNP检索到的含有SNP的基因组DNA序列信息，通过常规方法制成。
各PCR反应将1ng基因组DNA作为模板进行。15μL反应液含有dNTPs(0.25mM)、总反应液量的1/10的TaKaRa Ex Taq(Takara公司制)附带的PCR反应用缓冲液、各个组合的正向引物和反向引物(各130nM)和TaKaRa Ex Taq(Takara公司制)(0.5U)。各样本用DNA Engine PTC-0200(MJ Research公司制)扩增。PCR反应在94℃下进行2分钟后，进行50个循环，每个循环为：94℃下30秒，56℃、58℃或60℃下30秒，72℃下90秒。
在将得到的PCR产物稀释至10-1000倍的溶液中混合侵入物分析试剂，进行侵入物分析反应。15μL反应液含有5.5×侵入物缓冲液(2.75μL)、10×BioplexFRET Probe Mix(0.75μL)、Cleavase VIII酶(200ng/μL)(1μL)、PPIMix(3μL)和PCR产物稀释液(7.5μL)。反应在62℃、60-120分钟的条件下进行。
(e)基因型判定方法
基因型通过侵入物分析反应的结果、检测出的两色的荧光强度判定。由此，通过侵入物分析对115个基因中存在的188个SNPs确定受试患者中的基因型。
(f)统计的分析方法
通过列联x2测验比较粒细胞过少症发病患者组和未发病患者组中的等位基因频率。让步比通过布朗(Brown)法进行评价(Brown，C.C.，Am.J.Epidemiol.，113：474-480(1981))。让步比的95％置信区间用Woolf的方法计算得到。
(g)结果
对115个基因中存在的188个SNPs用上述方法进行分析，结果统计学上具有最显著差异的多态存在于胰岛素受体底物2(IRS-2)(JSNPID IMS-JST040476)。该SNP在受试患者组中被发现是遵守哈迪-温伯格平衡法则。
由该结果可知，人IRS-2基因中的SNP与服用维司力农引起的粒细胞过少症的发病非常相关，该人IRS-2基因可能在粒细胞过少症的发病中具有重要作用。
人IRS-2基因的表达产物属于胰岛素受体底物蛋白质家族(IRSs：IRS-1、IRS-2、IRS-3、IRS-4)。如果胰岛素受体的酪氨酸激酶被活化，则被酪氨酸磷酸化。已知磷酸化的IRSs活化PI-3激酶，促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)从细胞质向细胞膜的运送，表现出具有促进葡萄糖吸收的作用的胰岛素作用。所以，为了进一步研究人IRS-2基因和维司力农引起的粒细胞过少症的关系，进行了人IRS-2基因的多态分析试验。
实施例2人IRS-2基因多态和药物性粒细胞过少症的相关性分析
使用实施例1所述的患者样本，如下进行人IRS-2基因的多态分析。
(a)人IRS-2基因的筛选和多态的检测
为了筛选与转录调节相关的包括启动子区域的IRS-2基因整体，以从GenBank(登录号XM 007095)获得的人IRS-2的mRNA的序列信息为基础进行检索，从GenBank(登录号AL162497，全长143409bp)得到包含IRS-2基因的基因组序列。进行人IRS-2的mRNA的序列与包含IRS-2基因的基因组序列的详细比较，推测得到人IRS-2的基因结构。其中，为了将基因的方向统一为5’端到3’端，得到的基因组序列用其互补链进行比较。
其分析结果为，人IRS-2基因由2个外显子构成，包括内含子的该基因的全长为32730bp。
基于该序列信息设计、合成引物。
样本使用12例实施例1的受试患者中粒细胞过少症发病病例和12例未发病病例各自的基因组样本。
各PCR反应使用5ng基因组DNA作为模板进行。10μL反应液含有dNTPs(1.25mM)、氯化镁(3.9mM)、硫酸铵(16.6mM)、Tris-HCl(67mM，pH8.8)、β-巯基乙醇(10mM)、各个组合的正向引物和反向引物(各1.25mM)和TaKaRa ExTaq(Takara公司制)(0.5U)。反应液中根据需要加入DMSO(二甲基亚砜)，使最终浓度为10％。
各样本用DNA Engine PTC-0200(MJ Research公司制)或Gene AmpPCR系统9700(PEアプライドバイオシステム公司制)扩增。PCR反应在95℃下进行2分钟后，再进行37个循环，然后以72℃下10分钟进行最后的延伸反应，每个循环为：94℃下30秒，58℃或60℃下30秒，72℃下3分钟。
将得到的PCR产物用BigDyeTMTerminator RR mixer(PEアプライド·バイオシステム公司制)进行反应。
基因多态以ABI Prism 3700DNA Analyzer(PE アプライドバイオシステム公司制)中得到的碱基序列信息为基础，用SEQUENCHER 3.1(Gene Codes公司制)检测，确认在人IRS-2基因上的位置。
(b)样本的扩增和基因型判定方法
为了调查用上述检测方法鉴定的多态在受试患者中表现出怎样的基因型的分布，对所有的基因组DNA样本使用各个引物组合与上述同样地进行反应，使各PCR产物含有上述鉴定的基因多态，进行分析。
(c)统计学分析
除了与实施例1相同的方法，根据Thompson等的方法(Thompson，E.A.，等，Am.J.Hum.Genet.42：113-124(1988))计算两两连锁不平衡系数(D’＝D/Dmax或D/Dmin)。
(d)结果
上述分析的结果是，发现基于本实施例分析的所有多态在受试患者组中遵守哈迪-温伯格平衡法则。
本分析的结果是，被确认与由于服用维司力农诱发的粒细胞过少症非常相关的6个多态及其统计值如表1到表6所示。
[表1]
多态基因型   发病N(％)   未发病N(％) x2(df＝1) P   OR(95％CI)
C-4587ACCCA+AA合计 7(25.0)21(75.0)28 29(59.2)20(40.8)49 8.36 0.0038 4.35(1.56-12.16)
[表2]
多态基因型   发病N(％)   未发病N(％) x2(df＝1) P   OR(95％CI)
AT-2510delATATdel+del合计 7(24.1)22(75.9)29 28(57.1)21(42.9)49 8.02 0.0046 4.19(1.51-11.64)
[表3]
多态基因型   发病N(％)   未发病N(％) x2(df＝1) P   OR(95％CI)
A-1164CAAAC+CC合计 8(26.7)22(73.3)30 29(59.2)20(40.8)49 7.90 0.0049 3.99(1.48-10.73)
[表4]
多态基因型   发病N(％)   未发病N(％) x2(df＝1) P   OR(95％CI)
A15870GAAAG+GG合计 10(37.0)17(63.0)27 36(73.5)13(26.5)49 9.67 0.0019 4.71(1.72-12.88)
[表5]
多态基因型   发病N(％)   未发病N(％) x2(df＝1) P   OR(95％CI)
A29793GAAAG+GG合计 11(36.7)19(63.3)30 39(73.6)14(26.4)53 10.90 0.00096 4.81(1.84-12.56)
[表6]
多态基因型   发病N(％)   未发病N(％) x2(df＝1) P   OR(95％CI)
C31532delCCCdel+del合计 9(33.3)18(66.7)27 34(70.8)14(29.2)48 9.93 0.0016 4.86(1.76-13.39)
表中，“del”所表示的多态表示缺失多态，“多态”中所示的数字是将IRS-2基因的编码区的翻译起始密码子ATG的A作为+1计数的数字。此外，带有负号(-)数字表示位于自IRS-2基因的编码区的翻译起始密码子ATG的A起上游侧的碱基。
如表1-6所示，具有人IRS-2基因自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的C突变为A的多态“C-4587A”、上游第2510位的AT缺失的多态“AT-2510del”、上游第1164位的A突变为C的多态“A-1164C”、自编码区的翻译起始密码子起第15870位的A突变为G的多态“A15870G”、第29793位的A突变为G的多态A29793G”和第31532位的C缺失的多态“C31532del”6种多态中的至少1个多态的患者的情况下，观察到与服用维司力农后的粒细胞过少症的发病非常相关。这6种多态在人IRS-2基因中的位置关系如图1所示。图1中，+1表示翻译起始密码子ATG的A。
研究这些多态间的连锁不平衡是否成立的结果如表7所示。
[表7]
  SNP                                   D’
  C-4587A   AT-2510del   A-1164C   A15870G   A29793G
  AT-2510del   1.000   -   -   -   -
  A-1164C   1.000   1.000   -   -   -
  A15870G   1.000   1.000   1.000   -   -
  A29793G   0.956   0.956   0.957   1.000   -
  C31532del   0.952   0.953   0.953   1.000   1.000
由表7可知，与服用维司力农后的粒细胞过少症的发病非常相关的多态都大致是完全连锁不平衡。即，如果人IRS-2基因的编码区的上游第4587位的等位基因具有突变型A，则与服用维司力农后的粒细胞过少症的发病非常相关的另外5处存在的多态也具有突变型。
这些结果表明，人IRS-2基因中的这6处突变在服用维司力农后的粒细胞过少症的发病中具有重要的作用。
最近，Schacher等(Schacher，D.H.，等，J.Immunol.，164：113-120(2000))报告了原粒细胞HL-60细胞用DMSO刺激向粒细胞分化时IRS-2蛋白质的表达水平上升。该报告表明IRS-2与粒细胞的分化非常相关。本发明人发现的人IRS-2基因突变中的3个突变(C-4587A、AT-2510del和A-1164C)位于负责人IRS-2基因转录量的调节的启动子区域，或许由此可以支持出现这些突变时，IRS-2的转录量受到抑制，变得难以诱导向粒细胞的分化的观点。
实施例3
本实施例涉及本发明的人IRS-2基因的6个多态的其它检测方法的例子，如下述(a)和(b)所示进行。
(a)直接碱基测序法
使用表8所示的正向引物(序列编号1、4、7、10、13和15)和反向引物(序列编号2、5、8、11、14和16)，通过DNA Engine PTC-0200(MJ Research公司制)或Gene AmpPCR系统9700(PEアプライドバイオシステム公司制)扩增各DNA片断，使PCR产物含有本发明所述的6个多态。各PCR反应在95℃下进行2分钟后，再进行37个循环，然后，在72℃下10分钟进行最后的延伸反应，每个循环为：94℃下30秒，表8所示的各退火温度下30秒，72℃下表8所示的各延伸反应时间。退火温度和延伸反应时间如下述表8所示，对于各DNA片断分别为58℃～60℃的温度和0.5分钟～3分钟的时间。
[表8]
正向引物   与AL162497对应的序列编号 反向引物   与AL162497对应的序列编号   退火温度(℃)   延伸时间(min) DMSO
  C-4587A   序列编号：1   131420-131399   序列编号：2   130318-130339   60   3   -
  AT-2510del   序列编号：4   128930-128911   序列编号：5   127491-127510   60   3   -
  A-1164C   序列编号：7   127837-127818   序列编号：8   126460-126479   60   3   +
  A15870G   序列编号：10   110260-110240   序列编号：11   109859-109879   60   3   -
  A29793G   序列编号：13   96209-96190   序列编号：14   96070-96091   58   0.5   -
  C31532del   序列编号：15   94616-94595   序列编号：16   93139-93159   60   3   -
反应溶液的组成如实施例2-(a)所示。其中，用于检测“A-1164C”的反应溶液中加入DMSO，使最终浓度为10％(参看表8的DMSO项)。
表8中用于检测“A29793G”的反向引物(序列编号：14)第23位的G为用于导入限制性酶AfaI识别位点而引入的突变。
除“A29793G”的突变检测之外，用核苷酸碱基序列直接测序法[双脱氧法(Sanger，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467(1977))或Maxam-Gilbert法(Methods in Enzymology，65，499(1980))]进行多态的检测。使用的引物如表9所示(序列编号：3、6、9、12和17)。
[表9]
测序反应中使用的引物   与AL162497对应的序列编号
  C-4587A   序列编号：3   130343-130363
  AT-2510del   序列编号：6   128581-128562
  A-1164C   序列编号：9   126912-126929
  A15870G   序列编号：12   110249-110231
  C31532del   序列编号：17   94556-94537
(b)PCR-RFLP(限制性酶切片段长度多态性)分析法
“A29793G”的检测使用PCR-RFLP(限制性酶切片段长度多态性)分析法。即，20μL反应溶液由10μLPCR产物、2单位限制性酶AfaI(10units/mL；Takara公司制)和限制性酶附带的2μL10×缓冲液T构成，向其加入BSA使最终浓度为0.01％，在37℃下孵育16小时后，用4％琼脂糖凝胶分离限制性酶处理产物。
由此，如果对从患者样本提取的DNA适用上述实施例所述的人IRS-2基因的6个多态中任一种的检测方法，则可以在给药之前，预先判定是否存在因给药而引起药物性粒细胞过少症(包括粒细胞缺乏症)的可能性，即药物性粒细胞过少症发病几率。这样，如果采用本发明，特别是通过检测患者样本的DNA，可以检查因服用维司力农而引起的粒细胞过少症的发病几率。
产业上利用的可能性
本发明可以用于人药物性粒细胞过少症发病几率的检查、判定，特别是被报道有因给药引起的药物性粒细胞过少症(包括粒细胞缺乏症)副作用的给药前的该药物性粒细胞过少症发病几率的检查、判定。
                                  序列表
<110>大塚制药株式会社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)
<120>药物性粒细胞过少症发病几率判定法
<130>OP0046
<140>
<141>
<160>17
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>1
accactgtat ttgtgacaac tc                                            22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>2
aaatatggat cagtctcttt cc                                       22
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>3
atgttcattt tatgagggag g                                        21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>4
aactgccaat ccagagctgc                                          20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>5
tctcaccaca ccgcttcaag                                            20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>6
ccacattttc ttcaagcacc                                             20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>7
gagcttgctg ggatctgaac                                              20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>8
atgtgactcg gcgttacgca                                           20
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>9
ccttgcagtg gaagcatg                                              18
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>10
ctatcccgat tcctagatgt c                                          21
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>11
gactcatctg tgactaactc c                                         21
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>12
cctagatgtc agcttgccc                                            19
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>13
tctggaactc cagagattgc                                           20
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>14
tgctgagcgt cttcttttaa tggta                                     25
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>15
gaggcttttt tagaggaaga cc                                        22
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>16
catgtcatgg agggagcatt c                                          21
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：用于胰岛素受体底物-2(IRS-2)的SNPs的扩增的引物序列
<400>17
gcaaaagtct tcctgcttcc                                            20

Claims (22)

1.药物性粒细胞过少症发病几率的判定方法，其特征在于，检测受试者的人胰岛素受体底物-2基因的基因多态，将其作为指标判定是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险。
2.人胰岛素受体底物-2基因的基因多态检测方法，其特征在于，以是否存在该基因的基因多态为指标，用于判定受试者是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险。
3.药物性粒细胞过少症发病几率的检测方法，其特征在于，检测受试者的人胰岛素受体底物-2基因的基因多态，将其作为指标。
4.如权利要求1～3中的任一项所述的方法，其特征还在于，以是否存在人胰岛素受体底物-2基因的从下述(a)～(f)中选出的至少1个基因多态作为指标，判定是否存在药物性粒细胞过少症发病的危险：
(a)自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的野生型(C)突变为A的多态，
(b)自编码区的翻译起始密码子起上游第2510位的野生型(AT)缺失的多态，
(c)自编码区的翻译起始密码子起上游第1164位的野生型(A)突变为C的多态，
(d)自编码区的翻译起始密码子起第15870位的野生型(A)突变为G的多态，
(e)自编码区的翻译起始密码子起第29793位的野生型(A)突变为G的多态，
(f)自编码区的翻译起始密码子起第31532位的野生型(C)缺失的多态。
5.如权利要求1～4中的任一项所述的方法，其特征还在于，基因多态的检测通过从以下方法中选出的至少1种方法进行：核苷酸碱基序列直接测定法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析、单碱基引物延伸法、PCR-单链构象多态性(SSCP)分析、PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析、侵入物法、定量实时PCR检测法和使用质谱仪的基因多态检测法(mass array)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征还在于，基因多态的检测通过核苷酸序列直接测定法进行。
7.如权利要求5所述的方法，其特征还在于，基因多态的检测通过PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析进行。
8.如权利要求7所述的方法，其特征还在于，PCR-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析使用限制性酶Afa I，用于检测人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变。
9.寡核苷酸，其特征在于，它是作为可与人胰岛素受体底物-2基因杂交的用于基因多态检测的引物或探针的寡核苷酸，选自以下的(a)～(f)：
(a)包含人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起上游第4587位的C突变为A的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(b)包含人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起上游第2510位的AT缺失的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(c)包含人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起上游第1164位的A突变为C的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(d)包含人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第15870位的A突变为G的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(e)包含人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A突变为G的基因多态位点的寡核苷酸序列，
(f)包含人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第31532位的C缺失的基因多态位点的寡核苷酸序列。
10.寡核苷酸，其特征在于，它是可以与人胰岛素受体底物-2基因杂交的用于基因多态检测的引物，选自以下的(a)～(d)和(f)：
(a)序列编号：3所示的寡核苷酸序列，
(b)序列编号：6所示的寡核苷酸序列，
(c)序列编号：9所示的寡核苷酸序列，
(d)序列编号：12所示的寡核苷酸序列，
(f)序列编号：17所示的寡核苷酸序列。
11.药物性粒细胞过少症发病几率判定用试剂盒，其特征在于，包含权利要求9所述的寡核苷酸作为人胰岛素受体底物-2基因的多态检测用的引物或人胰岛素受体底物-2基因的多态检测用的探针。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征还在于，包含权利要求10所述的寡核苷酸。
13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征还在于，包含权利要求9的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶Afa I，用于检测人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变。
14.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，使用权利要求9或10所述的寡核苷酸判定服用维司力农引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
15.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，使用权利要求9的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶Afa I来判定服用维司力农引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
16.人胰岛素受体底物-2基因的基因多态检测用试剂盒，其特征在于，包含权利要求9所述的寡核苷酸作为人胰岛素受体底物-2基因的多态检测用的引物或人胰岛素受体底物-2基因的多态检测用的探针，用于判定药物性粒细胞过少症的发病几率。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征还在于，包含权利要求10所述的寡核苷酸。
18.如权利要求16所述的试剂盒，其特征还在于，包含权利要求9的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶Afa I，用于检测人胰岛素受体底物-2基因的自编码区的翻译起始密码子起第29793位的A到G的突变。
19.如权利要求2所述的方法，其特征还在于，使用权利要求9或10所述的寡核苷酸，检测用于判定服用维司力农引起的药物性粒细胞过少症的发病几率的基因多态。
20.如权利要求2所述的方法，其特征还在于，使用权利要求9的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶Afa I，检测用于判定服用维司力农引起的药物性粒细胞过少症的发病几率的基因多态。
21.如权利要求3所述的方法，其特征还在于，使用权利要求9或10所述的寡核苷酸来检查服用维司力农引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
22.如权利要求3所述的方法，其特征还在于，使用权利要求9的(e)所述的寡核苷酸和限制性酶Afa I来检查服用维司力农引起的药物性粒细胞过少症的发病几率。
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