JP3805692B2 - 牛、豚、鶏検出用プライマー - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は牛、豚、鶏のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅することにより、被験食品や被検飼料に牛、豚、鶏のいずれかの原料が用いられていたかを判定するための、原料肉種検出用のＰＣＲ用プライマーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食肉製品やこれを含む食品において、原料肉表示は食品衛生法で規定されており、また、食肉由来の原料を使用した商品においても、平成１４年４月からアレルギー表示として、可能な限りその由来を表示することが推奨されている。従って、食品においては、これら原料肉種の正確な鑑別法が不可欠である。また、平成１３年９月に国内で狂牛病が発見されて以来、国外又は国内において、食品中あるいは飼料中に牛由来原料が含まれているかどうかの判断を必要とする機会が多くなってきており、微量な混入であっても迅速、かつ正確に判定することが望まれている。
【０００３】
従来においては原料肉種の鑑別は免疫血清反応法、等電点電気泳動法、及び高速液体クロマトグラフィー法が用いられていたが、タンパク質の加熱が著しい加工食品等においては、これらの方法では鑑別が困難である。一方、近年の遺伝子工学の発達によって、ＤＮＡの配列の差異に基づいたハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を食品の原料肉種鑑別に応用することも検討され始めている。特にＰＣＲ法は、目的のＤＮＡ断片を微量であっても短時間で増幅させる技術であるため、簡便性や迅速性、正確性の点から食品中や飼料中の原料肉の種鑑別に応用できると期待されている。
【０００４】
例えば、ウシ遺伝子をＰＣＲ法によって検出する方法については現在まで幾つかの方法が公表されており、文献（日本食品化学工学会誌４６，１８７（１９９０））記載の方法は、一方のプライマーを数種の食肉種に対して共通のものを用い、他方のプライマーを各生物種特異的なプライマーを用いて、一度のＰＣＲ反応によって、多種類の食肉の存在を検出するプライマーの設計を行っている。しかし、この場合、特定の２種の食肉の判定が困難な場合があり、正確性に問題がある。さらに、検出に必要なＤＮＡ量として少なくとも0.25ng必要であり、高感度に検出しているとは言い難い。
【０００５】
また文献（Ｊ.ＡＯＡＣ Ｉｎｔ,７８，１５４２（１９９５））では牛、ブタ等のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の共通配列領域をＰＣＲ用のプライマーとして用いて増幅し、この増幅産物を制限酵素によって切断する方法を採用し、網羅的に多くの生物種を区別する方法が記載されている。しかし、検出にはＰＣＲ法による増幅産物を制限酵素処理する必要があり、迅速性に問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、我々は、正確かつ高感度に牛由来原料の存在を判断できるＰＣＲ用のプライマーの設計を本発明の課題とした。さらに他の主要な食肉である豚、鶏に対しても正確かつ高感度に存在を判断できるＰＣＲ用のプライマーの設計を課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため我々は鋭意研究を重ね、以下の知見を見いだした。すなわち、既知のデータベースより、種々の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を抽出し、その配列を比較検討することで、牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子のそれぞれに特異的なＤＮＡ領域を見いだした。
【０００８】
我々は、見出した牛、豚、鶏のそれぞれに特異的なミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の領域に対して、これを標的とするＰＣＲ用プライマーをいくつか作製した。そしてその中から正確に牛のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、豚のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、鶏のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子と特異的に反応するＰＣＲ用プライマー、及びプライマーセットを選出し、本発明とした。
【０００９】
すなわち、本発明は、まず第１のプライマーとして、配列表の配列番号１における塩基番号１４〜２３の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。次に、第２のプライマーとして、配列表の配列番号２における塩基番号１９〜２８の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。これら第１のプライマーと第２のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、共に牛のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子に特異的に結合するが、他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出可能に増幅しないので、牛原料を検出するのためのＰＣＲ用プライマーとして使用される。また、当該第１のプライマーと第２のプライマーのプライマーセットとすることで、より高感度に検出することができる。
【００１０】
また、本発明は、第３のプライマーとして、配列表の配列番号３における塩基番号１７〜２６の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。また、さらに、第４のプライマーとして、配列表の配列番号４における塩基番号１９〜２８の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。これら第３のプライマーと第４のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、共に豚のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子に特異的に結合するが、他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出可能に増幅しないので、豚原料を検出するのためのＰＣＲ用プライマーとして使用される。また、当該第３のプライマーと第４のプライマーのプライマーセットとすることで、より高感度に検出することができる。
【００１１】
また、本発明は、第５のプライマーとして、配列表の配列番号５における塩基番号１９〜２８の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。また、さらに、第６のプライマーとして、配列表の配列番号６における塩基番号１７〜２６の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。これら第５のプライマーと第６のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、共に鶏のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子に特異的に結合するが、他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出可能に増幅しないので、鶏原料を検出するのためのＰＣＲ用プライマーとして使用される。また、当該第５のプライマーと第６のプライマーのプライマーセットとすることで、より高感度に検出することができる。
【００１２】
前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを１５から４０とするのは、ＰＣＲ用プライマーとして塩基配列の長さが１５〜４０程度が適切であること、また、３´末端側１０個の塩基配列を特定するのは、３´末端側１０個程度がＰＣＲ反応に際して重要であって、５´末端側は多少配列が異なっていたり、長さが違っていてもＰＣＲ反応が可能な場合が多いためである。
【００１３】
本発明においては、さらに第１のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号１の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（１´）、第２のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号２の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（２´）を提案する。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００１４】
また、第３のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号３の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（３´）、第４のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号４の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（４´）を提案する。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００１５】
また、第５のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号５の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（５´）、第６のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号６の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（６´）を提案する。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する
プライマー
本発明の牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出用プライマー、すなわち、第１のプライマー又は第２のプライマーは、互いに組合わせて、あるいは牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする別のプライマーと組み合わせることによって、所定条件のＰＣＲに供されることにより、牛由来のＤＮＡの有するミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＰＣＲに供されることによっては、その他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅しないプライマーである。ここで、牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする「別」のプライマーとは、第１のプライマーを用いた場合、これに対してアンチセンスプライマーとなるものであればよく、この場合必ずしも牛だけに特異的なものでなくてもよい。また、同様に第２のプライマーを用いた場合、これに対してセンスプライマーとなるものであれば良く、この場合も必ずしも牛だけに特異的なものでなくてもよい。
【００１７】
本発明の豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出用プライマー、すなわち第３のプライマー又は第４のプライマーは、互いに組合わせることによって、あるいは豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする別のプライマーと組み合わせることによって、所定条件のＰＣＲに供されることにより、豚由来のＤＮＡの有するミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＰＣＲに供されることによっては、その他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅しないプライマーである。ここで、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする「別」のプライマーとは、上記牛の場合に順じて解釈する。
【００１８】
本発明の鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出用プライマー、すなわち第５のプライマー又は第６のプライマーは、互いに組合わせることによって、あるいは鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする別のプライマーと組み合わせることによって、所定条件のＰＣＲに供されることにより、鶏由来のＤＮＡの有するミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＰＣＲに供されることによっては、その他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅しないプライマーである。ここで、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする「別」のプライマーとは、上記牛、豚の場合に順じて解釈する。
【００１９】
また、これら前記のＰＣＲの所定条件としては、通常ブロックタイプのＰＣＲ装置やキャピラリータイプのＰＣＲ装置において採用される種々の条件が含まれるが、通常は変性を９０〜９８℃程度で３秒〜１分、アニーリングを５０℃〜６５℃程度で５秒〜２分間、ＤＮＡ伸張反応を６０℃〜７５℃程度で１０秒〜３分間行ない、反応系中のＭｇイオン濃度が１．０〜３．５ｍＭ程度の条件を提示できる。
【００２０】
本発明のプライマーを用いたＰＣＲ反応の対象となる食品や飼料は特に限定されないが、食品の場合、例えば、食肉、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した食肉具材、原料肉又はこれらの加工製品を含有する各種調理食品等を広く対象とすることができる。
【００２１】
本発明のプライマーは化学合成により容易に作製することができる。また、本発明のプライマーは前記の第１のプライマーと第２のプライマーを組み合わせて使用することが好ましく、さらに好ましくは前記（１´）と（２´）のプライマー、最も好ましくは配列表の配列番号１と配列番号２のプライマーを組合わせて使用する。これにより、目的とする牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を高感度に検出することができる。
【００２２】
また、同様に、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出するには、第３のプライマーと第４のプライマー、さらに好ましくは（３´）と（４´）のプライマー、最も好ましくは配列表の配列番号３と配列番号４のプライマーを組み合わせて使用することが好ましい。また、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出するには、第５のプライマーと第６のプライマー、さらに好ましくは前記（５´）と（６´）のプライマー、最も好ましくは配列表の配列番号５と配列番号６のプライマーを組合わせてを用いることが望ましい。
【００２３】
牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出方法
本発明の牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出方法は、被験食品に含まれるＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型として、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ない、増幅されたＤＮＡを検出する。
【００２４】
ＤＮＡ抽出操作
食品からのＤＮＡの抽出は公知の方法を採用することができる。例えば、このような公知の方法としてＭａｒｍｕｒ法、その変法である酵素法、塩化ベンジル法等が挙げられる。特に加熱等の処理がされ、微量のＤＮＡしか含まない被験食品からの効率的なＤＮＡの抽出にはＣＴＡＢ法が有効である（Ｎａｔｕｒｅ,１９８,５８８(１９６３)）。
【００２５】
ＰＣＲ
ＰＣＲ反応を行なうにあたっては前記説明した本発明のプライマーを用いる。被験食品中に牛由来原料が含まれていることを確認する必要がある場合、すなわち牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の存在を確認する場合は、第１のプライマー又は第２のプライマーと、他の牛ミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子のアンチセンス又はセンスプライマー、好ましくは第１と第２のプライマーを組み合わせて用いることができる。
【００２６】
同様に豚由来原料が含まれていることを確認する場合、すなわち豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の存在を確認する場合には第３のプライマー又は第４のプライマーと、他の豚ミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子のアンチセンス又はセンスプライマー、好ましくは第３と第４のプライマーを組み合わせて用いることができる。
【００２７】
さらに鶏由来原料が含まれていることを確認する場合、すなわち鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の存在を確認する場合には第５のプライマー又は第６のプライマーと、他の豚ミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子のアンチセンス又はセンスプライマー、好ましくは第５と第６のプライマーを組み合わせて用いることができる。
【００２８】
ＰＣＲ装置としてはブロックタイプ又はキャピラリータイプの装置を使用できる。尚、迅速にＤＮＡを増幅するにはキャピラリータイプのＰＣＲ装置を用いることが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は特に限定されず、検体毎に最適条件を定めればよいが、例えばキャピラリータイプのＰＣＲ装置を用いる場合、以下の条件が好ましい。
・二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性：通常９０〜９８℃、好ましくは９２℃から９６℃で通常１秒から1分程度、好ましくは３秒から３０秒程度加熱する。
・アニーリング：通常５０℃から７５℃程度、好ましくは５０℃〜７０℃程度で通常１秒〜１分３０秒程度好ましくは５秒から３０秒程度加熱する。
・ＤＮＡ伸張反応：通常５０℃〜７５℃程度、好ましくは７０℃〜７４℃程度で通常３秒〜２分間程度、好ましくは５秒〜１分間程度加熱する。
・反応系のＭｇイオン濃度：通常１．０〜３．５ｍＭ程度好ましくは２．０〜３．０ｍＭ程度である。
この反応を２５〜５０サイクル程度行うことにより、目的のミトコンドリア チトクロームｂの特定遺伝子領域を検出可能な程度まで増幅することができる。
【００２９】
ＤＮＡ検出工程
ＰＣＲ反応終了後の反応物の検出については、ＰＣＲ産物の量をサイバーグリーン等の蛍光検出を利用してモニタリングできるＰＣＲ装置を用いる場合には、ＰＣＲ反応後に融解曲線分析を用いて、ＰＣＲ産物の融解温度によって目的増幅産物を検出することができる。さらに、これらの増幅産物の存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーン等で核酸染色を行うこともできる。
【００３０】
融解曲線分析においてＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡの融解温度のピークが検出された場合、又はアガロース電気泳動による目的バンドが検出された場合には、そのプライマーセットが増幅することができるミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を有する食肉種に対応する食肉原料が存在していたことがわかる。例えば、配列番号１記載のプライマー及び配列番号２記載のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅産物の融解温度は約８４．４℃であり、融解曲線分析においてこのピークが見られた場合、又は電気泳動において約２９９塩基対のバンドが検出された場合には被験食品中に牛由来原料が存在していたことがわかる。また、配列番号３記載のプライマー及び配列番号４記載のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅産物の融解温度は約８３．０℃であり、融解曲線分析においてこのピークが見られた場合、又は電気泳動において約２５３塩基対のバンドが検出された場合には被験食品中に豚由来原料が存在していたことがわかる。また、配列番号５記載のプライマー及び配列番号６記載のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅産物の融解温度は約８５．７℃であり、融解曲線分析においてこのピークが見られた場合、又は電気泳動において約２８５塩基対のバンドが検出された場合には被験食品中に鶏由来原料が存在していたことがわかる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）牛、豚、鶏、七面鳥、羊、鮭、ヒト、大腸菌ＤＮＡを用いた場合のプライマーの特異性確認
ＤＮＡの調製
牛、豚、鶏、七面鳥、羊、ヒトの各ＤＮＡはバイオインサイド社製、鮭ＤＮＡはクローンテック社製、大腸菌はＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ 抽出キット（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いて精製したものを用いた。
【００３３】
プライマーの調製
配列番号１、２、３、４、５、６記載の各プライマーはＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００３４】
ＰＣＲ反応
各食肉及び鮭、大腸菌のＤＮＡ量を測定し、希釈をおこなうことで１ｎｇ/μlの各ＤＮＡ溶液を作製し、これらの被験ＤＮＡ液1μlに滅菌水及びＰＣＲバッファーを加えることにより、終濃度２．０ｍＭ MgCl2 50ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3) 0.25mg/ml BSA 200μＭ dNTPs 0.25μＭ各プライマーとなるように調製した。これに1.0unitsのHot Start Taq DNAポリメラーゼ（ロッシュダイアグノステック社製）を添加し、総液量を２０μlとしてＰＣＲ反応を行った。
【００３５】
まず、第１の反応として、配列番号１及び２記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。また、別に第２の反応として、配列番号３及び４記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６４℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行なった。さらに第３の反応として、配列番号５及び６記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ装置はライトサイクラー（ロッシュダイアグノスステック社製）を用いた。
【００３６】
ＰＣＲ反応終了後、融解曲線分析において各目的増幅産物の融解温度のピークを確認するとともに、得られたＰＣＲ産物を1.6％アガロースゲル（タカラ）でMupid-２（コスモバイオ）により、１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide(1.0μg/ml)で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
【００３７】
その結果、配列番号１，２のプライマーセットを使用した場合、増幅産物の融解温度のピークは、牛ＤＮＡの場合のみ約84.4℃のピークが認められ、電気泳動の結果は、図１（ａ）に示すように、牛ＤＮＡの場合のみ299bpに増幅産物が確認され、他の生物種ＤＮＡを使用した場合には増幅産物は見られなかった。また、配列番号３，４のプライマーセットを使用した場合は、増幅産物の融解温度のピークは、豚ＤＮＡの場合のみ約83.0℃のピークが認められ、電気泳動の結果は、図１（ｂ）に示すように、豚ＤＮＡの場合のみ253bpに増幅産物が確認された。さらに、配列番号５，６のプライマーセットを使用した場合は、増幅産物の融解温度のピークは、鶏ＤＮＡの場合のみ約85.7℃のピークが認められ、電気泳動の結果は、図１（ｃ）に示すように、鶏ＤＮＡの場合のみ285bpに増幅産物が確認された。
【００３８】
（実施例２）各プライマーで増幅するために必要な鋳型ＤＮＡ量の検討
ＤＮＡの調製
牛、豚、鶏の各ＤＮＡはバイオインサイド社製を使用した。
【００３９】
プライマーの調製
配列番号１、２、３、４、５、６記載の各プライマーはＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００４０】
ＰＣＲ反応
前記の牛、豚、鶏の各ＤＮＡの希釈を行うことで0.1pg/μl、1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1000pg/μlの各ＤＮＡ溶液の希釈系列を作製し、これらの被験ＤＮＡ液1μlに滅菌水及びＰＣＲバッファーを加えることにより、終濃度2.0ｍＭ MgCl2 50ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3) 0.25mg/ml BSA 200μＭ dNTPs 0.25μＭ各プライマーとなるように調製した。これに1.0unitsのHot Start Taq DNAポリメラーゼ（ロッシュダイアグノステック社製）を添加し、総液量を２０μlとしてＰＣＲ反応を行った。
【００４１】
牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出を行う場合、配列番号1及び２記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。また、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出を行う場合は、配列番号３及び４記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６４℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行なった。さらに鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の場合は、配列番号５及び６記載のプライマーを用いて９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
【００４２】
ＰＣＲ装置はライトサイクラー（ロッシュダイアグノスステック社製）を用いた。ＰＣＲ反応終了後、融解曲線分析において各目的増幅産物の融解温度のピークを確認するとともに、得られたＰＣＲ産物を1.6％アガロースゲル（タカラ）でMupid-２（コスモバイオ）により、１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide(1.0μg/ml)で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
【００４３】
また、電気泳動におけるそれぞれのプライマーセットによる検出限界の鋳型ＤＮＡ量は、図２に示すように牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用の配列番号１及び２のプライマーセットで（ａ）１ｐｇ、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用の配列番号３及び４のプライマーセットで（ｂ）１ｐｇ、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用の配列番号５及び６のプライマーセットで（ｃ）０．１ｐｇであった。
【００４４】
（実施例３）牛原料使用の乾燥調味肉と豚原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡでのプライマーの反応性
ＤＮＡの調製
即席麺等の具剤として使用される牛原料使用の乾燥調味肉と豚原料使用の乾燥調味肉を使用し、以下のＣＴＡＢ法によるＤＮＡの抽出を行った。すなわち、それぞれを１０ｇ採取し、抽出用バッファー（１％ＣＴＡＢ、０．７ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％β―メルカプトエタノール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣl(ｐＨ８．０)）を８０ｍｌ添加した後、５５℃ ３０分間適度に攪拌しながら保持した後、８０ｍｌのクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、さらに室温で１０分間、転倒混和した。
【００４５】
次に、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取し、本上清に１/１０容量のＣＴＡＢ溶液（１０％ＣＴＡＢ、０．７ＭＮａＣｌ）を加えて、室温で１０分間、転倒混和した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を採取した後、等量の沈殿ブッファー（１％ＣＴＡＢ、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣl（ｐＨ８．０））を加え、室温で３０分間静置し、２０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。上清を除去し、ペーパータオル上で沈殿を乾燥した後、続けて本沈殿をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔｓ（クローンテック社製）を用いて精製し、最終的に１００μlのＤＮＡ溶液を得た。ＤＮＡ濃度は牛原料使用の乾燥調味肉では0.13μg/μl、豚原料使用の乾燥調味肉からは0.11μg/μlであった。
【００４６】
プライマーの調製
配列番号１、２記載の各プライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００４７】
ＰＣＲ反応
上記の被験ＤＮＡ液1μl及び10倍希釈ＤＮＡ溶液1μlに滅菌水及びＰＣＲバッファーを加えることにより、終濃度2.0mＭ MgCl2 50ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3) 0.25mg/ml BSA 200μＭ dNTPs 0.25μＭプライマー（配列番号１及び２のプライマーセット）、となるように調製し、これに1.0unitsのHot Start TaqDNAポリメラーゼ（ロッシュダイアグノステック社製）を添加し、総液量を２０μlとして９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒で４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はＰＣＲ装置としてライトサイクラー（ロッシュダイアグノスステック社製）を用いた。得られたPCR産物を1.6％アガロースゲル（タカラ）でMupid-２（コスモバイオ）により、１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide(1.0μg/ml)で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。結果は図３に示すとおりである。
【００４８】
図３に示す様に牛原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡについては299bpに増幅バンドが検出されており、豚原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡについては検出されなかった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明のプライマーを用いてミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅することにより、被験食品や飼料中に牛、豚、鶏由来原料が使用されているかどうかを高感度に、かつ迅速に検査することができる。従って、本発明のプライマーは、食品や飼料における原料肉種検出用のプライマーとして有用である。
【００５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用のプライマーを用いて各生物種ＤＮＡとのＰＣＲ反応性を示したアガロース電気泳動図である。
（ａ）：配列番号１及び２のプライマーセットを用いた場合
（ｂ）：配列番号３及び４のプライマーセットを用いた場合
（ｃ）：配列番号５及び６のプライマーセットを用いた場合
【図２】牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用のプライマーを用いて検出感度を調べた結果を示したアガロース電気泳動図である。
（ａ）：配列番号１及び２のプライマーセットを用いた場合
（ｂ）：配列番号３及び４のプライマーセットを用いた場合
（ｃ）：配列番号５及び６のプライマーセットを用いた場合
【図３】牛原料使用の乾燥調味肉と豚原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡのＰＣＲ反応性を示したアガロース電気泳動図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は牛、豚、鶏のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅することにより、被験食品や被検飼料に牛、豚、鶏のいずれかの原料が用いられていたかを判定するための、原料肉種検出用のＰＣＲ用プライマーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食肉製品やこれを含む食品において、原料肉表示は食品衛生法で規定されており、また、食肉由来の原料を使用した商品においても、平成１４年４月からアレルギー表示として、可能な限りその由来を表示することが推奨されている。従って、食品においては、これら原料肉種の正確な鑑別法が不可欠である。また、平成１３年９月に国内で狂牛病が発見されて以来、国外又は国内において、食品中あるいは飼料中に牛由来原料が含まれているかどうかの判断を必要とする機会が多くなってきており、微量な混入であっても迅速、かつ正確に判定することが望まれている。
【０００３】
従来においては原料肉種の鑑別は免疫血清反応法、等電点電気泳動法、及び高速液体クロマトグラフィー法が用いられていたが、タンパク質の加熱が著しい加工食品等においては、これらの方法では鑑別が困難である。一方、近年の遺伝子工学の発達によって、ＤＮＡの配列の差異に基づいたハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を食品の原料肉種鑑別に応用することも検討され始めている。特にＰＣＲ法は、目的のＤＮＡ断片を微量であっても短時間で増幅させる技術であるため、簡便性や迅速性、正確性の点から食品中や飼料中の原料肉の種鑑別に応用できると期待されている。
【０００４】
例えば、ウシ遺伝子をＰＣＲ法によって検出する方法については現在まで幾つかの方法が公表されており、文献（日本食品化学工学会誌４６，１８７（１９９０））記載の方法は、一方のプライマーを数種の食肉種に対して共通のものを用い、他方のプライマーを各生物種特異的なプライマーを用いて、一度のＰＣＲ反応によって、多種類の食肉の存在を検出するプライマーの設計を行っている。しかし、この場合、特定の２種の食肉の判定が困難な場合があり、正確性に問題がある。さらに、検出に必要なＤＮＡ量として少なくとも0.25ng必要であり、高感度に検出しているとは言い難い。
【０００５】
また文献（Ｊ.ＡＯＡＣ Ｉｎｔ,７８，１５４２（１９９５））では牛、ブタ等のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の共通配列領域をＰＣＲ用のプライマーとして用いて増幅し、この増幅産物を制限酵素によって切断する方法を採用し、網羅的に多くの生物種を区別する方法が記載されている。しかし、検出にはＰＣＲ法による増幅産物を制限酵素処理する必要があり、迅速性に問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、我々は、正確かつ高感度に牛由来原料の存在を判断できるＰＣＲ用のプライマーの設計を本発明の課題とした。さらに他の主要な食肉である豚、鶏に対しても正確かつ高感度に存在を判断できるＰＣＲ用のプライマーの設計を課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため我々は鋭意研究を重ね、以下の知見を見いだした。すなわち、既知のデータベースより、種々の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を抽出し、その配列を比較検討することで、牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子のそれぞれに特異的なＤＮＡ領域を見いだした。
【０００８】
我々は、見出した牛、豚、鶏のそれぞれに特異的なミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の領域に対して、これを標的とするＰＣＲ用プライマーをいくつか作製した。そしてその中から正確に牛のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、豚のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子、鶏のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子と特異的に反応するＰＣＲ用プライマー、及びプライマーセットを選出し、本発明とした。
【０００９】
すなわち、本発明は、まず第１のプライマーとして、配列表の配列番号１における塩基番号１４〜２３の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。次に、第２のプライマーとして、配列表の配列番号２における塩基番号１９〜２８の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。これら第１のプライマーと第２のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、共に牛のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子に特異的に結合するが、他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出可能に増幅しないので、牛原料を検出するのためのＰＣＲ用プライマーとして使用される。また、当該第１のプライマーと第２のプライマーのプライマーセットとすることで、より高感度に検出することができる。
【００１０】
また、本発明は、第３のプライマーとして、配列表の配列番号３における塩基番号１７〜２６の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。また、さらに、第４のプライマーとして、配列表の配列番号４における塩基番号１９〜２８の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。これら第３のプライマーと第４のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、共に豚のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子に特異的に結合するが、他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出可能に増幅しないので、豚原料を検出するのためのＰＣＲ用プライマーとして使用される。また、当該第３のプライマーと第４のプライマーのプライマーセットとすることで、より高感度に検出することができる。
【００１１】
また、本発明は、第５のプライマーとして、配列表の配列番号５における塩基番号１９〜２８の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。また、さらに、第６のプライマーとして、配列表の配列番号６における塩基番号１７〜２６の塩基配列を３´末端側に含む最短１５最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマーを提案する。これら第５のプライマーと第６のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、共に鶏のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子に特異的に結合するが、他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出可能に増幅しないので、鶏原料を検出するのためのＰＣＲ用プライマーとして使用される。また、当該第５のプライマーと第６のプライマーのプライマーセットとすることで、より高感度に検出することができる。
【００１２】
前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを１５から４０とするのは、ＰＣＲ用プライマーとして塩基配列の長さが１５〜４０程度が適切であること、また、３´末端側１０個の塩基配列を特定するのは、３´末端側１０個程度がＰＣＲ反応に際して重要であって、５´末端側は多少配列が異なっていたり、長さが違っていてもＰＣＲ反応が可能な場合が多いためである。
【００１３】
本発明においては、さらに第１のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号１の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（１´）、第２のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号２の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（２´）を提案する。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００１４】
また、第３のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号３の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（３´）、第４のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号４の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（４´）を提案する。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００１５】
また、第５のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号５の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（５´）、第６のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号６の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー（６´）を提案する。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する
プライマー
本発明の牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出用プライマー、すなわち、第１のプライマー又は第２のプライマーは、互いに組合わせて、あるいは牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする別のプライマーと組み合わせることによって、所定条件のＰＣＲに供されることにより、牛由来のＤＮＡの有するミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＰＣＲに供されることによっては、その他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅しないプライマーである。ここで、牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする「別」のプライマーとは、第１のプライマーを用いた場合、これに対してアンチセンスプライマーとなるものであればよく、この場合必ずしも牛だけに特異的なものでなくてもよい。また、同様に第２のプライマーを用いた場合、これに対してセンスプライマーとなるものであれば良く、この場合も必ずしも牛だけに特異的なものでなくてもよい。
【００１７】
本発明の豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出用プライマー、すなわち第３のプライマー又は第４のプライマーは、互いに組合わせることによって、あるいは豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする別のプライマーと組み合わせることによって、所定条件のＰＣＲに供されることにより、豚由来のＤＮＡの有するミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＰＣＲに供されることによっては、その他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅しないプライマーである。ここで、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする「別」のプライマーとは、上記牛の場合に順じて解釈する。
【００１８】
本発明の鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出用プライマー、すなわち第５のプライマー又は第６のプライマーは、互いに組合わせることによって、あるいは鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする別のプライマーと組み合わせることによって、所定条件のＰＣＲに供されることにより、鶏由来のＤＮＡの有するミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＰＣＲに供されることによっては、その他の生物種のミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅しないプライマーである。ここで、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子をコードする「別」のプライマーとは、上記牛、豚の場合に順じて解釈する。
【００１９】
また、これら前記のＰＣＲの所定条件としては、通常ブロックタイプのＰＣＲ装置やキャピラリータイプのＰＣＲ装置において採用される種々の条件が含まれるが、通常は変性を９０〜９８℃程度で３秒〜１分、アニーリングを５０℃〜６５℃程度で５秒〜２分間、ＤＮＡ伸張反応を６０℃〜７５℃程度で１０秒〜３分間行ない、反応系中のＭｇイオン濃度が１．０〜３．５ｍＭ程度の条件を提示できる。
【００２０】
本発明のプライマーを用いたＰＣＲ反応の対象となる食品や飼料は特に限定されないが、食品の場合、例えば、食肉、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した食肉具材、原料肉又はこれらの加工製品を含有する各種調理食品等を広く対象とすることができる。
【００２１】
本発明のプライマーは化学合成により容易に作製することができる。また、本発明のプライマーは前記の第１のプライマーと第２のプライマーを組み合わせて使用することが好ましく、さらに好ましくは前記（１´）と（２´）のプライマー、最も好ましくは配列表の配列番号１と配列番号２のプライマーを組合わせて使用する。これにより、目的とする牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を高感度に検出することができる。
【００２２】
また、同様に、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出するには、第３のプライマーと第４のプライマー、さらに好ましくは（３´）と（４´）のプライマー、最も好ましくは配列表の配列番号３と配列番号４のプライマーを組み合わせて使用することが好ましい。また、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を検出するには、第５のプライマーと第６のプライマー、さらに好ましくは前記（５´）と（６´）のプライマー、最も好ましくは配列表の配列番号５と配列番号６のプライマーを組合わせてを用いることが望ましい。
【００２３】
牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出方法
本発明の牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出方法は、被験食品に含まれるＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型として、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ない、増幅されたＤＮＡを検出する。
【００２４】
ＤＮＡ抽出操作
食品からのＤＮＡの抽出は公知の方法を採用することができる。例えば、このような公知の方法としてＭａｒｍｕｒ法、その変法である酵素法、塩化ベンジル法等が挙げられる。特に加熱等の処理がされ、微量のＤＮＡしか含まない被験食品からの効率的なＤＮＡの抽出にはＣＴＡＢ法が有効である（Ｎａｔｕｒｅ,１９８,５８８(１９６３)）。
【００２５】
ＰＣＲ
ＰＣＲ反応を行なうにあたっては前記説明した本発明のプライマーを用いる。被験食品中に牛由来原料が含まれていることを確認する必要がある場合、すなわち牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の存在を確認する場合は、第１のプライマー又は第２のプライマーと、他の牛ミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子のアンチセンス又はセンスプライマー、好ましくは第１と第２のプライマーを組み合わせて用いることができる。
【００２６】
同様に豚由来原料が含まれていることを確認する場合、すなわち豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の存在を確認する場合には第３のプライマー又は第４のプライマーと、他の豚ミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子のアンチセンス又はセンスプライマー、好ましくは第３と第４のプライマーを組み合わせて用いることができる。
【００２７】
さらに鶏由来原料が含まれていることを確認する場合、すなわち鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の存在を確認する場合には第５のプライマー又は第６のプライマーと、他の豚ミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子のアンチセンス又はセンスプライマー、好ましくは第５と第６のプライマーを組み合わせて用いることができる。
【００２８】
ＰＣＲ装置としてはブロックタイプ又はキャピラリータイプの装置を使用できる。尚、迅速にＤＮＡを増幅するにはキャピラリータイプのＰＣＲ装置を用いることが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は特に限定されず、検体毎に最適条件を定めればよいが、例えばキャピラリータイプのＰＣＲ装置を用いる場合、以下の条件が好ましい。
・二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性：通常９０〜９８℃、好ましくは９２℃から９６℃で通常１秒から1分程度、好ましくは３秒から３０秒程度加熱する。
・アニーリング：通常５０℃から７５℃程度、好ましくは５０℃〜７０℃程度で通常１秒〜１分３０秒程度好ましくは５秒から３０秒程度加熱する。
・ＤＮＡ伸張反応：通常５０℃〜７５℃程度、好ましくは７０℃〜７４℃程度で通常３秒〜２分間程度、好ましくは５秒〜１分間程度加熱する。
・反応系のＭｇイオン濃度：通常１．０〜３．５ｍＭ程度好ましくは２．０〜３．０ｍＭ程度である。
この反応を２５〜５０サイクル程度行うことにより、目的のミトコンドリア チトクロームｂの特定遺伝子領域を検出可能な程度まで増幅することができる。
【００２９】
ＤＮＡ検出工程
ＰＣＲ反応終了後の反応物の検出については、ＰＣＲ産物の量をサイバーグリーン等の蛍光検出を利用してモニタリングできるＰＣＲ装置を用いる場合には、ＰＣＲ反応後に融解曲線分析を用いて、ＰＣＲ産物の融解温度によって目的増幅産物を検出することができる。さらに、これらの増幅産物の存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーン等で核酸染色を行うこともできる。
【００３０】
融解曲線分析においてＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡの融解温度のピークが検出された場合、又はアガロース電気泳動による目的バンドが検出された場合には、そのプライマーセットが増幅することができるミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を有する食肉種に対応する食肉原料が存在していたことがわかる。例えば、配列番号１記載のプライマー及び配列番号２記載のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅産物の融解温度は約８４．４℃であり、融解曲線分析においてこのピークが見られた場合、又は電気泳動において約２９９塩基対のバンドが検出された場合には被験食品中に牛由来原料が存在していたことがわかる。また、配列番号３記載のプライマー及び配列番号４記載のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅産物の融解温度は約８３．０℃であり、融解曲線分析においてこのピークが見られた場合、又は電気泳動において約２５３塩基対のバンドが検出された場合には被験食品中に豚由来原料が存在していたことがわかる。また、配列番号５記載のプライマー及び配列番号６記載のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ増幅産物の融解温度は約８５．７℃であり、融解曲線分析においてこのピークが見られた場合、又は電気泳動において約２８５塩基対のバンドが検出された場合には被験食品中に鶏由来原料が存在していたことがわかる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）牛、豚、鶏、七面鳥、羊、鮭、ヒト、大腸菌ＤＮＡを用いた場合のプライマーの特異性確認
ＤＮＡの調製
牛、豚、鶏、七面鳥、羊、ヒトの各ＤＮＡはバイオインサイド社製、鮭ＤＮＡはクローンテック社製、大腸菌はＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ 抽出キット（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いて精製したものを用いた。
【００３３】
プライマーの調製
配列番号１、２、３、４、５、６記載の各プライマーはＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００３４】
ＰＣＲ反応
各食肉及び鮭、大腸菌のＤＮＡ量を測定し、希釈をおこなうことで１ｎｇ/μlの各ＤＮＡ溶液を作製し、これらの被験ＤＮＡ液1μlに滅菌水及びＰＣＲバッファーを加えることにより、終濃度２．０ｍＭ MgCl2 50ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3) 0.25mg/ml BSA 200μＭ dNTPs 0.25μＭ各プライマーとなるように調製した。これに1.0unitsのHot Start Taq DNAポリメラーゼ（ロッシュダイアグノステック社製）を添加し、総液量を２０μlとしてＰＣＲ反応を行った。
【００３５】
まず、第１の反応として、配列番号１及び２記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。また、別に第２の反応として、配列番号３及び４記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６４℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行なった。さらに第３の反応として、配列番号５及び６記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ装置はライトサイクラー（ロッシュダイアグノスステック社製）を用いた。
【００３６】
ＰＣＲ反応終了後、融解曲線分析において各目的増幅産物の融解温度のピークを確認するとともに、得られたＰＣＲ産物を1.6％アガロースゲル（タカラ）でMupid-２（コスモバイオ）により、１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide(1.0μg/ml)で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
【００３７】
その結果、配列番号１，２のプライマーセットを使用した場合、増幅産物の融解温度のピークは、牛ＤＮＡの場合のみ約84.4℃のピークが認められ、電気泳動の結果は、図１（ａ）に示すように、牛ＤＮＡの場合のみ299bpに増幅産物が確認され、他の生物種ＤＮＡを使用した場合には増幅産物は見られなかった。また、配列番号３，４のプライマーセットを使用した場合は、増幅産物の融解温度のピークは、豚ＤＮＡの場合のみ約83.0℃のピークが認められ、電気泳動の結果は、図１（ｂ）に示すように、豚ＤＮＡの場合のみ253bpに増幅産物が確認された。さらに、配列番号５，６のプライマーセットを使用した場合は、増幅産物の融解温度のピークは、鶏ＤＮＡの場合のみ約85.7℃のピークが認められ、電気泳動の結果は、図１（ｃ）に示すように、鶏ＤＮＡの場合のみ285bpに増幅産物が確認された。
【００３８】
（実施例２）各プライマーで増幅するために必要な鋳型ＤＮＡ量の検討
ＤＮＡの調製
牛、豚、鶏の各ＤＮＡはバイオインサイド社製を使用した。
【００３９】
プライマーの調製
配列番号１、２、３、４、５、６記載の各プライマーはＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００４０】
ＰＣＲ反応
前記の牛、豚、鶏の各ＤＮＡの希釈を行うことで0.1pg/μl、1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1000pg/μlの各ＤＮＡ溶液の希釈系列を作製し、これらの被験ＤＮＡ液1μlに滅菌水及びＰＣＲバッファーを加えることにより、終濃度2.0ｍＭ MgCl2 50ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3) 0.25mg/ml BSA 200μＭ dNTPs 0.25μＭ各プライマーとなるように調製した。これに1.0unitsのHot Start Taq DNAポリメラーゼ（ロッシュダイアグノステック社製）を添加し、総液量を２０μlとしてＰＣＲ反応を行った。
【００４１】
牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出を行う場合、配列番号1及び２記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。また、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の検出を行う場合は、配列番号３及び４記載のプライマーを用いて、９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６４℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行なった。さらに鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子の場合は、配列番号５及び６記載のプライマーを用いて９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
【００４２】
ＰＣＲ装置はライトサイクラー（ロッシュダイアグノスステック社製）を用いた。ＰＣＲ反応終了後、融解曲線分析において各目的増幅産物の融解温度のピークを確認するとともに、得られたＰＣＲ産物を1.6％アガロースゲル（タカラ）でMupid-２（コスモバイオ）により、１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide(1.0μg/ml)で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
【００４３】
また、電気泳動におけるそれぞれのプライマーセットによる検出限界の鋳型ＤＮＡ量は、図２に示すように牛ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用の配列番号１及び２のプライマーセットで（ａ）１ｐｇ、豚ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用の配列番号３及び４のプライマーセットで（ｂ）１ｐｇ、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用の配列番号５及び６のプライマーセットで（ｃ）０．１ｐｇであった。
【００４４】
（実施例３）牛原料使用の乾燥調味肉と豚原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡでのプライマーの反応性
ＤＮＡの調製
即席麺等の具剤として使用される牛原料使用の乾燥調味肉と豚原料使用の乾燥調味肉を使用し、以下のＣＴＡＢ法によるＤＮＡの抽出を行った。すなわち、それぞれを１０ｇ採取し、抽出用バッファー（１％ＣＴＡＢ、０．７ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％β―メルカプトエタノール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣl(ｐＨ８．０)）を８０ｍｌ添加した後、５５℃ ３０分間適度に攪拌しながら保持した後、８０ｍｌのクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、さらに室温で１０分間、転倒混和した。
【００４５】
次に、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取し、本上清に１/１０容量のＣＴＡＢ溶液（１０％ＣＴＡＢ、０．７ＭＮａＣｌ）を加えて、室温で１０分間、転倒混和した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を採取した後、等量の沈殿ブッファー（１％ＣＴＡＢ、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣl（ｐＨ８．０））を加え、室温で３０分間静置し、２０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。上清を除去し、ペーパータオル上で沈殿を乾燥した後、続けて本沈殿をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔｓ（クローンテック社製）を用いて精製し、最終的に１００μlのＤＮＡ溶液を得た。ＤＮＡ濃度は牛原料使用の乾燥調味肉では0.13μg/μl、豚原料使用の乾燥調味肉からは0.11μg/μlであった。
【００４６】
プライマーの調製
配列番号１、２記載の各プライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００４７】
ＰＣＲ反応
上記の被験ＤＮＡ液1μl及び10倍希釈ＤＮＡ溶液1μlに滅菌水及びＰＣＲバッファーを加えることにより、終濃度2.0mＭ MgCl2 50ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3) 0.25mg/ml BSA 200μＭ dNTPs 0.25μＭプライマー（配列番号１及び２のプライマーセット）、となるように調製し、これに1.0unitsのHot Start TaqDNAポリメラーゼ（ロッシュダイアグノステック社製）を添加し、総液量を２０μlとして９５℃で１０分保持した後、熱変性９５℃ ５秒、アニーリング６６℃ １０秒、酵素反応７２℃ ２０秒で４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はＰＣＲ装置としてライトサイクラー（ロッシュダイアグノスステック社製）を用いた。得られたPCR産物を1.6％アガロースゲル（タカラ）でMupid-２（コスモバイオ）により、１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide(1.0μg/ml)で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。結果は図３に示すとおりである。
【００４８】
図３に示す様に牛原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡについては299bpに増幅バンドが検出されており、豚原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡについては検出されなかった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明のプライマーを用いてミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子を増幅することにより、被験食品や飼料中に牛、豚、鶏由来原料が使用されているかどうかを高感度に、かつ迅速に検査することができる。従って、本発明のプライマーは、食品や飼料における原料肉種検出用のプライマーとして有用である。
【００５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用のプライマーを用いて各生物種ＤＮＡとのＰＣＲ反応性を示したアガロース電気泳動図である。
（ａ）：配列番号１及び２のプライマーセットを用いた場合
（ｂ）：配列番号３及び４のプライマーセットを用いた場合
（ｃ）：配列番号５及び６のプライマーセットを用いた場合
【図２】牛、豚、鶏ミトコンドリア チトクロームｂ遺伝子検出用のプライマーを用いて検出感度を調べた結果を示したアガロース電気泳動図である。
（ａ）：配列番号１及び２のプライマーセットを用いた場合
（ｂ）：配列番号３及び４のプライマーセットを用いた場合
（ｃ）：配列番号５及び６のプライマーセットを用いた場合
【図３】牛原料使用の乾燥調味肉と豚原料使用の乾燥調味肉から抽出したＤＮＡのＰＣＲ反応性を示したアガロース電気泳動図である。
Claims (9)
- 配列表の配列番号１の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー
- 配列表の配列番号２の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー
- 配列表の配列番号３の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー
- 配列表の配列番号４の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー
- 配列表の配列番号５の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー
- 配列表の配列番号６の塩基配列を３´末端側に含む最大４０塩基のＤＮＡからなる原料肉種検出用プライマー
- 請求項１記載のプライマーと請求項２記載のプライマーからなるプライマーセット
- 請求項３記載のプライマーと請求項４記載のプライマーからなるプライマーセット
- 請求項５記載のプライマーと請求項６記載のプライマーからなるプライマーセット
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