CN1263559A - 分析动物产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分析动物产品的方法。特别地,本发明提供以品种来源为基础鉴别动物产品或鉴定动物产品的方法。

Description

分析动物产品的方法
本发明涉及分析动物及其产品的方法。具体地，本发明涉及以品种来源为基础鉴别动物产品、测定或测试动物产品的品种来源和鉴定动物产品的方法以及实现这些方法的试剂盒。此外，本发明提供测定与皮毛颜色有关的猪基因型的方法。引言动物品种
数千年来，人类在动物饲养过程中应用选择压力来产生表现某些有利特征的家畜。选择这些特征以满足审美、技术、宗教仪式、社会和经济的需要。结果是产生大量不同的动物品种。
术语“品种”是用于定义家畜的同型、亚种群体的专业术语，群体内家畜具有可定义和可鉴定的外部特征使其能够通过视觉评估与相同物种中其它相似定义群体区分开。因此，此术语定义一群动物，人类对它们应用选择压力而得到可遗传的并且可区分于该物种的其它成员的相同外部特征。
随着品种的确立，其完整性通过品种群落、家畜血统书和系谱记录得以维持。品种选择
传统的品种选择方法是基于对动物和/或其亲缘动物表型的直接测定。因此，完成育种策略需要保持广泛的表型记录。例如，美国和西欧的产奶家畜改进计划部分依赖于以月为基础进行的数百万头奶牛个体记录(奶产量和成分，种类性状、健康性状等)的收集。同样，育种公司细心地监测他们的猪和家禽育种原种进行完整的表型测定。
然而，一些重要特征不马上在存活动物水平表现。例如，一些肉质参数是由细微的生理或生化特征决定的，这些特征不容易观察到，且因此不能用作有效人工选择的基础。
这种质量育种部分依赖于在一定程度上与所需特征共遗传(连锁或相关)的其它(更容易观察的特征)。例如，在猪工业中，过去耳垂与生育能力相关并因此用作此性状的标记。
传统的育种选择方法由于有些表型仅在一种性别中或特定发育时期表达而受到限制。此外，有些表型难以测定并且测试费用昂贵。因此，借助以DNA为基础的诊断(用于标记辅助的筛选或MAS)间接测定这些表型特征被看作是直接测定表型参数的理想替代方案[参见Georges和Andersson(1996)，家畜基因组时代的到来，基因组研究，第6卷：907-921]。然而，决定许多所需特征的基因结构-功能关系经常是高度复杂的并且还没有得到足以使这种方法在实践中简单易行的充分了解。品种鉴定
动物品种的鉴定目前正处于分水岭时期。以前它们通过外在身特征和系谱记录得以鉴定，而在将来，随着从特定育种品系形成新品种，它们将通过一套DNA标记加以鉴定。这里所述的工作不仅允许目前在一定范围产品中可能的最精确的品种测定方法，而且允许以普通方式将通过应用本发明获得的品种因子信息与将来使用本发明获得的信息结合。因此，本发明不仅允许在目前环境下测定来源品种，而且允许将本发明与未来品种的形成及其独特鉴定联系起来。
一般认为鉴定作为给定品种代表的特定动物的唯一权威性方法是通过其系谱。因此，尽管外在表型特征在育种过程中和维持品种纯度时有根本的重要性，但是本领域技术人员一般认为品种一致性不能仅根据这些性状的视觉观察作决定性鉴定。例如，猪引起有条带表型的遗传因子对于无条带形式是显性的。因此，有条带的动物可能来自有条带品种物如Hampshire与无条带品种动物的杂交。
正如猪：世界育种手册，V.porter，Helm Inf.Ltd，ISBN 1-873403-17-8，1993，第16页中所述，“什么是品种？”：
外部特征可能是欺骗性的：永远不要通过其皮毛判断一头猪！
然而，在许多情况中，根据系谱的直接证据进行品种鉴定是困难或不可能的。因此，实际上，所谓的“品种标记”可用于测定品种的一致性。
术语“品种标记”是定义根据经验性数据似乎是品种特异性的可测定特征的专业术语。品种标记包括基因型特征如DNA多态性、化学特征如肉的蛋白和水分含量、外遗传/生化特征(如蛋白多态性)、染色体结构、基因拷贝数、DNA指纹、微卫星分析和RAPD DNA标记。
其它有用的标记包括品种因子(breed determinant)。术语“品种因子”在此用来指在育种计划中(至少部分)用作人工选择基础的外在表型特征。相对于术语“品种标记”使用该术语，(正如上面所解释的)品种标记在此用来定义根据经验性数据似乎是品种特异性的其它特征。术语“品种因子基因”用来指(至少部分)参与相应外在表型特征表达的基因。
有些品种因子(如皮毛颜色)在传统上用作品种“商标”，并且因此长期用作系谱(和品种一致性)的指标。同样被选择用于品种开发的其它品种因子包括诸如耳姿、面部形状和一般解剖结构的特征。品种因子相对于简单品种标记的优势在于它是品种特征与因子之间不可分割的纽带。品种一致性的生化和遗传测试
上述许多品种标记可用生化或遗传测试进行特征分析。这些标记包括基因型特征(如DNA多态性)、生化特征(如蛋白多态性)、染色体结构、基因拷贝数、DNA指纹、微卫星模式和RAPD DNA标记。
然而，如下所述，还存在许多与这些测试有关的显著问题：
以动物产品(如肉或精浆)的化学组成为基础的测试可能由于化学组成在动物不同部位(即不同肌肉)之间不同并受饮食、年龄、性别和样品贮存条件影响这一事实而受到干扰。此外，得到的结果在自然条件下一般是定量的，从而引起不同测试部位间解释与比较的问题。
由于任何给定蛋白的分布很可能不均一，使目的蛋白在某些组织中缺乏，所以基于蛋白多态性的测试受到限制。因此，可能需要多种不同多态性标记来检测所有目的产品的品种来源。此外，这些测试以抗体分析为基础，并且也需要高投资以开发特异性抗体测试所需的试剂。
由于进行细胞遗传学操作和解释需要高技术水平并且样品保存需要高度小心和细致，所以染色体结构分析受到制约。这些标记难以用于除了来自存活或新近死亡动物的材料之外其它任何材料。
经典的DNA指纹是以重复DNA序列区域为基础，这是由于它们的结构在种群内表现高度长度变异性。这些区域经常以许多拷贝存在于个体DNA中，因此增加了个体差异的可能性。通过根据大小分离总DNA片段并且然后用特异性探针确定高度可变区域的位置(和因此得到的大小)，可获得特定个体的一系列条带指纹。在猪中已经检测到许多DNA高度可变区的探针(包括M13病毒序列和人微卫星探针)并且据称在每个品种中发现了特异性条带。
随机扩增多态DNA(RAPD)标记是基于用随机序列引物对DNA片段的PCR扩增。这种反应一般产生许多DNA片段，可通过凝胶电泳根据大小对其进行特征分析。如果检测以来自不同品种DNA为基础的反应产物，则可能发现一些品种特异性DNA条带。然而，在大多数情况下，在存在这种重复系列等位基因与决定品种的真实性质的特征之间没有直接的联系。这与这些DNA区域的高度可变性一起导致其很少是品种特异性的(相似的等位基因存在于许多不同品种中)。由于与品种的表型无关联，故存在交叉特异性等位基因可能存在或出现于品种中的更大风险，而这对于品种因子来说是不大可能的，因为它们定义表型本身。如果是存在大量特异品种的动物种群，则不得不进行深入研究以从品种排除不是据称与其相关联的DNA标记。
然而，此方法的主要缺陷在于RAPD标记被认为是不可靠的并且发现在不同实验室间有差异。当必须分析和比较不同类型和历史的样品时，这些问题更加严重。
因此，需要可靠的品种标记，它可用作快速而廉价鉴定各种动物产品品种来源和鉴定动物产品(如饲料和用于育种计划的精液)方法的基础。
现已认识到此前所定义的品种因子(如皮毛颜色)作为品种标识或品种特异性标记有预想不到的优势。特别地，令人吃惊地发现在较长时间中使用外在表型特征作为选择基础得到了在大多数品种中固定的特定等位基因。这些品种标记可用于提供特定品种的工业标准模式，用于来自特定种的所有材料。
因此，现已发现实际上许多品种在品种因子基因方面(如此前所定义的)是遗传上同型的，从而这些基因可用作可靠品种特异性标记的基础(与本领域中较早提出的有关在品种鉴定中利用品种因子本身如皮毛颜色的偏见相反)。
此外，令人吃惊地发现决定任何一种品种因子(如皮毛颜色)的品种因子基因(或其等位基因)的性质可能是高度多态性的。因此，不同品种之间品种因子基因和/或等位基因的差异可能存在，尽管不同品种因子基因/等位基因可能导致相同外在表型特征的表达。
在本发明之前，认为相应遗传因子的多态性不足以提供鉴别不同品种的有用基础。例如，已知皮毛颜色在猪不同品种之间是相同的并且因此(如上面所述)不被看作是品种特异性标记的良好侯选标记。然而，本发明人已发现在这些品种中决定皮毛表型的等位基因实际上是高度多态性的并且经常是特征性的(并且因此可用作品种鉴定的基础)。
相似的考虑适用于其它外在身体特征(品种因子)，因此这些因子可能在不同品种中都有，但与每种品种中不同的基因/等位基因相关。这样的实例可在表现两种肌肉(double muscled)表型的牛中见到。Kambadur等(1997，基因组研究7，910-915)和Grobet等(1997，自然遗传学17，71-74)的工作说明牛的两种肌肉表型是由肌抑制素(myostatin)基因中的突变所致。而且，在Belgian Blue和Asturiana品种中，该基因含有11bp的缺失而在Piedmontese品种中存在G到A的转换。因此，正如猪皮毛颜色的情况，单一选择的特征是由许多潜在多态性引起。然而，这种外在身体特征的发生性质和选择历史导致特定等位基因在这些品种内的固定，产生因子的品种特异性模式。
根据这些发现，现已认识到品种因子(如皮毛颜色)的遗传分析提供鉴定动物产品(如饲料)的有效方法并且可有利地加入到动物产品(如食品)的加工生产线中以检测和维持产品质量并且可加入到食品工业中的质量控制过程中。皮毛颜色
猪品种表现出各种皮毛颜色，并且这些颜色与特定产品特征相关。例如，在欧洲商业品种如Large White和Landrace中白色是显性的皮毛颜色，并且这些品种与较大的产仔和良好的生育能力相关。然而，有大量商业上重要的有色品种，它们表现多种颜色及其组合。与肉质鲜嫩有关的Duroc是红色的，形成瘦骨架、肌肉发达的动物Pietrain是有斑点的，并且肌肉同样肌肉发达的Hampshire是黑色的并且在其肩上有白色鞍状物。此外，可能还有其它有用的地方品种，它们具有有潜在商业利益的性状并且是有色的。例如，中国Meishan品种由于其很大的产仔大小已进口到欧洲和美国。欧洲Wild Boar在成年时是棕色的而在幼年时是带条纹的，并且此品种用于满足传统肉产品的消费需求。同时据称其它地方品种或当地品种由于其适应当地环境如温度、地方病和当地饲料也是重要的。
皮毛颜色由于种种原因对于猪加工业是重要的。首先，在猪生产商脑海中，认为与除皮毛颜色以外的性状遗传学上一致的猪外表(即皮毛颜色的范围)的大体差异可能导致有关动物一致性和质量的问题。因此，猪的皮毛颜色经常用作品种的商标，并且育种者希望确保其动物品种的颜色正确。例如，在多个市场上，地方的、传统的和有色的品种根据其肉质或饲养它们所用的生产系统进行交易。然而，这不是简单的任务因为皮毛颜色受多个基因控制。遗传也因为显性的存在和基因间的相互作用而变得复杂。也可用于评估用作现代合成品系基础的传统品种的遗传学纯度并确认现代合成品系的来源。
其次，在多个市场中存在对白皮猪肉的偏好。这是由于猪肉经常连着肉皮一起出售，并且有色猪的皮肤即使去毛仍可能有颜色，这可能导致部分消费者的不好感觉，因为肉表面似乎杂有霉点。因此，在这些市场中从这样的畜体除去皮肤是必需的，从而导致额外的成本。例如，在美国，有色畜体与约1％需要去毛和去皮以去除色素的肉皮缺陷有关。结果，有色猪畜体一般要打折扣。
这种问题的一个实例涉及在白色和有色素品系之间杂交制备动物时出现的黑色色素斑点的存在。这种情况可能发生，因为从白色品种遗传的显性白色基因在此杂交中出现的杂合情况中不总是完全显性。此问题的可能解决办法将是确保生产动物对于存在于品种如Duroc中的隐性红色等位基因是纯合的。在此情况下，有色素形成的斑点将是红色而不是黑色的并且不那么显眼。为了达到此目的，人们需要在用于杂交育种的白色和有色素品系中将隐性红色等位基因培育成纯合体。然而，用表型选择方法将是十分困难的，因为在白色品系中选择红色背景颜色只能用很昂贵的子代测试策略才能实现。
此外，猪育种者希望处于能确保育种种群一致性的状况。育种者可能希望确保由育种杂交产生的子代总是白色的。选择性地，Duroc或Hampshire猪的育种者可能希望确保育种杂交总是产生特征性的Duroc或Hampshire颜色。在过去，试图用传统的动物育种方法从猪品系去除非典型颜色。例如，纯种育种者必须对可能的公猪进行子代测试以证实它们适于包括进育种群体中。此方法导致重大开支，包括确定足够交配的实际耽搁并且在可商业上使用动物之前已经产生了后代。
因此，与表型选择相比，基于诊断DNA测试对皮毛颜色基因突变的选择将是重要的进步。皮毛颜色是由多个不同基因基因座的作用决定的。例如，将决定猪是白色或有色的基因命名为I(抑制皮毛颜色)。阻止任何颜色表达的基因模式(I)对于允许颜色形成的基因模型(i)是显性的。对白色动物的传统选择降低了i的频率，但其仍然存在于白色杂合携带者动物的种群中。最近，鉴定到KIT基因的等位基因中的许多结构差异并且发现其涉及皮毛颜色决定的方面，从而允许开发鉴别此基因座不同等位基因的方法。
然而，在此基因座携带两拷贝隐性等位基因i的动物具有非白色皮毛颜色[Johansson-Moller等，哺乳动物基因组，7：822-830(1996)，WO-A-97/05278，在此引入其公开内容作为参考)。这种猪可能完全为一种颜色如Duroc(红色)或具有几种颜色的组合(特别是斑点状或条纹状或条带状图案，分别例如Pietrain和Hampshire)。多种其它组合也是可能的并且已经观察到(参见下表)：
     基因型        颜色
      I/I          白色
      I/i          白色
      i/i          有色
      Ip/Ip      杂有有色斑点的白色
      Ip/I        白色
      Ip/i        杂有有色斑点的白色
这些动物中的非白色可能是不同深浅的红色或黑色。表达的这种颜色是由命名为E(皮毛颜色的延伸)的第2种基因的作用所决定。根据文献，含有E基因模式的动物完全为黑色，并且该基因模式对于导致红色皮毛颜色的基因模式(e)为显性。有斑块或有斑点的动物如Pietrain品种含有称为Ep的第3种基因模式。此基因模式对于e是显性而对于E不是显性。例如，黑色动物可能具有基因型iiEe，iiEEp或iiEE。在E基因座均为杂合并且基因型为iiEe的黑色母猪和黑色公猪以3∶1比例产生黑色和红色小猪。黑色小猪将为iiEE或iiEe并且红色小猪将为iiee。
皮毛颜色的密度和面积以及白色条带的位置由其它基因座决定，其中之一即条带基因座在本申请中随后讨论。例如，Hampshire品种为背景黑色，有一白色条带穿过其肩部，此条带的宽度可以不同，然而其毛色应该为黑色。存在这样的证据，即一些Hampshire动物源自以前已与红色品种如Duroc杂交的畜群。在这种情况下，该基因的红色模式可在杂合状态下以沉默方式维持。当两个杂合子杂交时，25％的子代将含有红色。在有些情况下这些猪将具有Duroc品种的外部特征，为纯红色，然而在其它情况下这些动物将具有从Hampshire遗传的白色条带并且具有红色Hampshire的外部特征。在此情况下重要的是除了图案还存在非典型的皮毛颜色。
已知延伸基因座存在于其它家养动物品种中，例如马，其中e与栗色有关[Adalsteinsson，J.Hered.65：15-20(1974)]，牛[Klungland等，哺乳动物基因组6：636-639(1995)]，狐狸[Adalsteinsson，J.Hered.78：15-20(1987)]和小鼠[Jackson，遗传学年鉴28：189-217(1994)]。延伸基因座编码α促黑素受体(αMSHR)。现已表明在此基因座的隐性等位基因不表达有功能的αMSHR受体[Robbins等，细胞6：636-639(1995)]，并且这些研究者已在与不同皮毛颜色有关的这些种中鉴定到αMSHR基因序列内的突变。
经典的分离分析在猪延伸基因座中鉴定到至少3个等位基因，E为均一黑色，Ep为黑色斑点和e为均一红色[Ollivier和Sellier，Ann.Genet.Sel.Anim.，14：481-544，(1982)]。3个等位基因的显性关系为E＞Ep＞e。我们现已发现皮毛颜色变化与猪αMSHR基因中的序列多态性有关。我们已用来自有不同皮毛颜色的以下品种的样品分析此基因的DNA序列：野生型颜色的Wild Boar，带有均一黑色等位基因(E)的Meishan和Hampshire，带有黑色斑点等位基因(Ep)的Pietrain和Large White以及均一红色(e)的Duroc。在Large White中由于Ep等位基因的存在而预期的色块或色斑被隐藏，因为此品种也携带阻止任何颜色表达的显性白色基因。获取5种不同的αMSHR基因，一种来自Wild Boar，一种来自Meishan，一种来自Duroc，一种来自Hampshire并且一种发现于Pietrain和Large White中。我们将发现于Wild Boar中的等位基因称为E+并且认为此等位基因的存在对野生型颜色的表达是必需的。由Meishan和Hampshire猪携带的均一黑色E等位基因与不同的αMSHR序列相关。我们将这两个等位基因分别称为Em和Eh。与Pietrain中发现的与黑色斑点等位基因有关的DNA序列称为Ep。Ep和Eh等位基因的相似性表明它们来自共同起源。此处说明的序列差异可用作测定猪皮毛颜色方面基因型的方法和试剂盒的基础。选择性地，连锁标记的等位基因如发现与这些等位基因不平衡连锁的微卫星或AFLP标记可用于预测颜色基因型。总之，我们已发现与5种不同的延伸等位基因即E+、Em、Eh、Ep和e相关的5种不同αMSHR序列。
除了在等位基因Ep 5’末端的2个碱基对插入和在等位基因Em 3’非翻译区中的1个碱基对的缺失以外，在αMSHR基因中鉴定到的DNA序列差异为单个碱基对变化。这些变化中有些是沉默的，然而许多变化引起αMSHR蛋白氨基酸序列的变化。例如，e和其它等位基因之间的差异是αMSHR基因编码序列中的2个错义突变。重要的是，猪基因中的差异不同于在其它物种中发现的差异。牛和小鼠的e突变是一个碱基对的缺失[Robbins等，细胞，72：827-834(1993)；Klungland等，哺乳动物基因组6：636-639(1995)，Joerg等，基因组7：317-318(1996)]，而这里鉴定到的突变包括在人、小鼠、牛和马基因序列中保守的区域中的错义突变(G727变为A)[Wikberg等，WO 94/04674(1994)，Valverde等，自然遗传学11：328-330(1995)，Robbins等，细胞72：827-834(1993)，Klungland等，哺乳动物基因组6：636-639(1995)，Joerg等，基因组7：317-318(1996)，Marklund等，哺乳动物基因组7：895-899(1996)]。Ep组在基因5’末端Wild Boar序列核苷酸位66后有双核苷酸插入，这导致基因中产生另一个终止密码子，得到仅54个氨基酸的推测的突变多肽。最后，Meishan等位基因(Em)在蛋白中表现4个氨基酸变化。这些差异中的两个位于在牛中变化的基因的相同区域中。
一系列猪品种的颜色、典型的I和E基因型以及根据序列测定和测试研究测定的E基因型在下表中表示：品种            I基因座     E基因座      颜色Hampshire         i/i       Eh/Eh        黑色带有白色条带Large White       I/I       Ep/Ep        白色Landrace          I/I       Ep/Ep        白色Pietrain          i/i       Ep/Ep        白色带有黑色斑块Berkshire         i/i       Ep/Ep        黑色带有白点Meishan           i/i       Em/Em        黑色或黑色带有白点Duroc             i/i       e/e            红色Wild Boar         i/i       E+/E+        棕色(带状毛)
因此，有可能鉴别等位基因E+、Em、Eh、Ep和e并由此测定猪个体非白色皮毛颜色的基因型(或其产物的遗传起源)。有趣的是，已经检测的白色品种看来等位基因Ep都固定在E基因座处。认为E基因座对I基因座赋予的表型可能有一定的修饰效应。虽然此效应的机制还没有确定，但是Ep在这些品系中的固定说明了在品种特征选择方面对涉及皮毛颜色基因座的敏锐影响，由此在这些基因座之间提供比可能预期的更多的因子。
延伸基因座基因型与连锁标记如与该基因连锁的微卫星序列之间的关联可以得到测定。许多微卫星标记位于猪6号染色体已定位αMSHR基因的区域。
许多猪品种特征性地表现条带表型，其由肩部上的连续白色条带和白色前腿组成。表现此特征的品种实例有在黑色背部背景中表现白色条带的British Saddleback(来自Wessex和Essex品种)和Hampsphire以及特征为红色背景上白色条带的Bavarian Landschwein。该特征由称为Be的显性作用基因座Belt控制，该基因座认为是两个等位基因(Legault 1977，于：猪遗传学，Rothschild M.F.和Ruvinsky A编，CAB国际出版社中)[Ollivier和Sellier，Ann.Genet.Sel.Anim.，14：481-544，(1982)]。Be产生条带而纯合形式的be导致条带的缺乏。杂合动物Be/be带有条带，但是在此基因型中条带一般在特征上更窄。
为了鉴定有条带和无条带表型的真实遗传基础，用来自Pietrain X(Pietrain X Hampshire)杂交的动物进行研究。Pietrain是be/be而Hampshire是Be/Be。因此F1代均具有基因型Be/be。将F1进一步与Pietrain(be/be)回交导致Be等位基因在子代间的分离，得到表现条带的Be/be动物和无条带的be/be子代。然后建立这些系谱内部条带性状的遗传与某些微卫星标记之间的相关性。此工作令人吃惊地鉴定出实际参与的基因为上述参与显性白色的KIT基因。进一步分析表明此系谱中的表型与KIT核苷酸2678位存在的C或T多态性相关。C的存在产生AciI限制性位点，当T存在时没有此位点。根据这些意外的发现，可用多种方法测定动物在条带基因座的基因型，这些方法使用单核苷酸多态性或连锁标记包括微卫星或其它单核苷酸多态性。因此，可通过多种方法测定动物的基因型从而测定它们此特定外在特征的遗传状况。发明概述
根据本发明，提供以品种来源为基础鉴别动物和动物产品、测定或测试动物产品的品种来源或鉴定动物产品的方法，其中此方法包括以下步骤：(i)提供动物产品的样品；并且(ii)分析存在于样品中一种或多种品种因子基因的等位基因。
如上所解释的，品种因子是外在表型性状。如此处所用的，外在表型性状是可通过视觉识别的性状。
以品种来源为基础鉴别动物产品包括将一组不同动物产品成员分成许多具有相同品种来源的不同产品。这不一定意味着鉴定品种来源的性质。在动物产品来源的一致性必须得到监测(但其实际品种来源并不重要)的情况下，在这种基础上的动物产品鉴别可能是足够的。
相反，动物产品品种来源的测定意味着鉴定品种来源，而测试品种来源意味着足以测定是否使用了除所需来源以外的品种来源的分析(当其已经注明时不一定鉴定这样的其它品种来源)。
鉴定动物产品意味着鉴定其达到规定的品种来源要求。这样的鉴定根据进行分析的环境和可以得到的辅助数据的性质和程度可能包括鉴别、测定和/或测试。
用于本发明的样品可以是任何方便的形式。在许多情况下，样品将是食物样品(如肉产品)。对于大多数应用，样品经预处理(如提取、纯化和/或分级分离)以便可以对品种因子基因的等位基因进行[核酸(如RNA或DNA)和/或蛋白水平]分析。样品优选地是核酸样品，有这种情况下分析步骤(ii)包括DNA或RNA分析。选择性地，样品可以是蛋白样品(其中蛋白性质反映品种因子等位基因)，在这种情况下分析步骤(ii)包括蛋白分析。
本发明的品种因子可以是单基因或多基因性状。单基因性状是优选的，因为赋予这样的性状的基因一般容易鉴定和分析。然而，在有些情况下分析多基因性状(即由多个基因控制的性状)的等位基因可能是有用的，因为在这种情况下潜在的等位基因多态性更多(因此增加了品种鉴别的可能性)。
一般地，外在表型特征是那些在育种计划中用作人工选择基础的性状。外在表型性状优选地是行为或形态学性状、生理学或行为性状。
外在表型性状在品种间可能有量或质的差异。优选的是在品种间有数量上差异的性状，因为这样的性状经常是相应品种因子基因的等位基因中数量上差异的反映。在这些情况下，分析得到相对可靠的阳性-阴性结果，这些结果在不同测试站/实验室之间容易进行解释和比较。
在步骤(ii)中分析的品种因子基因可以是任何适合的品种因子基因。这些基因可通过本领域众所周知的方法用常规试验和误差加以鉴定和分析。优选地，它们选自皮毛颜色、图案、质地、密度或长度基因；耳朵方面的基因；两种肌肉形成基因；角形态基因；獠牙形态基因；眼颜色基因；羽毛基因；喙颜色/形态基因；发声(如吠叫)基因；鸡冠或肉垂基因和/或控制炫耀行为基因。
在优选实施方案中，品种因子基因是KIT或αMSHR皮毛颜色基因(例如猪KIT和/或αMSHR基因)。
分析步骤(ii)可以包括任何广泛的已知核酸/蛋白分析技术。所选分析技术的性质对于本发明的实施不是关键，并且本领域技术人员可以根据进行分析的情况和需要数据的类型容易地决定适当技术。
优选地，分析步骤(ii)包括选择性地扩增特定核酸片段(例如通过PCR)、测定品种因子基因内一个或多个限制性核酸内切酶位点的存在[例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析]、测定品种因子基因的部分或全部核苷酸序列、用等位基因特异性的DNA或RNA探针检测核酸、或者用至少一对适当引物对核酸样品进行一轮或多轮PCR扩增并且然后对这样得到的扩增核酸进行RFLP分析。
选择性地，分析步骤(ii)包括用对等位基因特异性表位特异的抗体(如单克隆抗体)检测蛋白样品、电泳分析、层析分析、氨基酸序列分析、蛋白水解分析或表位作图。例如Ep等位基因可以通过任何可以检测编码蛋白大小变化的方法加以鉴别。
在特别优选的实施方案中，分析步骤(ii)包括测定KIT和/或αMSHR基因的核苷酸序列或KIT和/或αMSHR蛋白的氨基酸序列。在这里，分析可以包括确定KIT和/或αMSHR基因中至少一个突变的存在与否。任何鉴定特异性序列改变存在的方法均可使用，包括例如单链构型多态性(SSCP)分析、连接酶链式反应、诱变分离的PCR、RFLP分析、异源双链分析、变性梯度凝胶电泳、温度梯度电泳、DNA序列分析和非凝胶系统如TaqManTM(Perkin-Elmer)。
在TaqManTM系统中，设计在待研究突变侧翼并允许该区域PCR扩增的寡核苷酸PCR引物。然后设计第3个寡核苷酸探针以与在基因的不同等位基因之间含有发生变化碱基的区域杂交。探针在5’和3’末端用荧光染料标记。选择这些染料使得当它们彼此接近时它们中的一种荧光被另一种萃灭并且不能检测到。用Taq DNA聚合酶从相对于探针来说位于模板5’的PCR引物的延伸通过Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性而切除结合在退火探针5’末端上的染料。这去除了萃灭效应，允许检测来自探针3’末端上染料的荧光。不同DNA序列之间的辨别基于下面的事实进行，即如果探针与模板分子之间的杂交不完全(即存在一些形式的错配)，那么染料的切除就不会发生。因此只有在寡核苷酸探针的核苷酸序列完全与其结合的模板分子互补时萃灭才会去除。反应混合物可含有2种不同的探针序列，每种探针针对可能存在的不同等位基因而设计，由此允许在一个反应中检测两种等位基因。
虽然TaqManTM系统目前仅能辨别两种等位基因，但是可开发出一些探针引物系列，其中一些目的等位基因的探针用非目的等位基因的不同荧光染料标记。例如，如果人们希望证实一组Duroc品种猪只带有等位基因e，他可以有以一种荧光染料标记的能检测此等位基因的探针和以第两种染料标记能检测所有其它等位基因的探针。由此人们可检测此基因座任何非Duroc型等位基因的存在。可设计这样的探针系列并根据实验需要加以标记。
分析步骤(ii)可进一步包括测定与KIT和/或αMSHR基因连锁的一种或多种微卫星标记等位基因与KIT和/或αMSHR基因的特定等位基因之间的关联。
选择性地，分析步骤(ii)可基于存在于核酸样品中微卫星标记的鉴定。
分析步骤(ii)优选地包括：(a)检测与KIT和/或αMSHR基因连锁的一种或多种微卫星标记等位基因与KIT和/或αMSHR基因的特定等位基因之间的关联；测定哪些微卫星标记等位基因存在于核酸样品中。
分析步骤(ii)优选地进一步包括测定至少一个额外基因座如额外的品种因子(如皮毛颜色)基因座基因型的步骤。尤为优选的额外基因座是KIT基因基因座(如猪KIT基因基因座)。
分析步骤(ii)优选地包括使用至少一对适当引物的PCR。在基因是猪αMSHR基因的情况下，至少一对适当引物是：
αMSHR正向引物1：(5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT RGT GCC TGG
AGG TGT-3′)
αMSHR反向引物5：(5′-CGC CCA GAT GGC CGC GAT GGA CCG-3′)；或
αMSHR正向引物2：(5′-CGG CCA TCT GGG CGG GCA CCG TGC-3′)
αMSHR反向引物2：(5′-GGA AGG CGT AGA TGA GGG GGT CCA-3′)；或
αMSHR正向引物3：(5′-GCA CAT CGC CCG GCT CCA CAA GAC-3′)
αMSHR反向引物3：(5′-GGG GCA GAG GAC GAC GAG GGA GAG-3′)
分析步骤(ii)也可包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析，例如包括用一种或多种限制性酶BstUI、HhaI和/或BspHI消化猪的核酸。在基因是猪αMSHR基因时，此分析可包括鉴定猪αMSHR基因中任何表现多态性的核苷酸位的多态性包括283、305、363、370、491、727、729、1162位或核苷酸位60与70之间或者核苷酸位1005与1010之间的多态性。
分析步骤(ii)可包括用至少一对适当引物对核酸样品进行一轮或多轮PCR扩增循环并且然后对这样得到的扩增核酸进行RFLP分析以测定猪的KIT或αMSHR基因型。在这里，当基因是猪αMSHR基因时，至少一对适当引物是上述的引物。
动物产品优选包括肉(如加工和/或罐装的肉)、禽蛋、禽蛋擦拭物或洗涤物、精液、血液、血清、唾液、绒毛、活检样品或皮革或由它们组成。它可包括基因组DNA、RNA或线粒体DNA。
动物优选地是哺乳动物(如猪、牛、狗、猫、马、绵羊、啮齿动物或兔)、鱼类(如鳟鱼或鲑鱼)或鸟类(如鸡或火鸡)。
本发明可以应用于极少量的样品并且可用于快速而廉价地筛选大量样品。本发明可适于给出绝对结果，并且定量不是必需的。此外，只需要核酸的小片段，并且相同的测试可用于大多数动物产品。应用
本发明发现在众多领域的应用。例如，认为有些品种产出具有更高食用品质的肉，并且许多零售商现在出售声称来自特定或传统品种(如Wild Boar杂交种)的产品。本发明使消费者组织能证实这些允诺并使零售商能监测供应他们的产品质量(如进行产品鉴定)。本发明发现在由零售商进行并使用以支持消费者信心的鉴定研究中有特别的用途，因为遗传标记与外在身体特征之间的连锁比品种特异性标记概念更容易被外行人理解。这使得采用这些品种因子有吸引力并且也给零售商提供了加强鉴定方案的机会。
同时也有许多品种对由不同肉加工技术生产的火腿质量的影响的报道。例如，在一则报道中根据对硬度、咸度和干燥腌制味道的感官描述将来自三个不同猪品种的火腿可靠地加以分类。本发明的品种鉴定方法使生产商能将原材料作为质量控制的一部分。
加强和鉴定原材料来源一致性的能力也导致改进的加工控制、更低的成本和更高的产品一致性，因为现已发现来自不同品种的产品的化学组成的异质性是口味不同的重要因素并且品种间其它肉成分的功能活性也可能不同。
本发明也发现在动物(如猪)育种者保持原种纯度中的应用。小规模的传统品种种群意味着维持足够大小的基因库以避免近亲交配的影响，这需要在分离的种群之间进行原种的引进和迁移。遗传污染的风险与这种迁移有关，本发明可用于减少或排除这些风险。生物多样性和提供此多样性库的稀有品种的维持产生对品种鉴定者增加的需求。例如British Saddleback育种者的问题。此品种的某些血统携带更高频率的条带基因座be等位基因，这可能导致达不到所需品种标准的无条带动物的产生并且不仅降低单个动物的价值而且降低所有产仔的价值。当新血统导入现存种群中时对此等位基因进行选择的能力将使育种者能够增加遗传多样性而无降低特定种群相对于一般品种相对标准的风险。
本发明也可用作育种计划的一部分以证实特定的杂交。这在建立金字塔育种计划中有重大价值。特定品种特征如皮毛颜色、体型和耳姿在这样的杂交种经常变化，但是仍然存在能够证实所需母本基因存在的必要。
这种用于视觉鉴定杂交品种的可见品种特征在使用人工授精时也是缺乏的，其中精液可能来自遥远地理位置的猪。
此外，技术人员将理解根据此处所述的信息，有可能提供测定猪皮毛颜色基因型的测试。因此，本发明也提供了测定猪皮毛颜色基因型的方法，此方法包括：
(i)获取猪核酸样品；并且
(ii)分析在(i)中获取的核酸样品以测定哪些αMSHR基因的等位基因存在。
在本发明这方面的一个实施方案中，步骤(ii)中的测定通过测定αMSHR基因的核苷酸序列来实现，并且具体地是基于测定哪个错义、插入或缺失突变存在于基因编码区域中。
在另一实施方案中，人们可以首先测定与αMSHR基因连锁的微卫星或其它连锁标记等位基因与αMSHR基因的特定等位基因之间的关联。因此，步骤(ii)中的测定将基于存在于核酸样品中微卫星标记等位基因的鉴定。
因此在进一步的方面，本发明提供了测定猪皮毛颜色基因型的方法，此方法包括：
(i)测定与αMSHR基因连锁的一种或多种微卫星或其它连锁标记等位基因与αMSHR基因的特定等位基因之间的关联；
(ii)获取猪核酸样品；并且
(iii)分析在(ii)中获取的核酸样品以测定哪些微卫星或其它连锁标记等位基因存在。
延伸基因座的等位基因的测定将表明动物的背景颜色以及某些情况下混合成色的图案即斑点，但不必测定得到子代的皮毛颜色。这将依赖于其它基因座如显性白色基因座I的基因型。I基因座的基因型可分别按WO-A-97/05278中所述加以测定。
因此，在适当情况下，上述的方法可以进一步包括以下步骤：
(iii)/(iv)测定其它皮毛颜色基因座的基因型。
这样的其它皮毛颜色基因座的实例是条带基因座。
在优选的方法中，用扩增含有核苷酸2678的KIT基因区域的引物进行PCR。合适引物对的实例是：
正向引物：
LA93 5’-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’
和反向引物：
KIT56 5’CTTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-
3’.
分析方法能测定2678位C或T的存在。在适当情况可以使用限制性酶AciI，因为C的存在产生了限制性位点，该位点在T存在时缺乏。在系谱内的类似检测将允许子代基因型的测定。
因此，在另一方面，本发明提供一种测定猪皮毛颜色基因型的方法，此方法包括：
(i)获取猪核酸样品；并且
(ii)分析在(i)中获取的核酸样品以测定KIT基因是否带有任何与条带基因型有关的多态性。
优选地，该方法包括对猪基因组DNA样品适当进行的RFLP分析，基因组DNA使用PCR和一对适当引物加以扩增。
鉴定特异性序列改变存在的优选方法是上述有关品种因子的方法。附图简述
图1：从多个猪品种中测得的猪αMSH-R基因的部分核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。核苷酸序列的位置数基于ATG起始密码子的A为核苷酸1。氨基酸数是根据牛BDF3序列[Vanetti等，FEBS通讯348：268-272(1995)]以允许比较。
图2：通过用BstUI或HhaI消化从猪αMSH-R基因扩增的DNA片段而获得的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳。标记为M的泳道含有50、150、300、500、750、1000bp的DNA标记。其它样品来自：
1.Pietrain
2.Pietrain
3.Large White
4.Large White
5.Large White
6.Duroc
7.Duroc
8.Hampshire
9.Meishan
10.Berkshire
11.Berkshire
图3：通过用BstUI(标记为B)或HhaI(标记为H)消化从猪αMSH-R基因扩增的DNA片段而获得的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳。标记为M的泳道含有50、150、300、500、750、1000bp的DNA标记。其它样品来自：
1.零售商1.皮肤
2.零售商1.脂肪
3.零售商1.肉
4.零售商2.脂肪
5.零售商1.肉
图4：表示使用引物KIT1F和KIT7R时KIT外显子16-19的RT-PCR产物的电泳图(4％琼脂糖)。样品1-3和4-6分别为瑞典Large White和Hampshire猪。424和301bp片段之间大小的差异是由于后者缺乏外显子17。Yorkshire猪的两条较上面的条带解释为异源双链(HD)。
图5：表示包括KIT外显子17的21bp和KIT内含子17的27bp的48bp序列。内含子/外显子边界的位置用垂直线标记并且剪接位点突变(核苷酸1G→A)用垂直箭头表示。在等位基因Ip和i中的相同碱基用点标记。
图6：用于检测KIT基因内含子17中剪接位点突变存在的NlaIII PCRRFLP测试。图6A表示用引物对KIT21和KIT35扩增的PCR产物内两个NlaIII识别位点的位置。所有距离以碱基对给出。图6B表示用NlaIII消化正常KIT或剪接突变KIT后得到的片段大小。图6C说明PCR RFLP测试的使用。泳道1表示未消化的KIT21/KIT35扩增的片段。对从以下泳道中不同克隆扩增的PCR产物进行消化，泳道2中：含有剪接位点突变的克隆；泳道3中：含有正常剪接位点序列的克隆；泳道4中：来自有色猪的基因组DNA；泳道5：来自白色猪的基因组DNA。片段大小以碱基对给出。
图7：三类基因型正常KIT比剪接突变KIT比例的比较。
图8：两个猪品种正常KIT比剪接突变KIT比例的比较。
图9：瑞典Landrace(1-8泳道)和Wild Boar(9与10泳道)品种中KIT基因的SSCP分析。两个多态性条带被标出。
图10：来自Hampshire品种动物的猪KIT cDNA的核苷酸序列。序列根据将N末端甲硫氨酸密码子的第1个核苷酸看作1来计数。
图11：在许多动物中多态核苷酸2678处KIT基因PCR-RFLP分析的聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道1和2：分别为Hampshire Wild Boar，两者在2678位的C是纯合的。3-7和9与10泳道、无关的Large White母猪，在2678位的T都是纯合的。泳道11 Pietrain在此位的T纯合以及泳道8 Large White母猪C和T杂合。泳道12含有未消化的PCR产物而泳道M是DNA大小标准。
图12：猪αMSHR编码区的3’末端和邻近的3’非翻译区的核苷酸序列。TGA终止密码子以黑体突出表示，EPIG14的引物结合位点以斜体表示。计数是根据图1a中所用的系统，其中核苷酸1是Wild Boar序列ATG起始密码子的A。与欧洲Wild Boar相同的碱基用破折号标记。缺失的标记以：标记。实施例实施例1：αMSHR基因序列的测定
猪αMSHR基因DNA序列通过同时对PCR产物和猪DNA的克隆部分进行DNA测序加以测定。用于PCR的DNA模板的制备
可从任何含有细胞核的组织来源如白细胞、毛囊、耳槽(earnotches)和肌肉制备DNA。这里的方法涉及血细胞制品；其它组织可通过直接将材料悬浮于K缓冲液中然后进行与血液相同的步骤来进行类似的处理。这里列出的方法制备含有适于PCR扩增的粗提DNA的细胞裂解液。然而，任何用于制备纯化或粗提DNA的方法应该同样有效。
将血液收集于pH 7.8的50mM EDTA中以防止凝结。将50μl血液悬浮于小微量离心管(0.5ml Eppendorf或类似物)中。加入450μl TE缓冲液以裂解红细胞(血红素簇抑制PCR)并将混合物旋涡振荡2秒钟。然后将完整白细胞和残余红细胞在微量离心机中以13,000g离心12秒。通过使用低压真空泵系统轻轻抽吸而移出上清液。然后再次加入450μlTE缓冲液以裂解残余红细胞并且按前述通过离心收集白细胞。如果沉淀中仍残留任何红色，重复此步骤直至沉淀为白色。从沉淀的白细胞去除最后一滴上清液后，加入100μl含有蛋白酶K的K缓冲液并将混合物于55摄氏度温育2小时。然后将混合物加热至95-100摄氏度8分钟并且将DNA裂解物储存于-20摄氏度直至需要。试剂
T.E.缓冲液：10mM TRIS-HCl pH8.0
            1mM EDTA
K缓冲液：   50mM KCl
            10mM TRIS-HCl pH8.3
            2.5mM MgCl2
            0.5％Tween 20PCR以制备DNA测序模板
用3对引物扩增αMSHR基因用于测序分析。
引物MSHR正向引物1：(5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT RGT GCC
TGG AGG TGT CCA T-3′)；和
MSHR正向引物5：(5′-CGC CCA GAT GGC CGC GAT GGA CCG-3′)从基因5’部分扩增428bp片段。
引物MSHR正向引物2：(5′-CGG CCA TCT GGG CGG GCA GCG TGC-3′)；和αMSHR反向引物2：(5′-GGA AGG CGT AGA TGA GGG GGT CCA-3′)从基因3’部分扩增405bp片段。因为这2个片段不重叠，所以使用第3对引物αMSHR正向引物4：(5′-TGC GCT ACC ACA GCA TCG TGA CCC TGC-3′)；和αMSHR反向引物4：(5′-GTA GTA GGC GAT GAA GAG CGT GCT-3′)扩增横跨50bp间隔的98bp片段。PCR于20μl总体积中在DNA热循环仪(Perkin Elmer 9600)上进行，20μl体积中含有25ng基因组DNA，1.0mM MgCl2，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，200μM dNTPs，0.5UAmpliTaq Gold(Perkin Elmer)和10pmol正向和反向引物。为了活化AmpliTaq Gold，起始热变性在94摄氏度进行10分钟，然后进行32轮循环，每轮循环由94摄氏度45秒、53摄氏度45秒和72摄氏度45秒组成。最后一次延伸在72摄氏度持续7分钟。用SureClone连接试剂盒(Pharmacia)将PCR产物克隆入载体pUC18中。质粒DNA的制备
用Jetstar质粒midi试剂盒50(Genomed)从过夜细菌培养物纯化质粒DNA并将得到的DNA稀释至150ng/μl。质粒DNA的序列测定
用染料引物化学法对克隆的质粒插入片段进行测序。按照ABI Prism方法P/N 402113(Perkin Elmer)中所述用模板和含有荧光标记的M13正向或反向引物的备好反应混合物制备每轮循环反应。按照仪器用户指南(文档号903877，Perkin Elmer)用Catalyst 800分子生物学工作站(ABI)进行循环和样品收集。根据仪器说明书(Perkin Elmer方法P/N402078)中所述用377 ABI Prism DNA测序仪对得到的延伸产物进行纯化、上样和分析。PCR产物的染料终止测序
染料终止测序要求将PCR产物纯化成不含有过量dNTP和残余引物的样品。在将纯化DNA稀释为15ng/μl之前，通过使模板DNA流过QiaQuick离心柱(Qiagen)来实现纯化。染料终止循环测序用AmpliTaq DNA聚合酶FS按照ABI Prism方法P/N 402078(Perkin Elmer)进行。循环测序反应在10μl总反应体积中进行。反应包含1.6pmole用于从基因组DNA扩增靶片段的正向或反向引物之一，20ng纯化的模板DNA和含有4种染料终止子的任何一种、dNTPs、Tris-HCl(pH9.0)、MgCl2、热稳定的焦磷酸和AmpliTaq DNA聚合酶FS的终止备好反应混合物(Perkin Elmer)。循环测序用GeneAmp 9600仪器(Perkin Elmer)进行，共25个循环，每轮循环由96摄氏度10秒、50摄氏度5秒和60摄氏度4分钟组成。用乙醇沉淀纯化延伸产物进行凝胶分离，按照仪器说明书(Perkin Elmer方法P/N 402078)在377 ABI Prism DNA测序仪中上样和电泳。结果
来自许多猪品种的猪αMHSR基因序列的部分编码区DNA序列与实施例22中测定的序列一起列于图1a中。推导的氨基酸序列在图1b中表示。实施例2：根据PCR-RFLP鉴别E基因座的等位基因用于PCR的DNA制备
同实施例1。PCR
反应设在0.25ml薄壁管(Perkin Elmer)中的20μl体积中，含有以下成分：
20μl反应体积：
2μl模板DNA
1.5mM MgCl2
200μM每种dNTP，
3pM正向和反向引物
0.5U AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)
MSHR正向引物3序列：5′GCA CAT CGC CCG GCT CCA CAA GAC 3′
MSHR反向引物3序列：5′GGG GCA GAG GAC GAC GAG GGA GAG 3′
将反应管置于预热至94摄氏度的Perkin Elmer 9600热循环仪中并且按照如下方案进行PCR：
   起始变性步骤为94摄氏度10分钟。
   33轮循环：94摄氏度-45秒
             55摄氏度-45秒
             72摄氏度-45秒
最后的循环是72摄氏度最后延伸7分钟。将样品保存于4摄氏度直至需要。限制性酶消化和电泳
PCR扩增产物长148bp。为测定扩增产物的多态性，将反应产物分成每份10μl的2等份，用HhaI(GIBCO-BRL)或BstUI(New England Biolabs)对其进行消化。反应如下设置并温育：
BstUI消化               HhaI消化
10μl扩增的DNA          10μl扩增的DNA
2.5μBstUI              2.5μHhaI
60摄氏度60分钟          0.5μl 10X React 2缓冲液(GIBCO-BRL)
                        37摄氏度60分钟
消化后，将2μl上样染料加入每个反应(100mM Tris pH8.0，100mM硼酸，1mM EDTA，50％(v/v)甘油，0.02％(w/v)Orange G)中并将混合物上样至0.5XTBE(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸和0.5mM EDTA)中4％琼脂糖凝胶(3％NuSieve/1％Seakem，FMC Bioproducts)上，并且于150v电泳1小时。
通过溴化乙锭染色观察产物。结果
BstUI和HhaI消化各得到61和87bp条带。消化与可能的等位基因之间的关系在下表中表示：限制性消化模式与E基因座单个等位基因之间的关系
    等位基因   用BstUI消化   用HhaI消化
    E+/Ep/Eh     是     是
    Em     否     是
    e     否     否
如果将未切开的等位基因称为等位基因1并且将用每种酶消化的等位基因称为等位基因2，则各种基因型将下表中所示：真实的E基因型和相关计数
基因型     BstUI     HhaI
Em/EmEm/Ep或Em/E+Em/eEp/Ep或Ep/E+或E+/E+Ep/e或E+/ee/e     1/11/21/12/21/21/1     2/22/21/22/21/21/1
注：携带等位基因Eh的动物的结果将与携带等位基因Ep的动物相同。
从多种猪制备样品并根据上述方法加以测定。结果在下表中表示并且图2显示电泳见到的图形。
用BstUI/HhaI消化系统对多个品种测得的E基因型
   品种  测试数 基因型(见注1)       αMSHR型
    BstUI     HhaI
 Hampshire     9   Eh/Eh     2/2     2/2
 Large White     4   Ep/Ep     2/2     2/2
 Landrace     1   Ep/Ep     2/2     2/2
 Pietrain     3   Ep/Ep     2/2     2/2
 Berkshire     2   Ep/Ep     2/2     2/2
 Bazna     4   Ep/Em     1/2     2/2
  Em/Em     1/1     2/2
 Duroc     4   e/e     1/1     1/1
 Meishan     3   Em/Em     1/1     2/2
注：在此特定测试中不能区分此基因型与E+或Eh。
如可从上面结果见到的，测得的基因型与根据图1中列出的Hampshire，Large White，Meishan和Duroc的测序数据预计的基因型相符。在此分型的其它品种表现根据其表型和发表文献中的描述而预计的基因型[Ollivier和Sellier，Ann.Genet.Sel.Anim.，14：481-544，(1982)]。Pietrain是带有不同程度黑斑的白色品种并且长期认为是Ep(与这里的结果一致)。最初有斑点的品种Berkshire现在主要是黑色带有白色“sock”的动物，一般也认为是Ep，与这里发现的一样。Landrace由于其在I基因座带有显性的白色等位基因，故为白色动物，然而根据经典的育种研究表明其E基因座的基因型为Ep。这再一次与这里获得的结果一致。Bazna是黑色基色带有白色条带的罗马尼亚品种。它从Berkshire和Mangalitza形成，Mangalitza具有众多颜色变异包括黑色的匈牙利品种[Porter，猪：世界品种手册，publ：Helm Information，ISBN1-873403-17-8(1993)]。基于可能携带与Meishan相似的等位基因Em的黑色品种和带有Ep的Berkshire的Bazna的起源与此工作中发现存在于品种中的等位基因一致。实施例3：零售肉品种来源的鉴定DNA制备
从来自两个不同零售商的猪排的不同部分制备DNA。用PromegaWizard基因组DNA制备试剂盒根据制造商说明从皮肤(仅一名零售商)、脂肪和肉制备DNA。将约4mm3每种组织切成小片用于提取。PCR和限制性消化分析
这完全按照实施例2进行。结果
结果示于图3中。可以见到从多种组织类型提取的DNA可以用于此基于DNA的测试，在此获得肉、脂肪和皮肤的结果。然后可以测定猪MHSR基因的基因型。在这种情况下来自2名零售商的材料源自测试类型BstUI1/2和HhaI 1/2(用与实施例2中一样的命名法)。这可翻译成基因型Ep/e或E+/e。基于我们目前对商业猪品种等位基因分布的知识，可以得出结论，即这两种来源动物含有来自Duroc的遗传材料。实施例4：加工肉样品的品种来源鉴定方法
根据Meyer等方法(AOAC国际杂志，78，1542-1551)从加热处理的肉样品制备DNA。用手术刀切碎肉样品并将0.3g样品转移至含有430μl提取缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA和1％w/v的十二烷基磺酸钠)的1.5ml无菌eppendorf管中。加入50微升5M的盐酸胍和20μl 20mg/ml的蛋白酶K(Boehringer)并且通过倒置混合，然后于57℃温育3小时。消化后，将样品以13,000Xg离心10分钟，并且将450μl水相加入1ml Wizard DNA纯化树脂(Promega)中。轻轻倒置混合混合物并且根据制造商说明进行Wizard DNA纯化步骤，纯化的DNA以50μl 70℃的水洗脱。然后将1μl 1∶10稀释液用作10μl PCR中的模板。
PCR按照前面实施例中所述方法进行。结果
于80℃加热30分钟的、来自基于Large White的品系和基于Duroc的品系的肉样品可根据其在E基因座的基因型加以鉴别，其中Large White样品得到Ep等位基因的模式特征而Duroc样品得到e等位基因的模式特征。实施例5：精液品种来源的鉴定
从猪精液分离DNA。将1ml精液以13,000Xg离心2分钟并移出上清。加入1ml 2X SSC并且涡旋搅拌混合物以悬浮精子。然后按照前述离心混合物并去除上清。加入400μl 0.2M NaOAc(pH7.0)并涡旋搅拌混合物，然后加入34μl的β-巯基乙醇。将混合物于40℃温育30分钟，然后加入100μl 10％w/v的十二烷基磺酸钠和50μl 15mg/ml的蛋白酶K(Boehringer)并于40℃进一步温育3小时。加入500μl以Tris-HClpH8.0平衡的酚并涡旋搅拌混合物2次然后以13,000Xg离心4分钟。移出400μl水相并加入800μl乙醇。让DNA在室温沉淀5分钟后以13,000Xg离心5分钟。用800μl 70％乙醇(v/v)洗沉淀并且空气干燥，然后重新悬浮于200μl Wizard DNA重新悬浮缓冲液(Promega)中。将1μl 1/10的稀释液用于10μl PCR中。
PCR按照前面实施例2中所述方法进行。结果
来自基于Hampshire的品系和基于Duroc的品系的精液可根据其在E基因座的基因型加以鉴别，其中Hampshire样品得到Ep等位基因模式特征而Duroc样品得到e等位基因的模式特征。实施例6：等位基因E+与等位基因Ep/Eh的鉴别DNA制备
DNA制备按照实施例1中所述方法进行。PCR
反应设在0.25ml薄壁管(Perkin Elmer)中的20μl体积中，含有以下成分：
10μl反应体积：
2μl模板DNA
2.5mM MgCl2
200μM每种dNTP，
5pM正向和反向引物
0.5U AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)
正向引物序列：5’CTG CCT GGC CGT GTC GGA CCT G 3’
反向引物序列：5’CTG TGG TAG CGC AGC GCG TAG AAG 3’
将反应管置于Strategene Robocycler中并且按照如下方案进行PCR：
起始变性步骤为94摄氏度10分钟。
    30轮循环：94摄氏度-60秒
              61摄氏度-60秒
              72摄氏度-60秒
最后的循环是72摄氏度最后延伸7分钟。将样品保存于6摄氏度直至需要。限制性酶消化和电泳
PCR扩增产物长228bp。为测定扩增产物的多态性，用BspHI(NewEngland Biolabs)消化反应产物。反应如下设置并温育：
  BsphI消化
  10μl扩增的DNA
  1μl 10X React 2(NEB New England Biolabs)
  0.5μl去离子水
  5单位BstUI
  37摄氏度60分钟
消化后，将2μl上样染料加入反应(100mM Tris pH8.0，100mM硼酸，1mM EDTA，50％(v/v)甘油，0.02％(w/v)Orange G)中并将混合物上样至0.5XTBE(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸和0.5mM EDTA)中4％琼脂糖凝胶(3％NuSieve/1％Seakem，FMC Bioproducts)上，并且于150v电泳1小时。
通过溴化乙锭染色观察产物。结果
BsphI消化各得到124和104bp条带。消化与可能的等位基因之间的关系在下表中表示：限制性消化模式与E基因座单个等位基因之间的关系
    等位基因     用BsphI消化
    Eh/Ep     是
    E+     否
从多种猪制备样品并按照上述方法加以测试，并且结果显示如下：用BspHI消化系统对多个品种测得的E基因
    品种   测试数  基因型(见注1)     数目
Wild Boar×Swedish LandraceLarge WhiteLandracePietrain     3413     Ep/E+Ep/EpEp/EpEp/Ep     3413
注：在此特定Eh测试中，列出Ep基因型的地方，其不能与Eh区分开。实施例7：鉴别牛产品的品种
按照实施例4中所述从牛肉样品制备DNA。然后按照Kambadur等，基因组研究7：910-915(1997)中所述用500nM浓度的下面引物对在100μl反应体系中进行PCR：
5’-TGAGGTTAGGAGAGTTTTGGG-3’和
5’-TCGAAATTGAGGGGAAGACC-3’其它反应成分是2.5mM MgCl2，200μM dNTPs，5mM KCl，10mM Tris-HClpH8.3，5单位AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)。将1μl牛基因组DNA用作模板。于94摄氏度变性12分钟后进行30轮循环，每循环94摄氏度1分钟，55摄氏度1分钟，72摄氏度1.5分钟，最后是72摄氏度7分钟。PCR后，将2.0μl上样染料(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸，0.5mMEDTA，50％w/v甘油，0.02％w/v Orange G)加入10μl产物中并通过在0.5XTBE缓冲液(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸和0.5mM EDTA)中的2％琼脂糖凝胶中于100v电泳1小时进行分析。
将剩余的PCR产物按照实施例1中所述用ABI染料终止化学法进行DNA测序分析。结果牛肌抑制素DNA多态性及相关表型
 品种 表型 核苷酸位941  PCR产物长度(bp)
 Belgian Blue 两种肌肉     G     482
 Piedmontese 正常     A     493
 Holstein-Friesian 两种肌肉     G     493
实施例8猪KIT外显子16-19的RT-PCRi.从血液样品纯化mRNA
将有色Hampshire和Large White猪的新鲜血液样品收集于柠檬酸盐试管中。用Ficoll 100(Pharmacia Biotech)从5ml血液分离白细胞。然后用Quickprep Micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)从白细胞分离mRNA。在用于反转录酶(RT)-PCR之前将mRNA作为沉淀保存于-70摄氏度乙醇中最多一个月。ii.对KIT外显子16-19的RT-PCR
用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)进行第一链cDNA合成以在15μl总体积中用0.1μg pd(N6)随机扩增出约100ng mRNA。然后通过加入10μl PCR混合物而直接将2μl完成的第一条cDNA链反应物用于每12μl PCR反应中，PCR混合物含有10pmol的每种小鼠/人来源的引物KIT1F和KIT7R(分别为5’-TCR TAC ATA GAA AGA GAY GTG ACTC和5’-AGC CTT CCT TGA TCA TCT TGT AG；Moller等，1996，同上)、1.2μl的10XPCR缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl)和0.5UAmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer)，将其与等量Taqstart抗体(Clontech)于25摄氏度温育5分钟以实现热起始PCR。用20μl矿物油覆盖反应物并在Hybaid Touchdown仪器(Hybaid)中进行40轮热循环，每循环包括94摄氏度1分钟，55-48摄氏度(头7个循环每循环降低1度然后在剩余循环中保持48摄氏度)1分钟和72摄氏度1分钟。PCR后，将2μl上样染料加入每个样品中并且然后上样于于4％琼脂糖凝胶(Nusieve/Seakem 3∶1，FMC Bioproducts)中并以100v电泳80分钟。产物通过溴化乙锭染色和UV照射加以观察。iii.RT-PCR产物的克隆与测序
通过用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从2％琼脂糖凝胶中提取来纯化代表KIT外显子16-19的RT-PCR产物并且用Sureclone连接试剂盒(Pharmacia Biotech)将其克隆入pUC18载体中。用QIAFilter质粒Midi试剂盒(QIAGEN)分离质粒。用染料引物化学法对克隆的质粒插入片段进行测序。用质粒模板DNA和含有ABI Prism方法P/N 402113(PerkinElmer)中所述的荧光标记的M13正向或反向引物的备好反应混合物制备每次循环反应。用Catalyst 800分子生物学工作站(ABI)按照仪器用户指南(文档号903877，Perkin Elmer)进行循环和样品收集。用377ABIPrism测序仪按照仪器说明书P/N 402078(Perkin Elmer)对得到的延伸产物进行纯化、上样与分析。iv.结果与讨论
从所有猪扩增包含KIT cDNA外显子16-19的424bp片段。Hampshire猪没有显示任何额外产物而Large White猪(测试8头)均显示301bp截短的cDNA片段(图4)。序列分析揭示424bp片段在这2个品种中相同而301bp片段中缺乏完整的外显子17(123bp)。不同个体间这两种产物相对量的明显差异可能由含有不同拷贝数KIT基因序列的不同基因型或mRNA表达水平的个体差异或随机RT-PCR效果所致。
存在于Large White猪中的两个上面的条带代表301bp和424bp片段之间的异源双链(图2)。这通过实验加以证明，即通过合并424bp和301bp的同源双链然后对其加热变性并冷却至25摄氏度而得到这些慢迁移率的片段。此外，Large White较低异源双链片段的克隆得到对应于两个同源双链中的任意一个的插入片段长度。实施例9 KIT外显子17-内含子17(5’前切位点)的PCR扩增和测序i.PCR以制备DNA测序模板
用正向引物KIT21(5’-GTA TTC ACA GAG ACT TGG CGG C-3’)和反向引物KIT35(5’-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3’)扩增包括KIT基因外显子17和内含子17之间边界的175bp区域用于序列分析。PCR在DNA热循环仪(Perkin Elmer 9600)上20μl总体积中进行，20μl总体积中含有25ng基因组DNA，1.0mM MgCl2，5mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3，200μM dNTP，0.5U AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)和10pmol KIT21和KIT35引物。为了活化AmpliTaq Gold，起始热变性在942进行10分钟，然后进行32轮循环，每循环由94℃ 45秒，55℃ 45秒和72℃ 45秒组成。最后一次延伸在72℃持续7分钟。用SureClone连接试剂盒(Pharmacia Biotech)将PCR产物克隆入载体pUC18中。ii.质粒DNA的制备
用Jetstar质粒midi试剂盒(Genomed)从过夜细菌培养物纯化质粒DNA，并且将得到的DNA稀释至150ng/μl。iii.质粒DNA的测序
DNA按照实施例8进行测序。iv.结果
测定和比较带有这三种等位基因之一的动物之间KIT基因外显子17和内含子17的DNA序列部分。图5表示I等位基因在内含子17的1位携带一个剪切位点突变。此G到A的碱基置换存在于每条染色体携带的两个基因拷贝的一个拷贝中。碱基置换发生在稳定的GT二核苷酸处，此处表征5’外显子/内含子的边界。Ip等位基因的分析表明剪切位点不存在于正常基因(KIT1)或基因的复制拷贝(KIT2)中。我们发现剪切位点突变是I等位基因独特的，并且因此使得有可能鉴别I-KIT2序列。实施例10用PCR RFLP检测剪切位点突变的存在
为了容易地测定G到A剪切位点突变的存在，用限制性内切核酸酶NlaIII(CATG)检测在内含子171位处鉴定到的点突变(图5)。在图6A和图6B中分别说明了从KIT扩增的片段中的NlaIII识别位点及其预期的限制性产物。i.PCR以制备用于RFLP测定的DNA完全按照实施例9中所述进行PCR以制备用于RFLP分析的DNA。ii.限制性酶消化和电泳
PCR扩增产物长175bp。为了测试内含子17的1位的多态性，消化反应设定如下：
30μl PCR扩增的DNA
1.0μl 10XNE缓冲液4
0.1μl BSA 100μg/ml
0.1μl NlaIII 10U/μl
5.8μl dH2O[1XNE缓冲液4(New England Biolabs)含有50mM乙酸钾、20mM Tris乙酸盐、10mM乙酸镁和1mM DTT)。37℃温育90分钟后，向每10μl反应体积加入2μl上样染料并将混合物上样到0.5XTBE(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸和0.5mM EDTA)中的8％天然聚丙烯酰胺凝胶(Protogel，37.5∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺，National Diagnostics，Atlanta)中，并且于200V在垂直板装置(SE600 Hoefer Scientific Instruments)中电泳3小时。产物通过溴化乙锭染色加以观察。iii.结果
因为突变发生在限制性内切核酸酶NlaIII的识别位点内，所以设计PCR RFLP方法以测试剪切位点突变的存在。图6B表示在KIT内含子17的1位G到A碱基置换的存在导致175bp DNA片段内两个NlaIII识别位点中每个位点的限制性消化。电泳后，得到了80bp、54bp和41bp大小的片段。然而，当剪切位点突变不存在时，用NlaIII温育仅在识别位点1导致消化。电泳后，得到134bp和41bp大小的片段。稳定的NlaIII识别位点1用作内部对照以确保完全消化已经发生。此PCR RFLP分析结果说明于图6C中。对从携带剪切位点突变(2道)或携带正常剪切位点序列(3道)的克隆中扩增的片段进行分析。4道表示使用从有色动物基因组DNA扩增的DNA的分析结果。5道表示测试白色动物得到的条带。测定用于分析来自7个不同品种猪的121个个体。剪切突变仅在具有显性表型(I/-或I*/i)的97头动物中见到而在24头有色(Ip或i)动物中没有突变(见下表)。此分析证实I和I*是独特的，因为它们是携带剪切位点突变的特有等位基因。
           不同品种与皮毛表型之间剪切位点突变的分布品种          皮毛颜色   推测的基因型  测试的动物  正常剪切的KIT2 剪切突变2Large White    白色           I/-         33            33           33Landrace       白色           I/-         56            56           56Hampshire      有色           i/i         5             5            0Duroc          有色           i/i         5             5            0Pietrain       有色           i/i         8             8            0Meishan        有色           i/i         5             5            0Wild Boar      有色           i/i         1             1            0Wild Boar x    白色           I*/-       8             8            8Large White总计
           白色           I/-         89            89           89
           白色           I*/-       8             8            8
           有色           i/i         24            24           01白色动物对于I等位基因可能是纯合或杂合的2通过NlaIII PCR RFLP测试确定剪切位点突变的存在实施例11正常KIT和剪切突变KIT(内含子17核苷酸1G→A)的定量测定
因为剪切位点突变仅存在于I复制区域(duplicated regions)中的一个区域中而不存在于Ip复制区域中，所以可以预计各种基因型具有下表中所述的特征：基因型   正常KIT的拷贝数   含有剪切突变的KIT    正常KIT比剪切突
                            拷贝数            变KIT的比例I/I          2                  2                  1∶1I/i          2                  1                  2∶1i/i          2                  0                  2∶0I/Ip        3                  1                  3∶1Ip/i        3                  0                  3∶0
因为等位基因I的显性，所以白色动物携带表中的三种基因型，并且因此不能通过表型特征分析加以鉴定。正常KIT基因和剪切突变的KIT基因的相对量的定量测定允许计算两种基因之间的比例，并且由此预测单个动物的基因型。这通过在NlaIII消化后对两种DNA片段的定量测定来实现。电泳后用GeneScan软件测定代表正常剪切KIT基因的134bp片段和代表剪切突变的KIT基因的54bp片段的量。i.PCR以制备用于定量测定的DNA
与实施例9部分i中所述一样。用ABI荧光染料FAM在5’末端标记反向引物KIT35。ii.限制性酶消化
与实施例9部分ii中所述一样。iii.DNA片段的电泳和定量测定
消化后，将0.5μl反应体积与2.5μl去离子甲酰胺、0.5μl GS350DNA标准(ABI)和0.4μl蓝色葡聚糖溶液混合，加热至90℃ 2分钟并于冰上迅速冷却。将3μl此混合物上样至377 ABI Prism测序仪中并以700V、40mA、32W在1XTBE缓冲液中的6％聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段2小时。用GeneScan(ABI)软件定量测定代表正常和剪切突变形式KIT的片段的峰面积。iv.比例计算
为了计算每种样品的比值，将134bp片段(正常KIT)的峰面积值除以2倍54bp片段(剪切突变KIT)的峰面积值。v.结果
对来自Swedish野生型猪/Large White杂交系谱的动物进行分析，这些动物在I处的基因型已通过传统育种实验用连锁标记加以测定。图7和下表表示对三种基因型中的每种基因型I/I(预期比例1∶1)、I/i(预期比例2∶1)和I/Ip(预期比例3∶1)动物计算的正常比突变KIT的比例。结果完全与预期比值完全一致，并且表明这三种基因型类型可以用此方法加以鉴别。
        Wild Pig/Large White杂交品种不同显性
            白色基因型中两种KIT形式的比值基因型   表型      预期比例      观察到的比例     测试的数目
            (正常/突变)      (正常∶突变)I/I     白色       1∶1         1.15±0.075          13I/Ip   白色       3∶1         3.11±0.084          12I/I     白色       2∶1         2.23±0.109          14
图7说明对两种基因型I/I和I/Ip计算的比值范围没有重叠。这使得携带Ip等位基因的动物能够得到鉴定，并且等位基因在不同猪品种中的频率可以得到测定。计算56头Landrace和33头Large White的比值并将结果表示于图8中。对7头Landrace和3头Large White个体观察到清晰的双峰分布，具有约3或更高的比值，表明它们是Ip等位基因(基因型I/Ip)的杂合携带者。这意味着Ip在Landrace和Large White品种中分别有6.25％(7/112测试的染色体)和4.5％(3/66测试的染色体)估计的基因频率。实施例12(i)DNA制备
可以从任何含有细胞核的组织来源如白细胞、毛囊、耳槽和肌肉制备DNA。在此列出的方法涉及血细胞制备；其它组织可进行类似地处理，即直接将材料悬浮于K缓冲液中并且然后进行与血液处理相同的操作。在此列出的方法制备含有适于PCR扩增的粗提DNA的细胞裂解液。然而，任何制备纯化或粗提DNA的方法应该同样有效。
将血液收集于50mM pH 8.0的EDTA中以防止凝结。将50μl分装至小的微量离心管(0.5ml Eppendorf或等价物)中。加入450μl TE缓冲液以裂解血红细胞(血团抑制PCR)并且涡旋混合2秒钟。然后将完整白细胞和残余红细胞在微量离心机中以13,000g离心12秒。通过用低压真空泵系统轻轻抽吸移出上清夜。然后再加入450μl TE缓冲液以裂解残余红细胞并按前述收集白细胞。如果沉淀中仍有红色，重复此过程直至沉淀为白色。从沉淀的白细胞中去除最后一滴上清液后，加入100μl含有蛋白酶K的K缓冲液并将混合物于55℃温育2小时。然后将混合物加热至95-100℃8分钟并且将DNA裂解液保存于-20℃备用。试剂
TE缓冲液：10mM TRIS-HCl pH8.0
          1mM EDTA
K缓冲液： 50mM KCl
          10mM TRIS-HCl pH 8.3
          2.5mM MgCl2
          0.5％Tween 20
用于裂解之前，向每1.0ml K缓冲液加入10μl 20mg/ml蛋白酶K(分子探针有限公司)。(ii)PCR
反应在0.25ml薄壁管(Perkin Elmer)中如下设置：
4.0μl 5μM CRC正向引物；
4.0μl 5μM CRC反向引物；
4.0μl 5μM KIT1-反向引物；
4.0μl 5μM KIT1-正向引物；
4.0μl 2mM dNTPs(Pharmacia)；
4.0μl 35mM MgCl2。
加入蜡珠(PCR Gem 50，Perkin Elmer)并将薄壁管置于Perkin Elmer9600热循环仪中。然后将管升温至80℃15秒接着冷却至4℃。然后按照下述向每管中加入第2套试剂：
4.0μl 10X缓冲液；
96μl无菌去离子水；
0.4μl(0.5单位)AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)；
2μl DNA裂解液。
然后将反应薄壁管置于预热至94℃的Perkin Elmer 9600热循环仪中并按照下述方案进行PCR：
  94℃4分钟；
  20轮循环，每循环94℃30秒，62℃30秒和72℃30秒；
  0℃直至需要。
循环数可依据用作DNA来源的组织而变化。KIT引物
正向GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC KIT1-FOR
反向CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG KIT1-REVCRC引物
正向CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT CRC-FORWARD
反向AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC CRC-REVERSE
反向KIT引物和正向CRC引物在5’末端用ABI荧光染料FAM标记。(iii)DNA片段的电泳和定量测定
将1μl PCR产物与2.5μl去离子甲酰胺、0.5μl GS350 DNA标准、0.4μl蓝色葡聚糖溶液混合，于90℃加热2分钟后于冰上迅速冷却。然后将3μl此混合物上样至AB1373 DNA测序仪中并以700V、40mA、32W在1XTBE缓冲液中的6％聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段2小时。用GeneScan软件定量测定对应于KIT和CRC基因产物的片段，每条带的峰面积得以测定。(iv)结果
下表中的数据代表从实验获得的结果，其中DNA裂解液从23头动物中的每只动物制备，对每种裂解液进行2次PCR测试。计算每种PCR KIT峰面积比CRC峰面积的比例并采用来自相同动物的那些样品的平均值。
  动物   基因型  KIT/CRC峰面积比
  1   II   3.25
  2   Ii   2.45
  3   II   2.94
  4   ii   1.16
  5   ii   1.34
  6   ii   1.20
  7   Ii   2.18
  8   Ii   2.19
  9   II   2.88
  10   ii   1.30
  11   Ii   1.84
  12   II   2.84
  13   ii   1.50
  14   ii   1.30
  15   Ii   2.07
  16   ii   1.31
  17   ii   1.14
  18   Ii   2.02
  19   Ii   1.87
  20   Ii   2.00
  21   ii   0.99
  22   ii   1.15
  23   II   2.80
此实验中不同基因型III、Ii和ii动物的比值的上限和下限如下：
基因型    上限     下限
I/I       3.25     2.80
I/i       2.45     1.84
i/i       1.50     0.99
这些结果说明用此测试对这些基因型的鉴别。实施例13
第二种测试利用存在于复制区的一个末端的独特DNA序列(或者如果复制区与基因的其余区域方向相反或复制区不与非复制区直接串联，存在于复制区的两个末端)。设计用于PCR的寡核苷酸引物使得处于PCR过程中所用的退火温度时，它们将仅与复制区末端的连接区域退火。然后用两对寡核苷酸引物进行PCR。一对由前述覆盖该连接区域的引物组成而第二对引物相隔适当距离，这使得扩增只从含有复制区的I等位基因发生。第二对引物允许在单倍体基因组中仅以单拷贝存在的序列的扩增。在相同反应管中进行的此反应的产物用作以前测试的内部标准。测定连接区域特异性反应产物相对于单拷贝对照序列产物的比例。
在此测试中不同基因型产物的预期比例之间存在较大差异。产物的相对水平及其比例说明如下：
基因型      连接区域产物    对照区域产物     比例
  II             2               2           1∶1
  Ii             1               2           1∶2
  ii             0               2           0∶2
这些较大比例使从不同基因型获得的结果范围之间有更大差异，降低了错误评估动物的危险。实施例14(i)DNA制备
DNA可按照实施例12中所述的加以制备。(ii)PCR
反应在0.25ml薄壁管(Perkin Elmer)中如下设置：
2.0μl 5mM的KITDEL2-FOR引物；
2.0μl 5mM的KITDEL2-REV引物；
1.0μl 2mM的dNTPs(Pharmacia)；
1.2μl 25mM MgCl2
2.0μl 10X缓冲液(无MgCl2)
0.1μl(0.5单位)AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)；
2.0μl DNA裂解液；
9.7μl无菌去离子水。
然后将反应管置于Perkin Elmer 9600热循环仪中并且按照如下方案进行PCR：
95℃1分钟；
3轮循环，每循环95℃15秒，50℃20秒和72℃40秒；
27轮循环，每循环94℃15秒，50℃20秒和72℃50秒；
72℃5分钟；
4℃直至需要。
循环数可以依据用作DNA来源的组织而变化。KIT引物
正向      GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT KITDEL2-FOR
反向      AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG KITDEL2-REV(iii)电泳
将1μl PCR产物与3μl上样缓冲液(95％去离子甲酰胺，10mM NaOH，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯苯胺)混合，加热至95℃3分钟后于冰上迅速冷却。然后将样品上样于1XTBE缓冲液(89mM Tris，89mM硼酸，2mM EDTA.Na2)中的8％天然聚丙烯酰胺凝胶(Protogel，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝37.5∶1，National Diagostics，Atlanta)中。使用0.6XTBE作为电泳缓冲液用20℃恒温以6W将DNA片段在垂直板装置(SE600 Hoefer Scientific Instruments，San Francisco)中通过电泳分离4.5小时。(iv)通过银染观察DNA片段
电泳后，将凝胶在固定液中轻轻摇动温育20分钟或者直到看不到示踪染料。将凝胶在去离子水中洗3次(每次摇动2分钟)。然后将凝胶在染色液中轻轻摇动温育40分钟，接着在去离子水中短时清洗(5-10秒)并直接转入显色液中。将凝胶在显色液中温育直至条带清晰可见并且然后通过加入等体积的固定液终止显色。最后，将凝胶在去离子水中洗2分钟。试剂
固定液：      10％去离子水中的冰乙酸
染色液：      2g硝酸银(AgNO3)
              3ml 37％的甲醛
              2升去离子水
显色液：      60g溶解于2升去离子水的碳酸钠(Na2CO3)。临
              用之前加入3ml 37％的甲醛和400ml硫代硫酸钠
              (10mg/ml)。溶液使用时应该为10-12℃温度。(v)结果
此SSCP分析揭示了到目前为止仅见于具有显性白色表型动物中的信息多态性(图9)。在1至8道中，分析是对携带显性白色的SwedishLandrace猪DNA进行的而在9和10道中DNA来自野生型颜色的野生型猪。多态性条带被标出。多态性特征在于仅存在于携带I型等位基因的复制KIT基因的动物中的两条独特片段。这些片段代表来自不同长度PCR产物的DNA链的异源双链，其中PCR产物代表KIT基因的复制和非复制拷贝。用此标记使用40头代表5个品种的无关动物和190头Large White/野生型猪杂交F2动物的筛选测试结果列于下表中：
      品种     颜色  动物数      异源双链
  存在   不存在
  SWEDISH LANDRACE     白色    10    10     0
 SWEDISH LARGE WHITE     白色     8     8     0
 SWEDISH HAMPSHIRE     有色     10     0     10
 SWEDISH DUROC     有色     10     0     10
 WILD PIG     有色     2     0     2
 LARGE WHITE/WILD PIG杂交 白色带有色斑块     131950     10600     25950
这些结果表明此特定多态性与KIT复制的存在非常紧密地相关。它与复制不完全相关，因为有些白色动物没有表现异源双链模式。因此此多态性是紧密连锁的遗传标记的一个实例，其本身或者与其它连锁标记结合可用于辨别有关显性白色皮毛颜色的基因型。实施例15i)DNA提取
按照实施例12制备DNA。ii)PCR
反应在0.25ml薄壁管(Perkin Elmer)中如下设置：
0.5μl 5μM的KITDEL1-FOR引物；
0.5μl 5μM的KITDEL1-REV引物；
1.0μl 2mM的dNTPs(Pharmacia)；
1.0μl 15mM MgCl2
1.0μl 10X缓冲液
4.9μl无菌蒸馏水
0.1μl AmpliTaq DNA聚合酶
1.0μl DNA裂解液
然后将反应管置于Perkin Elmer 9600热循环仪中并且按照如下方案进行PCR。
94℃4分钟；
21轮循环，每循环94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒；
72℃4分钟；
4℃直至需要。
循环数可依据用作DNA来源的组织而变化。引物
正向TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG KITDEL1-FOR
反向CCAGCAGGACAATGGGAACATCT KITDEL1-REV
反向引物用ABI荧光染料FAM在5’末端加以标记。iii)DNA片段的电泳和定量测定
将1μl PCR产物与1.5μl去离子甲酰胺、0.25μl GS350 DNA标准、0.25μl上样缓冲液(50mg/ml蓝色葡聚糖，25mM EDTA)混合并于90℃加热2分钟，然后于冰上迅速冷却。然后将1.5μl此样品上样于ABI373 DNA测序仪中并以3000V、60mA、200W和48℃在1XTBE缓冲液中的4.12％聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段2小时。用GeneScan软件定量测分别对应于来自KIT基因模板的不含缺失和含有缺失的产物的97bp和93bp片段，每条带的峰面积得以测定。结果
列于下表中的数据代表从实验获得的结果，其中DNA裂解液从已知基因型的20头动物制备，对每种裂解液进行一次PCR测试。计算来自不含4碱基对缺失比含有缺失的DNA模板的产物峰面积比。
    动物    基因型  非缺失/缺失峰面积比
    1     II   1.347
    2     II   1.21
    3     II   1.33
    4     II   2.267
    5     II   0.444
    6     II   0.713
    7     II   8.387
    8     II   0.994
    9     II   1.673
    10     II   1.056
    11     Ii   1.751
    12     Ii   1.73
    13     Ii   1.83
    14     Ii   0.631
    15     Ii   1.975
    16     Ii   2.147
    17     Ii   1.901
    18     Ii   1.749
    19     Ii   2.103
    20     Ii   2.026
对于小量样品，在预测的每种基因型比值(对于Ii预期比值＝2而对于II为1)之间的中点的数值1.5可用作对动物评估基因型的分界线。从表中可以确定7/10 II和9/10 Ii被鉴定为正确的基因型。实施例16 KIT cDNA克隆的测序
用Message Maker mRNA分离系统(Gibco BRL)通过从总RNA选择一种mRNA从白色(Landrace/Large White)和有色(Hampshire)猪外周血白细胞分离mRNA。用随机引物(第1链cDNA合成试剂盒，PharmaciaBiotech)反转录100ng的poly(A)+mRNA，并且根据制造商建议用纠错Advantage KlenTaq聚合酶(Clontech)对该产物的1∶10稀释液进行RT-PCR。下面的引物用于扩增几乎完整的编码区和部分5’非翻译区：对应于5’非翻译区的KIT40(5’-GGC TCT GGG GGC TCG GCT TTG C)和对应于外显子21的KIT22S(5’-TCA GAC ATC TTC GTG GAC AAG CAG AGG)；两种引物根据GENBANK数据库中人和小鼠KIT序列的保守序列进行设计。将RT-PCR产物凝胶纯化并使用pGEM-T载体系统(Promega)进行克隆。用一套内部引物和ABI PrismTM罗丹明终止循环测序试剂盒(PE AppliedBiosystems)对质粒克隆进行测序。开始对代表每种类型KIT序列的两个亚克隆进行测序，并且在观察到不匹配的情况(可能由于PCR差错)下，对其它克隆特定核苷酸位点进行测序。用引物KIT1F(5’-TCR TAC ATAGAA AGA GAY GTG ACT C)和KIT7R(5’-AGC CTT CCT TGA TCA TCT TGTAG)对KIT外显子16-19进行RT-PCR分析。结果
来自Hampshire品种动物的KIT基因编码区的序列示于图10中。分别从Hampshire和Yorkshire/Landrace猪克隆的KIT cDNA序列之间的差异示于下表中。序列比较包括除反转录PCR引物占据的27bp外的完整开放阅读框2919bp。列出了外显子和碱基对位数以及氨基酸密码子的每个差异。多态性碱基以粗体表示。破折号表示与Hampshire(i)等位基因一致。
   品种   皮毛颜色   推定的基因型 序列变体  剪切的外显子14  剪切的外显子17 外显子5821 外显子5828 外显子6978 外显子6984 外显子61008   外显子91464 外显子182502 外显子192678
 HampshireYorkshire/Landrace   有色白色   i/iI/I1 KIT1*0101KIT1*0201KIT1*0202KIT2*0101KIT2剪切变体   正常正常正常正常跳跃2   正常正常正常跳过跳过   AGGArg-AAGArg--   ACAThr-ACGThr--   AACAsnAATAsn-AATAsnAATAsn   GGAGlyGGCGly-GGCGlyGGCGly   GAGGluGAAGluGAAGluGAAGluGAAGlu   ACGThrACAThrACAThrACAThrACAThr   CCTProCCCProCCCProCCCProCCC-   GCGAlaGTGValGTGValGTGValGTG-
1由在与Hampshire(i/i)公猪交配后得到100％白色猪仔的母猪推断的基因型I/I，I/I*或I*/I*2外显子149(151bp)的跳过导致于2161处终止的无义翻译实施例17DNA制备
按照实施例12中所述的制备基因组DNA。PCR
用正向引物LA93(5’-GAG CAG CCC CTA CCC CGG AAT GCC AGT TGA-3’)和反向引物KIT56(5’-CCT TAA AAC AGA ACA TAA AAG CGG AAA CAT CATGCG AAG G-3’)扩增覆盖外显子19末端99bp和KIT基因59bp的158bp片段。PCR在Perkin Elmer 9600热循环仪上于20μl总体积中进行，20μl总体积中含有25ng基因组DNA，1.5mM MgCl2，50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3，200μM dNTPs，0.5U AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)和10pmol的LA93和KIT56引物。为了活化AmpliTaq Gold，起始热变性在94摄氏度进行10分钟，然后进行32轮循环，每轮循环由94摄氏度45秒、55摄氏度45秒和72摄氏度45秒组成。限制性消化和电泳
PCR扩增产物长158bp。为测定此产物93位处(对应于KIT cDNA序列的2678位)的多态性，消化反应设定如下：
  6.0μl PCR产物
  1.0μl 10X反应缓冲液3(New England Biolabs)
  0.2μl AciI(5U/μl)
  2.8μl去离子水
37℃消化120分钟后，向每10μl反应体积中加入2μl上样染料并将混合物上样至0.5XTBE(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中的8％天然聚丙烯酰胺凝胶(Protogel，37.5∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺，National Diagnostics，Atlanta)中，并且于200V在垂直凝胶板装置(SE600 Hoefer Scientific Instruments)中电泳3小时。产物通过溴化乙锭染色加以观察。结果
设计反向引物以将AciI位点导入扩增的序列中。用AciI消化扩增片段释放出23bp片段的结果使得可以证实消化过程。将剩余135bp片段消化成92和43bp片段依赖于对应于KIT cDNA序列2678位的核苷酸。在此位置的T阻止消化而在此位置的C允许消化。凝胶分辨率不足以分辨23bp片段，但是与未消化产物的对比使得可以证实此过程。
图11说明用多种基因型动物获得的结果。
测试用于分析来自7个猪品种的共66个无关个体。结果示于下表中：
   品种    数目  基因型1        核苷酸2678位的基因型
    C/C     C/T     T/T
 HampshirePolish Wild BoarDurocPietrainSwedish Wild BoarSwedish LandraceSwedish Yorkshire     4131111125145   i/ii/ii/ii/ii/iI/II/IpI/II/Ip     100010000     111000211     2121010123134
1按照实施例11中所述基于NlaIII RFLP分析的基因型。实施例18用快速以DNA为基础的测试对I基因座基因型的测定
从3个品种系动物即基于Hampshire的品系、Large White的品系和来自最初从前两个品系制备的杂交品系的白色动物的皮毛样品制备粗提DNA裂解物。将4个毛囊置于100μl的K缓冲液(50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3，2.5mM MgCl2，0.5％w/v Tween 20)中并加入1μl蛋白酶K(15mg/ml)(Boehringer)。将此混合物于55℃温育2小时后于95℃温育16分钟。DNA按照实施例12中所述的制备。
用PE Applied Biosystems TaqManTM系统设置等位基因鉴别反应。25μl反应物中含有300nM的引物E19FOR(5-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’)和E19REV(5-CTTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-3’)、8％甘油(w/v)、1XTaqManTM缓冲液A(PE Applied Biosystems)、5mM MgCl2、200μM dATP、dGTP、dCTP和dUTP、0.65单位AmpliTaq GoldTM(PEApplied Biosystems)、025单位AmpEraseTM UNG(PE Applied Biosystems)和100mM浓度的TaqManTM探针E19PC(5’-CATACATTTCCGCAGGTGCATGC-FAM)和E19PT(5’-TCATACATTTCCACAGGTGCATGC-TET)。1μl粗提DNA裂解液用作模板。PCR扩增用PE9600热循环仪(PE Applied Biosystems)或ABI7700 Prism(PE Applied Biosystems)进行，热循环方案为50℃2分钟后95℃10分钟，然后是95℃15秒、62℃1分钟的40轮循环。每个96孔板使用每种纯合基因型2678C和2678T的8个对照样品和8个用去离子水代替模板对照的非模板对照。用ABI7700 Prism(PE AppliedBiosystems)的等位基因鉴别功能进行基于这些反应的等位基因鉴定。结果
此测试用于分析来自4个猪品种的共20头无关个体。这些结果在下表中表示：
  品种  数目 推定的基因型   核苷酸2678位的KIT基因型
   C/C    C/T    T/T
 Hampshire   5     i/i     1     1     3
 Landrace   5     I/I     0     0     5
 Duroc   5     i/i     0     0     5
 Pietrain   1     i/i     0     0     5
实施例19条带皮毛颜色与KIT的完全其分离方法
Hampshire具有特征性皮毛颜色表型，在纯黑色背景上有白色条带。条带由显性等位基因(Be)决定。在Hampshire(Be/Be)与Pietrain(be/be)之间的回交中研究条带基因座的分离。将F1母猪(Be/Be)与纯种Pietrain(be/be)公猪回交。DNA制备完全按照实施例3中所述进行。KIT外显子19 PCR RFLPi)PCR以制备用于RFLP测试的DNA
用下面引物扩增覆盖KIT基因外显子19的3末端’99bp和内含子19的59bp的158bp片段：
正向引物LA93(5’-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’)和反向引物KIT56(5’-CTTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-3’)。
PCR于20μl总体积中进行，该体积中含有25ng基因组DNA，1.5mMMgCl2，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，200μM dNTPs，0.5U AmpliTaqGold(Perkin Elmer)和10pmol的LA93和KIT56引物。为了活化AmpliTaqGold，起始热变性在94摄氏度进行10分钟，然后进行32轮循环，每轮循环由94摄氏度45秒、55摄氏度45秒和72摄氏度45秒所组成。ii)限制性酶消化和电泳
PCR扩增产物长158bp。为测定此产物93位的多态性，消化反应设定如下：
  6.0μl PCR扩增的DNA
  1.0μl 10XNE缓冲液3
  0.2μl AciI(5U/μl)
  2.8μl dH2O
[1XNE缓冲液(Nee England Biolabs)含有100mM氯化钠、50mMTris-HCl、10mM氯化镁和1mM DTT]。37℃消化120分钟后，向每个样品加入2μl上样染料并将混合物上样至0.5XTBE(44.5mM Tris pH8.0，44.5mM硼酸和0.5mM EDTA)中的12％天然聚丙烯酰胺凝胶中并以200V在垂直板装置(SE600 Hoefer Scientific Instruments)中电泳3小时。产物通过溴化乙锭染色加以观察。结果
KIT核苷酸2678是多态性的，并且C或T存在于此位置。C的存在产生AciI限制性位点而T存在时没有此位点。已将第2个AciI位点加工入反转录引物KIT56中以用作消化的内部对照并且因此是不变的。多态性可以按照下表中所述通过简单的PCR-RFLP分析加以测定。
2678位KIT单核苷酸多态性(SNP)的测定
   核苷酸     DNA大小(bp)消化后的片段
    CT     23+43+9223+135
条带和KIT基因座在此系谱中的共分离总结于下表中。在Hampshire/Pietrain回交中KIT和条带间的共分离
 动物  测试数 表型  条带基因座 KIT SNP2678
 F1母猪    14 条带    Be/be     C/T
 Pietrain父本    2 无条带    be/be     T/T
 子代    41 条带    Be/be     C/T
 子代    41 无条带    be/be     T/T
条带表型与KIT多态性间的完全共分离表明此表型最有可能受KIT基因座突变控制。这意味着KIT多态性的检测可用于鉴定来自Hampshire猪的动物产品，因为条带是Hampshire猪中最重要的品种因子。有可能Saddleback和Hannover-Braunschweig猪中存在的条带表型由相同基因座控制。实施例20  αMSHR基因5’非翻译区和5’编码区序列的测定
测定和比较已知在E基因座携带不同Eh、E+和Ep的猪品种之间αMSHR基因的完整编码区。Hampshire携带Eh并且有杂有白色条带的纯黑色身体。该条带是另一皮毛颜色基因座的结果。携带等位基因E+的Wild Boar具有野生型表型而Pietrain品种携带Ep并且特征是白色身体上有黑色斑点。PCR以制备用于克隆构建的DNA
用引物EPIG10和EPIG16从基因组DNA扩增αMSHR基因的完整编码区。这些引物具有以下序列：
EPIG10    5’-GGT CTA GAT CAC CAG GAG CAC TGC AGC ACC-3’
EPIG16    5’-GGG AAG CTT GAC CCC CGA GAG CGA CGC GCC-3’
PCR在DNA热循环仪(Perkin Elmer 9600)上于20l总体积中进行，20μl体积中含有25ng基因组DNA，1.5mM MgCl2，50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3，200μM dNTPs，5％DMSO(二甲基亚砜)，0.5U AmpliTaqGold(Perkin Elmer)和10pmol的EPIG10和EPIG16。为了活化AmpliTaqGold，起始热变性在96℃进行10分钟，然后进行32轮循环，每轮循环由94℃45秒、55℃45秒和72℃45秒组成。最后的延伸持续7分钟。PCR产物的克隆
为了利于PCR产物的克隆，设计在5’末端具有限制性核酸内切酶识别位点的两个引物。引物EPIG10具有用酶XbaI切割的序列TCTAGA而引物EPIG16含有用酶HindIII切割的序列AAGCTT。进行上述PCR后，将反应物电泳并用Qiaex II凝胶提取试剂盒按照制造商指南(Qiagen)加以纯化。在连接之前将纯化的PCR产物如下消化：
   PCR产物                      17.0μl
   0.5u的HindIII(Amersham)      1.0μl
   0.5u的XbaI(Amersham)         1.0μl
   X10反应缓冲液M(Amersham      3.0μl
   X10牛血清蛋白(Amersham)      3.0μl
   H2O                         5.0μl
将反应物于37摄氏度温育16小时后，按照制造商指南(Qiagen)通过流过QIAquick离心柱来纯化消化的DNA。用400U T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)在20μl总体积中将PCR产物连入100ng载体pRc/CMV(Invitrogen)中，20μl体系含有10mM MgCl2，50mM Tris-HClpH7.5，10mM二硫苏糖醇，1mM ATP和25μg/ml牛血清白蛋白。连接反应在16℃进行16小时。质粒DNA的制备和测序
用Jetstar质粒midi试剂盒50(Genomed)从过夜细菌培养物纯化质粒DNA并将得到的DNA稀释至15ng/μl。按照ABI Prism方法P/N402078(Perkin Elmer)用AmpliTaq DNA聚合酶进行染料终止循环测序。循环测序反应包括1.6pmol的T7或SP6测序引物(Progema)、15ng质粒DNA和终止备好反应混合物(Perkin Elmer)。循环测序反应在GeneAmp9600仪中进行25轮循环，每轮循环由96℃10秒、50℃5秒和60℃4分钟组成。用乙醇沉淀纯化延伸产物以进行凝胶分离，并且按照仪器说明书(Perkin Elmer方法P/N 402078)中所述在377ABI Prism DNA测序仪中上样和电泳。结果
在携带Ep等位基因的Pietrain品种猪的αMSHR基因中鉴定到WildBoarαMSHR基因序列中的核苷酸位66到67之间的2bp插入。这导致翻译框的移码并在Wild BoarαMSHR基因序列中的核苷酸位161到163处产生TGA终止密码子。3个品种间αMSHR编码序列的5’部分的比较表示如下。此比较说明与Hampshire或Wild Boar等位基因比较时Pietrain动物携带的等位基因内存在双碱基对插入。ATG起始密码子以粗体突出显示，引物EPIG16的3’末端以斜体表示并且与Pietrain序列相同的碱基以破折号标记。缺失的碱基以：标记：
Pietrain    CGACGCGCCC TCCCTGCTCC CTGGCGGGAC GATGCCTGTG CTTGGCCCGG
Meishan     ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Wild Boar   ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Pietrain    AGAGGAGGCT GCTGGCTTCC CTCAGCTCCG CGCCCCCAGC CGCCCCCCCC
Meishan     ---------- ---------- ---------- --------:: ----------
Wild Boar   ---------- ---------- ---------- --------:: ----------
Pietrain    GCCTCGGGCT GGCCGCCAAC CAGACCAACC AGACGGGCCC CCAGTGCCTG
Meishan     ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Wild Boar   ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Pietrain    GAGGTGTCCA TT
Meishan     ---------- --
Wild Boar   ---------- --
这些结果也加在图1a中。实施例21对猪αMSHR基因中2bp插入突变存在的快速DNA测试允许鉴别Ep等位基因与在此基因座鉴定到的所有其它等位基因
完全按照上述用正向引物EPIG16(见上文)和反向引物MC1R121A进行PCR。反向引物用ABI染料Hex标记并具有以下序列：
MC1R121A  5’-Hex-GGACTCCATGGAGCCGCAGATGAGCACGGT-3’
PCR循环后，将0.2μl反应体积与2.5μl去离子甲酰胺、0.5μlGS500 DNA标准(ABI)和0.4μl蓝色葡聚糖溶液混合后加热至90℃2分钟并于冰上迅速冷却。然后将0.1μl此混合物上样至377 ABI Prism测序仪中并以700V、40mA、32W在1XTBE缓冲液中的6％聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段2小时。用GeneScan软件(ABI)测定得到的PCR产物长度。结果
设计测试以直接分析基因组中鉴定到的2bp插入的存在。引物EPIG16和MC1R121A用于PCR扩增野生型猪MC1R基因的5’部分的448bp。为了利于扩增产物的荧光测定，将ABI染料HEX共价结合在引物MC1R121A的5’末端。对来自3个品种的多个无关个体进行PCR并用GeneScan软件(ABI)测定得到的PCR产物大小。
  品种   测试数  延伸基因型       PCR产物大小
    448bp     450bp
 PietrainLarge WhiteHampshire     535     Ep/EpEp/EpEh/Eh     005     530
对个体间扩增的PCR产物长度的分析表明得到448bp或450bp的产物。从每头Hampshire动物中扩增到预期的448bp片段，然而从测试的每头Pietrain和Large White动物中检测到长2bp的产物。这表明通过序列分析鉴定到的2bp插入存在于两种赋予Ep等位基因的品种Pietrain和Large White的基因组DNA中，而不存在于携带Eh的Hampshire基因组DNA中。实施例22
除了αMSHR基因的编码区外，DNA序列多态性可能存在于品种间非翻译区(UTR)内。收集3’非翻译区的序列信息并且在表现各种皮毛颜色表型的6个猪品种之间进行比较。PCR以制备用于测序的DNA
用引物EPIG13和EPIG14扩增含有分子3’部分38个编码核苷酸和3’非翻译区(不包括引物结合位点)416bp的454bp产物。这些引物具有以下序列：
EPIG13    5’-GCA AGA CCC TCC AGG AGG TG-3’
EPIG14    5’-CAC TGA GCC GTA GAA GAG AG-3’
PCR在DNA热循环仪(Perkin Elmer 9600)上于20μl总体积中进行，20μl体积中含有25ng基因组DNA，1.5mM MgCl2，50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3，200μM dNTPs，0.5U AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)和10pmol的EPIG13和EPIG14。为了活化AmpliTaq Gold，起始热变性在96℃进行10分钟，然后进行32轮循环，每轮循环由94℃45秒、55℃45秒和72℃45秒组成。最后的延伸于72℃持续7分钟。PCR产物的测序
PCR产物用染料终止化学法进行测序。这首先需要纯化PCR产物使之不含有过量的dNTPs和引物。这可根据制造商说明(Qiagen)通过使模板DNA流过QiaQuick离心柱来实现。按照实施例1中所述用EPIG13或EPIG14对20ng纯化的模板进行循环测序反应。结果
引物EPIG13和EPIG14用于扩增454bp的DNA区域，此区域包含MC1R基因的3’末端编码区和与3’UTR紧密相连的区域。收集到的序列信息显示于图5中并且鉴定到2个多态性位点。
鉴定到的第1个多态性位点是与Meishan和Large Black相同的1bp缺失，它存在于Wild Boar序列中相当于核苷酸位1007处终止密码子下游的7个位置。由于此缺失存在于翻译区之外，所以预期其不改变得到的受体分子的氨基酸组成，然而其通过内切核酸酶切割对mRNA稳定性和3’末端形成的影响是未知的。这对携带Em和携带不存在于任何检测的其它品种中的αMSHR基因变体的两个品种是特有的。
第二种多态性是对欧洲Wild boar特有的核苷酸位1162处的碱基置换。图15表示5个品种在此位置有G碱基而Wild boar在此位置含有A。此序列差异提供了从用基于DNA的测试分析的其它品种鉴别欧洲Wildboar的可能性。

Claims (47)

1一种用于：
(a)以品种来源为基础鉴别动物和动物产品；或
(b)测定或测试动物产品的品种来源；或
(c)鉴定动物产品；的方法，包括以下步骤：
(i)提供动物产品的样品；并且
(ii)分析存在于样品中的一种或多种品种因子的等位基因。
2权利要求1的方法，其中品种因子是单基因性状。
3权利要求1的方法，其中品种因子是多基因性状。
4权利要求1-3中的任意一项权利要求的方法，其中外在表型性状是行为或形态学性状。
5权利要求3或4的方法，其中外在表型性状在不同品种之间有质量或数量上的差异。
6前述任意一项权利要求的方法，其中在步骤(ii)中分析的品种因子基因选自：
(a)皮毛颜色基因；和/或
(b)皮毛图案基因；和/或
(c)皮毛质地基因；和/或
(d)皮毛密度基因；和/或
(e)皮毛长度基因；和/或
(f)耳朵方面的基因；和/或
(g)两种肌肉形成基因；和/或
(h)角形态基因；和/或
(i)獠牙形态基因；和/或
(j)眼颜色基因；和/或
(k)羽毛基因；和/或
(l)喙颜色/形态基因；和/或
(m)发声(如吠叫)基因；和/或
(n)鸡冠或肉垂基因；和/或
(o)控制炫耀行为基因。
7权利要求6(a)的方法，其中皮毛颜色基因是KIT或αMSHR基因(例如猪KIT或αMSHR基因)。
8前述任意一项权利要求的方法，其中样品是核酸样品并且分析步骤(ii)包括DNA或RNA分析。
9权利要求1-7中的任意一项权利要求的方法，其中样品是蛋白样品并且分析步骤(ii)包括蛋白分析。
10一种测定猪皮毛颜色基因型的方法，包括：
(i)获取猪核酸样品；并且
(ii)分析(i)中获取的核酸以测定哪些αMSHR基因的等位基因存在。
11权利要求8或10的方法，其中分析步骤(ii)包括：
(a)(例如通过PCR)选择性扩增特异核酸片段；和/或
(b)测试品种因子基因/αMSHR基因内部一个或多个限制性核酸内切酶位点的存在[例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析]；和/或
(c)测定品种因子基因/αMSHR基因的全部或部分核苷酸序列；和/或
(d)用等位基因特异性DNA或RNA探针检测核酸样品；和/或
(e)用至少一对适当引物对核酸样品进行一轮或多轮PCR扩增循环，然后对这样得到的扩增核酸进行RFLP分析。
12一种测定猪皮毛颜色基因型的方法，包括：
(i)获取猪αMSHR蛋白样品；并且
(ii)分析步骤(i)中获取的蛋白以测定那些与皮毛颜色基因型相关位置的氨基酸序列或蛋白大小。
13权利要求9或12的方法，其中分析步骤(ii)包括：
(a)用对等位基因特异性表位特异的抗体(如单克隆抗体)检测蛋白样品；和/或
(b)电泳分析；和/或
(c)色谱分析；和/或
(d)氨基酸序列分析；和/或
(e)蛋白水解切割分析；和/或
(f)表位作图；和/或
(g)在体外转录/翻译系统中翻译通过PCR或其它方法制备的基因DNA或RNA拷贝。
14权利要求7的方法，其中分析步骤(ii)包括测定KIT或αMSHR基因的核苷酸序列或者KIT或αMSHR蛋白的氨基酸序列。
15权利要求7或14的方法，其中分析步骤(ii)包括确定KIT或αMSHR基因和/或其侧翼区域中至少一个核苷酸变化的存在与否。
16权利要求10或11的方法，其中测定步骤(ii)包括测定αMSHR基因和/或其相关侧翼区域中至少一个错义突变、插入或缺失的存在与否。
17权利要求7、10、11、14或15中的任意一项权利要求的方法，其中分析步骤(ii)进一步包括测定与KIT或αMSHR基因连锁的一种或多种微卫星或其它连锁标记等位基因与KIT或αMSHR基因的特定等位基因之间的关联。
18权利要求17的方法，其中分析步骤(ii)是基于存在于核酸样品中的微卫星标记的鉴定。
19权利要求7的方法，其中分析步骤(ii)包括：
(a)测定与KIT或αMSHR基因连锁的一种或多种微卫星或其它连锁标记等位基因与KIT或αMSHR基因的特定等位基因之间的关联；
(b)测定哪些微卫星或其它连锁标记等位基因存在于核酸样品中。
20测定猪皮毛颜色基因型的方法，包括：
(i)测定与αMSHR基因连锁的一种或多种微卫星或其它连锁标记等位基因与αMSHR基因的特定等位基因之间的关联；
(ii)获取猪核酸样品；并且
(iii)分析(ii)中获取的核酸样品以测定哪些微卫星或其它连锁标记等位基因存在。
21权利要求7、10、11和14-20中的任意一项权利要求的方法，其中分析步骤(ii)进一步包括测定至少一个其它基因座基因型的步骤。
22权利要求21的方法，其中其它基因座是其它皮毛颜色基因座。
23权利要求22的方法，其中其它皮毛颜色基因座是KIT基因基因座(如猪KIT基因基因座)。
24权利要求23的方法，其中对KIT基因基因座进行分析以测定它是否携带任何与条带基因型相关的多态性。
25权利要求24的方法，其中的测定包括RFLP分析。
26测定猪皮毛颜色基因型的方法，包括：
(i)获取猪核酸样品；并且
(ii)分析(i)获取的核酸样品以测定KIT基因是否携带任何与条带基因型相关的多态性。
27如权利要求26中所述的方法，其中步骤(ii)包括RFLP分析。
28如权利要求26或27中所述的方法，其中猪基因组DNA样品用PCR和一对适当引物加以扩增。
29权利要求21的方法，其中其它基因座是选自权利要求6中指定的那些基因中的任意一个的品种因子基因基因座。
30权利要求21的方法，其中其它基因座是品种特异性标记。
31权利要求30的方法，其中品种特异性标记是微卫星标记。
32权利要求7、10、11、14-23和28-31中的任意一项权利要求的方法，其中步骤(ii)包括使用至少一对适当引物的PCR。
33权利要求32的方法，其中基因是猪αMSHR基因并且至少一对适当引物是：
αMSHR正向引物1：(5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT RGT GCC TGG
AGG TGT-3′)；
αMSHR反向引物5：(5′-CGC CCA GAT GGC CGC GAT GGA CCG-3′)；或
αMSHR正向引物2：(5′-CGG CCA TCT GGG CGG GCA GCG TGC-3′)
αMSHR反向引物2：(5′-GGA AGG CGT AGA TGA GGG GGT CCA-3′)；或
αMSHR正向引物3：(5′-GCA CAT CGC CCG GCT CCA CAA GAC-3′)
αMSHR反向引物3：(5′-GGG GCA GAG GAC GAC GAG GGA GAG-3′).
34权利要求7、10、11、14-23和28-33中的任意一项权利要求的方法，其中步骤(ii)包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析，例如包括用一种或多种限制性酶BstUI，HhaI和/或BspHI消化猪核酸。
35权利要求34的方法，其中基因是猪αMSHR基因并且分析包括鉴定猪αMSHR基因中核苷酸位283、305、363、370、491、727、729、1162或核苷酸位60与70之间或核苷酸位1005与1010之间的多态性。
36权利要求7的方法，其中步骤(ii)包括用至少一对适当引物对核酸样品进行一轮或多轮PCR扩增循环，然后对这样得到的扩增核酸进行RFLP分析以测定猪的KIT或αMSHR基因型。
37权利要求36的方法，其中基因是猪αMSHR基因并且上述至少一对适当引物是权利要求35中指定的引物。
38权利要求30或31的方法，其中基因是猪KIT或αMSHR基因并且RFLP分析如权利要求28中所述。
39权利要求1-9、11、13-19、21-25和29-38中的任意一项权利要求的方法，其中动物产品是肉(如加工和/或罐装的肉)、禽蛋、禽蛋擦试物或洗涤物、精液、绒毛或皮革。
40权利要求1-9、11、13-19和21-39中的任意一项权利要求的方法，其中样品包括基因组DNA、RNA或线粒体DNA。
41权利要求1-9、11、13-19和21-40中的任意一项权利要求的方法，其中动物是哺乳动物(如猪、牛、狗、猫、马、绵羊、啮齿动物或兔)、鱼类(如鳟鱼或鲑鱼)或鸟类(鸡或火鸡)。
42一种用于
(a)以品种来源为基础鉴别动物产品；或
(b)测定或测试动物产品的品种来源；或
(c)鉴定动物产品；的试剂盒，包含用于分析存在于样品中的一种或多种品种因子基因的等位基因的一种或多种试剂。
43一种测定猪皮毛颜色基因型的试剂盒，包含一种或多种用于分析猪αMSHR基因型的试剂。
44权利要求42或43中所述的试剂盒，经调整用于猪基因组DNA样品。
45如权利要求42到44中所述的试剂盒，包含一种或多种与至少一对适当引物一起用于进行至少一轮PCR循环的试剂。
46如权利要求45中所述的试剂盒，其中至少一对适当引物是：
αMSHR正向引物1：(5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT RGT GCC TGG
AGG TGT CCA T-3′)
αMSHR反向引物5：(5′-CGC CCA GAT GGC CGC GAT GGA CCG-3′)；或
αMSHR正向引物2：(5′-CGG CCA TCT GGG CGG GCA GCG TGC-3′)
αMSHR反向引物2：(5′-GGA AGG CGT AGA TGA GGG GGT CCA-3′)；或
αMSHR正向引物3：(5′-GCA CAT CGC CCG GCT CCA CAA GAC-3′)
αMSHR反向引物3：(5′-GGG GCA GAG GAC GAC GAG GGA GAG-3′)。
47如权利要求42到46中的任意一项权利要求所述的试剂盒，包含一种或多种用于猪核酸RFLP分析的试剂。
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