KR20120038037A - 축종 감별용 ｐｃｒ 또는 실시간 ｐｃｒ 프라이머 조성물, 이를 포함하는 축종감별용 ｐｃｒ 키트 및 이를 이용한 축종감별방법 - Google Patents
축종 감별용 ｐｃｒ 또는 실시간 ｐｃｒ 프라이머 조성물, 이를 포함하는 축종감별용 ｐｃｒ 키트 및 이를 이용한 축종감별방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소, 돼지, 닭, 오리, 면양, 산양, 말, 개, 칠면조 및 거위의 10개 축종에 대해서 신속 정확하게 감별할 수 있기 위한 축종 감별용 PCR 또는 실시간 PCR 프라이머 조성물, 이를 포함하는 축종감별용 PCR 키트 및 이를 이용한 축종감별방법을 제공한다. 본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 또는 실시간 PCR 프라이머 조성물 및 이를 포함하는 PCR 또는 실시간 PCR 키트는 단일 PCR, 다중 PCR 그리고 실시간 PCR 에 적용하여 식품의 표시사항 검증에 도입함으로써 식품의 안정성 확보하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 소, 돼지, 닭, 오리, 면양, 산양, 말, 개, 칠면조 및 거위의 10개 축종에 대해서 신속 정확하게 감별할 수 있기 위한 축종 감별용 PCR 또는 실시간 PCR 프라이머 조성물, 이를 포함하는 축종감별용 PCR 키트 및 이를 이용한 축종감별방법을 제공한다. 본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 또는 실시간 PCR 프라이머 조성물 및 이를 포함하는 PCR 또는 실시간 PCR 키트는 단일 PCR, 다중 PCR 그리고 실시간 PCR 에 적용하여 식품의 표시사항 검증에 도입함으로써 식품의 안정성 확보하는데 사용될 수 있다.
산업이 발달하고 소득이 높아질수록 많은 소비자들은 축산물을 포함하여 더 좋은 먹을거리를 선택하게 된다.
단백질 섭취를 위해 육류의 소비가 날로 증가하고 있지만, 알레르기 반응 또는 종교 등의 이유로 인해 육류 역시 다른 농산물처럼 가려먹어야 하는 소비자들도 있어, 축산물에 표시된 관련사항들을 면밀하게 살펴보고 제품을 구입하는 추세가 증가하고 있다. 특히 외국에서 국내로 이주한 많은 외국인중 이슬람교와 같은 종교적 규정을 따르는 사람과 채식주의자들은 식품에 사용된 육류의 정보를 중요시 한다 [Calvo 등, 2001, J Anim Sci 79: 2108-2112쪽].
또한, 속이거나 비의도적으로 잘못 표시된 육류제품, 저가의 육류 혼합, 불명료하거나 부적당한 제품 그리고 사람과 동물 건강에 해로울 수 있는 어떤 동물의 육류 유입에 의해서 야기될 수 있는 축산물의 안전성 검증과 부정유통을 예방할 검사방법이 사회적으로 필요로 되고 있다. 그래서 소비자들의 신뢰성과 제품의 안정성 확보를 위해 축산물가공품 관련 축종 표시를 객관적으로 검증할 수 있는 과학적인 검사법이 여러 연구자들에 의해서 개발되었다[Calvo 등, 2001, J Anim Sci 79: 2108-2112쪽; Dalmasso 등, 2004, Mol Cell Probes 18(2): 81-87쪽; Lanzilao 등, 2005, J AOAC Int 88(1): 128-135쪽; Martㅽn 등, 2007a, J Anim Sci 85(2): 452-458쪽; Martㅽn 등, 2007b, J Anim Sci 85(10): 2734-2739쪽; Pfeiffer 등, 2004, BMC Genet 5: 30쪽; Wolf 등, 1999. J Agric Food Chem 47(4): 1350-1355쪽].
이에 따라 현재 국립수의과학검역원 축산물의 가공기준 및 성분규격의 식육감별법이 마련되어 있으나 이의 문제점은 다음과 같다.
| 검사방법 | 판정기준 | 감별 축종 | 비고 |
| Glycogen검사법 | 말(0.675%) 소(0-0.164%) 송아지(0%), 돼지(0%) |
말, 소, 송아지, 돼지 |
판단기준 모호 |
| 지방검사법 | 감별대상 모두 중복됨 | 말, 소, 양, 돼지 | 판단불가 |
| 자비법 | 수증기 냄새 | - | 검사자의 경험과 주관 |
| 혈청학적검사법 | 침전선 확인 | - | 열처리육 판단 난해 |
| 히스티딘 디펩타이드 함량 측정 |
말 134, 소 8, 돼지 30 닭 0.3, 오리 1.6, 칠면조 0.07 |
말 등 6개 축종 | 혼합제품 판단불가 |
| 유전자혼성화법 | 발색환과 색의 강도 | 말 등 9개 축종 | 검사기간 5일 검사방법 난해함 |
국립수의과학검역원에서 고시한 축산물의 가공기준 및 성분규격에 채택된 식육감별법인 glycogen검사법, 지방검사법 그리고 자비법은 감별기준이 모호하거나 매우 주관적이다. 그리고 혈청학적 시험법인 한천겔면역확산법과 효소면역반응법 등은 특이적이고 민감하지만, 근연종에서 교차반응이 발생하는 문제가 있다[Berger 등, 1998, J Assoc Off Anal Chem 71(2): 406-409쪽; Hsieh 등, 1988, J Food Prot 61(4): 476-481쪽]. 또한, 식육의 단백질을 이용한 전기영동법[Kim 등, 1986, J Food Sci 51(3): 731-741쪽; Skarpeid 등, 1998, Electrophoresis 19(18): 3103-3109쪽], 액체크로마토그래피[Chou 등, 2007, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 846(1-2): 230-239쪽]등 여러 가지 분석법으로 축종감별을 실시할 수 있지만, 단백질이 도축되고 나서 생물학적 활성이 사라져 세포 분류에 따라 특성이 달라지게 되며, 열과 압력 처리과정을 거치는 동안 변성되기 때문에 가공된 검체에서 축종감별은 매우 까다로운 것으로 알려져 있다 [Montiel-Sosa 등, 2000, J Agric Food Chem 48(7): 2829-2832쪽].
한편, 소해면상뇌증에 대응하여 여러 국가에서 반추류 동물에게 포유류 물질의 사료공급을 금지하는 규정이 시행되고 있으며, 국내에서도 남은 음식물 사료를 소 등 반추동물의 사료원료로 사용하는 것을 금지토록 2004년 12월에 사료관리법을 개정하여 고시하였지만, 소해면상뇌증 예방을 위해 EU에서 공식적으로 인정한 현미경법은 사료에서 동물 뼛조각 유무를 검사하는 방법으로써 많은 시간이 소요되고 전문적인 기술을 요구한다[European Commission. Commission directive 98/88/EC of 13 November 1998 establishing guidelines for the microscopic identification and estimation of constituents of animal origin for the official control of feedingstuffs. 1998. Off J Eur Comm L 318: 45-50쪽; European Commission. Commission regulation 1774/2002/EC of 3 October 2002 laying down health rules concerning animal by-products not intended for human consumption. 2002, Off J Eur Comm L 273: 1-95쪽].
또한, 축종 고유의 조직학적 및 해부학적 특성을 이용한 식육감별은 동물학적 분류(포유류, 조류 그리고 어류) 정도만 가능하며, 그의 기원이 되는 축종은 판별할 수 없다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 소, 면양, 돼지 및 가금 등의 조직이나 혈액 등으로부터 DNA을 이용한 유전자 검사에 의한 식육감별법이 개발되다. 예를 들면 Polymerase chain reaction(PCR) [Calvo 등, 2001, J Anim Sci 79: 2108-2112쪽; Martㅽn 등, 2007a, J Anim Sci 85(2): 452-458쪽; Martㅽn 등, 2007b, J Anim Sci 85(10): 2734-2739쪽], DNA hybridization [이명헌 등, 대한수의학회지 1999, 39(3): 513-522쪽], random amplified polymorphic DNA fingerprints(RAPD)-PCR [Lee 등, 1994, Forensic Sci Int 67(2): 103-107쪽] 등이 개발되었으며, PCR-restriction fragment length polymorphism(RFLP) 방법으로 축종의 미토콘드리아 DNA (mt DNA)의 변이를 확인하는 축종의 감별법이 또한 개발되었다 [Lanzilao 등, 2005, J AOAC Int 88(1): 128-135쪽; Pfeiffer 등, 2004, BMC Genet 5: 30쪽; Wolf 등, 1999. J Agric Food Chem 47(4): 1350-1355쪽].
또한, Real-time PCR을 이용한 방법으로 다양한 형광색소의 양을 실시간 별로 측정하여 유전자를 검사하는 방법이 개발되었는데, 이는 두 가지로 분류되며 TaqMan 또는 FRET 화학물질과 같은 PCR 산물과 상보적으로 결합할 수 있는 probe [Laube 등, 2003, International Journal of Food Science and Technology 38: 111-118쪽; Rensen 등, 2005, Foodborne Pathog Dis 2(2): 152-159쪽]와 SYBR Green[Fajardo 등, 2008, J AOAC Int 91(1): 103-111쪽]처럼 염기서열과 상관없이 핵산의 특이적으로 결합하는 DNA intercalating dye로 구분된다. SYBR Green을 이용하는 경우 핵사의 염기서열과 상관없이 이중나선과 반응해서 형광을 발산하기에 부정확할 수도 있고 PCR 산물의 크기에 따라 형광의 세기가 달라지는 단점이 있다. 형광 probe에 기초한 5'-3' exonuclease기법은 비특이적으로 형광을 발산하지 않아 특이성과 민감성이 기존의 일반 PCR 검사보다 크게 향상된 것으로 알려져 있으며, 검사에 소요되는 시간 또한 단축시켜 준다는 장점이 있다[Laube 등, 2003, International Journal of Food Science and Technology 38: 111-118쪽; Lㆃpez-Andreo 등, 2005, Anal Biochem 339(1): 73-82쪽; Tanabe 등, 2007, Biosci Biotechnol Biochem 71(12): 3131-3135쪽].
그러나 기존의 PCR 기법을 이용한 축종 감별법의 경우 대부분 단일 축종에 대한 프라이머를 이용한 감별법이어서, 해당 프라이머가 증폭하는 축종에 대한 해당여부만을 확인할 수 있을 뿐이며, 정확히 어떠한 축종인지를 감별하는 것은 용이하지 않으며, 미지 축종 검체에 대한 축종 구별을 위해서는 축종마다 해당여부를 확인하기 위한 여러 번의 PCR 실험을 수행하는 등 매우 번거로운 점이 많았다.
따라서 여러 축종에 대해서 동일한 PCR 조건에서 감별할 수 있는 방법에 대한 개발이 당업계에서 요구되어 왔다.
일반적으로 PCR은 변성(denaturation), 혼성화(annealing), 중합(polymerization) 단계를 반복하여 해당 유전자를 증폭하게 되는데, DNA 주쇄와 프라이머가 결합하는 annealing 온도는 주쇄와 프라이머간의 GC/AT 비율에 따라 결정되게 된다. 따라서 식용으로 이용하는 여러 축종들에 대한 프라이머의 설계는 (i) 해당 축종의 DNA 주쇄에 특이적으로 결합하여 PCR 증폭이 되어야 하고, (ii) 각각의 축종별로 설계된 프라이머들은 모두 주쇄에 결합하는 동일한 혼성화 온도를 공유해야 되며, (iii) PCR 증폭산물이 축종 간에 구별이 될 수 있는 크기를 가져야만 한다. 그러나 식용으로 이용하는 축종은 매우 다양하며 모든 축종에 대해서 상기와 같은 조건을 모두 충족하는 프라이머를 설계하는 것은 매우 어려운 일이었다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 세트"는 PCR 증폭반응을 위해서 혼성화 단계에서 DNA 주쇄에 결합될 수 있는 정방향(forward) 프라이머 및 역방향(backward) 프라이머로 이루어진 세트를 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 조성물"은 상기 "프라이머 세트"를 포함하는 조성물을 의미하며, 프라이머 세트를 용해시키기 위한 용매 혹은 프라이머 분자의 안정화를 위한 성분 등을 추가로 더 포함하거나 포함하지 않을 수도 있으며, 상기 프라이머 세트가 실시간 PCR 증폭반응에 이용되는 경우 PCR 증폭산물에 결합할 수 있는 프로브 또는 인터켈레이터를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명자들은 상기 10개 축종의 Genbank database에서 제공된 염기서열을 정렬하여 mt DNA의 12S rRNA과 16S rRNA 유전자의 염기서열을 비교분석하면서 10의 축종에 대한 프라이머를 설계한 결과, 본 발명에 따라 제공된 서열의 프라이머를 이용할 경우 (i) 해당 축종의 DNA 주쇄에 특이적으로 결합하여 PCR 증폭이 되고, (ii) 각각의 축종별로 설계된 프라이머들은 모두 주쇄에 결합하는 동일한 혼성화 온도를 공유하며, (iii) PCR 증폭산물이 다양한 축종 간에 구별이 될 수 있어 해당 프라이머를 축종에 따라 적절하게 선택하여 1번의 PCR을 수행하여도 축종의 종류를 신속하고 정확하게 확인할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 소, 돼지, 닭, 오리, 면양, 산양, 말, 개, 칠면조 및 거위의 10개 축종에 대해서 동일한 PCR 조건하에 1회의 PCR 시험 수행만으로도 신속 정확하게 축종을 감별할 수 있는 PCR용 프라이머를 포함하는 축종감별용 PCR 조성물 및 이를 포함하는 축종감별용 PCR 키트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 소, 돼지, 닭, 오리, 칠면조 및 거위의 축종에 대해서 동일한 PCR 조건하에 1회의 실시간 PCR 수행만으로도 신속 정확하게 축종을 감별 및 정량할 수 있는 실시간 PCR용 프라이머 및 프로브를 포함하는 축종감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물 및 이를 포함하는 축종감별용 실시간 PCR 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 축종 감별용 프라이머 조성물은 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조 검체로부터 수득되는 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하여, PCR 증폭을 통해 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 축종을 감별하는데 사용되는 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물에 있어서,
상기 프라이머 세트는 하기 (a) 내지 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(b) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(c) 면양의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(d) 산양의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(e) 말의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(f) 개의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(g) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(h) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 15 및 16의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(i) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 17 및 18의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(j) 닭의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 19 및 20의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(k) 닭의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(l) 오리의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 23 및 24의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(m) 거위의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(n) 거위의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 27 및 28의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(o) 칠면조의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 29 및 30의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트.
축종 감별을 위해 단일 PCR 및 다중 PCR 에 사용될 수 있는 상기 프라이머 세트의 염기서열을 정리하면 하기와 같다.
| 축종 | 명칭 | 서열(5'→3') | 서열번호 | 유전자부위 | 증폭산물의 크기 (bp) |
| 소1 | 정방향 | ATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGC | 서열번호 1 | 12S rRNA | 190 |
| 역방향 | CCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA | 서열번호 2 | |||
| 소2 | 정방향 | GCCAGAGTACTACTAGCAACTGGTTA | 서열번호 3 | 12S rRNA | 280 |
| 역방향 | TTTCATAATAACTTTCGTGCTTGG | 서열번호 4 | |||
| 면양 | 정방향 | CACCCTCCTCAAGTAAATATGATAT | 서열번호 5 | 12S rRNA -16S rRNA |
219 |
| 역방향 | TATTTAAACTGGAGAGTGGGAGA | 서열번호 6 | |||
| 산양 | 정방향 | AATACGAAAGCCATTATGAAATTAATG | 서열번호 7 | 12S rRNA -16S rRNA |
350 |
| 역방향 | GGTAAATGTTTTGTTTTAGACTGTTTT | 서열번호 8 | |||
| 말 | 정방향 | AAGAACAAGAACTTTAACCCGG | 서열번호 9 | 12S rRNA -16S rRNA |
467 |
| 역방향 | TTTGCTGTTTAGTACTTTTAATGCA | 서열번호 10 | |||
| 개 | 정방향 | CCTGCCCGGTGACACTTG | 서열번호 11 | 16S rRNA | 241 |
| 역방향 | TGCCTTGTAGGTATCTAGTATCCATAAG | 서열번호 12 | |||
| 돼지1 | 정방향 | GAACAATAGTAAGCACAATCATAGCA | 서열번호 13 | 12S rRNA | 119 |
| 역방향 | ATAAAAACTTTCGTGTGGTGGATATT | 서열번호 14 | |||
| 돼지2 | 정방향 | AACAATAGTAAGCACAATCATAGCA | 서열번호 15 | 12S rRNA | 193 |
| 역방향 | CTTTACGCCGTGGATCTATTAAT | 서열번호 16 | |||
| 돼지3 | 정방향 | TATCAAAATCTCATTTGTCAGGGAA | 서열번호 17 | Fibroblast growth factor 7 | 153 |
| 역방향 | ATGATACACTGTTATGCAGTATACTTTCA | 서열번호 18 | |||
| 닭1 | 정방향 | TGAGCTCAATAGCCCCTCG | 서열번호 19 | 12S rRNA | 171 |
| 역방향 | CGTCTTAAAGTGAGCTTAGGGGG | 서열번호 20 | |||
| 닭2 | 정방향 | CAACAGTGAGCTCAATAGCCACTC | 서열번호 21 | 12S rRNA | 175 |
| 역방향 | CGTCTTAAAGTGAGCTTAGGG | 서열번호 22 | |||
| 오리 | 정방향 | GTCAAGGTATAGCCTATCGGAC | 서열번호 23 | 12S rRNA | 229 |
| 역방향 | CGACTTACCTCATCTTTGGCA | 서열번호 24 | |||
| 거위1 | 정방향 | GACTTAGTTATAGCAACAGCCTAACTTC | 서열번호 25 | 12S rRNA | 111 |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGTGTCAATA | 서열번호 26 | |||
| 거위2 | 정방향 | ACGGAAAGAAGCGTGTATCCAC | 서열번호 27 | 12S rRNA | 166 |
| 역방향 | CTTACCTCATCTTCAGCGTAATAAT | 서열번호 28 | |||
| 칠면조 | 정방향 | AACGCATCAAAGTACTAATAGTAATTT | 서열번호 29 | 16S rRNA | 268 |
| 역방향 | CTTTCGTACTAGGAGGAGTTCTTA | 서열번호 30 | |||
| IPC | 정방향 | CGGTCTGAACTCAGATCACGTA | 서열번호 31 | 18S rRNA | 152?3 |
| 역방향 | CTAGGGATAACAGCGCAATC | 서열번호 32 |
본 발명에 의하면, 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조 검체로부터 DNA 를 수득하는 방법은 당업계에 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)에 개시된 바에 따라 제조할 수 있으나, 본 발명이 이에 국한 되는 것은 아니다.
한편, 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조 검체는 축산물의 지육이 식품으로 사용되는 모든 종일 수 있으며, 그 예로는 소(Bos taurus), 면양(Ovis aries), 산양(Capra hircus), 말(Equus caballus), 개(Canis familiaris), 돼지(Sus scrofa domestica), 닭(Gallus gallus), 오리(Anas platyrhynchos; Cairina muschata), 거위(Anser anser), 칠면조(Meleagris gallipavo)일 수 있으며, 이들 축종으로부터 DNA 를 얻기 위한 축종 검체는 축종의 세포, 조직, 기관 또는 신체 일부일 수 있으며, 예를 들면 지육, 혈액, 털 등 축종의 DNA 를 소량이라도 포함하고 있는 부위라면 어떠한 부분일 수도 있으며, 바람직하기로는 지육일 수 있다. 이로부터 얻은 DNA 는 단일 PCR, 다중 PCR 또는 실시간 PCR 등의 모든 PCR 을 수행함에 있어서 주형 DNA 로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물은 PCR 반응액에 포함시켜 PCR 반응을 수행하는데 사용될 수 있으며, PCR 반응은 95℃에서의 변성(denaturation) 단계, 57℃에서의 혼성화(annealing) 단계 및 72℃에서의 중합단계의 사이클을 반복하여 수행할 수 있다. PCR 반응이 완료되면 전기영동을 통하여 PCR 증폭산물의 분자크기를 확인하여 PCR 증폭여부를 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물은 상기 (a) 내지 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머 세트만을 포함할 경우, 미지의 축종이 선택된 프라이머 세트가 특이적으로 증폭시키는 축종에 해당하는지를 판별하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물은 상기 (a) 내지 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하되, 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 축종으로부터 수득되는 DNA를 증폭할 수 있고, PCR 증폭산물의 크기가 축종별로 서로 상이하도록 선택된 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
예를 들면, 어떠한 축종인지 알지 못하는 미지의 검체에 대해서 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 축종으로부터 수득되는 DNA를 증폭할 수 있도록 상기 (a) 내지 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물을 제조하여 PCR 반응액에 포함시켜 미지의 검체로부터 얻은 DNA 를 주쇄로 하여 PCR 반응을 수행하면, 미지의 검체가 선택된 프라이머 세트가 특이적으로 증폭시키는 축종에 해당하는지 혹은 2종 이상의 축종이 혼합된 상태인지를 한번의 PCR 을 통해 확인할 수 있다.
이 경우, 본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물은 PCR 증폭산물의 크기가 축종별로 서로 상이하도록 선택된 프라이머 세트를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면 거위1 프라이머 세트와 돼지1 프라이머 세트는 PCR 증폭산물의 크기가 거의 유사하기 때문에, 거위1 프라이머 대신에 거위2 프라이머 세트로 대신하거나 돼지1 프라이머 세트를 돼지2 또는 돼지3 프라이머 세트로 대신함으로써 두 축종에 대한 PCR 반응산물의 크기를 달리함으로써 한번의 PCR을 통해 축종의 구별이 가능하다.
본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물은 PCR 증폭반응이 정상적으로 수행되었는지 확인하기 위해서, 대조군으로서 서열번호 31 및 32의 염기서열을 갖는 진핵세포 검출용 프라이머 세트를 내재성 유전자용(Internal positive control; IPC) 프라이머로서 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물을 포함하는 축종 감별용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 상기 프라이머 세트를 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징될 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 PCR 반응에 필요로 하는 성분들을 상기 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물에 포함시키거나 별도의 용기에 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 Taq 중합효소(Taq polymerase), MgCl2 등의 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당 업계에 공지된 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 식품으로 사용되는 축종의 진위여부 및/또는 식품 내에 표시사항 이외의 다른 축종의 혼입 여부를 정확하고 간단하게 확인할 수 있다.
본 발명에 따르면, 다중 PCR에서 소와 닭 유전자의 검출 최소 농도는 100 fg/uL이며, 돼지와 오리 유전자의 검출 최소 농도는 1.0 pg/uL이다.
또한, 본 발명은 (i) 축종 검체로부터 DNA를 수득하는 단계; (ii) 수득된 DNA를 주쇄로 하고, 본 발명에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물을 이용하여 PCR 증폭산물을 수득하는 단계; (iii) 상기 수득된 PCR 증폭산물을 전기영동하여 증폭산물의 크기를 확인하여 검체의 축종을 감별하는 단계를 포함하는 축종 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 축종 감별 방법은 축산물을 재료로 제조된 식품에 가열처리되었거나, 축산물 원재료 상태로 혼합된 가공제품에서도 제품에 표시된 축종 이외에 다른 축종의 혼재 여부를 확인하는데 이용될 수도 있다.
한편, 본 발명은 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조 검체로부터 수득되는 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트와, 상기 프라이머 세트에 의한 PCR 증폭산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 인터켈레이터를 포함하여, 실시간 PCR 증폭을 통해 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 축종을 감별하는데 사용되는 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 (i) 내지 (ix) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물을 제공한다:
(i) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 33 및 35의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(ii) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 34 및 35의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(iii) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 37 및 39의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(iv) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 38 및 39의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(v) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 41 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(vi) 닭의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 43 및 44의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(vii) 오리의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 45 및 46의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(viii) 거위의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(ix) 칠면조의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 47 및 48의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트.
본 발명에 따른 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물은 상기 (i) 내지 (ix) 로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 세트를 포함할 경우, 미지의 축종이 선택된 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭시키는 축종에 해당하는지를 판별하는데 사용될 수 있다.
상기 (i) 내지 (ix) 로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 세트에 의한 PCR 증폭산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브는 PCR 증폭산물의 서열에 상보적으로 결합하는 능력과, PCR 중합반응시의 혼성화(annealing) 온도를 고려하여 적절한 서열로 설계될 수 있다.
이러한 프로브 서열의 예로서, 상기 프라이머 세트가 (i) 또는 (ii) 인 경우 프로브는 서열번호 36 의 염기서열을 가지며; 상기 프라이머 세트가 (iii) 또는 (iv)인 경우 프로브는 서열번호 40 의 염기서열을 가지며; 상기 프라이머 세트가 (v)인 경우 프로브는 서열번호 42의 염기서열을 가지며; 상기 프라이머 세트가 (vi), (vii), (viii) 또는 (ix) 인 경우 프로브는 서열번호 49의 염기서열을 가질 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시간 PCR 에 사용되는 프라이머 세트 및 프로브의 염기서열은 예를 들면 하기와 같다:
| 축종 | 명칭 | 서열(5'→3') | 서열번호 | 증폭산물의 크기(bp) |
| R-소1 | 정방향1 | CACGAAAGTTATTATGAAACCAATAA | 서열번호 33 | 166bp |
| 역방향1 | CCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA | 서열번호 35 | ||
| 프로브1 | CACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCT | 서열번호 36 | ||
| R-소2 | 정방향2 | CATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGC | 서열번호 34 | 191bp |
| 역방향1 | CCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA | 서열번호 35 | ||
| 프로브1 | CACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCT | 서열번호 36 | ||
| R-소3 | 정방향3 | TCGCTCGGAGGATTTTTTATT | 서열번호 37 | 116bp |
| 역방향2 | GCTTTAACTAACCAACCCAAAGAG | 서열번호 39 | ||
| 프로브2 | CCCAACCGAAACTACCAACTCATGGAGATT | 서열번호 40 | ||
| R-소4 | 정방향4 | TTTGGATCAATGAGCGATAGAG | 서열번호 38 | 168bp |
| 역방향2 | GCTTTAACTAACCAACCCAAAGAG | 서열번호 39 | ||
| 프로브2 | CCCAACCGAAACTACCAACTCATGGAGATT | 서열번호 40 | ||
| R-돼지 | 정방향 | GGAACAATAGTAAGCACAATCATAGCA | 서열번호 41 | 121bp |
| 역방향 | ATAAAAACTTTCGTGTGGTGGATATT | 서열번호 14 | ||
| 프로브 | AGGTCAAGGTGTAGCTTATGGGTTGGA | 서열번호 42 | ||
| R-닭 | 정방향 | GACTTAGCCATAGCAACCCAG | 서열번호 43 | 95bp |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGGGTA | 서열번호 44 | ||
| 프로브 | TGCCAGCCACCGCGGTCAT | 서열번호 49 | ||
| R-거위1 | 정방향 | GACTTAGTTATAGCAACAGCCTAACTTC | 서열번호 25 | 111bp |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGTGTCAATA | 서열번호 26 | ||
| 프로브 | TGCCAGCCACCGCGGTCAT | 서열번호 49 | ||
| R-오리 | 정방향 | TAGCAAGCCTCCACCCAA | 서열번호 45 | 97bp |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGCTTGT | 서열번호 46 | ||
| 프로브 | TGCCAGCCACCGCGGTCAT | 서열번호 49 | ||
| R-칠면조 | 정방향 | AACTTGACTTAGCCATAGCAACTTTA | 서열번호 47 | 201bp |
| 역방향 | CGTTAAGTTAAGATCATTTTTTAGGCT | 서열번호 48 | ||
| 프로브 | TGCCAGCCACCGCGGTCAT | 서열번호 49 | ||
| R-IPC | 정방향 | CGGTCTGAACTCAGATCACGTA | 서열번호 31 | |
| 역방향 | CTAGGGATAACAGCGCAATC | 서열번호 32 | ||
| 프로브 | TGATCCAACATCGAGGTCGTAAACC | 서열번호 50 |
본 발명에 따른 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물 중에 포함되는 프로브는 실시간 PCR 반응과정 중에서 증폭산물의 검출이 가능하도록 검출 수단이 프로브에 연결, 결합 또는 부착 등의 통상적인 방식으로 표지되어, 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인 가능하도록 할 수 있다.
예를 들면, 통상적으로 사용되는 형광표지 인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등으로 표지될 수 있으나, 본 발명이 이로 한정되는 것은 아니다. 형광표지 인자로 표지되는 것이 바람직하다.
형광표지 인자는 현재 시중에 다수가 시판되고 있으며 용이하게 입수가능하다. 예를 들면 형광표지 인자로서 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, Cy5, RED 610, RED670 등이 프로브의 5'-말단에 표지될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 프로브의 3'-말단은 PCR 증폭반응이 일어날 경우에만 발광이 일어나도록 하기 위해서 PCR 증폭산물에 결합하기 이전에는 발광이 억제되도록 5'-말단에 표지된 형광표지 인자의 발광을 억제하는 퀀쳐(quencher)에 의해 표지되어 있는 것이 바람직하다.
형광표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응액에 형광표지 인자를 2개 이상 사용할 경우 실시간 PCR 기기가 별개로 검출가능한 수단을 가지고 있는지를 판단하여 사용해야만 한다. 상기 형광표지 인자에 대한 사용방법 등의 구체적인 사항 및 선택은 당업자들에게 자명할 것이다.
예를 들어 여기 및 방사 파장이 서로 상이한 형광표지 인자로 표지된 2종 이상의 프로브가 축종별 PCR증폭산물에 각각 혼성화하도록 선택될 경우, 미지의 축종을 감별하기 위해서 각각 별도의 실시간 PCR 반응액을 제조할 필요 없이 하나의 실시간 PCR 반응액을 통해서 실시간 PCR을 수행함으로써 축종 감별을 보다 신속하고 정확하게 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 PCR에서 증폭산물의 실시간 증폭을 확인하기 위해서 여러 방법들을 사용할 수 있으며, 예를 들면 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 사용될 수 있다.
인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 인터켈레이터 (interchelator: SYBR Green I, EtBr 등)를 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터(interchelator)가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발광하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
TaqMan™ 프로브법은 5'-말단을 형광표지 인자로 3'말단을 퀀쳐(quencher; 예: TAMRA 등)로 표지한 올리고뉴클레오티드(TaqMan™ probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqMan™ 프로브가 혼성화 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발광이 억제되고, 중합 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발광하게 된다.
분자 비콘 방법은 양 말단을 형광표지 인자(예: FAM, TAMRA 등)과 quencher(예: DABCYL등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광표지 인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 혼성화 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광표지 인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
본 발명에 따르면, 반응 효율, 시간, 형광표지 인자 타입 등을 적절히 고려하여, 위에 열거된 방법 중 적절한 실시간 PCR 증폭확인방법을 선택할 수 있다. 본 발명에서는 TaqMan™ 프로브 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 PCR 방법은 통상적인 실시간 PCR 방법에 따라 수행될 수 있으며, 일예로 Uracil-DNA glycosylase(UDG) 활성을 위하여 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 15초), 혼성화(annealing, 55℃ 또는 60℃에서 60초)을 실시하는 조건을 취할 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법으로 특이적인 증폭산물을 비특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 ABI 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광표지 인자를 감지하여 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
실시간 PCR 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
본 발명은 상기한 본 발명에 따른 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 본 발명의 실시간 PCR 프라이머 조성물 이외에 실시간 PCR 반응에 필요로 하는 성분들을 상기 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물에 포함시키거나 별도의 용기에 제공할 수 있으며, 이러한 성분들은 당업계에 통상적으로 알려져 있으며, 예를 들면 dNTP, PCR 완충제, KCl, DNA 중합효소 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 축종 감별용 실시간 PCR 키트는 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 축종에 대하여 실시간 PCR을 통해 축종 감별이 가능하도록 하는 각각의 축종에 대한 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물을 포함할 수 있다. 각각의 실시간 PCR 프라이머 조성물을 이용하여 각각의 실시간 PCR 반응액을 제조한 다음 실시간 PCR 기기에서 각각의 반응액을 넣고 동시에 PCR 반응을 수행함으로써 동일한 형광표지 인자로 표지된 프로브를 이용할 수 있다.
이때, 실시간 PCR 증폭 확인을 위한 대조군으로서 서열번호 31 및 32의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 진핵세포 검출용 프라이머 세트와, 이 프라이머 세트에 의한 PCR 증폭산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브로서 서열번호 50의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 실시간 PCR 프라이머 조성물을 추가로 더 포함할 수 있다.
이 경우, 서열번호 50의 프로브가 축종 감별을 위한 프로브와 여기 및 발광 파장이 다른 형광표지 인자를 사용한 경우에는 동일한 실시간 PCR 반응액에 대조군 프라이머 세트와 프로브를 넣고 실시간 PCR 반응을 수행할 수 있고, 동일한 형광표지 인자로 표지된 프로브라면 별도의 실시간 PCR 반응액에 제조하여 실시간 PCR 을 동시에 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 상기 프라이머 세트 및/또는 프로브를 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징될 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 PCR 반응에 필요로 하는 성분들을 상기 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물에 포함시키거나 별도의 용기에 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl2 등의 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당 업계에 공지된 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 식품으로 사용되는 축종의 진위여부 및/또는 식품내에 표시사항 이외의 다른 축종의 혼입 여부를 정확하고 간단하게 확인할 수 있다.
본 발명에 따르면, 실시간 PCR 에서 소, 돼지 닭 유전자의 검출 최소 농도는 1.0 pg/uL이며, 오리 유전자의 최소 검출 농도는 0.1 pg/uL이다.
또한, 미지의 시료가 2개 이상의 축종이 혼합되어 있을 경우 형광강도의 기준선 (baseline)을 설정하고 이 기준선에 도달하는 PCR 사이클 수를 측정함으로써 축종의 혼합비율을 또한 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 단일 PCR 및/또는 다중 PCR 및/또는 실시간 PCR을 이용한 10개 축종의 구별 방법은 식육을 재료로 사용된 식품에서 원료 축종을 확인할 수 있는 축종감별법으로 도입가능하며, 채식주의자나 이슬람교 등 육류를 금지하는 종교적 이유, 육류 알레기환자의 건강보호 및 소시지, 햄류와 같은 제품의 품질을 확보할 수 있을 뿐만 아니라 저가의 지육 혼합을 방지함으로써 소비자에게 올바른 정보를 제공하고 식품의 신뢰성과 안전성 확보할 수 있다.
또한, 본 발명의 10개 축종 단일 또는 다중 검출 세트, 및 이를 이용한 10개 축종 단일 또는 다중 구별 방법에 의해, 기존의 축종감별법의 정확도, 시간 및 비용을 현저하게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 전기영동 또는 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.
도 1는 실시간 PCR을 위한 조류 4종(닭, 오리, 거위, 칠면조) 확인을 위한 프라이머와 TaqMan를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2은 단일 PCR, 다중 PCR, 실시간 PCR을 위한 IPC 프라이머 및 TapMan 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3a, 도3b는 소 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 면양 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 산양 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 말 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 개 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8b는 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 돼지 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 닭 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 닭 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 오리 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 거위 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11b는 거위 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 칠면조 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 소, 돼지, 닭, 오리 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 다중 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 조류 4종(닭, 오리, 거위, 칠면조) 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 다중 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 본 발명의 R-소1 또는 R-소2 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 15b는 본 발명의 R-소3 또는 R-소4 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 15c는 본 발명의 R-소1 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 검출 세트를 이용하여 모든 축종의 DNA에 대해서 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 17 내지 도 21은 본 발명의 R-닭, R-오리, R-거위1, R-칠면조 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 23는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 24는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 25는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 26는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 27는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 28는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 29는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에서 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 30는 본 발명의 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 31는 본 발명의 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 33는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 R-닭 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 37는 본 발명의 R-닭 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에서 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 2은 단일 PCR, 다중 PCR, 실시간 PCR을 위한 IPC 프라이머 및 TapMan 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3a, 도3b는 소 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 면양 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 산양 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 말 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 개 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8b는 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 돼지 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 닭 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 닭 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 오리 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 거위 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11b는 거위 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 칠면조 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 단일 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 소, 돼지, 닭, 오리 프라이머와 IPC 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 다중 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 조류 4종(닭, 오리, 거위, 칠면조) 프라이머를 이용한 11개 축종에 대한 다중 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 본 발명의 R-소1 또는 R-소2 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 15b는 본 발명의 R-소3 또는 R-소4 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 15c는 본 발명의 R-소1 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 검출 세트를 이용하여 모든 축종의 DNA에 대해서 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 17 내지 도 21은 본 발명의 R-닭, R-오리, R-거위1, R-칠면조 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 검출 세트를 이용한 실시간 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 23는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 24는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 25는 돼지와 소프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 26는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 27는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 28는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 29는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에서 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 30는 본 발명의 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 31는 본 발명의 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 33는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 R-닭 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 37는 본 발명의 R-닭 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에서 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 기술적 사상을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험재료 및 genomic DNA 추출
하기 실시예에서 각 축종의 genomic DNA 는 특별한 언급이 없는 한 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)에 개시된 방법에 따라 분리하였으며, 사용된 검사재료는 소고기, 면양 혈액, 산양 혈액, 말 분변, 돼지 혈액, 개 혈액, 고양이 혈액, 닭 혈액, 오리 혈액, 거위 혈액, 칠면조 혈액으로부터 각 축종에 해당하는 genomic DNA를 분리하였다.
Genomic DNA 농도 측정
하기 실시예에서 각 축종으로부터 분리된 genomic DNA 의 농도는 훼스트 다이-기초 프로토콜에 따라 추출된 DNA를 NanoDrop™ ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 260:280nm에서 정량한 것이며. 멸균된 3차 증류수로 분리된 genomic DNA 용액을 한 후 10-100 ng/㎕ 농도로 정량하여 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
[실시예 1] PCR 프라이머 설계
상기 10개 축종의 Genbank database에서 제공된 mt DNA의 12S rRNA과 16S rRNA 유전자의 염기서열을 도 1에서 보는 바와 같이 정렬하여 비교분석한 후, 각 축종에 사용할 축종감별용 프라이머를 설계하였고, 각 축종에 대해 특이적으로 PCR 증폭산물을 생성하기 위한 프라이머 염기서열은 하기 표 1에서 보는 바와 같다.
한편, 돼지 축종 감별용 PCR 프라이머는 Genbank database에서 제공하는 섬유아세포성장인자7(Fibroblast growth factor 7) 유전자를 분석하여 설계하였고, 하기 표 1에서 그 프라이머 염기서열은 하기 표 1에서 보는 바와 같다.
또한, 추출한 DNA를 주형으로 목적하는 유전자가 증폭되는 것을 확인하기 위하여, 18S rRNA 유전자의 염기서열 비교하여 상기 10개 축종에 공통으로 동일한 PCR 증폭산물을 생성하는 내재성 유전자용(Internal positive control; IPC) 프라이머를 설계하고, 이를 축종감별 검사로서 단일 PCR, 다중 PCR 및 실시간 PCR 을 수행할 때 대조군용 PCR 프라이머로 사용하였다. 해당 서열을 갖는 프라이머들은 Bioneer 社에 의뢰하여 제작한 것을 사용하였다.
| 축종 | 명칭 | 서열(5'→3') | 유전자부위 | 증폭산물의 크기 (bp) |
| 소1 | 정방향 | ATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGC | 12S rRNA | 190 |
| 역방향 | CCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA | |||
| 소2 | 정방향 | GCCAGAGTACTACTAGCAACTGGTTA | 12S rRNA | 280 |
| 역방향 | TTTCATAATAACTTTCGTGCTTGG | |||
| 면양 | 정방향 | CACCCTCCTCAAGTAAATATGATAT | 12S rRNA -16S rRNA |
219 |
| 역방향 | TATTTAAACTGGAGAGTGGGAGA | |||
| 산양 | 정방향 | AATACGAAAGCCATTATGAAATTAATG | 12S rRNA -16S rRNA |
350 |
| 역방향 | GGTAAATGTTTTGTTTTAGACTGTTTT | |||
| 말 | 정방향 | AAGAACAAGAACTTTAACCCGG | 12S rRNA -16S rRNA |
467 |
| 역방향 | TTTGCTGTTTAGTACTTTTAATGCA | |||
| 개 | 정방향 | CCTGCCCGGTGACACTTG | 16S rRNA | 241 |
| 역방향 | TGCCTTGTAGGTATCTAGTATCCATAAG | |||
| 돼지1 | 정방향 | GAACAATAGTAAGCACAATCATAGCA | 12S rRNA | 119 |
| 역방향 | ATAAAAACTTTCGTGTGGTGGATATT | |||
| 돼지2 | 정방향 | AACAATAGTAAGCACAATCATAGCA | 12S rRNA | 193 |
| 역방향 | CTTTACGCCGTGGATCTATTAAT | |||
| 돼지3 | 정방향 | TATCAAAATCTCATTTGTCAGGGAA | Fibroblast growth factor 7 | 153 |
| 역방향 | ATGATACACTGTTATGCAGTATACTTTCA | |||
| 닭1 | 정방향 | TGAGCTCAATAGCCCCTCG | 12S rRNA | 171 |
| 역방향 | CGTCTTAAAGTGAGCTTAGGGGG | |||
| 닭2 | 정방향 | CAACAGTGAGCTCAATAGCCACTC | 12S rRNA | 175 |
| 역방향 | CGTCTTAAAGTGAGCTTAGGG | |||
| 오리 | 정방향 | GTCAAGGTATAGCCTATCGGAC | 12S rRNA | 229 |
| 역방향 | CGACTTACCTCATCTTTGGCA | |||
| 거위1 | 정방향 | GACTTAGTTATAGCAACAGCCTAACTTC | 12S rRNA | 111 |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGTGTCAATA | |||
| 거위2 | 정방향 | ACGGAAAGAAGCGTGTATCCAC | 12S rRNA | 166 |
| 역방향 | CTTACCTCATCTTCAGCGTAATAAT | |||
| 칠면조 | 정방향 | AACGCATCAAAGTACTAATAGTAATTT | 16S rRNA | 268 |
| 역방향 | CTTTCGTACTAGGAGGAGTTCTTA | |||
| IPC | 정방향 | CGGTCTGAACTCAGATCACGTA | 18S rRNA | 152?3 |
| 역방향 | CTAGGGATAACAGCGCAATC |
[실시예 2] PCR 에 의한 축종의 구별
상기 10개 축종의 검체로부터 genomic DNA를 각각 정제하였다.
주형 DNA 로서 정제된 genomic DNA 를 이용하여, 하기 표 2 내지 표 5 중 어느 하나의 PCR 반응용액을 제조하고, 하기 표 6의 반응 조건에 따라 PCR 증폭을 수행하였다.
| 축종 | 명칭 | 농도 | 함량 |
| 프라이머 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| IPC 프라이머 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 0.5㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 0.5㎕ | |
| DMSO | 0.4㎕ | ||
| 주형 DNA | 2㎕ | ||
| 증류수 | 14.6㎕ | ||
| 총량 | 20㎕ | ||
| Maxime PCR PreMix Kit i-StarTaq, iNtRON biotechnology, Korea | |||
상기 표 2에서 프라이머는 소1 프라이머 (서열번호 1 및 2), 소2 프라이머 (서열번호 3 및 4), 면양 프라이머 (서열번호 5 및 6), 산양 프라이머 (서열번호 7 및 8), 말 프라이머 (서열번호 9 및 10), 개 프라이머 (서열번호 11 및 12), 돼지1 프라이머 (서열번호 13 및 14), 돼지2 프라이머(서열번호 15 및 16), 닭1 프라이머 (서열번호 19 및 20), 오리 프라이머 (서열번호 23 및 24) 및 거위 1 프라이머 (서열번호 25 및 26) 중에서 선택된 하나이다.
| 축종 | 명칭 | 농도 | 함량 |
| 프라이머 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| DMSO | 0.4㎕ | ||
| 주형 DNA | 2㎕ | ||
| 증류수 | 15.6㎕ | ||
| 총량 | 20㎕ | ||
| Maxime PCR PreMix Kit i-StarTaq, iNtRON biotechnology, Korea | |||
표 3에서 프라이머는 돼지3 프라이머(서열번호 17 및 18), 닭2 프라이머 (서열번호 21 및 22), 거위2 프라이머 (서열번호 27 및 28) 및 칠면조 프라이머 (서열번호 29 및 30) 중에서 선택된 하나이다.
| 축종 | 명칭 | 농도 | 함량 |
| 소1 프라이머 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| 돼지1 프라이머 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| 닭1 프라이머 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| 오리 프라이머 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| IPC 프라이머 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 0.5㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 0.5㎕ | |
| DMSO | 0.4㎕ | ||
| 주형 DNA | 2㎕ | ||
| 증류수 | 8.6㎕ | ||
| 총량 | 20㎕ | ||
| Maxime PCR PreMix Kit i-StarTaq, iNtRON biotechnology, Korea | |||
| 축종 | 명칭 | 농도 | 함량 |
| 닭1 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| 오리 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| 거위1 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| 칠면조 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 1㎕ | |
| DMSO | 0.4㎕ | ||
| 주형 DNA | 2㎕ | ||
| 증류수 | 9.6㎕ | ||
| 총량 | 20㎕ | ||
| Maxime PCR PreMix Kit i-StarTaq, iNtRON biotechnology, Korea | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 |
| 95℃ | 5분 | 1회 |
| 95℃ | 30초 | 35회 |
| 57℃ | 35초 | |
| 72℃ | 35초 | |
| 72℃ | 5분 | 1회 |
PCR 종류 후, 증폭된 유전자 부위를 확인하기 위하여 QIAxcel system (Qiagen, USA)장비로 QIAxcel DNA High Resolution kit를 사용하여 전기영동하였고, 제조사에서 공급한 Bio Cal-culator 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 분자 크기 마커로는 50-800bp 또는 pUC18/HaeIII DNA 래더(Qiagen, 미국)를 사용하였고, 내부 정렬 마커로는 C1 (15bp)과 C2 (1,000bp)을 사용하였다.
그 결과를 도 3 내지 도 14에 나타내었다.
도 3 내지 도 14에서 각 도면의 레인 M은 50-800bp DNA 래더 또는 pUC18/HaeIII 이고, 레인 1은 소의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 2는 면양의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 3은 산양의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 4는 말의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 5는 개의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 6은 고양이의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 7은 돼지의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 8은 닭의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 9는 오리의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 10은 거위의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이고, 레인 11은 칠면조의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용한 PCR 반응결과이다.
도 3 내지 도 12에서 각 도면의 레인 12는 증류수이다.
도 13 내지 도 14에서 각 도면의 레인 13은 증류수이다.
도 13에서 레인 12는 소, 돼지, 닭 및 오리의 genomic DNA 혼합물을 주형 DNA로 이용하여 PCR 반응결과이다.
도 14에서 레인 12는 닭, 오리, 거위 및 칠면조의 genomic DNA 혼합물을 주형 DNA로 이용하여 PCR 반응결과이다.
도 3a 는 소1 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 3b 는 소2 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 4 는 면양 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 5 는 산양 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 6 은 말 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 7 는 개 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 8a 는 돼지1 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 8b 는 돼지2 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 8c 는 돼지3 프라이머를 이용하여 표 3의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 9a 는 닭1 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 9b 는 닭2 프라이머를 이용하여 표 3의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 10 는 오리 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 11a 는 거위1 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 표 2의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 11b 는 거위2 프라이머를 이용하여 표 3의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 12 는 칠면조 프라이머를 이용하여 표 3의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 13 은 표 4의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
도 14 는 표 5의 PCR 반용용액을 사용한 PCR 결과이다.
각 축종별 프라이머 세트로 증폭한 결과, 도 3 내지 도 14에서 보는 바와 같이, 소1 프라이머는 축종 특이적으로 190bp의 증폭산물을, 소2 프라이머는 축종 특이적으로는 280bp의 증폭산물을, 면양 프라이머는 축종 특이적으로 219bp의 증폭산물을, 산양 프라이머는 축종 특이적으로 350bp의 증폭산물을, 말 프라이머는 축종 특이적으로 467bp의 증폭산물을, 개 프라이머는 축종 특이적으로 241bp의 증폭산물을, 돼지1 프라이머는 축종 특이적으로 119bp의 증폭산물을, 돼지 2 프라이머는 축종 특이적으로 193bp의 증폭산물을, 돼지 3 프라이머는 축종 특이적으로 153bp의 증폭산물을, 닭1 프라이머는 축종 특이적으로 171bp의 증폭산물을, 닭2 프라이머는 축종 특이적으로 175bp의 증폭산물을, 오리 프라이머는 축종 특이적으로 229bp의 증폭산물을, 거위1 프라이머는 축종 특이적으로 111bp의 증폭산물을, 거위2 프라이머는 축종 특이적으로 166bp의 증폭산물을, 칠면조 프라이머는 축종 특이적으로 268bp의 증폭산물을, 그리고 IPC 프라이머는 11개 축종 모두에서 152-3bp의 증폭산물을 생성시켰다. 또한, 도 13에서 보는 바와 같이, 레인 12 의 결과는 소, 돼지, 닭 및 오리의 DNA가 모두 증폭되었음을 보여준다. 도 14에서 보는 바와 같이, 레인 12는 닭, 오리, 거위, 칠면조의 DNA가 모두 증폭되었음을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 축종 감별용 프라이머는 해당 축종에 대해서 특이적으로 DNA 를 증폭시킴을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] 실시간 PCR용 프라이머 및 프로브 설계
Genbank database에서 제공된 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조 mt DNA의 12S rRNA 유전자 염기서열을 비교분석하여 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조의 실시간 PCR용 프라이머의 염기서열을 표 7에서는 바와 같이 설계하였다. 그에 특이적으로 결합하는 프로브 서열을 설계하였다.
거위 및 내재성 유전자용(Internal positive control; IPC) 프라이머, 즉 R-거위 및 R-IPC 용 프라이머는 각각 표 1의 거위1 프라이머 및 IPC 프라이머와 서열이 동일하다.
| 축종 | 명칭 | 서열(5'→3') | 증폭산물의 크기(bp) |
| R-소1 | 정방향1 | CACGAAAGTTATTATGAAACCAATAA | 166bp |
| 역방향1 | CCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA | ||
| 프로브1 | FAM-CACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCT-BHQ1 | ||
| R-소2 | 정방향2 | CATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGC | 191bp |
| 역방향1 | CCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA | ||
| 프로브1 | FAM-CACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCT-BHQ1 | ||
| R-소3 | 정방향3 | TCGCTCGGAGGATTTTTTATT | 116bp |
| 역방향2 | GCTTTAACTAACCAACCCAAAGAG | ||
| 프로브2 | FAM-CCCAACCGAAACTACCAACTCATGGAGATT-BHQ1 | ||
| R-소4 | 정방향4 | TTTGGATCAATGAGCGATAGAG | 168bp |
| 역방향2 | GCTTTAACTAACCAACCCAAAGAG | ||
| 프로브2 | FAM-CCCAACCGAAACTACCAACTCATGGAGATT-BHQ1 | ||
| R-돼지 | 정방향 | GGAACAATAGTAAGCACAATCATAGCA | 121bp |
| 역방향 | ATAAAAACTTTCGTGTGGTGGATATT | ||
| 프로브 | FAM-AGGTCAAGGTGTAGCTTATGGGTTGGA-BHQ1 | ||
| R-닭 | 정방향 | GACTTAGCCATAGCAACCCAG | 95bp |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGGGTA | ||
| 프로브 | FAM-TGCCAGCCACCGCGGTCAT-BHQ1 | ||
| R-거위1 | 정방향 | GACTTAGTTATAGCAACAGCCTAACTTC | 111bp |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGTGTCAATA | ||
| 프로브 | FAM-TGCCAGCCACCGCGGTCAT-BHQ1 | ||
| R-오리 | 정방향 | TAGCAAGCCTCCACCCAA | 97bp |
| 역방향 | CACTCTTTACGCCGCTTGT | ||
| 프로브 | FAM-TGCCAGCCACCGCGGTCAT-BHQ1 | ||
| R-칠면조 | 정방향 | AACTTGACTTAGCCATAGCAACTTTA | 201bp |
| 역방향 | CGTTAAGTTAAGATCATTTTTTAGGCT | ||
| 프로브 | FAM-TGCCAGCCACCGCGGTCAT-BHQ1 | ||
| R-IPC | 정방향 | CGGTCTGAACTCAGATCACGTA | |
| 역방향 | CTAGGGATAACAGCGCAATC | ||
| 프로브 | JOE-TGATCCAACATCGAGGTCGTAAACC-BHQ1 |
[실시예 4] 실시간 PCR를 이용한 축종의 구별
상기 6개 축종의 검체로부터 genomic DNA를 각각 정제하였다.
추출한 각 DNA 축종 검체마다 R-소1, R-소2, R-소3, R-소4, R-돼지, R-닭, R-오리, R-거위1, R-칠면조 프라이머 및 프로브, 및 R-IPC 프라이머 및 프로브를 함유한 실시간 PCR 반응용액과, 주형 DNA 없이 증류수만을 넣은 대조군 실시간 PCR 반응용액을 각각 제조하였다. R-소1, R-소2, R-소3, R-소4 및 R-돼지 프라이머 및 프로브의 실시간 PCR 반응용액은 하기 표 8 의 조성으로, R-닭, R-오리, R-거위1, R-칠면조 프라이머 및 프로브의 경우 표 9의 조성으로 제조하였다.
각 실시간 PCR 반응용액에 대해서 하기 표10의 조건으로 실시간 PCR 을 수행하였다.
| 축종 | 명칭 | 농도 | 함량 |
| 소 또는 돼지 프라이머 및 프로브 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 0.6㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 0.6㎕ | |
| 프로브 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ | |
| IPC 프라이머 및 프로브 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ | |
| 프로브 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ | |
| 2×마스터 믹스 | 10㎕ | ||
| 주형 DNA | 1㎕ | ||
| 증류수 | 6.2㎕ | ||
| 총량 | 20㎕ | ||
| Taqman Gene Expression master kit(2X, Applied biosystems) | |||
| 축종 | 명칭 | 농도 | 함량 |
| 닭 또는 오리 또는 거위 또는 칠면조 프라이머 및 프로브 | 정방향 | 10 pmol/㎕ | 0.6㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 0.6㎕ | |
| 조류 프로브 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ | |
| IPC 프라이머 및 프로브 |
정방향 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ |
| 역방향 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ | |
| 프로브 | 10 pmol/㎕ | 0.4㎕ | |
| 2×마스터 믹스 | 10㎕ | ||
| 주형 DNA | 1㎕ | ||
| 증류수 | 6.2㎕ | ||
| 총량 | 20㎕ | ||
| Taqman Gene Expression master kit(2X, Applied biosystems) | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 |
| 50℃ | 2분 | 1회 |
| 95℃ | 10분 | 1회 |
| 95℃ | 15초 | 40회 |
| 55℃ | 60초 |
그 결과는 도 15 내지 도 21에서 보는 바와 같다.
도 15a 는 주형 DNA로는 소를 사용한 것으로 R-소1, R-소2 프라이머 및 프로브가 축종 특이적으로 실시간 PCR에서 증폭됨을 확인할 수 있었다.
도 15b는 주형 DNA로는 소를 사용한 것으로 R-소3, R-소4 프라이머 및 프로브가 축종 특이적으로 실시간 PCR에서 증폭됨을 확인할 수 있었다.
도 15c 및 도 16 내지 도 20은 소, 돼지, 닭, 오리, 거위, 칠면조의 DNA 를 주형 DNA 로 하여 각각 실시간 PCR 을 수행한 결과로서, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트가 축종 특이적으로 주형 DNA 를 증폭시킴을 확인할 수 있다.
도 15c는 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용한 소의 증폭 곡선을 확인, 도 16는 돼지의 증폭 곡선을 확인, 도 17는 닭의 증폭 곡선을 확인, 도 18는 오리의 증폭 곡선을 확인, 도 19는 거위의 증폭 곡선, 도 20는 칠면조의 증폭 곡선이다.
도 21은 11개 축종(소, 돼지, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 면양, 산양, 말, 개, 및 고양이)로부터 얻은 genomic DNA 를 주형 DNA로 사용한 것으로서, IPC용 프라이머와 프로브를 사용하여 소, 돼지, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 면양, 산양, 말, 개, 그리고 고양이에서 모두 증폭 곡선을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 다중 PCR를 이용한 혼합육에서 축종의 검출한계
소고기와 돼지고기의 혼합육, 및 닭고기와 돼지고기의 혼합육에 대한 검출한계 시험을 위해 검체를 가위로 세절하여 준비하였다. 육함량에 따른 검출한계를 확인하기 위하여 소고기와 닭고기 검체들을 각각 돼지고기 안에 0.1, 1, 2, 10 그리고 50% 함유되도록 각각 0.1 g씩 준비하였다. 생육 혼합육으로부터 genomic DNA를 각각 정제한 것과, 열처리에 따른 검출실험을 위한 각각의 검체들의 120℃에서 30분 동안 가열한 열처리육 검체로부터 genomic DNA를 각각 정제한 것을 준비하였다.
생육 혼합육으로부터 추출한 각 DNA 검체는 소, 돼지, 닭의 DNA 확인을 위해서 다중 PCR을 이용하여 표 4의 다중 PCR 반응 조성물을 준비한 다음 표 6의 PCR 반응조건으로 PCR을 실시하였다.
다중 PCR 종류 후, 증폭된 유전자 부위를 확인하기 위하여 QIAxcel system (Qiagen, USA)장비로 QIAxcel DNA High Resolution kit를 사용하여 전기영동하였다. 획득된 자료는 전기영동 제조사에서 공급한 Bio Calculator 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 분자 크기 마커로는 50-800bp DNA 래더(Qiagen, 미국)를 사용하였고, 내부 정렬 마커로는 C1 (15bp)과 C2 (1,000bp)을 사용하였다.
그 결과는 도 22 내지 도 29에서 보는 바와 같다.
도 22는 돼지와 소 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 23는 돼지와 소 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 24는 돼지와 소 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 25는 돼지와 소 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 26는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0 % 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 27는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 28는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 29는 닭과 돼지 프라이머와 IPC 프라이머를 이용하여 돼지고기에서 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 22 내지 도 23에서 각 도의 레인 M은 50-800bp DNA 래더이고, 레인 1은 소고기함량 0.1%이고, 레인 2는 소고기함량 1.0%이고, 레인 3은 소고기함량 2.0%이고, 레인 4는 소고기함량 10.0%이고, 레인 5는 소고기함량 50%이다.
도 24 내지 도 27에서 각 도의 레인 M은 50-800bp DNA 래더이고, 레인 1은 돼지고기함량 0.1%이고, 레인 2는 돼지고기함량 1.0%이고, 레인 3은 돼지고기함량 2.0%이고, 레인 4는 돼지고기함량 10.0%이고, 레인 5는 돼지고기함량 50%이다.
도 28 내지 도 29에서 각 도의 레인 M은 50-800bp DNA 래더이고, 레인 1은 닭고기함량 0.1%이고, 레인 2는 닭고기함량 1.0%이고, 레인 3은 닭고기함량 2.0%이고, 레인 4는 닭고기함량 10.0%이고, 레인 5는 닭고기함량 50%이다.
다중 PCR로 혼합육에서 소, 돼지, 닭의 검출한계를 실험한 결과 도 22 내지 도 23에서 돼지고기에 소고기가 0.1, 1, 2, 10 그리고 50% 함유된 분쇄 혼합육의 원료육과 열처리육에서 소고기의 검출한계는 0.1%였다. 도 24 내지 도 25에서 소고기에 돼지고기의 함량별 분쇄 혼합육의 원료육과 열처리육에서 돼지고기의 검출한계는 0.1%였다. 도 26 내지 도 27에서 닭고기에 돼지고기가 0.1, 1, 2, 10 그리고 50% 함유된 분쇄 혼합육의 비열처리육과 열처리육에서 돼지고기의 검출한계는 1.0%였다. 도 28 내지 도 29에서 돼지고기에 닭고기의 함량별 분쇄 혼합육에서 닭고기의 검출한계는 원료육과 열처리육에서 0.1%였다.
[실시예 6] 실시간 PCR를 이용한 혼합육에서 축종의 검출한계
소고기와 돼지고기의 혼합육, 및 닭고기와 돼지고기의 혼합육에 대한 검출한계 시험을 위해 검체를 가위로 세절하여 준비하였다. 육함량에 따른 검출한계를 확인하기 위하여 소고기와 닭고기 검체들을 각각 돼지고기 안에 0.1, 1, 2, 10 그리고 50% 함유되도록 각각 0.1 g씩 준비하였다. 생육 혼합육으로부터 genomic DNA를 각각 정제한 것과, 열처리에 따른 검출실험을 위한 각각의 검체들의 120℃에서 30분 동안 가열한 열처리육 검체로부터 genomic DNA를 각각 정제한 것을 준비하였다.
생육 혼합육으로부터 추출한 각 DNA 검체는 소, 돼지, 닭의 DNA 확인을 위해 실시간 PCR을 이용하여 표 8 및 표 9의 실시간 PCR 반응 조성물을 준비한 다음 표 10의 실시간 PCR 반응조건으로 PCR을 실시하였다.
실시간 PCR로 혼합육에 사용된 소, 돼지 그리고 닭의 특이적 구분은 증폭 곡선을 이용한 구분 방법을 사용하였다.
그 결과는 도 30 내지 도 37에서 보는 바와 같다.
도 30는 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 31는 R-소1 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 소고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 소고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 32는 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 33는 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 소고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 34는 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 35는 R-돼지 프라이머 및 프로브를 이용하여 닭고기에 돼지고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 돼지고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 R-닭 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 생육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 37는 본 발명의 R-닭 프라이머 및 프로브를 이용하여 돼지고기에서 닭고기의 함량을 0.1%에서부터 50.0% 함유되도록 하여 열처리육에서 닭고기의 검출한계 실험결과를 나타낸 것이다.
도 30 내지 도 31에서 각 도의 레인 1은 소고기함량 50.0%이고, 레인 2는 소고기함량 10.0%이고, 레인 3은 소고기함량 2.0%이고, 레인 4는 소고기함량 1.0%이고, 레인 5는 소고기함량 0.1%이고, 레인 6은 소고기함량 0.0%이다. 도 32 내지 도 35에서 각 도의 레인 1은 돼지고기함량 50.0%이고, 레인 2는 돼지고기함량 10.0%이고, 레인 3은 돼지고기함량 2.0%이고, 레인 4는 돼지고기함량 1.0%이고, 레인 5는 돼지고기함량 0.1%이고, 레인 6은 돼지고기함량 0.0%이다. 도 36내지 도 37에서 각 도의 레인 1은 닭고기함량 50.0%이고, 레인 2는 닭고기함량 10.0%이고, 레인 3은 닭고기함량 2.0%이고, 레인 4는 닭고기함량 1.0%이고, 레인 5는 닭고기함량 0.1%이고, 레인 6은 닭고기함량 0.0%이다.
실시간 PCR로 혼합육에서 소, 돼지, 닭의 검출한계를 실험한 결과 도 30 내지 도 31에서 돼지고기에 소고기가 0.1, 1, 2, 10 그리고 50% 함유된 분쇄 혼합육의 원료육과 열처리육에서 소고기의 검출한계는 1.0%였다. 도 32 내지 도 35에서 소고기 또는 닭고기에 돼지고기의 함량별 분쇄 혼합육의 원료육과 열처리육에서 돼지고기의 검출한계는 1.0%였다. 도 36 내지 도 37에서 돼지고기에 닭고기의 함량별 분쇄 혼합육에서 닭고기의 검출한계는 원료육과 열처리육에서 0.1%이었다.
<110> GWANGJU METROPOLITAN CITY
<120> PCR or real-time PCR primers for identification of animal
species, the kit comprising the primers, and the method for
identifying animal species using the primers or kits
<130> PP3714
<160> 50
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
attctctaca ccaagagaat caagc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
cctctcatgt agctagtgcg ttta 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 3
gccagagtac tactagcaac tggtta 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
tttcataata actttcgtgc ttgg 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 5
caccctcctc aagtaaatat gatat 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 6
tatttaaact ggagagtggg aga 23
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 7
aatacgaaag ccattatgaa attaatg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 8
ggtaaatgtt ttgttttaga ctgtttt 27
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 9
aagaacaaga actttaaccc gg 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 10
tttgctgttt agtactttta atgca 25
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 11
cctgcccggt gacacttg 18
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 12
tgccttgtag gtatctagta tccataag 28
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 13
gaacaatagt aagcacaatc atagca 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 14
ataaaaactt tcgtgtggtg gatatt 26
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 15
aacaatagta agcacaatca tagca 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 16
ctttacgccg tggatctatt aat 23
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 17
tatcaaaatc tcatttgtca gggaa 25
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 18
atgatacact gttatgcagt atactttca 29
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 19
tgagctcaat agcccctcg 19
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 20
cgtcttaaag tgagcttagg ggg 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 21
caacagtgag ctcaatagcc actc 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 22
cgtcttaaag tgagcttagg g 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 23
gtcaaggtat agcctatcgg ac 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 24
cgacttacct catctttggc a 21
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 25
gacttagtta tagcaacagc ctaacttc 28
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 26
cactctttac gccgtgtcaa ta 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 27
acggaaagaa gcgtgtatcc ac 22
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 28
cttacctcat cttcagcgta ataat 25
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 29
aacgcatcaa agtactaata gtaattt 27
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 30
ctttcgtact aggaggagtt ctta 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 31
cggtctgaac tcagatcacg ta 22
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 32
ctagggataa cagcgcaatc 20
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 33
cacgaaagtt attatgaaac caataa 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 34
cattctctac accaagagaa tcaagc 26
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 35
cctctcatgt agctagtgcg ttta 24
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 36
caccctcctc aaatagattc agtgcatct 29
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 37
tcgctcggag gattttttat t 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 38
tttggatcaa tgagcgatag ag 22
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 39
gctttaacta accaacccaa agag 24
<210> 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> forward primer
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
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<212> DNA
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<223> probe
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Claims (11)
- 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조 검체로부터 수득되는 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하여, PCR 증폭을 통해 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 축종을 감별하는데 사용되는 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물에 있어서,
상기 프라이머 세트는 하기 (a) 내지 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물:
(a) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(b) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(c) 면양의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(d) 산양의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(e) 말의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(f) 개의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(g) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(h) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 15 및 16의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(i) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 17 및 18의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(j) 닭의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 19 및 20의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(k) 닭의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(l) 오리의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 23 및 24의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(m) 거위의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(n) 거위의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 27 및 28의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(o) 칠면조의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 29 및 30의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트. - 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 내지 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하되, 소, 면양, 산양, 말, 개, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 축종으로부터 수득되는 DNA를 증폭할 수 있고, PCR 증폭산물의 크기가 축종별로 서로 상이하도록 선택된 프라이머 세트를 포함하는 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, PCR 증폭 확인을 위한 대조군으로서 서열번호 31 및 32의 염기서열을 갖는 진핵세포 검출용 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가로 더 포함하는 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물을 포함하는 축종 감별용 PCR 키트.
- (i) 축종 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;
(ii) 수득된 DNA를 주쇄로 하고, 제 1 항 또는 제 2 항의 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물을 이용하여 PCR 증폭산물을 수득하는 단계;
(iii) 상기 수득된 PCR 증폭산물을 전기영동하여 증폭산물의 크기를 확인하여 검체의 축종을 감별하는 단계를 포함하는 축종 감별 방법. - 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조 검체로부터 수득되는 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트와, 상기 프라이머 세트에 의한 PCR 증폭산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 인터켈레이터를 포함하여, 실시간 PCR 증폭을 통해 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 축종을 감별하는데 사용되는 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물에 있어서,
상기 프라이머 세트는 하기 (i) 내지 (ix) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물:
(i) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 33 및 35의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(ii) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 34 및 35의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(iii) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 37 및 39의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(iv) 소의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 38 및 39의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(v) 돼지의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 41 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(vi) 닭의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 43 및 44의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(vii) 오리의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 45 및 46의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(viii) 거위의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트;
(ix) 칠면조의 DNA 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 47 및 48의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 세트. - 제 6 항에 있어서, 상기 프라이머 세트가 (i) 또는 (ii) 인 경우 프로브는 서열번호 36 의 염기서열을 가지며; 상기 프라이머 세트가 (iii) 또는 (iv)인 경우 프로브는 서열번호 40 의 염기서열을 가지며; 상기 프라이머 세트가 (v)인 경우 프로브는 서열번호 42의 염기서열을 가지며; 상기 프라이머 세트가 (vi), (vii), (viii) 또는 (ix) 인 경우 프로브는 서열번호 49의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 프로브는 5'-말단이 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, Cy5, RED 610 및 RED670 로 이루어진 군으로부터 선택된 형광표지 인자로 표지되어 있으며, 3'-말단이 5'-말단에 표지된 형광표지 인자의 발광을 억제하는 퀀쳐(quencher)에 의해 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물.
- 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 축종 감별용 PCR 프라이머 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 키트.
- 제 9 항에 있어서, 상기 축종 감별용 실시간 PCR 키트는 소, 돼지, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 축종에 대하여 실시간 PCR을 통해 축종 감별이 가능하도록 하는 각각의 축종에 대한 축종 감별용 실시간 PCR 프라이머 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 키트.
- 제 9 항에 있어서, 실시간 PCR 증폭 확인을 위한 대조군으로서 서열번호 31 및 32의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 진핵세포 검출용 프라이머 세트와, 이 프라이머 세트에 의한 PCR 증폭산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브로서 서열번호 50의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 실시간 PCR 프라이머 조성물을 추가로 더 포함하는 것으로 특징으로 하는 축종 감별용 실시간 PCR 키트.
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| KR20160058301A (ko) * | 2014-11-14 | 2016-05-25 | 제주대학교 산학협력단 | 식품 내 원료육 검출 또는 정량용 프라이머 세트 및 이를 이용한 원료육 검출 또는 정량 방법 |
| CN108676896A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-10-19 | 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 | 小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及应用 |
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