CN113755607B

CN113755607B - 特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物、检测方法及应用

Info

Publication number: CN113755607B
Application number: CN202111079454.9A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 王文君; 周翔; 师曼娜; 危铁安
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2021-09-15
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2041-09-15
Also published as: CN113755607A

Abstract

本发明提供了特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物、检测方法及应用，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明中所述的引物是指一对能同时特异性扩增驴特异性序列SEQ ID NO.1和马特异性序列SEQ ID NO.2的通用引物。本发明提供的检测方法可对PCR扩增产物进行电泳检测或高分辨率熔解分析，根据扩增片段大小或标准化熔解曲线和熔解峰图对驴、马和骡源性成分进行有效鉴定和区分。本发明为阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的快速鉴别提供了简便、高效、可靠的检测方法，为阿胶企业原料采购及其阿胶制品真实性保驾护航。

Description

特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物、检测方法及应用

技术领域

本发明属于动物分子生物学检测技术领域，具体涉及一种特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物、检测方法和应用。

背景技术

阿胶是以干燥或新鲜的驴皮为原料，经炖制浓缩而成的固体凝胶，是一类名贵中药，2000多年来被广泛应用于益气养血。近年来随着人们对自身健康的日益关注，阿胶的消费量也呈现不断增加的势头。然而，受驴养殖量的限制，驴皮供应远远不能满足目前市场需求。因此，一些非法养殖者和生产商将牛、马、猪、骡皮等各种动物皮张混入阿胶产品中，以牟取暴利。阿胶掺假不仅会影响其药用功效，损害消费者的健康和经济利益，还会使企业和政府都失信于消费者，造成了极坏的社会影响。因此，对阿胶及其原料建立一套简便、可靠、准确的检测方法具有重要意义。

马、骡与驴同属马科动物，其皮张在外观上与驴皮非常相似，因此在阿胶原料采购中很难准确区分。近年来，基于特异性蛋白质/多肽的方法已被开发用于阿胶鉴定。但由于其前处理繁琐且成本高昂而较难推广。基于DNA 的PCR技术的发展在一定程度上解决了上述问题，并在阿胶鉴定中显示出一定的特异性和准确性。然而目前的PCR方法大都须采用多对引物或加入荧光探针才能进行驴、马和骡源性成分的鉴定，反应体系复杂，检测和分析过程也较繁琐、耗时、成本高。如何筛选并鉴定一对通用引物来特异性鉴别驴、马和骡，是实现简便、高效、快速检测的关键。这对引物序列的选择提出了更高的要求——既需要确保该引物与驴、马和骡DNA无差别结合且所扩增的产物不同，又不能与牛、猪、羊、鸡、鸭等常见畜禽或可能掺假物种DNA 有任何结合。因此，筛选一对驴、马和骡特异性的通用引物并建立一种更加高效、简便的检测方法对阿胶及其原料进行准确鉴定，是食品和药品监管部门所亟需的，可为阿胶企业原料采购以及阿胶制品真实性与信誉保驾护航。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供用于特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物。本发明的目的还在于提供上述快速鉴别驴、马和骡源性成分的引物在检测驴、马和骡源性成分中的应用。

本发明的另一目的在于提供用于阿胶及其原料中鉴定和区分的检测方法，包括PCR或PCR-HRM方法，该检测方法可对PCR扩增产物进行电泳检测或高分辨率熔解(highresolution melting,HRM)分析，可根据扩增片段大小或标准化熔解曲线和熔解峰图对驴、马和骡源性成分进行有效鉴定和区分。该方法具有简便、高效、快速的特点。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

用于特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物，其包括能同时特异性扩增如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物。

如上所述的通用引物，优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步，本发明提供上述通用引物在驴、马和骡源性成分鉴别中的应用。

一种用于鉴别驴、马和骡源性成分的检测试剂盒，其包括如上所述的通用引物。

如上所述的检测试剂盒，优选地，其还包括Taq酶、PCR buffer、dNTP Mixture或/和SsoFast EvaGreen Supermix。

一种用于鉴别驴、马和骡源性成分的检测方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)用序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的通用引物进行PCR 反应或PCR-HRM反应，并以驴和马的DNA模板或含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

(3)对扩增产物进行电泳检测或HRM分析，并对结果进行判定。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤(2)中，PCR反应体系采用20.0 μL体系，包括终浓度为0.025U/μL的Taq酶、1×PCR Buffer、各0.2mM 的dNTP，0.15μM的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物及样品 DNA；

PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性20s、66℃退火15s、72℃延伸15s，循环32次；72℃终延伸2min。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤(2)中，PCR-HRM反应体系采用20.0μL体系，包括终浓度为1×的SsoFast EvaGreen Supermix，0.15μM的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物及样品DNA；

PCR-HRM反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性20s，66℃退火15 s，72℃延伸15s，共进行35次循环；HRM升温步骤为75℃至92℃，升温速率为0.2℃/s。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，PCR扩增的电泳结果按如下进行结果判定：

对于PCR方法的电泳结果，驴和马的阳性对照PCR扩增反应中分别扩增出89bp和99bp的扩增片段，而空白对照中无扩增产物，表明PCR反应体系正常工作，否则需重新配置进行检测；

若扩增片段与驴的阳性对照的扩增片段大小一致，表明样品中检测出驴源性成分；

若扩增片段与马的阳性对照的扩增片段大小一致，表明样品中检测出马源性成分；

若扩增片段既有与驴的阳性对照的扩增片段大小一致的条带，又有与马的阳性对照的扩增片段大小一致的条带，表明样品中检测出骡源性成分或样品中同时检测出驴源性成分和马源性成分；

若扩增片段与驴和马的阳性对照的扩增片段大小均不一致或无扩增条带，表明样品中未检测出驴和马的特异性序列，表述为“样品中未检测出驴、马和骡源性成分”。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，PCR-HRM方法的结果判定如下：

驴和马的阳性对照的PCR-HRM反应中，其熔解温度分别为85.2～85.8℃和87.0～87.2℃，而空白对照中无熔解峰，表明反应体系正常工作，否则应重新配置进行检测；

若样品中有特异性扩增且熔解温度与驴的阳性对照的熔解温度 85.2～85.8℃一致，表明样品中检测出驴源性成分；

若样品中有特异性扩增且熔解温度与马的阳性对照的熔解温度 87.0～87.2℃一致，表明样品中检测出马源性成分；

若样品中有特异性扩增且熔解温度分别与驴和马的阳性对照的熔解温度 85.2～85.8℃和87.0～87.2℃一致，表明样品中检测出骡源性成分或样品中同时检测出驴源性成分和马源性成分；

若样品中没有扩增，或熔解温度与驴和马阳性对照的熔解温度都不一致，表明样品中未检测出驴和马所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出驴、马和骡源性成分。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的用于特异性鉴定和区分阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物，能用于准确、可靠检测出原料中驴、马和骡源性成分。

本发明提供的驴、马和骡源性成分的分子鉴定方法，有效、精准、可靠，可在一次反应中同时鉴定样品中是否含有驴、马和骡源性成分，并可根据特异性扩增片段大小或标准化熔解曲线和熔解峰图对驴、马和骡源性成分进行有效鉴定和区分，为阿胶企业原料采购及其阿胶制品的真实性保驾护航。

本发明提供的检测方法可以在驴、马和骡源性成分检测中作为标准检测方法使用，具有简便、快速、高效、特异性强等特点，且成本较低，适用性广。

附图说明

图1为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸特异性序列与其他物种同源序列的多序列比对分析结果。

图2为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸特异性序列在23个物种中的PCR检测结果。

图3为5份马皮、7份驴皮、8份马骡皮和1份驴骡皮样品进行PCR后的电泳检测结果。

图4为驴、马和骡DNA的PCR-HRM标准化熔解曲线(A)和熔解峰(B) 图谱。

图5为PCR-HRM法分析驴、马和骡DNA的灵敏度检测结果。

图6为对5份马皮、7份驴皮、8份马骡皮和1份驴骡皮样品进行 PCR-HRM分析的结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1快速鉴别驴、马和骡的特异性序列和通用引物

本发明经过大量数据分析，筛选到马OBSCN基因(NC_009157.3)的一段序列作为马科特异性序列，该序列与NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的58个目标物种(黄牛、瘤牛、牦牛、野牛、水牛、家马、普氏野马、驴、绵羊、山羊、鹿、双峰驼、猪、兔、狐、狗、狼、澳洲野狗、猫、熊、貂、猴、人、小鼠、大鼠、跳鼠、仓鼠、豚鼠、土拨鼠、海狸、鼠兔、海豚、鲸鱼、大象、蝙蝠、刺猬、鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、变色龙、青蛙、斑马鱼、鲑鱼、果蝇、大豆、玉米、水稻、小麦、枸杞、核桃、葵花籽、花生、黑芝麻、酵母菌、大肠杆菌和沙门氏菌)参考基因组进行Nucleotide BLAST比对分析，并对各物种的同源序列进行ClustalW多序列比对分析，结果见图1。筛选在驴、马和骡中特异存在，在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。此外，为了简化检测过程和降低检测成本，所筛选序列在保证特异性的同时，应能有效区分驴、马和骡。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。引物设计的原则为引物长度为22～24 bp。引物的设计需要考虑扩增片段长度、反应温度、是否容易发生错配和二聚体等多方面因素。具体地说，在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列的保守区设计驴、马和骡特异性引物，并使用Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在上述58个物种基因组中对引物的特异性进行验证，筛选仅与驴、马和骡DNA结合的引物对作为候选引物对。此外，考虑到深加工过程对DNA的严重破坏以及对驴、马和骡的有效区分，由大量经验得知，引物扩增的序列大小应小于100bp，且马和驴序列之间应至少有5％的核苷酸差异。

经反复分析验证，最终本发明在驴和马(包括家马、普氏野马)的序列保守区域设计一对驴、马和骡特异性的通用引物。该引物结合区域与其他物种存在明显的碱基差异；引物所扩增如SEQ ID NO.1所示的驴DNA片段比所扩增如SEQ ID NO.2所示的马DNA片段小10bp，正、反向通用引物序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

驴特异性扩增序列的核苷酸序列，长度为89bp，如SEQ ID NO.1所示：

TCCTCCCTAGCACCAGCTCAGCTCACCTGCCACCGGCTGCGGGCC AGGAGGAACTTCAGCTGCTTGGTGTTGATGAAGTGGGCCTCCTC

马特异性扩增序列的核苷酸序列，长度为99bp，如SEQ ID NO.2所示：

TCCTCCCTAGCACCAGCTCAGCGCAGCTCGGCTCACCTGCCACCG GCTGCGGGCCAGGAGGAACTTCAGCTGCTTGGTGTTGATGAAGTGGGC CTCCTC

SEQ ID NO.3：5’-TCCTCCCTAGCACCAGCTCAGC-3’

SEQ ID NO.4：5’-GAGGAGGCCCACTTCATCAACACC-3’

本发明经过进一步的试验验证，发现该通用引物仅能特异性扩增驴、马和骡，而对其他物种无特异性扩增，且可根据扩增的片段大小快速区分驴、马和骡。

实施例2驴、马和骡物种特异性PCR反应体系建立和验证

1.样品采集及DNA提取

收集23个物种的样品，包括：驴、马和骡的皮张样品，黄牛、水牛、山羊、鹿、猪、猫、狗、狐、貂、兔、小鼠、大鼠、鸡、鸭和鹅的肌肉样品，以及枸杞、核桃、大枣、葵花籽和黑芝麻。

DNA模板制备采用苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京：科学出版社， 1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法。DNA模板制备后，将各个物种的基因组DNA稀释至50ng/μL，并于-20℃下保存备用。

2.PCR扩增验证

正、反向通用引物序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。在 PCR反应管中依次加入反应试剂(见表1)，混匀后离心。

表1本发明PCR扩增的反应体系

反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性20s、66℃退火15s、72℃延伸15s，循环32次；72℃终延伸2min。扩增反应在Bio-Rad MyCycler^TMThermal cycler仪器中进行。

在试样PCR反应的同时，设置双蒸水为模板作为空白对照。

3.PCR扩增产物的检测

按25g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入0.5×TBE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μL GelRed核酸染料溶液，混匀，冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入 0.5×TBE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μL PCR产物与2μL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳检测。

电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。

4.结果分析与表述

结果如图2所示，其中，泳道中编号说明如下：M为50bp DNA Ladder Marker；1为空白对照(双蒸水)；2为驴；3为马；4为骡；5为黄牛；6 为水牛；7为山羊；8为猪；9为鹿；10为小鼠；11为大鼠；12为兔；13为猫；14为狗；15为狐；16为貂；17为鸡；18为鸭；19为鹅；20为枸杞；21为核桃；22为大枣；23为葵花籽；24为黑芝麻。空白对照中未扩增出任何目的条带。在驴皮中提取的DNA模板进行扩增的PCR反应中，扩增片段大小与预期片段大小89bp一致，经测序分析与SEQ ID NO.1所示的特异性序列相一致，在马皮中提取的DNA模板进行扩增的PCR反应中，扩增片段大小与预期片段大小99bp一致，经测序分析与SEQ ID NO.2所示的特异性序列相一致。而骡皮提取的DNA进行扩增获得的是与89bp、99bp一致的两条扩增条带，为阳性结果。其余的黄牛、水牛、山羊、鹿、猪、猫、狗、狐、貂、兔、小鼠、大鼠、鸡、鸭、鹅、枸杞、核桃、大枣、葵花籽和黑芝麻等的模板进行的PCR反应产物中均无扩增产物，为阴性结果。表明所建立的驴、马和骡的PCR检测方法的特异性较好。

实施例3皮张样品的PCR电泳检测

按照实施例2中的DNA提取和PCR方法对由山东东阿阿胶集团提供的 5份马皮、7份驴皮、8份马骡皮和1份驴骡皮样品进行PCR扩增和电泳检测。结果如图3所示，泳道中编号说明如下：M为GL DNA Marker 500；1 为空白对照(双蒸水)；2-6为马皮；7-13为驴皮；14-21为马骡皮；22为驴骡皮。结果表明样品都被准确地鉴定和区分：驴的扩增片段大小为89bp、马的扩增片段大小为99bp、骡(包含马骡和驴骡)同时扩增出89bp和99bp 两个片段。说明本发明PCR方法对驴、马和骡皮张的检测具有较强的可靠性和准确性，可用于皮张种源成分的精准鉴别。

实施例4驴、马和骡物种特异性PCR-HRM反应体系建立和验证

为了简化检测流程，减少电泳过程的繁琐操作和时间损耗，本发明进一步建立了PCR-HRM方法。该方法的操作更加简便、检测更加快速、结果判别更加直观。具体操作如下：

1.样品采集及DNA提取

同实施例2。

2.PCR-HRM反应

正、反向通用引物序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。在反应管中依次加入反应试剂(见表2)，混匀后离心。同时，分别以驴和马皮提取的DNA为模板作为阳性对照。

表2本发明PCR-HRM的反应体系

反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性20s、66℃退火15s、72℃延伸15s，循环35次；HRM升温步骤为75℃至92℃，升温速率为0.2℃/s。扩增反应在CFX96^TMReal-Time Systeminstrument仪器中进行。

3.结果分析与表述

使用BioRad CFX Manager软件下载Melt Curve Data数据，并使用 PyHRM(https://github.com/liuyigh/PyHRM/blob/master/PyHRM.ipynb)对数据进行标准化处理，生成标准化熔解曲线和熔解峰图，结果如图4所示，其中 A为PCR-HRM标准化熔解曲线，B为PCR-HRM标准化熔解峰图谱。空白对照和所有猪、黄牛、水牛、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉作为阴性对照中均未产生明显的荧光。在驴皮的DNA为模板的PCR-HRM反应中，扩增获得如SEQ ID NO.1所示的特异性序列，熔解温度为85.6℃；在马皮的DNA为模板的PCR-HRM反应中，扩增获得如SEQ ID NO.2所示的特异性序列，熔解温度为87.0℃；在骡皮的 DNA为模板的PCR-HRM反应中，扩增获得如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的特异性序列，熔解温度在85.6℃和87.0℃之间。结果表明所建立的 PCR-HRM方法的特异性较好，且可准确鉴别驴、马和骡。

实施例5 PCR-HRM法灵敏度测试

分别在20μL体系中加入5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ng的驴皮、马皮或骡皮的DNA以及双蒸水，按照实施例4的扩增体系和条件进行PCR-HRM 反应。每个浓度梯度各设置3个技术重复。结果如图5所示，对于驴、马和骡的DNA模板左侧图为扩增曲线，右侧图为熔解峰图谱，每个PCR-HRM 反应体系中加入DNA含量分别为5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ng、0ng。在20μL反应体系中加入0.05ng的DNA可在35个循环内产生有效扩增且可准确鉴别驴、马和骡，表明该发明中建立的检测方法具有较好的灵敏性。

实施例6皮张样品的PCR-HRM检测

按照实施例4中的PCR-HRM方法对由山东东阿阿胶集团提供的5份马皮、7份驴皮、8份马骡皮和1份驴骡皮样品进行提取DNA并按实施例4所述的方法进行检测。结果如图6所示，A为标准化熔解曲线，B为熔解峰图谱，所有样品都被准确地鉴定和区分：驴的熔解峰值为85.2～85.8℃、马的熔解峰值为87.0～87.2℃、骡(包含马骡和驴骡)有两个熔解峰。结果表明，本发明PCR-HRM方法对驴、马和骡皮张的检测具有较强的可靠性和准确性，操作简便、高效，可用于皮张种源成分的精准、快速的鉴别。

实施例7阿胶样品的PCR-HRM检测

1.取样

阿胶样品(山东东阿阿胶集团提供)采集应不少于0.6g，立即检测或于 -20℃下保存备用。

2.DNA提取、纯化和质量检测

DNA模板制备采用苯酚-氯仿粗提法，并使用MicroElute DNA Clean-Up Kit(OMEGA BIO-TEK,USA)试剂盒进行纯化。提取的DNA使用Nanodrop 2000(ThermoScientific,USA)仪器进行浓度和质量测定。质量合格且浓度10 ng/μL以上的DNA样品可用于下一步检测，质量不合格或浓度小于10ng/μL 的样品须重新提取DNA。

3.PCR-HRM检测

按照实施例4中的PCR-HRM反应体系和程序对样品进行检测，并使用 PyHRM对结果进行分析。其中，采用从驴皮提取的DNA模板作为阳性对照样品，从马皮提取的DNA模板作为阳性对照样品，从骡皮提取的DNA模板作为阳性对照样品。

4.结果分析与表述

如表3所示，空白对照中未产生荧光，阳性对照样品均有扩增，驴的阳性对照样品生成85.6℃熔解峰、马的阳性对照样品生成87.0℃熔解峰、骡的阳性对照样品的熔解峰在85.6℃和87.0℃之间，表明扩增反应正常。9份委托山东东阿阿胶集团制作的阿胶样品均得到有效扩增，样品1生成85.6℃熔解峰，表明仅检出驴源性成分；其余样品的熔解温度在85.6℃和87.0℃之间，均检出了驴源性成分和马源性成分。

表3各种阿胶制品中驴和马源性成分的PCR-HRM检测结果

经高压处理的阿胶中的种源成分也得到准确鉴别。表明所建立的 PCR-HRM方法准确、可靠，可快速鉴别阿胶中的驴源性成分和马源性成分。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物、检测方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctccctag caccagctca gctcacctgc caccggctgc gggccaggag gaacttcagc 60

tgcttggtgt tgatgaagtg ggcctcctc 89

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccctag caccagctca gcgcagctcg gctcacctgc caccggctgc gggccaggag 60

gaacttcagc tgcttggtgt tgatgaagtg ggcctcctc 99

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccctag caccagctca gc 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggaggccc acttcatcaa cacc 24

Claims

1.用于特异性鉴别阿胶及其原料中驴、马和骡源性成分的通用引物，其特征在于，其包括能同时特异性扩增如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物；

所述引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的通用引物在驴、马和骡源性成分鉴别中的应用。

3.一种用于鉴别驴、马和骡源性成分的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的通用引物。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括Taq酶、PCR buffer、dNTPMixture或/和SsoFast EvaGreen Supermix。

5.一种用于鉴别驴、马和骡源性成分的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)用序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的通用引物进行PCR-HRM反应，并以驴和马的DNA模板或含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

(3)对扩增产物进行HRM分析，并对结果进行判定。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR-HRM反应体系采用20.0μL体系，包括终浓度为1×的SsoFast EvaGreen Supermix，0.15μM的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物及样品DNA；

PCR-HRM反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性20s，66℃退火15s，72℃延伸15s，共进行35次循环；HRM升温步骤为75℃至92℃，升温速率为0.2℃/s。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR-HRM方法的结果判定如下：

驴和马的阳性对照的PCR-HRM反应中有特异性扩增，其熔解温度分别为85.2～85.8℃和87.0～87.2℃，而空白对照中无熔解峰，表明反应体系正常工作，否则应重新配置进行检测；

若样品中有特异性扩增且熔解温度与驴的阳性对照的熔解温度85.2～85.8℃一致，表明样品中检测出驴源性成分；

若样品中有特异性扩增且熔解温度与马的阳性对照的熔解温度87.0～87.2℃一致，表明样品中检测出马源性成分；

若样品中有特异性扩增且熔解温度分别与驴和马的阳性对照的熔解温度85.2～85.8℃和87.0～87.2℃一致，表明样品中检测出骡源性成分或样品中同时检测出驴源性成分和马源性成分；

若样品中没有扩增，或熔解温度与驴和马阳性对照的熔解温度都不一致，表明样品中未检测出驴、马和骡源性成分。