CN104745707A - 兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系 - Google Patents

兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系 Download PDF

Info

Publication number
CN104745707A
CN104745707A CN201510163176.3A CN201510163176A CN104745707A CN 104745707 A CN104745707 A CN 104745707A CN 201510163176 A CN201510163176 A CN 201510163176A CN 104745707 A CN104745707 A CN 104745707A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
primer pair
pcr
species
deer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510163176.3A
Other languages
English (en)
Inventor
周辰杰
宋平
王瑜
陈建兵
张磊
党平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU HONGGUANZHUANG MEDICINES Co Ltd
Original Assignee
SUZHOU HONGGUANZHUANG MEDICINES Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU HONGGUANZHUANG MEDICINES Co Ltd filed Critical SUZHOU HONGGUANZHUANG MEDICINES Co Ltd
Priority to CN201510163176.3A priority Critical patent/CN104745707A/zh
Publication of CN104745707A publication Critical patent/CN104745707A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，该引物体系可一次性检测多达十个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的；且本发明引物均仅对各自物种目标片段进行特异性扩增，不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种及以上引物对的多重PCR反应，从能有效缩短实验时间；此外在进行PCR时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效的鉴定鹿血制品的真伪及掺假情况，为鹿血的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。

Description

兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物体系
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，适用于上述十种动物血液制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿血液制品的快速防伪鉴定。
背景技术
鹿血为鹿科动物的血液，据《本草纲目》记载：“鹿血大补虚损，益精血，解痘毒、药毒”。鹿血作为传统的珍贵中药材具有不可替代性，其药用价值一直以来得到广泛认可和深入开发，产品系列不断丰富，包括鹿血酒、鲜鹿血、鹿血晶等，所产生的市场价值和需求十分巨大。在经济利益的驱使下，不法分子常常会利用其它常见动物血液假冒鹿血，或在鹿血产品中掺入其他常见动物血以次充好来降低成分，常用的动物血液为猪、马、驴、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅的血液。但目前鹿血的品质检测一直没有很好的手段，传统目测及理化分析方法无法有效地判别这些性质十分相似的血液样品。为了确保鹿血的真实度和纯度，从源头上控制鹿血的品质，开发用于鉴别常见物种血液样品的简便快速的现代分子生物学检测技术具有迫切性和必要性。
聚合酶链式反应(PCR)技术具有响应快速、灵敏度高且特异性好的优点，是当前应用最广的先进分子生物学技术，该技术利用特异的引物可以从微量样品中扩增出相应特定的DNA片段，达到放大核酸信号的目的。同时，PCR具有非常高的反应特异性，可以区分少至几个核苷酸碱基的差异，因此PCR技术在诊断性检测领域得到广泛深入的应用。由于在进化过程中不同物种的遗传物质DNA存在序列上的保守性和多变性，尤其在物种内部具有较高的保守性，而物种之间存在较大的差异性。利用PCR技术上述的高度灵敏性和特异性，可以区分不同物种材料，尤其是具有较高经济价值的产品。而线粒体DNA相对基因组DNA具有更高的突变率和遗传多变性，因此线粒体DNA序列的差异常用于不同物种及物种内部的进化分析及诊断检测。
目前虽然有专利报道对常见物种动物血液中DNA进行PCR鉴定技术从而进行防伪和掺假鉴定，但由于在同一个总DNA模板体系中，引物对的数量越多，引物对与总DNA模板之间的相互干扰越严重，PCR反应的特异性就越不能保证，因此其所适用的鉴定范围非常狭窄，能够同时适用的常见物种非常有限，在实际应用中并不能达到很好的鉴定效果。
发明内容
为了克服上述现有技术中出现的问题，本发明提供了一种兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速且特异性高的检测兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿血液制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿血产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物，由下列引物对组成：
(1)对兔12S rRNA基因进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物：5’-CGGCGTAAAGCGTGATTAGAATAA-3’
反向引物：5’-GCTATCGTGAGTTCGAAGAGTAT-3’；
(2)对鸡12S rRNA基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物：5’-CCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’
反向引物：5’-GGCTATTGAGCTCACTGTTGTT-3’；
(3)对鸭D-Loop基因进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物：5’-GCGCTATCCTATATCTCAGGGATTA-3’
反向引物：5’-TGATTGTCATCGGGTTTGGATCGT-3’；
(4)对鹅Cytb基因进行扩增生成鹅特异性扩增片段的引物对Ⅳ：
正向引物：5’-ATCCCGTACATTGGGCAAACTCTA-3’
反向引物：5’-TAGAGGGGTGATTATTAAGGTAAG-3’；
(5)对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅴ：
正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’
反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；
(6)对山羊Cytb基因进行扩增生成山羊特异性扩增片段的引物对Ⅵ：
正向引物：5’-GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT-3’
反向引物：5’-GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT-3’；
(7)对驴16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对Ⅶ：
正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’
反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’；
(8)对马16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物Ⅷ：
正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’
反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’；
(9)对猪12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物Ⅸ：
正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’
反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’；
(10)对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅹ：
正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’
反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’。
本发明通过分析兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿十种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因(包括12SrRNA、16S rRNA、Cytb和D-Loop)，进行序列比对后，根据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，因此能够快速准确的对各物种进行定性检测。本发明的引物对均可通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA合成技术来获得。
本发明还提供了一种兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物的鉴定方法，该方法为以样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII、引物对VIII、引物对IX和引物对X分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品总DNA模板来自兔、鸡、鸭、鹅、牛、山羊、驴、马、猪和鹿物种血液的混合，或上述各物种血液产品中的一种。
所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水2体积份、2×PCR预混Taq酶5体积份、经稀释500倍的总DNA模板1体积份、2μM正向引物1体积份、2μM反向引物1体积份。其最优组分为，双蒸水2μl、2×PCR预混Taq酶5μl、经稀释500倍的总DNA模板1μl、2μM正向引物1μl、2μM反向引物1μl。
所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为：依次进行94℃下预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束。
本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对I、引物II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII、引物对VIII、引物对IX和引物对X分别扩增出的DNA片段大小；其中：
兔物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为126bp；
鸡物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为299bp；
鸭物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为282bp；
鹅物种的引物对Ⅳ扩增出的DNA片段大小260bp；
牛物种的引物对Ⅴ扩增出的DNA片段大小为360bp；
山羊物种的引物对Ⅵ扩增出的DNA片段大小为231bp；
驴物种的引物对Ⅶ扩增出的DNA片段大小为232bp；
马物种的引物对Ⅷ扩增出的DNA片段大小568bp；
猪物种的引物对Ⅸ扩增出的DNA片段大小为300bp；
鹿物种的引物对Ⅹ扩增出的DNA片段大小为376bp。
本发明还提供了一种兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用试剂盒，包括所述引物对I、引物II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII、引物对VIII、引物对IX和引物对X。可以将本发明所述引物对以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。
本发明试剂盒可以是由多个隔断所形成，用以容纳固定一个或多个如管或小瓶类的容器。这些容器中可以分别装有本发明中各物种的引物对，也可以将各物种的引物对按照一定比例混合成引物对混合物后装于其中，根据实际需要各物种的引物对或引物对混合物可以是冻干形式或者溶于前述相关试剂中的状态。
本发明所述试剂盒用于单物种总DNA模板进行兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿的物种鉴定。且所述试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿的物种鉴定。所述试剂盒尤其适用于鹿血液产品的真伪及掺假判定。
本发明的有益技术效果是：通过使用本发明的引物体系，
可以一次性检测多达十个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的；并且本发明的引物均仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种或两种以上引物对的多重PCR反应，从而能有效的缩短实验时间；此外在进行PCR反应时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效的鉴定鹿血制品的真伪及掺假情况，为鹿血的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。
附图说明
图1是以本发明所述鹿12S rRNA基因的引物对Ⅹ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图2是以本发明所述猪12S rRNA基因的引物对Ⅸ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图3是以本发明所述马16S rRNA基因的引物Ⅷ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图4是以本发明所述驴16S rRNA基因的引物对Ⅶ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图5是以本发明所述牛Cytb基因的引物对Ⅴ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图6是以本发明所述羊(山羊)Cytb基因的引物对VI作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图7是以本发明所述兔12S rRNA基因的引物对I作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图8是以本发明所述鸡12S rRNA基因的引物对II作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图9是以本发明所述鸭D-Loop基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图10是以本发明所述鹅Cytb基因的引物对Ⅳ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
图11是以本发明所述各物种总DNA样品按同体积混合后的混合总DNA样品为模板，使用各物种特异性引物分别与此混合总DNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；
其中M代表标准核算分子量标签，该标签自上向下依次为500bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp和50bp；图1至图10中鹿、猪、马、驴、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅的标签分别表示对应物种的总DNA模板；图11中鹿、猪、马、驴、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅的标签分别表示对应物种的特异性引物对。
具体实施方式
下面结合具体实施例及图1至图11对本发明做进一步的详细说明。
一、各物种特异性引物的设计：
针对进化上较不保守的线粒体DNA，利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)核酸序列数据库，对兔、鸡、鸭、鹅、牛、羊、驴、马、猪和鹿十个常见物种进行DNA序列分析及比对，筛选出遗传多变的特定目标区域，包括12S rRNA、16SrRNA、Cytb、D-Loop等基因，针对上述基因各序列上的特异性碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，并通过NCBI BLAST进行在线比对，进一步确认引物的物种特异性，用于PCR扩增目的片段。
各引物如下所述：
(1)对兔12S rRNA基因进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物：5’-CGGCGTAAAGCGTGATTAGAATAA-3’(SEQ ID NO.1)
反向引物：5’-GCTATCGTGAGTTCGAAGAGTAT-3’；(SEQ ID NO.2)
(2)对鸡12S rRNA基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物：5’-CCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’(SEQID NO.3)
反向引物：5’-GGCTATTGAGCTCACTGTTGTT-3’；(SEQID NO.4)
(3)对鸭D-Loop基因进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物：5’-GCGCTATCCTATATCTCAGGGATTA-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-TGATTGTCATCGGGTTTGGATCGT-3’；(SEQ ID NO.6)
(4)对鹅Cytb基因进行扩增生成鹅特异性扩增片段的引物对Ⅳ：
正向引物：5’-ATCCCGTACATTGGGCAAACTCTA-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-TAGAGGGGTGATTATTAAGGTAAG-3’；(SEQ ID NO.8)
(5)对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅴ：
正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’(SEQID NO.9)
反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；(SEQID NO.10)
(6)对山羊Cytb基因进行扩增生成山羊特异性扩增片段的引物对Ⅵ：
正向引物：5’-GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT-3’(SEQ ID NO.11)
反向引物：5’-GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT-3’；(SEQ ID NO.12)
(7)对驴16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对Ⅶ：
正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’(SEQID NO.13)
反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’；(SEQ ID NO.14)
(8)对马16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物Ⅷ：
正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’(SEQID NO.15)
反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’；(SEQID NO.16)
(9)对猪12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物Ⅸ：
正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’(SEQ ID NO.17)
反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’；(SEQ ID NO.18)
(10)对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅹ：
正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’(SEQID NO.19)
反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’。(SEQ ID NO.20)
二、各物种血液总DNA的抽提：
上述十种动物的血液采集于健康动物活体，使用抗凝试管分装(1ml/管)，冻存于-80℃，进行血液总DNA抽提前放至室温。各动物物种血液总DNA(其中包括线粒体DNA)的抽提采用QIAGEN公司DNA Mini and Blood Mini试剂盒(或其他公司同类DNA抽提试剂盒)进行，其抽提步骤如下所述：
(1)吸取20μl蛋白酶(Protease)至1.5ml离心管底部；
(2)加入200μl所采集的上述十种动物血液样品中的一种，轻柔吹打混匀；加入200μl AL裂解缓冲液，点震混匀15s；
(3)在56℃温育10分钟后，进行短暂离心；
(4)加入200μl无水乙醇后点震混匀15s，然后进行短暂离心，得到混合液；
(5)预先将微量旋转柱(Mini spin column)置于2ml收集管上，然后将(4)中所得混合液移入Mini spin column，然后在12000r/min下离心1min，离心结束将Mini spin column置于一个新的2ml收集管之上；
(6)打开Mini spin column的盖子，加入500μl AW1漂洗缓冲液，然后在12000r/min下离心1min后，将Mini spincolumn置于一个新的2ml收集管上；
(7)打开Mini spin column的盖子，加入500μl AW2漂洗缓冲液后在16000r/min下离心1min；
(8)将Mini spin column置于一个剪去盖子的新1.5ml收集管上，于16000r/min下离心2min；然后将Mini spin column再次置于一个剪去盖子的新1.5ml收集管上，加入200μl AE洗脱缓冲液，室温静置1min后，于12000r/min下离心1min；最后将洗脱下来的总DNA样品冻存于-20℃。
三、各物种特异性引物对进行PCR实验：
采用步骤一中合成所得各动物物种的特异性引物对进行PCR实验，所选用的总DNA模板可以为步骤二中各动物物种的总DNA样品，也可以为将步骤二中所得各动物物种总DNA样品按一定比例混合后的混合总DNA样品。在本发明中，针对所述各物种总DNA样品和混合总DNA样品均在同样的PCR反应系统和同样的PCR反应程序下进行。具体如下所述。
实施方式一：
以所述各物种总DNA样品为总DNA模板：
(1)各物种总DNA样品的处理：将所述种动物的总DNA样品各取1μl后稀释500倍，作为总DNA模板，并将引物稀释至2μM/L；
(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μl/管。
双蒸水2μl、2×PCR预混合Taq酶(2×Taq Master Mix)5μl、(1)中所述总DNA模板1μl、2μM正向引物1μl和2μM反向引物1μl；反应体系所使用的Taq酶为预混合了Taq酶、dNTPs、Mg2+的预混合Taq酶。
(3)PCR反应程序的制定：依次进行94℃下预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。
(4)1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳：将(3)中所得PCR反应产物进行1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。
所得凝胶成像结果如图1至图10所示。其中：
图1是分别采用十种动物的总DNA模板，以鹿12S rRNA基因的引物对Ⅹ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示鹿物种特异引物对仅对鹿血总DNA模板特异扩增出376bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图2是分别采用十种动物的总DNA模板，以猪12S rRNA基因的引物对Ⅸ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示猪物种特异引物对仅对猪血总DNA模板特异扩增出300bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图3是分别采用十种动物的总DNA模板，以马16S rRNA基因的引物对Ⅷ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示马物种特异引物对仅对马血总DNA模板特异扩增出568bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图4是分别采用十种动物的总DNA模板，以驴16S rRNA基因的引物对Ⅶ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示驴物种特异引物对仅对驴血总DNA模板特异扩增出232bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图5是分别采用十种动物的总DNA模板，以牛Cytb基因的引物对V作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示牛物种特异引物对仅对牛血总DNA模板特异扩增出360bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图6是分别采用十种动物的总DNA模板，以羊(山羊)Cytb基因的引物对VI作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示羊(山羊)物种特异引物对仅对羊(山羊)血总DNA模板特异扩增出231bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图7是分别采用十种动物的总DNA模板，以兔12S rRNA基因的引物对I作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示兔物种特异引物对仅对兔血总DNA模板特异扩增出126bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图8是分别采用十种动物的总DNA模板，以鸡12S rRNA基因的引物对II作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示鸡物种特异引物对仅对鸡血总DNA模板特异扩增出299bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图9是分别采用十种动物的总DNA模板，以鸭D-Loop基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示鸭物种特异引物对仅对鸭血总DNA模板特异扩增出282bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图10是分别采用十种动物的总DNA模板，以鹅Cytb基因的引物对Ⅳ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示鹅物种特异引物对仅对鹅血总DNA模板特异扩增出260bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
通过上述实验及实验结果可知，当上述各物种的特异性引物对分别于十种总DNA模板进行PCR实验时，确定该引物对仅与其自身物种的总DNA模板有反应，而与其他九个物种的总DNA模板没有反应，以单物种DNA模板方式验证了各物种引物的特异性。
实施方式二：
以所述各物种总DNA样品按照一定比例混合后的混合总DNA样品为模板：
(1)混合总DNA样品的处理：将所述十种动物的总DNA样品等体积混合，其中每种各占10vol.％，所得为混合总DNA样品。取1μl该混合总DNA样品并稀释500倍，作为混合总DNA模板，并将引物稀释至2μM/L；
(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μl/管。双蒸水2μl、2×PCR预混合Taq酶(2×Taq Master Mix)5μl、(1)中所述混合DNA模板1μl、2μM正向引物1μl和2μM反向引物1μl；反应体系所使用的Taq酶为预混合了Taq酶、dNTPs、Mg2+的预混合酶。
(3)PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例一中的反应程序。
(4)1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程及条件同实施例一中的电泳。
所得凝胶成像结果如图11所示。该方法以各物种特异性引物分别与混合总DNA模板进行PCR扩增反应，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。由图11可以看出的，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。
根据上述实施例一和实施例二中所述的PCR反应体系，本发明所述引物体系可以配合相关试剂制成组装成不同组合的试剂盒，可用于对鹿、猪、马、驴、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅物种鉴定，尤其适用于用于鹿血液产品的真伪及掺假判定。

Claims (10)

1.一种兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物，其特征在于：由下列引物对组成：
(1)对兔12S rRNA基因进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物：5’-CGGCGTAAAGCGTGATTAGAATAA-3’
反向引物：5’-GCTATCGTGAGTTCGAAGAGTAT-3’；
(2)对鸡12S rRNA基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物：5’-CCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’
反向引物：5’-GGCTATTGAGCTCACTGTTGTT-3’；
(3)对鸭D-Loop基因进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物：5’-GCGCTATCCTATATCTCAGGGATTA-3’
反向引物：5’-TGATTGTCATCGGGTTTGGATCGT-3’；
(4)对鹅Cytb基因进行扩增生成鹅特异性扩增片段的引物对Ⅳ：
正向引物：5’-ATCCCGTACATTGGGCAAACTCTA-3’
反向引物：5’-TAGAGGGGTGATTATTAAGGTAAG-3’；
(5)对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅴ：
正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’
反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；
(6)对山羊Cytb基因进行扩增生成山羊特异性扩增片段的引物对Ⅵ：
正向引物：5’-GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT-3’
反向引物：5’-GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT-3’；
(7)对驴16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对Ⅶ：
正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’
反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’；
(8)对马16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物Ⅷ：
正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’
反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’；
(9)对猪12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物Ⅸ：
正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’
反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’；
(10)对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅹ：
正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’
反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’。
2.基于权利要求1所述兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于：以样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII、引物对VIII、引物对IX和引物对X分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品总DNA模板来自兔、鸡、鸭、鹅、牛、山羊、驴、马、猪和鹿物种血液的混合，或上述各物种血液产品中的一种。
3.根据权利要求2所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水2体积份、2×PCR预混Taq酶5体积份、经稀释500倍的总DNA模板1体积份、2μM正向引物1体积份、2μM反向引物1体积份。
4.根据权利要求3所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水2μl、2×PCR预混Taq酶5μl、经稀释500倍的总DNA模板1μl、2μM正向引物1μl、2μM反向引物1μl。
5.根据权利要求2所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为：依次进行94℃下预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束。
6.根据权利要求2至5中任一权利要求所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对I、引物II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII、引物对VIII、引物对IX和引物对X分别扩增出的DNA片段大小；其中：
兔物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为126bp；
鸡物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为299bp；
鸭物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为282bp；
鹅物种的引物对Ⅳ扩增出的DNA片段大小260bp；
牛物种的引物对Ⅴ扩增出的DNA片段大小为360bp；
山羊物种的引物对Ⅵ扩增出的DNA片段大小为231bp；
驴物种的引物对Ⅶ扩增出的DNA片段大小为232bp；
马物种的引物对Ⅷ扩增出的DNA片段大小568bp；
猪物种的引物对Ⅸ扩增出的DNA片段大小为300bp；
鹿物种的引物对Ⅹ扩增出的DNA片段大小为376bp。
7.基于权利要求1所述兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于：包括所述引物对I、引物II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII、引物对VIII、引物对IX和引物对X。
8.根据权利要求7所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于单物种总DNA模板进行兔、鸡、鸭、鹅、牛、山羊、驴、马、猪和鹿的物种鉴定。
9.根据权利要求7所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行兔、鸡、鸭、鹅、牛、山羊、驴、马、猪和鹿的物种鉴定。
10.根据权利要求7所述的兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于鹿血液产品的真伪及掺假判定。
CN201510163176.3A 2015-04-08 2015-04-08 兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系 Pending CN104745707A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510163176.3A CN104745707A (zh) 2015-04-08 2015-04-08 兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510163176.3A CN104745707A (zh) 2015-04-08 2015-04-08 兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104745707A true CN104745707A (zh) 2015-07-01

Family

ID=53585954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510163176.3A Pending CN104745707A (zh) 2015-04-08 2015-04-08 兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104745707A (zh)

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105177150A (zh) * 2015-09-29 2015-12-23 上海市农业科学院 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN105256013A (zh) * 2015-09-29 2016-01-20 上海市农业科学院 一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴pcr引物体系及检测方法
CN105274246A (zh) * 2015-11-20 2016-01-27 华中农业大学 牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105296648A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 华中农业大学 狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒
CN105296646A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 华中农业大学 猪源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105296647A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 华中农业大学 羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105603110A (zh) * 2016-03-28 2016-05-25 上海逍鹏生物科技有限公司 物种鉴别试剂盒和物种鉴别方法
CN106148559A (zh) * 2016-09-21 2016-11-23 上海市农业科学院 一种同步检测五种动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN107475433A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 公安部物证鉴定中心 一种混合动物种属鉴定方法及引物
CN107699613A (zh) * 2017-11-17 2018-02-16 上海市农业科学院 一种同步检测5种动物源性成分的多重pcr方法及试剂盒
CN109609662A (zh) * 2018-12-30 2019-04-12 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒
CN110305972A (zh) * 2019-08-02 2019-10-08 锡林郭勒职业学院 肉制品中鸡、鸭和鹅源性同步检测的引物和探针及试剂盒
CN111394481A (zh) * 2020-05-14 2020-07-10 遵义医科大学 基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法
CN112708683A (zh) * 2021-02-08 2021-04-27 韩山师范学院 一种检测羊源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用
CN113073140A (zh) * 2021-04-22 2021-07-06 宁波大学 一种用于同时鉴别7种肉源食品的pcr检测用引物组和方法
CN114561476A (zh) * 2022-02-24 2022-05-31 宁波大学 用于同时鉴别12种肉源食品的多重pcr检测用引物组和方法
EP3898929A4 (en) * 2018-12-18 2022-06-01 Ricoh Company, Ltd. NUCLEIC ACID TEST DEVICE, METHOD AND NUCLEIC ACID TEST DEVICE AND GENE TEST METHOD
CN114686600A (zh) * 2022-02-24 2022-07-01 宁波大学 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876805A (zh) * 2012-10-25 2013-01-16 苏州市红冠庄国药饮片有限公司 鹿猪牛羊马驴兔鸡的pcr鉴定用引物体系
CN103789438A (zh) * 2014-02-17 2014-05-14 苏州市红冠庄国药饮片有限公司 鹿牛羊马驴猪动物皮组织dna的pcr鉴定用引物体系

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876805A (zh) * 2012-10-25 2013-01-16 苏州市红冠庄国药饮片有限公司 鹿猪牛羊马驴兔鸡的pcr鉴定用引物体系
CN103789438A (zh) * 2014-02-17 2014-05-14 苏州市红冠庄国药饮片有限公司 鹿牛羊马驴猪动物皮组织dna的pcr鉴定用引物体系

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FABIO COLOMBO ET AL.: "Identification of the goose species (Anser anser) in Italian "Mortara" salami by DNA sequencing and a Polymerase Chain Reaction with an original primer pair", 《MEAT SCIENCE》 *
SANTOSH HAUNSHI ET AL.: "Identification of chicken, duck, pigeon and pig meat by species-specific markers of mitochondrial origin", 《MEAT SCIENCE》 *

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105256013A (zh) * 2015-09-29 2016-01-20 上海市农业科学院 一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴pcr引物体系及检测方法
CN105177150A (zh) * 2015-09-29 2015-12-23 上海市农业科学院 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN105256013B (zh) * 2015-09-29 2018-08-31 上海市农业科学院 一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴pcr引物体系及检测方法
CN105177150B (zh) * 2015-09-29 2018-08-31 上海市农业科学院 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN105296646B (zh) * 2015-11-20 2018-08-03 华中农业大学 猪源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105274246A (zh) * 2015-11-20 2016-01-27 华中农业大学 牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105296648A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 华中农业大学 狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒
CN105296646A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 华中农业大学 猪源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105296647A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 华中农业大学 羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105274246B (zh) * 2015-11-20 2018-08-03 华中农业大学 牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105296647B (zh) * 2015-11-20 2018-08-03 华中农业大学 羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105603110A (zh) * 2016-03-28 2016-05-25 上海逍鹏生物科技有限公司 物种鉴别试剂盒和物种鉴别方法
CN106148559A (zh) * 2016-09-21 2016-11-23 上海市农业科学院 一种同步检测五种动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN107475433B (zh) * 2017-10-09 2020-06-05 公安部物证鉴定中心 一种混合动物种属鉴定方法及引物
CN107475433A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 公安部物证鉴定中心 一种混合动物种属鉴定方法及引物
CN107699613A (zh) * 2017-11-17 2018-02-16 上海市农业科学院 一种同步检测5种动物源性成分的多重pcr方法及试剂盒
EP3898929A4 (en) * 2018-12-18 2022-06-01 Ricoh Company, Ltd. NUCLEIC ACID TEST DEVICE, METHOD AND NUCLEIC ACID TEST DEVICE AND GENE TEST METHOD
CN109609662B (zh) * 2018-12-30 2022-02-15 广州海关技术中心 同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒
CN109609662A (zh) * 2018-12-30 2019-04-12 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒
CN110305972A (zh) * 2019-08-02 2019-10-08 锡林郭勒职业学院 肉制品中鸡、鸭和鹅源性同步检测的引物和探针及试剂盒
CN110305972B (zh) * 2019-08-02 2022-12-27 锡林郭勒职业学院 肉制品中鸡、鸭和鹅源性同步检测的引物和探针及试剂盒
CN111394481A (zh) * 2020-05-14 2020-07-10 遵义医科大学 基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法
CN112708683A (zh) * 2021-02-08 2021-04-27 韩山师范学院 一种检测羊源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用
CN112708683B (zh) * 2021-02-08 2023-11-21 韩山师范学院 一种检测羊源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用
CN113073140A (zh) * 2021-04-22 2021-07-06 宁波大学 一种用于同时鉴别7种肉源食品的pcr检测用引物组和方法
CN113073140B (zh) * 2021-04-22 2022-02-22 宁波大学 一种用于同时鉴别7种肉源食品的pcr检测用引物组和方法
CN114561476A (zh) * 2022-02-24 2022-05-31 宁波大学 用于同时鉴别12种肉源食品的多重pcr检测用引物组和方法
CN114686600A (zh) * 2022-02-24 2022-07-01 宁波大学 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法
CN114686600B (zh) * 2022-02-24 2023-12-12 宁波大学 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法
CN114561476B (zh) * 2022-02-24 2024-01-23 宁波大学 用于同时鉴别12种肉源食品的多重pcr检测用引物组和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104745707A (zh) 兔鸡鸭鹅牛羊驴马猪鹿的pcr鉴定用引物体系
CN102876805B (zh) 鹿猪牛羊马驴兔鸡的pcr鉴定用引物体系
US20180044667A1 (en) Method for constructing nucleic acid single-stranded cyclic library and reagents thereof
CN105177150B (zh) 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN105734160A (zh) 畜禽肉猪牛羊源性成分pcr鉴定用引物体系及pcr鉴定方法与试剂盒
CN103789438A (zh) 鹿牛羊马驴猪动物皮组织dna的pcr鉴定用引物体系
CN106148559A (zh) 一种同步检测五种动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN104178570A (zh) 鹿猪马驴牛羊动物骨组织的pcr鉴定用引物体系
CN106119408A (zh) 一种霍山石斛的鉴定方法
CN102312003A (zh) 鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的pcr引物对及其应用
CN105331528B (zh) 一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法
CN105907852A (zh) 一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光pcr检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用
CN102312011B (zh) 鉴定或辅助鉴定鼠组织和/或器官的pcr引物对及其应用
CN107345250A (zh) 基于16SrRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法和专用引物
CN104372078B (zh) 一种食品中产气荚膜梭菌的hda引物及其应用方法
CN104962656A (zh) 一种快速鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法
KR101595016B1 (ko) 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법
CN105176988A (zh) 一种基于pcr-rflp鉴定中药材鹿茸的方法
CN102277439A (zh) 一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法
CN106435000A (zh) 一种无乳链球菌的恒温热隔绝式pcr检测方法
CN104774960A (zh) 应用双重高分辨率熔解曲线技术检测巴尔通体的方法
CN108285922A (zh) 焦磷酸测序法检测tert启动子突变试剂盒及方法
CN104032010B (zh) 鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的pcr引物对及其应用
CN102827931A (zh) Pcr-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法
CN104032012B (zh) 鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的pcr引物对及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150701