CN107345250A

CN107345250A - 基于16SrRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法和专用引物

Info

Publication number: CN107345250A
Application number: CN201710503231.8A
Authority: CN
Inventors: 樊艳凤; 高玉时; 唐修君; 葛庆联; 顾荣; 贾晓旭; 刘茵茵; 马丽娜; 张静; 黄胜海; 王珏
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: CN107345250B

Abstract

本发明公开了一种快速检测食品中鹌鹑源性成分的方法及专用引物。专用引物见序列表SEQ ID NO 1‑2。针对以鹌鹑肉源DNA为阳性模板，牛、羊、猪、兔、鸽、鸡、鸭和鹅8个物种的DNA为干扰模板的混合模板，分别进行PCR和qPCR反应。其中PCR方法的结果以琼脂糖凝胶电泳图谱中电泳条带为阳性结果，而qPCR方法中以扩增曲线的Ct值小于34的扩增作为阳性结果，检测灵敏度达皮克级DNA。该方法首次利用16S rRNA为目标基因对深加工鹌鹑肉进行检测，所设计引物同时适用于PCR和qPCR方法中，不仅具有良好的特异性，且高度的灵敏性为食品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径，具有操作便捷，稳定准确等有益结果。

Description

基于16SrRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法和专用引物

技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，尤其涉及鹌鹑特异性PCR扩增鉴定畜禽肉中鹌鹑肉源性成分。

背景技术

近年来，动物源性食品掺杂掺假、以次充好、以廉价劣质的畜禽肉替代高价优质畜禽肉等各种食品安全事件频发，严重扰乱了市场秩序，侵害了生产者和消费者的合法利益，同时带来了严重的食品安全隐患。在西方，一项对近千种肉制品的检测分析表明，有近20％的产品存在标识与品种不完全相符的现象。

鹌鹑属于鸡形目最大的特点就是耐粗饲，抗病能力强，出栏快，产蛋率高，易管理等等很多优点，很多人都饲养鹌鹑，因此市场上常会利用家养鹌鹑冒充野生麻雀、鸽子或其他野生鸟类的不法行为。研究动物源性食品安全检测技术，对食品动物源性成分进行鉴定，显得尤为重要。PCR技术由于其操作简便、快速高效等特点，已在国外肉类掺假研究中得到广泛应用，并取得一些创新性成果。动物线粒体基因组DNA作为核外遗传物质，无论是在种间还是种内都具有广泛的多态性，是设计肉类成分定性检测的首选靶点，包括细胞色素b(Cyt b)基因、细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(COX1)基因、16S rRNA、D-Loop基因等，在这些基因中16S rRNA在线粒体基因组中属于进化速率较慢的，更有利于肉类成分的定性检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种PCR检测肉类中鹌鹑源成分鉴定的方法及专用引物，操作简便、快速，检测结果准确的分析肉质中鹌鹑源成分，该方法首次利用16S rRNA为目标基因对深加工鹌鹑肉进行检测，所设计引物同时适用于PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)方法中，不仅具有良好的特异性，且高度的灵敏性为食品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径，具有操作便捷，稳定准确等有益结果。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定专用引物对，其核苷酸序列为：

所述引物对的上游引物序列为：5‘-AAGGATACCACAATTTAAC-3’，

所述引物对的下游引物序列为：5‘-AGAGGGAAGGTAGTGTT-3’。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，一种PCR检测肉类中鹌鹑源成分鉴定的方法：分别提取鹌鹑肉样本DNA作为阳性对照样本和待测肉样DNA并稀释到同一浓度；利用所述PCR扩增鉴定专用引物对鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA同时在相同条件下进行PCR 扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，以鹌鹑肉样本DNA琼脂糖凝胶电泳图谱中118bp电泳条带为阳性结果；将待测肉样DNA其PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与阳性结果进行比对，如果待测肉样DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱中出现电泳条带118bp 并与阳性对照样本条带亮度相同，认定待测鹌鹑肉为纯正鹌鹑肉，反之，则是掺假鹌鹑肉。

优选的，所述PCR扩增反应体系为：2×PCR Mix 10μl，10mol/μl上游引物0.2μl，10mol/μl 下游引物0.2μl，20ng/μl模板DNA或者待测肉样DNA 1μl，灭菌双蒸水8.6μl。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s 此过程经过30个循环，最后72℃延伸5min。

优选的，所述PCR扩增产物为：

AAGGATACCA CAATTTAACC CCCTTATGTA AAGATTAAGA ACAATTCGAC GGAGGTACAG 60

CTCCATCGAA AAAGAATACA ACCTCCCCCA GCGGATAAAC TAACACTACC TTCCCTCT 118

本发明的第三个目的是通过以下技术方案实现，一种QPCR检测肉类中鹌鹑源成分鉴定的方法：提取鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA并稀释到同一浓度；利用所述PCR扩增鉴定专用引物对鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA实时荧光定量PCR扩增(qPCR)，实时荧光定量PCR扩增反应在ABI 7500序列扩增仪中进行，应用实时荧光定量PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。以鹌鹑肉样本DNA扩增曲线的Ct值小于34的扩增曲线作为阳性结果，将待测肉样DNA的扩增曲线图谱与阳性结果对照，如果待测鹌鹑肉DNA的扩增产物的Ct值与阳性对照结果相似，即待测肉样DNA的扩增曲线的Ct值小于34，认定待测鹌鹑肉为纯正鹌鹑肉，反之，则是掺假鹌鹑肉。

优选的，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20ng/μl DNA模板1.2μl，10pmol/μl 上游引物0.2μl，10pmol/μl下游引物0.2μl，绿色荧光实时PCR反应试剂盒(SYBRRealMaster Mix)7.5μl，双蒸水5.9μl。

优选的，所述实时荧光定量PCR扩增反应程序如下图所示：50℃预热2min，95℃预变性10min，然后95℃变性15s、60℃退火延伸1min，共40个循环，最后95℃变性15s，60℃退火延伸30s，95℃变性15s收集熔解曲线。

与现有技术相比，本发明具有以下有益结果：

第一，根据鹌鹑线粒体基因组中16S rRNA设计引物对；提取鹌鹑肉样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱；操作简便、快速，检测结果准确。

第二，本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出肉类样品中鹌鹑源成分，为市场上的掺假肉类提供便捷的鉴定方法。

第三，本发明的检测引物无论是针对普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳方法检测还是荧光定量PCR方法直接观察，都能取得较好结果。

第四，本发明的方法不局限于样品的状态，无论是生鲜样本还是对于DNA破坏较严重、提取效率较低的深加工产品，这样便于对市场上产品进行便捷、有效的监管，具有更高的实用价值。

附图说明

图1是普通PCR方法的特异性检测结果图；

图2是普通PCR方法的灵敏性检测结果图；

图3是荧光定量PCR(qPCR)方法的特异性检测结果图；

图4是荧光定量PCR(qPCR)方法的灵敏性检测结果图。

具体实施方式

DNA的提取—酚仿法

(1)取生/熟鹌鹑肉样本25mg，剪碎，加入500μl细胞裂解液(0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)， 0.1mol/L氯化钠(NaCl)，10mmol/L三异丙基乙磺酰盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH8.0),1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA，pH 8.0))作用30min，10％蛋白酶K 10μl，55℃水浴过夜。

(2)将消化后的肉样加入等量体积的Tris饱和酚(pH8.0)，缓慢颠倒离心管10min，12000rpm 离心10min，用大口径的枪头小心吸取上清液至干净的离心管中。

(3)重复一次上一步工作。如果上清液清亮透明，此步可以省略。

(4)加入等量的酚:氯仿(1:1)，缓慢颠倒离心管10min，12000rpm离心10min，用大口径的枪头小心吸取上清液至干净的离心管中。

(5)加入等体积的氯仿，缓慢颠倒离心管10min，12000rpm离心10min，用大口径的枪头小心吸取上清液至干净的离心管中。

(6)加入两倍体积的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色雾状沉淀出现停止摇动。

(7)用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有75％乙醇的离心管中。

(8)将乙醇吸净，室温下让乙醇挥发干净(在通风橱中约3小时，或者室温过夜6-8小时)，加入200μl 0.1mol/L的NaOH溶液溶解，最后适量双蒸水或TE缓冲液稀释DNA。

(9)待DNA完全溶解后用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果或在分光光度仪上检测浓度。

(10)将溶解好的DNA置于-20℃保存。

PCR反应

引物设计

根据NCBI数据库上的鹌鹑的线粒体全基因组序列，找出16S rRNA的DNA序列(见序列表 SEQ ID NO 4)，利用Primer Express 3.0程序设计引物，最后优化出1对引物进行PCR及qPCR 扩增测序。

表1 PCR及qPCR反应引物信息

建立最佳PCR反应体系

普通20μlPCR扩增反应体系，各成分配比如表2。

反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s此过程经过32个循环，最后72℃延伸5min。

表2 20μl PCR扩增体系

PCR产物检验

1.5％琼脂糖凝胶电泳检测：

(1)取5μLPCR产物，加1μL上样缓冲液，上样。

(2)120V，电泳20min。

(3)照胶并保存胶图。

特异性检测：

利用同一PCR扩增体系，同一对引物对9个不同物种DNA模板进行扩增以检测引物的特异性。其扩增结果如图1所示。

由试验结果可知，这对引物具有较好的特异性，对鹌鹑以外的其他8个物种均没有扩增，具有较好的针对性，能够作为一种特征引物对鹌鹑肉样进行特异性检测。

灵敏性检测：

先测取所有物种DNA的浓度，并稀释成统一浓度，除鹌鹑DNA外，将其他物种DNA 等比例混匀成干扰DNA Mix，将目标模板DNA用混匀的DNA Mix分别稀释成10^-1、10^-2、 10^-3、一直到10^-8倍。分别使用该引物对其进行检测以考察方法的灵敏性。其PCR检测胶图如图2所示。

由试验得知，25mg深加工肉样一般提取的DNA在微克级，经稀释后，我们的检测体系可以达到皮克级，满足了市场检测的需要，相比于国外文献中报导较多的多重PCR鉴定，本研究的方法虽通量较小，但反应体系简单，检测结果更可靠。

定量PCR

反应体系与程序

实时荧光定量PCR(qPCR)对样品的DNA和阴性对照进行扩增。整个反应在ABI 7500序列扩增仪中进行，反应条件如下所示，试验用的体系见下表。每个样品设3个重复。

表3 qPCR扩增体系

实时荧光定量反应条件为：50℃预热2min，95℃预变性10min，然后95℃变性15s、60℃退火延伸1min，共40个循环，最后95℃变性15s，60℃退火延伸30s，95℃变性15s收集熔解曲线。

特异性检测结果见图3。

灵敏性检测结果见图4。

由图中结果显示，这对引物在荧光定量PCR扩增体系中仍能取得较好的特性结果，鹌鹑以外的其他物种的DNA扩增曲线的Ct值均在34以上，可以有效地辨别模板DNA的来源。在灵敏性检测中，利用普通PCR同样的稀释方法，扩增结果显示，在稀释倍数为10^-7(e^-7)时，仍能有较好的扩增曲线。

基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法和专用引物

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120>基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法和专用引物

<160> 4

SEQ ID NO 1

<210> 1

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定专用引物对上游引物

<400> 1

AAGGATACCA CAATTTAAC 19

SEQ ID NO 2

<210> 2

<211> 17

<212> DNA（序列类型，例如：DNA、RNA或PRT）

<213>人工序列（序列来源的生物名称）

<220>

<223>基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定专用引物对下游引物

<400> 2

AGAGGGAAGG TAGTGTT 17

SEQ ID NO 3

<210> 3

<211> 118

<212> DNA（序列类型，例如：DNA、RNA或PRT）

<213>人工序列（序列来源的生物名称）

<220>

<223> PCR扩增产物

<400> 3

AAGGATACCA CAATTTAACC CCCTTATGTA AAGATTAAGA ACAATTCGAC GGAGGTACAG 60

CTCCATCGAA AAAGAATACA ACCTCCCCCA GCGGATAAAC TAACACTACC TTCCCTCT 118

SEQ ID NO 4

<210> 4

<211> 1615

<212> DNA（序列类型，例如：DNA、RNA或PRT）

<213> 人工序列（序列来源的生物名称）

<220>

<223>Coturnix japonica mitochondrial DNA中16S 1615bp序列

<400> 4

TTTGCCCTAC CTCTAGCCCA ACCAACAAAT CTTCAAAAAA TCCAAAATCA CCTCACACAG 60

TTTAATTAAA ACATTTAATC TTATCCTAGT ATAGGCGATA GAACCGACCC GAGGCGCAAT 120

AGAGACCAAC CGTACCGTAA GGGAAAGATG AAATAACAAT GAAAAACACA AGCAAAAAGC 180

AGTAAAGACA AACCCTTGTA CCTCTTGCAT CATGATTTAG CAAGAACAAC CAAGCAAAGC 240

GGACTAAAGC TTGCCTTCCC GAAACCCAAG CGAGCTACTT GCGAGCAGCT AAAATTGAGC 300

GAACCCGTCT CTGTCGCAAA AGAGTGGGAT GACTCGCTAG TAGAGGTGAA AAGCCAACCG 360

AGCTGGGTGA TAGCTGGTTA CCTGCCAAAC GAATCTAAGT TCCCCCTTAA TCTCTCCCTA 420

AAGGATACCA CAATTTAACC CCCTTATGTA AAGATTAAGA ACAATTCGAC GGAGGTACAG 480

CTCCATCGAA AAAGAATACA ACCTCCCCCA GCGGATAAAC TAACACTACC TTCCCTCTCT 540

CCGTGGGCCT TCAAGCAGCC ATCAACAAAA GAGTGCGTCA AAGCTCCTCT ACTAAAAATC 600

CAGATACTAA TTTGATTCCC TCATCCAAAG CAGGTCAACC TATGACAATA GAAGAATCAA 660

TGCTAAAATG AGTAACTTGG AACCTTCCTC TACACAGCGT AGACTTACAT CAACACATTA 720

TTAACAGACC TAACTTATAC TCACACCACA ACAAGAACTC ATATGTCTAT GATCTGTTAG 780

CCCAACTCAG GAACGCCCAC AAGATGATTA AAATCCGCAA AAGGAATTCG GCAAACCAAA 840

GACCCGACTG TTTCCCAAAA ACATAGCCTT CAGCAATCAA CAAGTATTGA AGGTGACGCC 900

TGCCCAGTGA CCCGCAACGT TCAACGGCCG CGGTATCCTA ACCGTGCAAA GGTAGCGCAA 960

TCAATTGTCC CATAAATCGA GACTTGTATG AATGGCTAAA CGAGGTCTTA ACTGTCTCCT 1020

GCAGATAATC AGTGAAATTA GTATCCTCGT GCAAAAACGA GAATGTGACC ATAAGACGAG 1080

AAGACCCTGT GGAACTTTAA AATCACGACC ACCCTTATAA TTACATTCAC CCCACCGGGC 1140

ACATCCACAC TAACACCCTT GGTCGACATT TTTCGGTTGG GGCGACCTTG GAGAAAAACA 1200

AAACCTCCAA ACTTACAGAC CACACCTCTT AACCAAGATC CACCCATCAA AGTCCTAACA 1260

GTAACTAGAC CCAATATAAT TGATTAATGG ACCAAGCTAC CCCAGGGATA ACAGCGCAAT 1320

CTCCTCCAAG AGCCCCTATC GACAAGGAGG TTTACGACCT CGATGTTGGA TCAGGACAAC 1380

CTAATGGTGT AGCCGCTATT AAGGGTTCGT TTGTTCAACG ATTAACAGTC CTACGTGATC 1440

TGAGTTCAGA CCGGAGTAAT CCAGGTCGGT TTCTATCTAT GAACACACTC CTCCTAGTAC 1500

GAAAGGACCG GAGAAGTAGG GTCAATACCA CAAGCACACC CTAACCTTCC AAGCAATGAA 1560

CTCAACTTAA TTGCCAAGAA GCTCACCATC CACTTACACT CCTAGAAAAG GAACA 1615

Claims

1.基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定专用引物对，其特征是，所述引物对的核苷酸序列为：

所述引物对的上游引物序列为：5' AAGGATACCACAATTTAAC 3'，

所述引物对的下游引物序列为：5' AGAGGGAAGGTAGTGTT 3'。

2.一种利用权利要求1所述的引物进行鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述鉴定方法为：分别提取鹌鹑肉样本DNA作为阳性对照样本和待测肉样DNA并稀释到同一浓度；利用所述PCR扩增鉴定专用引物对鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA在相同条件下进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，以鹌鹑肉样本DNA琼脂糖凝胶电泳图谱中118bp电泳条带为阳性结果；将待测肉样DNA其PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与阳性结果进行比对，如果待测肉样DNA PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱中出现电泳条带118bp并与阳性对照样本条带亮度相同，认定待测鹌鹑肉为纯正鹌鹑肉，反之，则是掺假鹌鹑肉。

3.根据权利要求2所述的所述PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述PCR扩增反应体系为：2×PCR Mix 10 μl，10mol/μl上游引物 0.2μl，10mol/μl下游引物 0.2μl，模板DNA 1μl，灭菌双蒸水 8.6μl。

4.根据权利要求2所述的基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述PCR扩增的反应程序为95℃ 5 min； 95℃ 30 s，60℃ 30 s， 72℃ 30 s此过程经过32个循环，最后72℃ 延伸5 min。

5.根据权利要求2所述的基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述PCR扩增产物为：

AAGGATACCA CAATTTAACC CCCTTATGTA AAGATTAAGA ACAATTCGAC GGAGGTACAG 60

CTCCATCGAA AAAGAATACA ACCTCCCCCA GCGGATAAAC TAACACTACC TTCCCTCT 118。

6.一种利用权利要求1所述的引物进行鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述鉴定方法为：提取鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA并稀释到同一浓度；利用所述PCR扩增鉴定专用引物对鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA在相同条件下实时荧光定量PCR扩增，对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱；以鹌鹑肉样本DNA扩增曲线的Ct值小于34的扩增曲线作为阳性结果，将待测肉样DNA的扩增曲线图谱与阳性结果对照，如果待测鹌鹑肉DNA的扩增产物的 Ct值小于34，认定待测鹌鹑肉为纯正鹌鹑肉，反之，则是掺假鹌鹑肉。

7.根据权利要求6所述的PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20 ng /μl DNA模板 1.0μl，10 pmol/μl上游引物 0.2μl，10 pmol/μl下游引物 0.2μl，SYBR RealMaster Mix 7.5μl，双蒸水6.1μl。

8.根据权利要求6所述的PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述实时荧光定量PCR扩增反应程序为：50℃预热2min，95℃预变性10min，然后95℃变性15s、60℃退火延伸1min，共40个循环，最后95℃变性15s，60℃退火延伸30s，95℃变性15s收集熔解曲线。

9.根据权利要求6所述的PCR扩增鉴定方法，其特征是，所述实时荧光定量PCR扩增反应在ABI 7500序列扩增仪中进行。