CN107858443B - 定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于TaqMan PCR技术一次性检测羊、牛和猪源性成分的引物、探针、试剂盒及检测方法，正向引物：5'‑AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT‑3'，反向引物：5'‑TTTACTGCTAAATCCTCCTT‑3'，羊探针：5'‑CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT‑3'，牛探针：5'‑CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT‑3'，猪探针：5'‑CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT‑3'；本发明的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现动物源性的定性和定量检测，并且可以进行羊、牛和猪源性的同时检测。

Description

定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及动物源性检测领域。
背景技术
动物源性成分是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)等食品或饲料。动物源性检测是指从动物源性食品(肉制品、乳制品等)以及饲料中检测其源性成分的过程。动物肉类、乳制品为人类的生命活动提供了丰富的蛋白质、脂肪和B族维生素等，是人们生活的重要食品来源。但在利益的驱动下在食品加工、流通和餐饮领域中掺假事件时有发生。由于价格差带来的利益诱惑，驱使一些不法商贩、企业在牛、羊、鹿等高价肉制品中掺杂猪、鸭等低价肉原料；用低价肉或非肉成分经香精处理后冒充高价肉；用牛奶冒充羊奶；用非原产地产品冒充原产地产品等；甚至还有一些商家厂家为谋取利益隐瞒或更改说明书。这些掺杂使假的行为不仅严重侵害了消费者利益，有时还会涉及到“民族”问题、“宗教”问题等不良的社会影响，如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象而影响出口贸易。动物源性检测正是应对这些问题，除了起到保护消费者合法权利、民族利益、宗教信仰以外还能防止牛海绵状脑病(BSE)、传染性海绵状脑病(TSE)，疯牛病(MCD)以及口蹄疫(FMD)等人畜传染病的传播。作为牛、羊、马产品基地的锡林郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的动物源性检测试剂盒。
近年来，肉、奶等食品中掺假造假的投诉事件不断上升，疯牛病的传播风险也在不断加大，作为保障食品安全、维护消费者利益的重要技术手段，食品和饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点。研发出适用于各种样品的多通道、高效、特异性强、快速的检测方法是亟待解决的问题。本试剂盒的研发是基于TaqMan PCR技术的多通道动物源性检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的基于TaqMan PCR技术的一次性检测羊、牛、猪源性成分的引物序列和探针，解决羊、牛、猪源性成分定性和定量检测问题。
本发明的技术方案为：基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪肉源成分的引物和探针，引物和探针序列如下：
正向引物：5'-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3'，
反向引物：5'-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3'，
羊探针：5'-CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT-3'，
牛探针：5'-CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT-3'，
猪探针：5'-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-3'；
羊、牛和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。
基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪肉源成分的方法，步骤如下：
(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取肉制品的DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；
(3)利用本发明的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用羊、牛和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、牛和猪相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性或三源性；
(5)利用羊、牛和猪阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(6)通过将检测肉制品的相应源性的Ct值带入标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
进一步地，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。
进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR mix 10μL，正向引物、反向引物、羊探针、牛探针和猪探针各1μL，DNA 1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。
含有权利要求1所述的引物和探针的试剂盒。
该试剂盒包含：Probe qPCR mix、正向引物、反向引物、羊探针、牛探针、猪探针、羊阳性标准品、牛阳性标准品、猪阳性标准品。
本发明通过比对羊、牛、猪、马、骆驼、驴、鸡、鸭、兔、鹅等10种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述100条序列，筛选出羊、牛、猪保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现动物源性的定性和定量检测，并且可以进行羊、牛和猪源性的同时检测。
附图说明
图1利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性的实时荧光定量PCR的检测，说明待测样品有羊源性。
图2利用HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性的实时荧光定量PCR的检测，说明待测样品有牛源性。
图3利用ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明待测样品有猪源性。
图4利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊单源性检测能力以及待测样品只有羊源性。
图5利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有牛单源性检测能力以及待测样品只有牛源性。
图6利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有猪单源性检测能力以及待测样品只有猪源性。
图7利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊和牛双源性检测能力以及待测样品有羊和牛源性。
图8利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊和猪双源性检测能力以及待测样品有羊和猪源性。
图9利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有牛和猪双源性检测能力以及待测样品有牛和猪源性。
图10利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊、牛和猪三源性检测能力以及待测样品有羊、牛和猪源性。
图11利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性检测灵敏度扩增曲线图，可以检测到1pg的羊源性DNA。
图12利用HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性检测灵敏度扩增曲线图，可以检测到1pg的牛源性DNA。
图13利用ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性检测灵敏度扩增曲线图，可以检测到1pg的猪源性DNA。
图14羊源性检测标准曲线(用于肉制品中羊源性的定量检测)。
图15牛源性检测标准曲线(用于肉制品中牛源性的定量检测)。
图16猪源性检测标准曲线(用于肉制品中猪源性的定量检测)。
具体实施方式
1、检测方法：
(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒(QIAGEN、Takara、Transgen等)提取肉制品的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL。
(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，利用羊、牛和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表2所示。
表1Real-time PCR反应体系
Figure BDA0001499503280000041
Figure BDA0001499503280000051
表2Real-time PCR扩增参数
Figure BDA0001499503280000052
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、牛和猪相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct值。只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定。当相应探针的C t≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性或三源性。
(5)利用羊、牛和猪阳性标准品做标准曲线定量检测肉制品中羊、牛和猪的含量。将羊、牛和猪DNA分别稀释101到107(共10个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测，制作羊源性定量检测标准曲线(图14)、牛源性定量检测标准曲线(图15)和猪源性定量检测标准曲线(图16)。
(6)通过将检测肉制品的相应源性的Ct值带入标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
2、引物和探针序列的设计
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在深加工过程中破坏程度相对较小，所以选择线粒体基因设计羊、牛和猪源性检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
正向引物序列：5'-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3'(SEQ ID No.1)，
反向引物序列：5'-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3'(SEQ ID No.2)，
羊探针序列：5'-CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT-3'(SEQ ID No.3)，
牛探针序列：5'-CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT-3'(SEQ ID No.4)，
猪探针序列：5'-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-3'(SEQ ID No.5)；
羊、牛和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。
3、引物和探针的特异性检测
单源性检测的Real-time PCR反应体系如下表所示
成分 体积(微升)
Probe qPCR mix 10
正向引物 1
反向引物 1
相应源性探针 1
DNA 1
灭菌的去离子水 6
总体积 20
3.1利用引物和羊探针(利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性)对羊肉、牛肉、猪肉、马肉、鸡肉、鸭肉、兔肉和鹅肉进行qPCR的检测
检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000061
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有羊源性。检测结果符合样品动物来源。在羊肉中检测出羊源性，而在其他肉中没有检测到羊源性。
3.2利用引物和牛探针(利用HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性)对牛肉、羊肉、猪肉、马肉、鸡肉、鸭肉、兔肉和鹅肉进行qPCR的检测
检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000071
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有牛源性。检测结果符合样品动物来源。在牛肉中检测出牛源性，而在其他肉中没有检测到牛源性。
3.3利用引物和猪探针(利用ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性)对猪肉、羊肉、牛肉、马肉、鸡肉、鸭肉、兔肉和鹅肉进行qPCR的检测
检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000072
Figure BDA0001499503280000081
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有猪源性。检测结果符合样品动物来源。在猪肉中检测出猪源性，而在其他肉中没有检测到猪源性。
4、相应源性检测的引物和探针的检测限度实验
4.1羊探针的检测限度
将羊的肌肉基因组DNA分别稀释101到107(共10个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，稀释105倍(0.001ng)的猪基因组DNA样本(3个平行实验)出现典型扩增曲线Ct值为32.45±0.46，且Ct值小于35，此时稀释的羊基因组DNA的浓度是1pg/μL；小于105稀释的样本都出现典型扩增曲线，而且随着模板稀释的进行Ct值逐渐变大。以上结果说明自主研发的羊特异性引物和探针的检测限度达到1pg/μL，检测的灵敏度较高。
检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000082
Figure BDA0001499503280000091
4.2牛探针的检测限度
将牛的肌肉基因组DNA分别稀释101到107(共10个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，稀释105倍(0.001ng)的猪基因组DNA样本(3个平行实验)出现典型扩增曲线Ct值为34.27±0.36，且Ct值小于35，此时稀释的牛基因组DNA的浓度是1pg/μL；小于105稀释的样本都出现典型扩增曲线，而且随着模板稀释的进行Ct值逐渐变大。以上结果说明自主研发的牛特异性引物和探针的检测限度达到1pg/μL，检测的灵敏度较高。
检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000092
4.3猪探针的检测限度
将猪的肌肉基因组DNA分别稀释101到107(共10个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，稀释105倍(0.001ng)的猪基因组DNA样本(3个平行实验)出现典型扩增曲线Ct值为33.426±0.335，且Ct值小于35，此时稀释的猪基因组DNA的浓度是1pg/μL；小于105稀释的样本都出现典型扩增曲线，而且随着模板稀释的进行Ct值逐渐变大；当猪基因组DNA稀释至106倍，虽然3个平行实验都出现典型扩增曲线，但是Ct值已经大于35；随着稀释至107，3个平行实验中有1个未出现扩增曲线。以上结果说明自主研发的猪特异性引物和探针的检测限度达到1pg/μL，检测的灵敏度较高。
检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000093
Figure BDA0001499503280000101
5、多重荧光定量PCR的检测(同时检测羊、牛、猪源性成份)
利用引物和羊、牛、猪三种探针对羊肉、牛肉、猪肉及混合样各6种进行qPCR的检测。检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000102
Figure BDA0001499503280000111
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。检测结果符合样品动物来源。在羊肉中检测出羊源性，牛肉中检测出牛源性，猪肉中检测出猪源性，而且在两种和三种混合的肉中检测到相应源性。
6、定量检测
利用引物和羊、牛、猪三种探针对羊肉、牛肉、猪肉进行qPCR的检测。
定量检测结果如下：
Figure BDA0001499503280000112
Figure BDA0001499503280000121
结果说明：利用实时荧光定量PCR检测羊、牛、猪各5个样品，通过羊、牛、猪的标准曲线计算相应的浓度值，与实际的浓度值50ng/μl，200ng/μl，100ng/μl符合程度较高。以上结果说明所发明的动物源性检测的引物、探针和试剂盒具有较好的定量检测能力。
7、试剂盒制作
试剂盒试剂如下表所示：
试剂 说明
Probe qPCR mix 反应体系(酶、dNTP、Mg<sup>2+</sup>)
正向引物 浓度为10μM
反向引物 浓度为10μM
羊探针 浓度为10μM
牛探针 浓度为10μM
猪探针 浓度为10μM
羊阳性标准品 浓度为100ng/μL，用于羊阳性对照及标准曲线
牛阳性标准品 浓度为100ng/μL，用于牛阳性对照及标准曲线
猪阳性标准品 浓度为100ng/μL，用于猪阳性对照及标准曲线
灭菌的去离子水 补充反应体系
采用该试剂盒能实现一次性羊、牛、猪源成分定性和定量鉴定。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 锡林郭勒职业学院
<120> 定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaatgggc tacattytct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttactgcta aatcctcctt 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaagaaaa tttaatacga aagccatt 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccaagaga atcaagcacg aaagttatt 29
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cataagaata cccaccatac gaaagttttt at 32

Claims (6)

1.基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：
正向引物：5'-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3'，
反向引物：5'-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3'，
羊探针：5'-CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT-3'，
牛探针：5'-CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT-3'，
猪探针：5'-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-3'；
羊探针、牛探针和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。
2.基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取肉制品的DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；
(3)利用权利要求1所述的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用羊、牛和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、牛和猪相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性或三源性；
(5)利用羊、牛和猪阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(6)通过将检测肉制品的相应源性的Ct值带入标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
3.根据权利要求2所述的基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。
4.根据权利要求3所述的基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR mix 10μL，正向引物、反向引物、羊探针、牛探针和猪探针各1μL，DNA1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。
5.含有权利要求1所述的引物和探针的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：Probe qPCR mix、权利要求1所述的引物和探针、羊阳性标准品、牛阳性标准品、猪阳性标准品。
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