CN102876805A - 鹿猪牛羊马驴兔鸡的pcr鉴定用引物体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，该引物体系可一次性检测多达八个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的；且本发明引物均仅对各自物种目标片段进行特异性扩增，不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种及以上引物对的多重PCR反应，从能有效缩短实验时间；此外在进行PCR时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效的鉴定鹿血制品的真伪及掺假情况，为鹿血的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。

Description

鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，适用于上述八种动物血液制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿血液制品的快速防伪鉴定。

背景技术

鹿血为鹿科动物的血液，据《本草纲目》记载：“鹿血大补虚损，益精血，解痘毒、药毒”。鹿血作为传统的珍贵中药材具有不可替代性，其药用价值一直以来得到广泛认可和深入开发，产品系列不断丰富，包括鹿血酒、鲜鹿血、鹿血晶等，所产生的市场价值和需求十分巨大。在经济利益的驱使下，不法分子常常会利用其它常见动物血液假冒鹿血，或在鹿血产品中掺入其他常见动物血以次充好来降低成分，常用的动物血液为猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的血液。但目前鹿血的品质检测一直没有很好的手段，传统目测及理化分析方法无法有效地判别这些性质十分相似的血液样品。为了确保鹿血的真实度和纯度，从源头上控制鹿血的品质，开发用于鉴别常见物种血液样品的简便快速的现代分子生物学检测技术具有迫切性和必要性。

聚合酶链式反应（PCR）技术具有响应快速、灵敏度高且特异性好的优点，是当前应用最广的先进分子生物学技术，该技术利用特异的引物可以从微量样品中扩增出相应特定的DNA片段，达到放大核酸信号的目的。同时，PCR具有非常高的反应特异性，可以区分少至几个核苷酸碱基的差异，因此PCR技术在诊断性检测领域得到广泛深入的应用。由于在进化过程中不同物种的遗传物质DNA存在序列上的保守性和多变性，尤其在物种内部具有较高的保守性，而物种之间存在较大的差异性。利用PCR技术上述的高度灵敏性和特异性，可以区分不同物种材料，尤其是具有较高经济价值的产品。而线粒体DNA相对基因组DNA具有更高的突变率和遗传多变性，因此线粒体DNA序列的差异常用于不同物种及物种内部的进化分析及诊断检测。

目前国内外针对上述报道的文献较少，且大多是针对少量物种进行的。如Dalmasso A等人为抑制疯牛病传播，防止在其他产品中掺入牛制品，利用多元PCR技术鉴定饲料中动物成分，使用了四对引物分别针对反刍动物、家禽、鱼和猪，引物设计时针对的基因为：12S rRNA，tRNA Val及16S rRNA（Dalmasso A, Fontanella E, Piatti P, Civera T, Rosati S, Bottero MT, A multiplex PCRassay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes, 2004, 18: 81-87.）。Ghovvati, S.等人为鉴定工厂肉制品中是否掺假，防止伊斯兰教食品中掺入猪肉制品，设计了分别针对反刍动物、家禽及猪的三对引物，引物设计时针对的基因为：12S rRNA及16S rRNA（Ghovvati,S., M.R.Nassiri, S.Z. Mirhoseini, A.H. Moussavi, A. Javadmanes, Fraud identification in industrial meat productsbymultiplex PCR assay. Food Control, 2009,20:696-699.）。又如Dai-Ming Zha等人为检测鹿产品中的掺假情况，设计了四对分别针对牛、羊、家禽和猪的引物，引物设计时针对的基因为：tRNA Val和16S rRNA（Dai-Ming Zha, Xiu-Mei Xing, Fu-He Yang,A multiplex PCR assay for fraud identification of deer products, Food Control, 2010,21:1402-1407.）。但上述方案并未设计针对鹿的引物，因此虽然能测定样品中是否含有这四类物质，但不能确定是否是鹿产品。

由以上具有代表性的研究结果可以看出，这些检测存在下列不足：（1）检测范围窄，一次只能检测少量物种，基本不会大于四个。这是由于在同一个总DNA模板体系中，引物对的数量越多，引物对与总DNA模板之间的相互干扰越严重，PCR反应的特异性也越不能保证；（2）没有建立对大量常见物种的快速且特异性高的引物体系及检测方法，这也会造成漏检现象。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速且特异性高的检测鹿猪牛羊马驴兔鸡血液制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿血产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：

（1）对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3’

反向引物：5’-AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3’；

（2）对猪12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

正向引物：5’-AGCACACCTATAACGGTAGCTCA-3’

反向引物：5’-CCTAGCTATCGTGTGTCAGGATT-3’；

（3）对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅲ：

正向引物：5’-CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3’

反向引物：5’-GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3’；

（4）对羊Cytb基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅳ：

正向引物：5’-CGCCATGCTACTAATTCTTGTTCT-3’

反向引物：5’-TGGAGGAAGGGTACAAGTACTAAG-3’；

（5）对马基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对组合，该引物对组合由对马Cytb基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对Ⅴ和对马12S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对Ⅵ组成：

引物对Ⅴ：

正向引物：5’-CACAGCCCTGGTAGTCGTACA-3’

反向引物：5’-TGTCCGCCGATTCATGTTAGT-3’；

引物对Ⅵ：

正向引物：5’-CGTGTCAAAGACTAATACCAA-3’

反向引物：5’-AGCTATCGTGTAGTCAGAGGTA-3’；

（6）对驴16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对Ⅶ：

正向引物：5’-TTCAAGCTCAACGTCACACATA-3’

反向引物：5’-TGTGTTGGGTTAACAATAGTCT-3’；

（7）对兔12S rRNA基因进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅷ：

正向引物：5’-GCGTAAAGCGTGATTAGAATAAAC-3’

反向引物：5’-TAGCTATCGTGAGTTCGAAGAGT-3’；

（8）对鸡12S rRNA基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅸ：

正向引物：5’-ATCCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’

反向引物：5’-CTATTGAGCTCACTGTTGTTCTTT-3’。

本发明通过分析鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡八种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因（包括12S rRNA、16S rRNA和Cytb），进行序列测定及比对后，根据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，因此能够快速准确的对各物种进行定性检测。本发明的引物对均可通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA合成技术来获得。

本发明还提供了一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定方法为，以样品总DNA为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品总DNA模板来自鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡物种血液的混合，或上述各物种血液产品中的一种。

所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水3体积份、10×PCR反应缓冲液1体积份、2.5mM each的dNTPs 0.8体积份、2.5U/μl的Taq酶0.2体积份、经稀释500倍的总DNA模板1体积份、1μM正向引物2体积份和1μM反向引物2体积份。其最优组分为双蒸水3μl、10×PCR反应缓冲液1μl、2.5mM each的dNTPs 0.8μl、2.5U/μl的Taq酶0.2μl、经稀释500倍的总DNA模板1μl、1μM正向引物2μl和1μM反向引物2μl，共计10μl。

所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为：依次进行94℃下预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束。

本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ分别扩增出的DNA片段大小；其中

鹿物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为376bp；

猪物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为300bp；

牛物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为360bp；

羊物种的引物对Ⅳ扩增出的DNA片段大小为231bp；

马物种的由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合扩增出的DNA片段大小为分别对应为456bp和115bp；

驴物种的引物对Ⅶ扩增出的DNA片段大小为232bp；

兔物种的引物对Ⅷ扩增出的DNA片段大小为126bp；

鸡物种的引物对Ⅸ扩增出的DNA片段大小为299bp。

本发明还提供了一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用试剂盒，包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ。可以将本发明所述引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。

本发明试剂盒可以是由多个隔断所形成，用以容纳固定一个或多个如管或小瓶类的容器。这些容器中可以分别装有本发明中各物种的引物对，也可以将各物种的引物对按照一定比例混合成引物对混合物后装于其中，根据实际需要各物种的引物对或引物对混合物可以是冻干形式或者溶于前述相关试剂中的状态。

本发明所述试剂盒用于单物种总DNA模板进行鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的物种鉴定。且所述试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的物种鉴定。所述试剂盒尤其适用于鹿血液产品的真伪及掺假判定。

本发明的有益技术效果是：通过使用本发明的引物体系，可以一次性检测多达八个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的；并且本发明的引物均仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种或两种以上引物对的多重PCR反应，从而能有效的缩短实验时间；此外在进行PCR反应时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效的鉴定鹿血制品的真伪及掺假情况，为鹿血的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。

附图说明

图1是本发明所述八种动物血液提取出的总DNA模板的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是以本发明所述鹿12S rRNA基因的引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图3是以本发明所述猪12S rRNA基因的引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图4是以本发明所述牛Cytb基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图5是以本发明所述羊Cytb基因的引物对Ⅳ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图6 是以本发明所述马的两对特异性引物，即马Cytb基因的特异性引物对Ⅴ和马12S rRNA基因的特异性引物对Ⅵ共同作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图7是以本发明所述驴16S rRNA基因的引物对Ⅶ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图8是以本发明所述兔12S rRNA基因的引物对Ⅷ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图9是以本发明所述鸡12S rRNA基因的引物对Ⅸ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图10是以本发明所述各物种总DNA样品按同体积混合后的混合总DNA样品为模板，使用各物种特异性引物分别与此混合总DNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

其中M代表标准核算分子量标签，图1中该标签自上向下依次为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp和100bp；图2至图10中该标签自上向下依次为500bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp和50bp；其中图1至图10中编号1~8依次代表鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

一、各物种特异性引物的设计：

针对进化上较不保守的线粒体DNA，利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)核酸序列数据库，对鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡八个常见物种进行DNA序列测定及比对分析，筛选出遗传多变的特定目标区域，包括12S rRNA、16S rRNA和Cytb 3个基因，针对上述基因各序列上的特异性碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，并经NCBI BLAST数据库进行在线比对，进一步确认引物的物种特异性，用于PCR扩增目的片段。

各引物如下所述：

对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3’（SEQ ID NO.1）

反向引物：5’-AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3’ （SEQ ID NO.2）；

对猪12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

正向引物：5’-AGCACACCTATAACGGTAGCTCA-3’ （SEQ ID NO.3）

反向引物：5’-CCTAGCTATCGTGTGTCAGGATT-3’ （SEQ ID NO.4）；

对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅲ：

正向引物：5’-CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3’ （SEQ ID NO.5）

反向引物：5’-GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3’ （SEQ ID NO.6）；

对羊Cytb基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅳ：

正向引物：5’-CGCCATGCTACTAATTCTTGTTCT-3’ （SEQ ID NO.7）

反向引物：5’-TGGAGGAAGGGTACAAGTACTAAG-3’ （SEQ ID NO.8）；

对马基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对组合，该引物对组合由对马Cytb基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对Ⅴ和对马12S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对Ⅵ组成：

引物对Ⅴ：

正向引物：5’-CACAGCCCTGGTAGTCGTACA-3’ （SEQ ID NO.9）

反向引物：5’-TGTCCGCCGATTCATGTTAGT-3’ （SEQ ID NO.10）；

引物对Ⅵ：

正向引物：5’-CGTGTCAAAGACTAATACCAA-3’ （SEQ ID NO.11）

反向引物：5’-AGCTATCGTGTAGTCAGAGGTA-3’ （SEQ ID NO.12）；

对驴16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对Ⅶ：

正向引物：5’-TTCAAGCTCAACGTCACACATA-3’ （SEQ ID NO.13）

反向引物：5’-TGTGTTGGGTTAACAATAGTCT-3’ （SEQ ID NO.14）；

对兔12S rRNA基因进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅷ：

正向引物：5’-GCGTAAAGCGTGATTAGAATAAAC-3’（SEQ ID NO.15）

反向引物：5’-TAGCTATCGTGAGTTCGAAGAGT-3’ （SEQ ID NO.16）；

对鸡12S rRNA基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅸ：

正向引物：5’-ATCCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’ （SEQ ID NO.17）

反向引物：5’-CTATTGAGCTCACTGTTGTTCTTT-3’ （SEQ ID NO.18）。

二、各物种血液总DNA的抽提：

上述八种动物的血液采集于健康动物活体，使用抗凝试管分装（1ml/管），冻存于－80℃，进行血液总DNA抽提前放至室温。各动物物种血液总DNA（其中包括线粒体DNA）的抽提均采用QIAGEN公司QIAamp?DNA Mini and Blood Mini 试剂盒进行，其抽提步骤如下所述：

（1）吸取20μl蛋白酶（Protease）至1.5ml离心管底部；

（2）加入200μl所采集的上述八种动物血液样品中的一种，轻柔吹打混匀；加入200μl AL缓冲液，点震混匀15s；

（3）在56℃温育10分钟后，进行短暂离心；

（4）加入200 μl 无水乙醇后点震混匀15s，然后进行短暂离心，得到混合液；

（5）预先将微量旋转柱（Mini spin column）置于2ml收集管上，然后将（4）中所得混合液移入Mini spin column，然后在12000r/min下离心1min，离心结束将Mini spin column置于一个新的2ml收集管之上；

（6）打开Mini spin column的盖子，加入500 μl AW1的缓冲液，然后在12000r/min下离心1min后，将Mini spin column置于一个新的2ml收集管上；

（7）打开Mini spin column的盖子，加入500 μl AW2缓冲液后在16000r/min下离心1min；

（8）将Mini spin column置于一个剪去盖子的新1.5ml收集管上，于16000r/min下离心2min；然后将Mini spin column再次置于一个剪去盖子的新1.5ml收集管上，加入200μl AE缓冲液，室温静置1min后，于12000r/min下离心1min；最后将洗脱下来的总DNA样品冻存于-20℃。

由上述步骤抽提所得各动物物种的总DNA是否能用于进一步的扩增实验，需要通过琼脂糖凝胶电泳实验进行判定，若得到染色清晰的条带，则说明抽提所得总DNA可用于进一步的扩增实验。本发明中将抽提所得的各物种总DNA样品进行1wt.%琼脂糖凝胶电泳实验，并在凝胶中加入溴化乙锭（EB）进行染色。采用120V电泳40分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。其中各加样孔上样量为20μl。

所得结果如图1所示。由图1可以看出，本发明所述各动物血液抽提所得的总DNA样品经电泳染色后，得到非常清晰的条带，并无弥散不清的情况，说明样品线粒体DNA完整无降解，质量很好可用于进一步的PCR实验。

三、各物种特异性引物对进行PCR实验：

采用步骤一中合成所得各动物物种的特异性引物对进行PCR实验，所选用的总DNA模板可以为步骤二中各动物物种的总DNA样品，也可以为将步骤二中所得各动物物种总DNA样品按一定比例混合后的混合总DNA样品。在本发明中，针对所述各物种总DNA样品和混合总DNA样品均在同样的PCR反应系统和同样的PCR反应程序下进行。具体如下所述。

实施方式一：

以所述各物种总DNA样品为总DNA模板：

（1）各物种总DNA样品的处理：将所述八种动物的总DNA样品各取1μl后稀释500倍，作为总DNA模板，并将引物稀释至1μmol/L；

（2）反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μl/管。

双蒸水3μl、10×PCR反应缓冲液1μl、2.5mM each的dNTPs 0.8μl、2.5U/μl的Taq酶0.2μl、（1）中所述总DNA模板1μl、1μM正向引物2μl和1μM反向引物2μl；其中Taq酶为常规Taq酶（参见Tiangen公司的Taq酶说明书）。

（3） PCR反应程序的制定：依次进行94℃下预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。

（4）2wt.%琼脂糖凝胶电泳：将（3）中所得PCR反应产物进行2wt.%琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭（EB）进行染色，然后再120V下电泳40分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。

所得凝胶成像结果如图2至图9所示。

其中图2是分别采用八种动物的总DNA模板，以鹿12S rRNA基因的引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示鹿物种特异引物对Ⅰ仅对鹿血总DNA模板特异扩增出376bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

图3是分别采用八种动物的总DNA模板，以猪12S rRNA基因的引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示猪物种特异引物对Ⅱ仅对猪血总DNA模板特异扩增出300bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

图4是分别采用八种动物的总DNA模板，以牛Cytb基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示牛物种特异引物对Ⅲ仅对牛血总DNA模板特异扩增出360bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

图5是分别采用八种动物的总DNA模板，以羊Cytb基因的引物对Ⅳ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示羊物种特异引物对Ⅳ仅对羊血总DNA模板特异扩增出231bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

图6是分别采用八种动物的总DNA模板，以马的两对特异性引物，即马Cytb基因的特异性引物对Ⅴ和马12S rRNA基因的特异性引物对Ⅵ共同作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示上述两对马物种的特异性引物仅对马血总DNA模板特异扩增出了456bp和115bp大小的两个条带，而对其他物种DNA模板无扩增。

图7是分别采用八种动物的总DNA模板，以驴16S rRNA基因的引物对Ⅶ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示驴物种特异引物对Ⅶ仅对驴血总DNA模板特异扩增出232bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

图8是分别采用八种动物的总DNA模板，以兔12S rRNA基因的引物对Ⅷ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示兔物种特异引物对Ⅷ仅对兔血总DNA模板特异扩增出126bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

图9是分别采用八种动物的总DNA模板，以鸡12S rRNA基因的引物对Ⅸ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。 结果显示鸡物种特异引物对Ⅸ仅对鸡血总DNA模板特异扩增出299bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。

通过上述实验及实验结果可知，当上述各物种的单对引物（马为两对引物）均分别与八种总DNA模板进行PCR实验时，确定该引物仅对其自身物种的总DNA模板有反应，而对其他七个物种的总DNA模板没有反应，以单物种DNA模板方式验证了各物种引物的特异性。

实施方式二：

以所述各物种总DNA样品按照一定比例混合后的混合总DNA样品为模板：

（1）混合总DNA样品的处理：将所述八种动物的总DNA样品等体积混合，其中每种各占12.5vol.%，所得为混合总DNA样品。取1μl该混合总DNA样品并稀释500倍，作为混合总DNA模板，并将引物稀释至1μmol/L；

（2）反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μl/管。

双蒸水3μl、10×PCR反应缓冲液1μl、2.5mM each的dNTPs 0.8μl、2.5U/μl的Taq酶0.2μl、（1）中所述混合总DNA模板1μl、1μM正向引物2μl和1μM反向引物2μl；其中Taq酶为常规Taq酶（参见Tiangen公司的Taq酶说明书）。

（3） PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例一中的反应程序。

（4）2wt.%琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程及条件同实施例一中的电泳。

所得凝胶成像结果如图10所示。该方法以各物种特异性引物分别与混合总DNA模板进行PCR扩增反应，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。由图10可以看出的，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。

根据上述实施例一和实施例二中所述的PCR反应体系，本发明所述引物体系可以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，可用于对鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡物种鉴

定，尤其适用于用于鹿血液产品的真伪及掺假判定。

Claims (10)

1.一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系，其特征在于：由下列引物对组成：

（1）对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3’

反向引物：5’-AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3’；

（2）对猪12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

正向引物：5’-AGCACACCTATAACGGTAGCTCA-3’

反向引物：5’-CCTAGCTATCGTGTGTCAGGATT-3’；

（3）对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅲ：

正向引物：5’-CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3’

反向引物：5’-GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3’；

（4）对羊Cytb基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅳ：

正向引物：5’-CGCCATGCTACTAATTCTTGTTCT-3’

反向引物：5’-TGGAGGAAGGGTACAAGTACTAAG-3’；

（5）对马基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对组合，该引物对组合由对马Cytb基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对Ⅴ和对马12S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对Ⅵ组成：

引物对Ⅴ：

正向引物：5’-CACAGCCCTGGTAGTCGTACA-3’

反向引物：5’-TGTCCGCCGATTCATGTTAGT-3’；

引物对Ⅵ：

正向引物：5’-CGTGTCAAAGACTAATACCAA-3’

反向引物：5’-AGCTATCGTGTAGTCAGAGGTA-3’；

（6）对驴16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对Ⅶ：

正向引物：5’-TTCAAGCTCAACGTCACACATA-3’

反向引物：5’-TGTGTTGGGTTAACAATAGTCT-3’；

（7）对兔12S rRNA基因进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅷ：

正向引物：5’-GCGTAAAGCGTGATTAGAATAAAC-3’

反向引物：5’-TAGCTATCGTGAGTTCGAAGAGT-3’；

（8）对鸡12S rRNA基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅸ：

正向引物：5’-ATCCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’

反向引物：5’-CTATTGAGCTCACTGTTGTTCTTT-3’。

2.一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定方法，其特征在于：以样品总DNA为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品总DNA模板来自鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡物种血液的混合，或上述各物种血液产品中的一种。

3.根据权利要求2所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水3体积份、10×PCR反应缓冲液1体积份、2.5mM each的dNTPs 0.8体积份、2.5U/μl的Taq酶0.2体积份、经稀释500倍的总DNA模板1体积份、1μM正向引物2体积份和1μM反向引物2体积份。

4.根据权利要求3所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水3μl、10×PCR反应缓冲液1μl、2.5mM each的dNTPs 0.8μl、2.5U/μl的Taq酶0.2μl、经稀释500倍的总DNA模板1μl、1μM正向引物2μl和1μM反向引物2μl。

5.根据权利要求2所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为：依次进行94℃下预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束。

6.根据权利要求2至5所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ分别扩增出的DNA片段大小；其中

鹿物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为376bp；

猪物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为300bp；

牛物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为360bp；

羊物种的引物对Ⅳ扩增出的DNA片段大小为231bp；

马物种的由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合扩增出的DNA片段大小为分别对应为456bp和115bp；

驴物种的引物对Ⅶ扩增出的DNA片段大小为232bp；

兔物种的引物对Ⅷ扩增出的DNA片段大小为126bp；

鸡物种的引物对Ⅸ扩增出的DNA片段大小为299bp。

7.一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、由引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成的引物对组合、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ。

8.根据权利要求7所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于单物种总DNA模板进行鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的物种鉴定。

9.根据权利要求7所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的物种鉴定。

10.根据权利要求7所述的鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于鹿血液产品的真伪及掺假判定。

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