CN117286262B - 荧光pcr检测试剂盒及利用其检测乳制品真实性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了荧光PCR检测试剂盒及利用其检测乳制品真实性的方法，属于乳制品真实性检测技术领域。所述的试剂盒包含分别用于扩增奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的线粒体细胞色素b基因的引物对以及分别与这些扩增产物特异性结合的探针。利用本发明的荧光PCR检测试剂盒，能够高通量、特异性强、灵敏度高、稳定性好的进行乳制品中奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的特异性线粒体DNA的鉴别检测，从而确定乳制品的真伪。

Description

荧光PCR检测试剂盒及利用其检测乳制品真实性的方法
技术领域
本发明涉及一种荧光PCR检测试剂盒及利用其检测乳制品真实性的方法，属于乳制品的真实性鉴定领域。
背景技术
奶是由哺乳动物乳腺分泌的一种不透明胶体溶液，其颜色多为白色或淡黄色，具有较高的营养价值。奶中营养成分众多，主要包含蛋白质、乳糖、脂肪、氨基酸、维生素、矿物质等，可以促进机体生长发育以及增强免疫力。近年来，除牛奶外，水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶、驴奶、骆驼奶等特色奶因具有营养全面易吸收、低致敏性、功能因子多样等特点也逐渐进入大众视野（参见：1、Guo L, Qian J-P, Guo Y-S, et al. Simultaneousidentification of bovine and equine DNA in milks and dairy productsinferredfrom triplex TaqMan real-time PCR technique[J]. Journal of dairyscience, 2018,101(8): 6776-6786；2、Deng L, Li A, Gao Y, et al. Detection ofthe bovine milk adulterated in camel, horse, and goat milk using duplex PCR[J]. Food Analytical Methods, 2020, 13: 560-567.）。然而，受产出量、稀有度以及营养价值不同的影响，不同奶制品差价显著，衍生出市场中以低价奶掺伪特色奶的问题频发，主要是用价格较低的牛奶掺入价格较高的特色奶中（参见：BaptistaM, Cunha J T,Domingues L. DNA-based approaches for dairy products authentication: A reviewand perspectives[J]. Trends in Food Science&Technology, 2021, 109: 386-397.）。奶源掺假问题不仅对消费者合法权益造成损害，而且对牛奶过敏消费者的健康构成一定威胁。因此，如何快速准确的鉴别乳制品真伪，对于维护消费者合法权益和保障特色乳产品质量安全具有重要意义。
用于乳制品鉴定的基于蛋白质的技术（ELISA、等电聚焦和色谱技术）已被更高灵敏度和可重复性的基于DNA的方法所取代，其通过利用DNA的种属特异性以及对加工条件更高的化学稳定性和热稳定性，应用于实际乳制品的掺假鉴别检测（参见：Sobrino-GregorioL, Vilanova S, Prohens J, et al. Detection of honey adulterationbyconventional and real-time PCR[J]. Food control, 2019, 95: 57-62.）。同时，与基于蛋白质的方法相比，基于DNA的方法在时间、成本、样品量和样品处理方面呈现出明显的进步。
目前，以检测DNA为基础的方法主要有：常规聚合酶链式反应（Polymerase chainreaction，PCR）-凝胶电泳法、多重PCR-凝胶电泳法、PCR-随机扩增多态性DNA（Randomamplifiedpolymorphic DNA，RAPD）分析、PCR-限制性内切酶片段长度多态性（Restrictionfragment length polymorphism，RFLP）分析、DNA条形码（DNA barcoding）、荧光定量PCR、微滴数字（Droplet digital，dd）PCR方法等（参见：Ye H, Yang J, Xiao G, et al. Acomprehensive overview ofemerging techniques and chemometrics forauthenticity and traceability of animal-derived food[J]. Food Chemistry,2022: 134216.）。其中实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)通过荧光信号对PCR过程进行实时监测，无需琼脂糖凝胶电泳，具有灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便、定量准确以及自动化程度等优点，且可以有效降低污染，尤其是基于TaqMan的实时荧光定量PCR法，能够通过实时监测每个循环的扩增产物而实现定性或定量检测的结果。Sultana等（参见：Sultana S, Hossain M M, Azlan A, et al. TaqMan probe basedmultiplex quantitative PCR assay for determination of bovine, porcine andfishDNA in gelatin admixture, food products and dietary supplements[J].FoodChemistry, 2020, 325: 126756.）开发了基于TaqMan探针的多重定量PCR检测，可在同一反应管中区分牛、猪和鱼的明胶种类，检测限达0.005 ng/μL。Dalmasso等（DalmassoA, Civera T, La Neve F, et al. Simultaneousdetection of cow and buffalo milkin mozzarella cheese by Real-Time PCR assay[J]. Food Chemistry, 2011, 124(1):362-366.）建立了一种针对线粒体细胞色素b基因设计的特异性引物和探针，并基于TaqMan探针检测方法，能够识别乳制品中的牛奶和水牛奶，灵敏度为2%。因此，以荧光定量 PCR 技术为主的技术可用于绝大多数动物源性成分的鉴定，也能满足食品安全监管部门对检测技术简便、准确、高效的基本需求。
针对动物奶源的研究多集中于两种或三种奶源种属相近样品间检测（参见：1、GuoL, Qian J-P, Guo Y-S, et al. Simultaneous identification of bovine andequineDNA in milks and dairy products inferred from triplex TaqMan real-timePCR technique[J]. Journal of dairy science, 2018, 101(8): 6776-6786；2、Deng L,Li A, Gao Y, et al. Detection of the bovine milk adulterated in camel, horse,andgoat milk using duplex PCR[J]. Food Analytical Methods, 2020, 13: 560-567；3、Hai X, Liu G-Q,Luo J-X, et al. Triplex real-time PCR assay for theauthentication of camel-derived dairy and meat products[J]. Journal of dairyscience, 2020, 103(11): 9841-9850.），成体系的奶源间的鉴别方法较少，一次性实现对各奶样的鉴别检测较困难。多重PCR检测技术作为检测食品掺假的有效手段，该技术在同一PCR体系中加入不同种属特异性基因的特异性引物，可同时扩增多个模板的不同区域，得到相应的而不同长度PCR产物，以此来检测目标物是否存在（参见：苗金梁, 张九凯, 周正火等. 不同乳源动物成分鉴别技术研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(18):7314-7323.）。Hossain等（参见：Hossain M M, Ali M E, Sultana S, et al.Quantitative tetraplex real-time polymerase chainreaction assay with TaqManprobes discriminates cattle, buffalo, and porcine materials in food chain[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(19): 3975-3985.）研究表明，基于TaqMan探针的多重实时荧光PCR可以鉴定牛、水牛和猪源性成分，防止商业环境中的不公平竞争。Guo等（参见：Guo L, Qian J-P, Guo Y-S, et al.Simultaneousidentification of bovine and equine DNA in milks and dairyproducts inferred from triplex TaqMan real-time PCR technique[J]. Journal ofdairy science, 2018, 101(8): 6776-6786.）报道，使用三重实时PCR可有效鉴定牛奶和乳制品中的牛和马DNA，在特异性、灵敏度和重现性方面表现出良好的效果。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种荧光PCR检测试剂盒，以能够高通量、特异性强、灵敏度高、稳定性好的进行乳制品中奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的特异性线粒体DNA的鉴别检测，从而确定乳制品的真伪。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种荧光PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包含分别用于扩增奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的线粒体细胞色素b基因的引物对，以及分别与这些扩增产物特异性结合的探针。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种荧光PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包含两个彼此独立的扩增体系Ⅰ和扩增体系Ⅱ，其中：扩增体系Ⅰ用于扩增奶牛、水牛、驴和骆驼的线粒体细胞色素b基因的引物对以及分别与这些扩增产物特异性结合的探针； 扩增体系Ⅱ用于扩增牦牛、山羊、绵羊和马的线粒体细胞色素b基因的引物对以及分别与这些扩增产物特异性结合的探针；
其中，奶牛的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_006853.1所示，或为其片段；
水牛的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_006295.1所示，或为其片段；
牦牛的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_025563.1所示，或为其片段；
山羊的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_005044.2所示，或为其片段；
绵羊的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_001941.1所示，或为其片段；
马的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_001640.1所示，或为其片段；
驴的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_001788.1所示，或为其片段；
骆驼的线粒体细胞色素b基因序列如Genbank ID：NC_009629.2所示，或为其片段。
在本发明的一种优选的实施方案中：
用于扩增奶牛、水牛或牦牛的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的序列为CCTAGCAATACACTACACATCCG(SEQ ID No.1)，下游引物的序列为TTGAAGCTCCGTTTGCGT(SEQID No.2)；
用于扩增山羊或绵羊的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的序列为ATAGGCTATGTTTTACCATGAGGAC(SEQ ID No.3)，下游引物的序列为CATTCGACTAGGTTTGTGCCA(SEQ ID No.4)；
用于扩增马或驴的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的序列为AGACCCAGACAACTACACCCC(SEQ ID No.5)，下游引物的序列为TTGTTGGGAATGGAGCGTA(SEQ IDNo.6)；
用于扩增骆驼的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的序列为ACAGGCTCTAATAACCCGACAG(SEQ ID No.7)，下游引物的序列为GGTGAGAACAGTACGAGAATAAGG(SEQ ID No.8)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种荧光PCR检测试剂盒，其中：
与奶牛的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为Texas Red-TCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTG(SEQ ID No.9)-BHQ2；
与水牛的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为FAM-CGTGAACTATGGATGAA(SEQ ID No.10)-MGB；
与牦牛的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为 HEX-CTCCGTTGCCCATAT(SEQ ID No.11)-MGB；
与山羊的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为Texas Red-ACAGTCATCACTAATCTTCTTTCAGCAATCCC(SEQ ID No.12)-BHQ2；
与绵羊的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为CY5-TATTACCAACCTCCTTTC(SEQ ID No.13)-MGB；
与马的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为FAM-TACTTCCTGTTTGCCTAC(SEQ ID No.14)-MGB；
与驴的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为HEX-TTCCTATTTGCTTACGCC(SEQ ID No.15)-MGB；
与骆驼的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针序列为CY5-CTCCTCAGACATAGACA(SEQ ID No.16)-MGB。
本发明的第二个目的是提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，以能够高通量、特异性强、灵敏度高、稳定性好的进行乳制品中奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的特异性线粒体DNA的鉴别检测，从而确定乳制品的真伪。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）提取乳制品中的DNA；
（2）利用如上所述的试剂盒对步骤（1）提取得到的DNA进行扩增和定量检测；
（3）根据步骤（2）的扩增和定量检测结果判断乳制品的真实性。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，其中步骤（1）中，在乳制品中加入蛋白酶K和裂解液，室温静置后加入异丙醇，振荡混匀一定时间后加入磁珠悬浮液特异性吸附核酸，磁分离后先后加入清洗缓冲液和漂洗液充分清洗磁珠去除蛋白质杂质和纯化核酸，最后用洗脱缓冲液将DNA从磁珠上洗脱并保存。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，其中：
所述的裂解液为Buffer GHL（天根磁珠法血液基因组提取试剂盒（货号：DP329-01））；
所述的清洗缓冲液为Buffer GDA（天根磁珠法血液基因组提取试剂盒（货号：DP329-01））；
所述的漂洗液为Buffer PWD（天根磁珠法血液基因组提取试剂盒（货号：DP329-01））；
所述的洗脱缓冲液为Buffer TB（天根磁珠法血液基因组提取试剂盒（货号：DP329-01））。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，其中步骤（1）中，乳制品在提取DNA前还进行脱脂处理。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，其中步骤（2）中，DNA进行扩增和定量检测的反应体系每20 μL包含：10 μL 2×TaqMan 快速qPCR主混合物，各种上游引物和各种下游引物各0.4 μL，各种探针各0.3 μL，5ng/μL 的步骤（1）提取得到的DNA混合液4 μL，余量为无RNA酶双蒸水。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，其中所述的反应体系中，各种上游引物、各种下游引物、各种探针的浓度均为100 μM。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的试剂盒检测乳制品真实性的方法，其中步骤（2）中，DNA进行扩增和定量检测的反应体系分为每管20 μL的两管，一管中加入扩增和定量检测奶牛、水牛、驴、骆驼的线粒体细胞色素b基因或其片段的引物对和探针，另一管中加入扩增和定量检测牦牛、山羊、绵羊、马的线粒体细胞色素b基因或其片段的引物对和探针。
本发明的有益效果在于，利用本发明的荧光PCR检测试剂盒，能够高通量、特异性强、灵敏度高、稳定性好的进行乳制品中奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的特异性线粒体DNA的鉴别检测，从而确定乳制品的真伪。
基于特异性引物的qPCR方法在鉴别乳源成分时，需要进行复杂的引物设计，在进行多重检测时需要添加多对引物，使得反应体系复杂、优化困难且浪费试剂，本发明的通用引物克服了特异性引物的不足，不需要复杂的引物设计及优化就能实现在同一反应体系中检测多个目标物。此外，本发明在传统TaqMan探针的基础上，利用小沟结合物（MinorGroove Binder，MGB）和黑洞淬灭剂（Black Hole Quencher 2，BHQ2）基团修饰了3'末端非荧光猝灭基团, 能够在不增加探针碱基数的情况下, 将探针的Tm值提高10 ℃左右, 从而提高特异性并更容易设计，还可减少荧光背景并提高信噪比。通过TaqMan-BHQ2/MGB 标记技术，本发明可双重保障特异性引物对和特异性探针序列反应的特异性, 相较常规PCR更具应用与推广价值。因此，本发明在前人研究的基础上，基于线粒体DNA设计奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼物种特异性引物和探针，利用TaqMan和MGB标记技术可以具有增加探针杂交的特异性和设计灵活性等优点，克服多重荧光PCR普遍存在的不同目标序列扩增效率不一致等问题，建立了可同时检测上述8种乳源性成分的多重real-timePCR方法，并验证不同热处理工艺（原料乳、巴氏杀菌乳、高温灭菌乳和冷冻干燥乳粉）对方法稳定性、灵敏度的影响，可为特色乳制品的掺假检验提供检测依据。
本发明以8种乳源动物（奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼）源性成分的线粒体Cytb基因为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针，以阳性质粒为阳性对照，建立多重实时荧光PCR方法，并对该方法进行方法学验证，同时对不同掺入比例模拟样品、不同加工工艺模拟样品和重复性进行检测。结果表明，该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点。当Ct值≤35时，该方法对非靶标物种具有良好的特异性；灵敏度可检测到浓度为0.0064 ng/μL的模板DNA；对奶牛乳的检出限为乳的0.1%，说明建立的多重实时荧光PCR法可用于乳及乳制品中常见掺假源性成分的检测。
附图说明
图1为实施例5中四种组合的多重real-time PCR扩增结果；其中，A为奶牛、水牛、牦牛和绵羊组合的多重real-time PCR扩增结果；B为奶牛、水牛、牦牛和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果；C为奶牛、水牛、绵羊和驴组合的多重real-timePCR扩增结果；D为奶牛、绵羊、马和驴组合的多重real-time PCR扩增结果。
图2为实施例5中四种组合的多重real-time PCR扩增结果；其中，E为奶牛、马、驴和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果；F为奶牛、牦牛、绵羊和马组合的多重real-time PCR扩增结果；G为奶牛、牦牛、马和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果；H为奶牛、水牛、驴和骆驼组合的多重real-timePCR扩增结果。
图3为实施例5中四种组合的多重real-time PCR扩增结果；其中，I为奶牛、牦牛、绵羊和山羊组合的多重real-time PCR扩增结果；J为水牛、牦牛、山羊和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果；K为水牛、绵羊、山羊和驴组合的多重real-timePCR扩增结果；L为水牛、山羊、驴和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果。
图4为实施例5中四种组合的多重real-time PCR扩增结果；其中，M为牦牛、山羊、马和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果；N为牦牛、绵羊、山羊和马组合的多重real-time PCR扩增结果；O为绵羊、山羊、马和驴组合的多重real-timePCR扩增结果；P为山羊、马、驴和骆驼组合的多重real-time PCR扩增结果。
图5为实施例6中8种乳源real-time PCR灵敏度扩增曲线；其中，A、D为Texas Red通道中奶牛和山羊源性灵敏度扩增曲线；B、F为FAM通道中水牛和马灵敏度扩增曲线；C、G为HEX通道中牦牛和驴灵敏度扩增曲线；E、H为CY5通道中绵羊和骆驼灵敏度扩增曲线。
图6为实施例6中得到的8种乳源多重实时PCR标准曲线，A-H依次为奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼乳源在多重实时PCR扩增中的标准曲线。
图7为实施例7中得到的 8种乳源多重real-time PCR检出限，A和B分别为奶牛、水牛乳源在多重实时PCR体系中的检出限。
图8为实施例7中得到的 8种乳源多重real-time PCR检出限，C和D分别为牦牛、山羊乳源在多重实时PCR体系中的检出限。
图9为实施例7中得到的 8种乳源多重real-time PCR检出限，E和F分别为绵羊、马乳源在多重实时PCR体系中的检出限。
图10为实施例7中得到的 8种乳源多重real-time PCR检出限，G和H分别为驴和骆驼乳源在多重实时PCR体系中的检出限。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
下述实施例中的奶牛乳从北京牧场采集，水牛乳从广西牧场采集，牦牛乳从甘肃牧场采集，山羊乳从陕西牧场采集，绵羊乳从内蒙古牧场采集，马乳、驴乳和骆驼乳从新疆牧场采集。用于实际样品测定的乳及乳制品，分别购自超市和生产企业。其他动物材料猪、狗、水貂、狐狸、兔、鼠、鸡、鸭、鹅、鱼购自北京超市和农贸市场。
实施例1提取乳制品中的DNA
量取待测奶样1 mL，或将奶粉样品按照1:8的质量体积比用双蒸水溶解配制成复原乳后取1mL，分别置于干净Eppendorf管中，6000 r/min离心10 min；弃去上层脂质层与中间层液体，加入1 mL TE 缓冲液反复冲洗沉淀，6000 r/min离心10min；弃去清液，加入1 mLPBS反复冲洗沉淀，6000 r/min离心10 min；弃去清液，加入500 μL PBS反复冲洗沉淀，6000r/min离心10 min；弃去清液，加入200 μL PBS反复冲洗沉淀（参见宋宏新, 刘建兰, 徐丹等. 羊乳制品中牛乳成分的荧光定量PCR检测方法研究[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(07): 283-287+299.）。使用天根磁珠法血液基因组提取试剂盒（货号：DP329-01）提取生乳和乳制品中的DNA。
在脱脂后的样品管中加入20 μL蛋白酶K和300 μL 裂解液Buffer GHL，在65 ℃下孵育15 min，用以消化蛋白、裂解细胞并灭活细胞内核酸酶；室温静置5 min，随后加入350μL异丙醇，振荡混匀5 min，以去除多糖和杂蛋白释放核酸；进而加入20 μL磁珠悬浮液特异性吸附核酸；磁分离后先后加入700 μL清洗缓冲液Buffer GDA和700 μL漂洗液BufferPWD，充分清洗磁珠去除蛋白质等杂质和纯化核酸；最后用洗脱缓冲液 Buffer TB 80 μL将DNA从磁珠上洗脱，转移至一个新的Eppendorf中，并于-20 ℃保存。采用分光光度计在260 nm波长下测定DNA的浓度和纯度，DNA的OD260/OD280在1.8~2.0之间，可用于DNA 扩增。将DNA稀释至5 ng/μL，放于- 20℃冰箱备用。
实施例2引物和探针合成
从GenBank上查找并下载线粒体细胞色素b（cytb）基因序列，对应于奶牛（编号1，序列ID：NC_006853.1）、水牛（编号2，序列ID：NC_006295.1）、牦牛（编号3，序列ID：NC_025563.1）、山羊（编号4，序列ID：NC_005044.2）、绵羊（编号5，序列ID：NC_001941.1）、马（编号6，序列ID：NC_001640.1）、驴（编号7，序列ID：NC_001788.1）和骆驼（编号8，序列ID：NC_009629.2）。通过软件 Primer Premier 3.0 比对分析物种基因序列，选取匹配度低、差异大的序列片段，使用Primer Premier 5.0软件在基因保守区域设计引物和探针（表1）。探针在5’端用荧光报道分子6-羧基荧光染料（6-carboxyfluorescein，FAM）、黑色素扩增体（hexachlorofluo-rescein，HEX）、磺基罗丹明101（Sulforhodamine 101 acid chloride，Texas Red）或花青素荧光染料（Cyanine5，CY5）修饰，在3’端用MGB 或BHQ2修饰。保证在2个反应体系中同时进行四重real-time PCR。引物和探针序列见表1。
表1 引物和探针序列
实施例3荧光定量PCR检测方法的建立
单重real-time PCR体系：分别以8个物种基因组DNA为模板进行扩增。总体积20 μL包含10 μL 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix（上海生工，B639274-0005），0.4 μL上游引物（100 μM），0.4 μL下游引物（100 μM），0.3 μL探针（100 μM），1 μL模板DNA（5 ng/μL），RNase free ddH2O补足20 μL。
多重real-time PCR体系：在2个20 μL反应体系中对奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的混合基因组DNA进行四重real-time PCR反应，每个体系中4 种不同荧光的浓度分别为100 μM的上游、下游引物和探针分别按照1:1:1:1混合配制成上下游引物混合液以及探针混合液，对应的4 种靶标乳粉DNA（5 ng/μL）等体积混合配成DNA mix。总体积20μL包含10 μL 2×TaqMan Fast qPCRMaster Mix，各种上游引物和下游引物各0.4 μL（浓度各自均为100 μM），各种探针各0.3 μL（浓度各自均为100 μM），DNA混合液4 μL（5 ng/μL），RNase free ddH2O 补足20 μL。
扩增和检测在全自动荧光定量仪CFX96 Touch上进行，反应程序参考2×TaqManFast qPCR Master Mix试剂说明书，具体如下：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性5 s、57℃ 退火15 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
实施例4引物和探针的特异性试验
分别提取奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼生乳8个目标物种的DNA，猪、狗、水貂、狐狸、兔、鼠、鸡、鸭、鹅、鱼10个非目标物种的组织基因组DNA（5 ng/μL）为模板进行扩增，以阳性质粒（选择奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼线粒体色素CYTB基因引物分别扩增核酸，扩增产物分别用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化，纯化的DNA分别连接克隆入大肠杆菌Puc-57载体，分别选取白色菌落进行增菌培养，提取细菌质粒，即为阳性质粒，由上海生工公司测序验证）为阳性对照，非目标物种DNA为阴性对照，无菌ddH2O为空白对照，进行实时荧光PCR。
仔细评估所有引物和探针的错配序列和解链温度(Tm)。在多重real-time PCR系统中，多个引物和探针可以在一定温度范围内同时与多个模板相互作用。在此测定中，奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼特异性引物和探针具有相同或非常接近的Tm值（58±1和 66℃），这确保了引物和探针与其各自的DNA模板在所选条件下正确退火。引物Tm值为57-59°C，所有引物在57 °C下退火。较高的探针Tm值（66°C）会在结合前优先进行引物退火，这也是探针试验所必需的。这些因素可以使用四种荧光报告染料（FAM、HEX、Texas Red和CY5）区分同一反应混合物中的四种不同扩增子（表2）。
采用单重实时荧光PCR体系分别对奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼8种乳源进行检测，阳性质粒为阳性对照，非目标物种DNA作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。扩增结果显示，只有阳性对照和靶标乳源物种产生扩增曲线，扩增Ct值在20.57~24.93之间（表2），与非靶标乳源物种之间无交叉反应，阴性对照和空白对照也均无扩增，说明设计的引物和探针特异性良好。
表2 特异性引物和探针单重实时PCR检测的Ct值
实施例5多重real-time PCR交叉反应性
按照real-time PCR仪的4 种荧光系统，对8种乳源的探针分别用FAM、HEX、TexasRed和CY5进行荧光标记并编号，编号如实施例2所述。根据发光基团的不同将8 种乳源进行组合，共产生16种组合：即A（奶牛、水牛、牦牛、绵羊）、B（奶牛、水牛、牦牛、骆驼）、C（奶牛、水牛、绵羊、驴）、D（奶牛、、绵羊、马、驴）、E（奶牛、马、驴、骆驼）、F（奶牛、牦牛、绵羊、马）、G（奶牛、牦牛、马、骆驼）、H（奶牛、水牛、驴、骆驼）、I（水牛、牦牛、绵羊、山羊）、J（水牛、牦牛、山羊、骆驼）、K（水牛、绵羊、山羊、驴）、L（水牛、山羊、驴、骆驼）、M（牦牛、山羊、马、骆驼）、N（牦牛、绵羊、山羊、马）、O（绵羊、山羊、马、驴）、P（山羊、马、驴、骆驼）。8种乳DNA均调至5 ng/μL，将每种组合对应的4 种DNA进行等体积混合作为模板（DNA终质量浓度1.25 ng/μL），阴性对照DNA调至12.5 ng/μL并进行等体积混合作为阴性对照（保证反应体系中每个物种终质量浓度一致），以阳性质粒为阳性对照，以无菌ddH2O为空白对照，进行多重real-time PCR检测，每个样品6个平行。
多重real-time PCR可以在同一反应管内同时检测多种模板DNA，减少时间、成本以及试验的复杂性，但其要求在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增，因而引物间的配对与竞争性扩增均会影响扩增效果。因此，本实施例对8种乳源引物探针的16种组合进行多重real-time PCR交叉反应性检测。结果表明，16种组合均可检测到对应的4个物种，但发现含有奶牛（图1）、水牛（图1）、牦牛（图1）、山羊（图3）、绵羊（图1）、马（图1和2）成分的组合均存在非典型的S型曲线；同时含有绵羊（图1和3）、驴（图4）、骆驼（图3）成分的组合RFU值偏低，说明在9种组合出现了交叉反应，扩增受到抑制。剩下的反应体系中只有图2（H）和图4（N）这2种组合可以同时保证8种乳源均具有良好的扩增效果，混合体系之间未产生交叉反应，故确定以图2（H）和图4（N）这两种组合作为8种乳源多重real-time PCR检测体系。
实施例6多重real-time PCR标准曲线的生成以及检出限确定、目标DNA和PCR效率的定量
为了分析建立的多重real-time PCR体系对混合样检测的检出限，将每种组合对应的4种靶标乳（1:1:1:1，总浓度20 ng/µL）的混合物中的连续稀释DNA来校准多重real-time PCR体系。将DNA混合物连续稀释5倍，得到分别含有20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128ng的样品，在此测定中，将每个4 µL稀释样品添加到20 µL反应混合物中。每个反应混合物的最终体积包含来自所有四个目标物种的相同量的DNA，用优选的组合对每个稀释度进行多重 real-time PCR反应，各浓度进行6次平行，以DNA浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标制作标准曲线，并按公式Eff%=（10-1/斜率-1）×100%计算扩增效率，确定体系LOD。PCR效率的接受范围在90%至110%之间，对应的回归斜率在-3.1至-3.6之间（R2≥0.98）（参见：Sultana S, Hossain M M, Azlan A, et al. TaqMan probe based multiplexquantitative PCRassay for determination of bovine, porcine and fish DNA ingelatin admixture, food products and dietary supplements[J]. Food Chemistry,2020, 325: 126756.）。根据Rojas等（参见：Rojas M, González I, Pavón M Á, et al.Novel TaqMan real-time polymerase chain reaction assay for verifyingtheauthenticity of meat and commercial meat products from game birds[J].FoodAdditives and Contaminants, 2010, 27(6): 749-763.）的方法，未知样品中8种靶标乳DNA的数量是根据各自的Ct值确定的：Ct=mlog[ ]+C，其中，m为斜率，C为截距。
为了确定对选择的1278和3456这种组合的多重real-time PCR方法能够检测到的各个生乳DNA最低含量，以及计算PCR扩增反应的效率，将提取出生乳DNA稀释成一系列浓度梯度进行real-time PCR实验。使用目标物种（奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼）的5倍连续稀释的混合基因组DNA（每个物种 20-0.00128 ng/µL）确定两个四重real-timePCR系统的LOD。当运行混合物时，扩增曲线反映了相应的Ct值，该值从较高浓度到较低浓度变化。结果显示，奶牛乳（图5A）和水牛乳（图5B）在DNA浓度为20~0.0064 ng/µL 扩增效果良好，当乳源DNA浓度高于0.0064 ng/µL时，该体系可以检测到奶牛和水牛乳源成分；牦牛（图5C）、山羊（图5D）、绵羊（图5E）、马（图5F）、驴（图5G）、骆驼（图5H）在DNA浓度为20~0.00128ng/µL扩增效果良好，当乳源DNA浓度高于0.00128 ng/µL时，该体系可以检测到牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼乳源成分。GUO等（参见：Guo L, Qian J-P, Guo Y-S, et al.Simultaneousidentification of bovine and equine DNA in milks and dairyproducts inferred from triplex TaqMan real-time PCR technique[J]. Journal ofdairy science, 2018, 101(8): 6776-6786.）以牛和羊的物种保守性和特异性荧光探针为引物， 开发并验证了一种三重TaqMan qPCR方法，可在消除假阳性的同时检测到0.005ng/µL的羊DNA和0.01 ng/µL的牛DNA。孙国栋等（参见：孙国栋, 李爱丽, 李威等. 基于双重聚合酶链式反应技术检测掺假驴乳中的牛乳[J]. 食品安全质量检测学报, 2022,13(20): 6511-6517.）基于双重聚合酶链式反应技术检测掺假驴乳中的牛乳，在双重体系中DNA的检出限为10 ng。王天添等（参见：王天添, 刘悦, 赵远等. 鉴定动物奶源的多重PCR方法建立及应用[J]. 中国农业大学学报, 2020, 25(11): 74-81.）建立的多重PCR方法对牛乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和骆驼乳的LOD为1 ng/µL。目前，快速准确鉴定奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴及骆驼奶间完好的鉴定体系研究较少。本发明灵敏度高，一次检测即可鉴定常见奶源掺假情况，良好特异性引物的选择，避免了假阳性的出现。
根据标准曲线对每个目标物种DNA进行定量。从各目标物种生乳的等量混合物（1:1:1:1）中提取的DNA（20 ng/μL）连续稀释5倍，以获得反应混合物中 20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128 ng的总DNA。使用每种稀释的DNA 样品进行多重real-time PCR，并通过绘制Ct值与DNA对数浓度的关系来构建奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的标准曲线。为了进行比较和可视化，使用GraphPad Prism 8生成所有物种的比较标准曲线（图6）。标准曲线可以观察到良好的线性回归，奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼物种的回归系数(R2)分别为0.9914、0.9956、0.9957、0.99、0.9965、0.9911、0.9967和0.9932，所反映的各标准曲线对应的斜率分别为-3.3758、-3.5683、-3.5169、-3.5818、-3.3806、-3.5528、-3.4092和-3.5664。计算得出的PCR效率Eff%（Eff%=（10-1/斜率-1）×100%）分别达到97.80%、90.65%、92.46%、90.19%、97.61%、91.19%和96.48%和90.72%，获得的回归系数、相应的斜率和PCR效率均在推荐值范围内，说明线性关系良好，引物和探针的扩增效率较高，建立的多重real-time PCR反应体系稳定。因此，生成的标准曲线和四重real-time PCR系统适合定量测定混合乳类样品中目标物种的贡献。
实施例7掺假样品的检出限试验
为分析建立的多重实时荧光 PCR体系对混合样品检测检出限，将优选组合对应的靶标乳先等体积混合，以非靶标乳（当研究组合一：奶牛乳/水牛乳/驴乳/骆驼乳混合乳时，需要加入除了组合一中4种乳外的一种乳，选自牦牛乳、山羊乳、绵羊乳和马乳；同理，当研究组合二：牦牛乳/山羊乳/绵羊乳/马乳混合乳时，需要加入除了组合二中4种乳外的一种乳，选自奶牛乳、水牛乳、驴乳和骆驼乳）为基质，按照每种靶标乳含量90%，50%，10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0.01%的比例制备混合乳品。即以山羊乳为基质添加奶牛乳/水牛乳/驴乳/骆驼乳混合乳，以骆驼乳为基质添加牦牛乳/山羊乳/绵羊乳/马乳混合乳，以对应的基质DNA为阴性对照，以ddH2O为空白对照，对目标物种成分进行多重real-time PCR检测，每个反应设置3个平行。
LOD有助于确定在掺假或污染的样本中可检测到的目标的最小数量，为了精确判定建立的多重real-time PCR体系对混合乳品检测的检出限并确定该方法对产品的实际应用性，制备了10种目标乳含量为90%、70%、50%、30%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%的混合样品。多重实时PCR检测结果显示（图7-图10），奶牛乳的检出限为0.1%，水牛乳和马乳的检出限为0.5%，牦牛乳、山羊乳、绵羊乳和骆驼乳的检出限为0.01%，驴乳的检出限为1%，检测Ct值在26.83~33.95之间，可以满足检测需求。这与宋宏新等（参见：宋宏新, 刘建兰, 徐丹等. 羊乳制品中牛乳成分的荧光定量PCR检测方法研究[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(07):283-287+299.）研究的基于荧光染料的real-time PCR方法最低可以检测2.5%奶牛生乳相比，具有高通量、快速准确以及特异性强的优势。Dalmasso等（参见：Dalmasso A,Civera T, La Neve F, et al. Simultaneous detection of cow and buffalo milk inmozzarella cheese by Real-Time PCRassay[J]. Food Chemistry, 2011, 124(1):362-366.）针对线粒体细胞色素b基因设计的特异性引物和探针可以检测水牛奶中的奶牛奶的LOD为2%。因此，本发明建立的多重real-time PCR方法高度灵敏，不受掺假形式的影响，克服了普通PCR假阳性的问题和交叉污染，可自动实时检测分析，同时也比荧光染料法具有更强的特异性和灵敏度，已在动物源性成分检测项目上成为常用的分子生物学检测手段。
实施例8重复性试验
分别以两个组合的同一批次和不同批次制备的不同浓度（4 ng/µL、0.8 ng/µL、0.16 ng/µL、0.032 ng/µL）DNA作为模板，用优化后的条件分别进行批内和批间重复性试验，每个模板分别做6个重复，计算批内及批间重复性试验的Ct平均值（Mean）、标准偏差（Standard deviation，SD）和变异系数（Coefficient of variation，CV/%）。
结果显示（表3-表6），8种乳源的批内CV值在0.18%-5.20%，批间CV值在0.01%-3.11%。以上数据表明，本发明所建立的real-time PCR检测方法具有良好的稳定性及重复性。
表3多重real-time PCR批内重复性试验结果（1）
表4多重real-time PCR批内重复性试验结果（2）
表5多重real-time PCR批间重复性试验结果（1）
表6多重real-time PCR批间重复性试验结果（2）
实施例9实际样品检测试验
应用建立的多重real-time PCR法对市场采购的54份样品进行乳源成分分析，判定与所贴标签是否相符，同时验证所建立的检测方法推广使用的可行性。DNA的提取和多重real-time PCR反应如上所述进行。样品包括7份水牛乳产品、15份牦牛乳产品、8份山羊乳产品、4份绵羊乳产品、6份马乳产品、6份驴乳产品以及8份骆驼乳产品。种类包括液态鲜奶、酸奶、奶粉、婴配，涉及的加工方式包括巴氏杀菌、发酵、高温灭菌、超高温灭菌、高温喷雾干燥等。
用建立的方法对54份样品市售特色乳产品进行了乳源成分分析（表7），结果显示所有乳产品检测Ct值均在35以内。多重real-time PCR体系进行8种乳源成分的检测结果显示，有18份乳制品检出非标识物种成分，掺伪率达33.33%，主要是水牛乳制品、牦牛乳制品、羊乳制品及驴乳制品。其中，4份水牛乳制品检出非标识牛成分，不符率达57.14%；8份牦牛乳制品检出非标识牛成分或山羊成分，不符率达53.33%；2份山羊乳和1份绵羊乳产品检出非标识奶牛成分，不符率为25%；3份驴乳制品检出非标识奶牛成分，不符率为50%；马乳和骆驼乳制品未检出非标识乳源成分，符合其乳源标识。整体市售特色乳产品乳源标识不符率达33.33%。经过高温处理的乳制品，其DNA降解为许多仅有几百个碱基的小片段，如果检测目的片段太大，可能无法发现阳性片段，而普通PCR法受电泳检测有效性的限制，难以采纳小片段目的产物。而本发明采用多拷贝线粒体基因为靶基因，克服了单拷贝基因随着样品热处理温度上升，掺假比例越低，检测结果偏差越大的问题，同时也有效避免了传统PCR方法耗时较长、操作繁琐、易造成污染，且费工较多、效率较低，一次只能检出一个物种、不能满足高通量的检测需求的缺点。
表7 市售乳制品乳源动物物种成分检测结果
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本发明采用多拷贝线粒体基因为靶基因，参照奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼的线粒体基因组中高度保守的Cytb的种内保守中间特异性区域作为各个奶源物种特异检测的靶序列，通过在反应体系中加入特异性的荧光探针识别和检测扩增产物，优化反应体系中的引物探针浓度和退火温度等条件，建立能同时检测奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼奶源性成分的多重real-time PCR体系，实现在2个反应管中扩增8种目标源性DNA，有效缩短和简化乳制品掺假鉴定的流程，提高检测效率。此外，本发明具有较强的特异性和较高的灵敏度，对10种非目标源性DNA均无交叉反应，且可检测到浓度为0.00128-0.0064ng/μL的模板DNA，对生乳的掺假检出限达到乳含量的0.01%~1%，检测结果准确、稳定，也适用于牦牛奶、骆驼奶等高附加值乳制品源性成分的检测。

Claims (2)

1.一种荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光PCR检测试剂盒包含两个彼此独立的扩增体系Ⅰ和扩增体系Ⅱ，其中：扩增体系Ⅰ含有用于扩增奶牛、水牛、驴和骆驼的线粒体细胞色素b基因的引物对以及分别与这些扩增产物特异性结合的探针； 扩增体系Ⅱ含有用于扩增牦牛、山羊、绵羊和马的线粒体细胞色素b基因的引物对以及分别与这些扩增产物特异性结合的探针；
其中，用于扩增奶牛、水牛或牦牛的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列为 SEQ ID No.2所示；
用于扩增山羊或绵羊的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；
用于扩增马或驴的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ IDNo.5所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；
用于扩增骆驼的线粒体细胞色素b基因的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ IDNo.7所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；
与奶牛的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.9所示；
与水牛的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.10 所示；
与牦牛的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为 SEQ IDNo.11所示；
与山羊的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.12所示；
与绵羊的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.13所示；
与马的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.14所示；
与驴的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.15所示；
与骆驼的线粒体细胞色素b基因扩增产物特异性结合的探针的核苷酸序列为SEQ IDNo.16 所示；
其中，在探针的5’端用荧光报道分子6-羧基荧光染料、黑色素扩增体、磺基罗丹明101或花青素荧光染料修饰，在探针的3’端用MGB或BHQ2修饰。
2.权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒在检测乳制品真实性中的应用。
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