CN105969900B - 一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的方法。针对市场上用鸡肉、兔肉下脚料经过加工冒充猪肉的现象，需要一个统一的检测方法，以鉴别生鲜猪肉、鸡肉和兔肉，以及混合或加工过的肉制品中该三种肉的成分。传统的检测方法检测时间长，耗时费力，本发明以猪肉、鸡肉和兔肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计3对特异性引物：F/R猪、F/R鸡和F/R兔，通过PCR得到特异性扩增片段，分析电泳图中是否出现目标条带，进而检测肉样是否掺假。该方法能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别鸭肉、鸡肉、兔肉以及混合或加工过的肉品中的这三种肉的成分。
Description
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，涉及一种一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的PCR技术检测方法。
背景技术
我国是一个肉类消费大国，肉类是我国居民食物源中的一个极为重要的类别。近年来，随着人们生活水平的提高，肉类市场也急剧扩大，不法商贩在利益的驱使下，掺假事件频频发生。目前，掺假的手段主要是以假乱真，例如有些商家在商品中掺杂异种肉，如用鸡肉、兔肉及其下脚料等冒充猪肉制成饺子馅等等，肉类食品掺假已成为影响我国食品质量安全的又一大问题。因此，对肉类进行快速、准确的检测以确定是否掺假显得十分重要。然而传统方法操作复杂、耗时耗力，对样品要求高而不能满足肉类鉴定快速、精确的要求。因此，亟需建立一套简单、快速、准确、可靠、特异性高的现代化检测方法。
以核酸为基础的鉴定方法，特别是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)技术正逐步成为肉类食品鉴定的主要分析方法。曾经提出或使用过的方法，如红外线光谱检测、蛋白质指纹方法、免疫学方法、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)和扩增片段长度多态性分析(AFLP)等均存在某些缺点，如检测结果不稳定、难以区分混合肉样、操作繁琐等。本发明利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列，通过尝试截短引物、设计通用上游引物，优化反应条件等多种策略，经过反复试验，开发出了一种可一次性、快速准确鉴别食品中猪肉、鸡肉和兔肉三种成分的检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、低成本、高效可靠的快速检测肉类掺假的方法。
本发明首先提供一种用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的PCR引物组，引物组中引物的信息如下：
用于鉴别猪肉的引物组，其上游引物的序列为TAGGAGACCCAGAHAACT(SEQ ID NO:1)；
下游引物的核苷酸序列为TAGGAAGTATAAGATGGAG(SEQ ID NO:2)；
用于鉴别鸡肉的引物组，其上游引物的序列为TAGGAGACCCAGAHAACT(SEQ ID NO:1)，
下游引物的序列为GAGGACTGAGGCTGCT(SEQ ID NO:3)；
用于鉴别兔肉的引物组，其上游引物的序列为TAGGAGACCCAGAHAACT(SEQ ID NO:1)；
下游引物的序列为AAGGACCATGAGGTCGG(SEQ ID NO:4)；
上述的引物组用于制备用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的制品；
本发明另一个方面提供一种鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的方法，是使用上述的引物组进行PCR扩增检测鉴定。
上述的方法，其一种操作步骤如下：
1)提取检测样品的DNA
提取待检测样品的DNA作为检测用的模板
2)PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水；
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min；
3)电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将扩增产物与6×Loading Buffer混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。
本发明所建立的一种一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的PCR技术检测方法，其中根据猪、鸡、兔肉线粒体细胞色素b基因所设计的3对特异性引物，其扩增出的条带特异性明显，能有效检测出掺假肉品种类，且引物数量较传统方法大为减少，从而减少了假阳性的出现。该方法准确、可靠、简单快捷，可用于混合或加工食品中肉类种属的筛选和肉类掺假的检测和监管。
附图说明
图1为猪、鸡、兔的标准PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3为分别加入猪、鸡、兔引物后的PCR扩增条带；泳道4：阴性对照；
图2为实施例2～4的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3、泳道4～6、泳道7～9分别为实施例2～4的PCR扩增条带；泳道1～9依次为加入猪、鸡、兔、兔、猪、鸡、兔、猪、鸡引物后的PCR扩增条带；
图3为实施例5～6的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3、泳道4～6分别为实施例5～6的PCR扩增条带；泳道1～6依次为加入兔、猪、鸡、兔、猪、鸡引物后的PCR扩增条带；泳道7：阴性对照；
图4为实施例7的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3依次为加入猪、鸡、兔引物后的PCR扩增条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。
实施例1：扩增引物的筛选
首先对PCR反应中最重要的引物进行设计，并对所设计的引物的检测灵敏度进行验证筛选。
1)引物设计
选用种属间特异性差异明显的线粒体细胞色素b基因作为靶基因，同时，为了既实现一次性鉴别出鸡肉、兔肉和猪肉3个物种的目的，又减少实验中所加入引物的数量，首先确定各组物种的细胞色素b基因的高度保守区，然后在各物种的高度保守区中找出彼此的差异区，在差异区设计特异性引物组。利用Oligo 6.0，Primer5.0，DNAMAN等软件设计多组引物，要求退火温度大致相同，这样才能实现一次PCR反应能够扩增出3条目的条带，并在预实验中设计引物特异性试验、模板之间的交叉试验来进行筛选；确定了几组待筛选的引物组。
2)灵敏度检验
对设计的几组引物进行检测灵敏度的筛选，首先是设置3组鸡肉/兔肉/猪肉的梯度比例，分别为10g/10g/100g、1g/1g/100g和0.1g/0.1g/100g，将三者充分混匀后用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份200mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品，然后进行PCR扩增，所用的25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。最后确定了能检测出鸡肉或兔肉当掺杂量低至0.1g/0.1g/100g的引物组(在实际的制售掺假肉环节，1g/100g的掺假廉价肉对于商贩来说无利可图，因此检测限已足够低。)
最终所筛选出的引物组，其引物的信息如下：
猪：F-TAGGAGACCCAGAHAACT；(H＝A/C)(SEQ ID NO:1)
R猪-TAGGAAGTATAAGATGGAG；(SEQ ID NO:2)
鸡：F-TAGGAGACCCAGAHAACT；(SEQ ID NO:1)
R鸡-GAGGACTGAGGCTGCT；(SEQ ID NO:3)
兔：F-TAGGAGACCCAGAHAACT；(SEQ ID NO:1)
R兔-AAGGACCATGAGGTCGG；(SEQ ID NO:4)。
上述引物组的扩增结果如图1所示，M表示标准分子量Marker，泳道1为猪的特异性扩增条带，泳道2为鸡的特异性扩增条带，泳道3为兔的特异性扩增条带，泳道4为阴性对照。其中从图中所示条带的位置可知，猪的特异性引物F/R猪的扩增长度为331bp，鸡的特异性引物F/R鸡的扩增长度为148bp，兔的特异性引物F/R兔的扩增长度为256bp。
实施例2
1、样品准备及DNA提取
取适量市售鸡肉和兔肉，混合成均质后用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，对应泳道在148bp和256bp处均出现特异性目标条带，而在猪对应泳道中未出现目标条带，说明检测样本中含有鸡肉和兔肉。
实施例3
1、样品准备及DNA提取
取适量市售猪肉另加少量鸡肉和兔肉混合后制成饺子馅，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在331bp、148bp和256bp处均出现特异性目标条带，说明检测样本中含有猪肉、鸡肉和兔肉。
实施例4
1、样品准备及DNA提取
取适量市售猪肉和兔肉，混合后制成均质，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在331bp和256bp处均出现特异性目标条带，说明检测样本中含有猪肉和兔肉。
实施例5
1、样品准备及DNA提取
取适量市售猪肉和鸡肉，混合成均质后用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图3可知，相应泳道在331bp和148bp处出现特异性目标条带，说明检测样本中含有猪肉和鸡肉。
实施例6
1、样品准备及DNA提取
取市售兔肉，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图3可知，相应泳道在256bp处出现特异性条带，说明检测样本中含有兔肉。
实施例7
1、样品准备及DNA提取
取市售猪肉饺子馅，每种肉用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品，然后再将提取好的各肉DNA等量充分混合。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图4可知，相应泳道只在331bp处出现特异性条带，说明检测样本中只含有猪肉，没有鸡、兔肉的掺假。
上述的结果表明本发明所提供的引物组能够有限的鉴定猪肉、鸡肉和兔肉。
Claims (1)
1.一种用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中用于鉴别猪肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1，下游引物的序列为SEQ ID NO:2；
用于鉴别鸡肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3，
下游引物的序列为SEQ ID NO:4；
用于鉴别兔肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5；
下游引物的序列为SEQ ID NO:6。
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