CN112680531A - 用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的RPA标记引物对、试剂盒及方法，属于生物技术领域。RPA标记引物对，其序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。在肉眼初步鉴别的基础上，对于疑似驴皮的马皮和骡皮，提取DNA，采用RPA标记引物对其进行扩增；用检测试纸条对上述RPA扩增产物检测并判断结果。通过判定样品是否有马源性成分，鉴定样品是否为马皮或骡皮，从而判断驴皮真伪。本发明针对马皮和骡皮中马源性成分的检测方法无需特殊设备，反应时间仅需40min，特异性强，具有简便、快速等优点，还为马皮和骡皮中马源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，且十分适用于现场驴皮真伪的检测。

Description

用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的引物对、试剂盒及 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

阿胶是利用马科动物驴(Equus asinus L.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩而成的固体胶，是亚洲人常用的保健品，需求量逐年增加，但驴皮的数量远不能满足生产的需要。这种驴皮供不应求的现状，使得一些不法分子在利益驱使下，用与驴皮相似的马皮和骡皮(骡皮来源于骡，骡由马和驴杂交产生)冒充驴皮销售，以致阿胶中掺入马皮和骡皮的成分，使阿胶功效发生改变，扰乱市场秩序，损害了商家信誉及消费者权益。所以急需针对阿胶中掺假原料马皮和骡皮中马源性成分鉴定的检测方法。

目前针对阿胶原料驴皮、马皮和骡皮的鉴别，传统方法主要是通过观察皮张外表、颜色和辨别气味，但是驴骡皮和驴皮特征相似容易混淆，难以区分，所以通过肉眼观察只能对特征明显的马皮、骡皮和驴皮进行区分，无法区分形态特征相似的皮张，因此需要借助其他方法进行鉴别。近年来，随着分子生物技术的发展，以核酸为靶标的PCR方法和以多肽为靶标的液相色谱-质谱联用检测方法逐渐被应用到皮张的鉴定。中国专利(CN201610716622.3)公开了基于MGB探针利用荧光定量鉴定驴皮、马皮、骡皮；中国专利(CN201610504874.X)公开了基于特征性多肽采用液相色谱-质谱联用的方法鉴别马皮、骡皮；但上述方法都需要昂贵的仪器设备、比较费时，而不能实现现场检测；因此建立一种用于马皮和骡皮中马源性成分现场快速检测方法十分必要。

近年来，核酸恒温扩增技术得到了快速发展，与传统PCR相比，核酸等温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便、快速、灵敏等优点。重组酶聚合酶介导等温扩增技术(recombinasepolymerase amplification，RPA)是在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA动态解链，同时在重组酶介导下引物与模板正确配对形成复合体，然后DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA链。其最大的特点是不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，只需在37-40℃恒温反应10-40min即可完成对模板核酸的扩增。

但目前基于RPA的马皮和骡皮中马源性成分的现场检测方法，由于目前没有专门设计RPA引物的软件，而且引物设计的要求较高，需保证其在种间特异、种内保守，不能形成引物二聚体，所以RPA的引物设计难度较大，从而缺乏马皮和骡皮中马源性成分的现场检测方法。

本发明利用重组酶聚合酶介导的等温扩增技术快速检测马皮和骡皮中马源性成分。根据特异DNA序列，筛选出一组扩增效果较好的RPA引物对并进行标记然后进行RPA扩增，再结合试纸条对上述RPA扩增产物进行检测并判断结果。针对马皮和骡皮中马源性成分的检测方法无需特殊设备，为马皮和骡皮中马源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，且十分适用于现场驴皮真伪的检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的引物对、试剂盒及方法。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的RPA标记引物对，其RPA标记引物包括正向引物和反向引物，其序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中正向引物5’端标记荧光素FITC，反向引物5’端标记生物素Biotin。

RPA标记引物对如下所示：

Horse-F(SEQ ID No.1):5’-FITC-CACGGTCCATCTTGACCACACGCCGGCA-3’

Horse-R(SEQ ID No.2):5’-Biotin-TCTTGCCTCGGCGGAAGTCTGTAAGTAG-3’

包含如上所述用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测RPA标记引物对的检测试剂。

含有如上所述用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的RPA标记引物对或如上所述检测试剂的试剂盒。

如上所述的试剂盒，优选地，其包括RPA反应缓冲液，280mM醋酸镁、阳性对照DNA、灭菌双蒸水。

进一步优选地，所述阳性对照DNA为马基因组DNA，马基因组DNA为对马皮提取的DNA；所述空白对照为灭菌双蒸水。

如上所述的试剂盒，优选地，其还包括针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，该试纸条包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有抗生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

一种马皮和骡皮中马源性成分快速检测的方法，其包括如下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)用如上所述的RPA标记引物对进行RPA扩增；

3)利用金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有抗生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗的胶体金试纸条对RPA扩增产物进行检测，并根据试纸条显色进行结果判定。

如上所述的方法，优选地，在步骤2)中，所述RPA扩增的反应体系中含有DNA模板的终浓度为0.5～2ng/μL，RPA标记引物对的终浓度各为0.3～0.6μmol/L。

进一步优选地，在步骤2)中，所述RPA扩增的扩增体系采用25μL，包括有浓度为10μmol/L的正向标记引物、反向标记引物各1.2μL，DNA模板1μL，RPA反应缓冲液14.25μL，醋酸镁1.25μL，ddH₂O 6.1μL。

如上所述的方法，优选地，在步骤2)中，同时设置以马基因组DNA的模板为阳性对照，以灭菌双蒸水为模板检测的空白对照。

如上所述的方法，优选地，在步骤2)中，所述RPA扩增的反应程序如下：恒温反应40℃，40分钟。

如上所述的方法，优选地，在步骤3)中，根据显色条带进行判定：阳性对照的RPA反应中，马的特异性序列得到扩增，试纸条在检测线和质控线处都有显色；同时空白对照中无扩增产物，仅在质控线处有显色，表明RPA反应体系正常工作，否则重新检测。当检测样品的试纸条在检测线和质控线处都有显色，则表示待测样品中含有马源性成分，样品可能是马皮或骡皮，不是驴皮；当检测样品仅在质控线处有显色，则表示待测样品中不含有马源性成分，样品则既不是马皮也不是骡皮，而是驴皮；若检测线和质控线处均无显色，则表示无扩增或试纸条无效。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的RPA标记引物对，能特异地、高灵敏检测马皮和骡皮中马源性成分。

提供的马皮和骡皮中马源性成分快速检测方法能快速有效的鉴别驴皮真伪，通过鉴定样品中是否含有马源性成分达到鉴别目的。利用建立的检测方法分别对马皮、驴皮和骡皮进行扩增，证实本发明所建立的检测方法具有很高的特异性，为阿胶生产企业和市场监管部门提供了一个快速、简便、准确的检测手段。本发明的方法也可以作为标准检测方法用于马皮和骡皮中马源性成分的检测。本发明利用RPA扩增结合试纸条显色的检测方法无需特殊设备，反应时间仅需40min，特异性强，具有简便、快速、全面、特异性强的特点，结果可经肉眼判读，且十分适用于现场检测驴皮真伪。

附图说明

图1为RPA引物PCR的筛选结果。

图2为利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列进行的特异性检测的结果。

图3为利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列进行的灵敏度检测结果。

图4为利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列进行的真实样品检测结果。

具体实施方式

本发明利用重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)快速检测马皮和骡皮中马源性成分。根据特异DNA序列，设计了大量的RPA特异性引物对，从中筛选出一组扩增效果较好的RPA引物对，再利用异硫氰酸荧光素FITC和生物素分别标记正反向引物的5’端后进行RPA扩增反应，扩增产物经试纸条检测，FITC标记的扩增产物与抗FITC抗体的金标物结合后形成免疫复合物，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素抗体捕获，形成具有颜色的检测线。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线。该方法特异性好，检测时间短，结果可经肉眼判读，可以广泛应用于驴皮现场真伪鉴别。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1特异性检测

1.RPA扩增引物设计

因为RPA扩增结合试纸条的检测方法对引物设计的要求较高，需保证其在种间特异、种内保守，不能形成引物二聚体，否则会直接影响RPA扩增速度和检测灵敏度，从而影响现场检测的结果判断。本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性等方面进行马特异序列的筛选，通过本地BLAST将马基因组序列与其他哺乳动物(牛、水牛、绵羊、山羊、猪、驴)全基因组序列进行比对，最终筛选出马LOC102147906基因序列作为检测靶标；根据RPA引物的设计原则，引物长度28～35bp，在种间特异、种内保守等筛选出若干特异性的RPA引物，引物序列如表1所示，进行PCR扩增，PCR体系：正、反向引物各0.2μmol/L，0.025U/μL rTaq，0.2mmol/L dNTP，1×buffer(TaKaRa公司)，模板1μL，用无菌超纯H₂O补足到20μL。扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，扩增35个循环；)

表1设计的特异性引物信息

通过PCR反应剔除扩增结果中形成引物二聚体的RPA引物对，其结果如图1所示，最终筛选出引物序列如序列表Horse-F2(SEQ ID NO.1)和Horse-R2(SEQ ID NO.2)所示。

标记引物序列如下所示：

正向标记引物Horse-F:5’-FITC-CACGGTCCATCTTGACCACACGCCGGCA-3’

反向标记引物Horse-R:5’-Biotin-TCTTGCCTCGGCGGAAGTCTGTAAGTAG-3’

2.RPA扩增

2.1试样RPA扩增反应

将所设计的引物对利用TwistDx RPA试剂盒进行重组酶聚合酶等温扩增，RPA反应体系总体积为25μL，其中，浓度为10μmol/L的正向引物Horse-F加入1.2μL、反向标记引物Horse-R各加入1.2μL，检测样品DNA加入1μL，RPA反应缓冲液14.25μL，280mM醋酸镁1.25μL，ddH₂O补足至25μL。RPA扩增反应程序为：恒温反应40℃，扩增40分钟。

2.2对照RPA扩增反应

在待测样品进行RPA扩增反应的同时，设置空白对照。各对照RPA扩增反应体系中，除模板外其余组分及RPA反应条件均相同，且待测DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

3.产物检测

将RPA扩增产物稀释后滴在划有生物素(Biotin)抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的核酸检测试纸条上，侧向层析2～5分钟，可观察到扩增结果。

4.结果

结果如图2所示，其中标号1是以驴皮提取的基因组DNA模板作为阴性对照，标号2是以双蒸水为模板作为空白对照，标号3是以马皮提取的基因组DNA，标号4是以骡皮提取的基因组DNA，分别进行RPA扩增，扩增产物经试纸条检测，结果显示只有马皮和骡皮样品的试纸条在检测线(T线)和质控线(C线)处都有显色，而驴皮和空白对照中仅在质控线处有显色，无假阳性结果出现，表明此方法的特异性好，所以，以驴皮提取的基因组DNA模板作为阴性对照，马皮和骡皮提取的基因组DNA模板作为阳性对照。

所以进行结果分析时：

阳性对照的RPA反应中，马的特异性序列得到扩增，试纸条在检测线和质控线处都有显色；同时空白对照中无扩增产物，仅在质控线处有显色，表明RPA反应体系正常工作，否则重新检测。当检测样品的试纸条在检测线和质控线处都有显色，则表示待测样品中含有马源性成分，样品可能是马皮或骡皮，不是驴皮；当检测样品仅在质控线处有显色，则表示待测样品中不含有马源性成分，样品则既不是马皮也不是骡皮，而是驴皮；若检测线和质控线处均无显色，则表示无扩增或试纸条无效。

实施例2灵敏度试验

将马皮DNA浓度用Nanodrop定量到10ng/μL，然后10倍梯度稀释(10¹、10⁰、10^-1、10^-2)，分别以马皮基因组DNA浓度为10¹ng/μL、10⁰ng/μL、10^-1ng/μL、10^-2ng/μL作为模板，按照实施例1的条件，进行RPA扩增。扩增产物经试纸条检测，结果如图3所示，模板浓度低至1ng/μL时质控线和检测线都显色，即反应体系中加入1ng的模板DNA即可被检测。由于本发明的检测方法是针对驴皮、马皮和骡皮建立的，所以灵敏度试验的结果是能够达到检测的要求的。

实施例3试纸条

本发明提供一种针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，其包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体。利用柠檬酸钠还原法制备胶体金，取0.01％氯金酸水溶液200ml，加入柠檬酸钠3.6ml，加热煮沸直至颜色呈现酒红色。然后将10ml胶体金修饰上60μl抗FITC的抗体(1mg/mL)。金标垫上吸附有金标抗体，其包被浓度为1mg/L和包被量为1μL；所述检测线吸附有抗生物素抗体，其包被浓度为1mg/L和包被量为1μL；所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗，其包被浓度为1mg/L和包被量为1μL。

实施例4马皮和骡皮中马源性成分快速检测试纸条的应用

分别以两个马皮样品、两个骡皮样品和一个驴皮样品，用DNA基因组提取试剂盒提取样品的基因组DNA，以提取的DNA样品为模板，按照实施例1的条件，进行RPA扩增。扩增产物经试纸条检测，结果如图4所示。标号1为蒸馏水作为空白对照，2为驴皮DNA样品，3-4分别为两个马皮DNA样品，5-6分别为两个骡皮DNA样品，结果显示在3-6样品中试纸条T、C线均出现条带，2样品中试纸条仅在C线出现条带，说明SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2序列可用于真实样品的检测。

针对马皮、驴皮和骡皮的检测，试纸条1为空白对照仅在质控线处有显色，表明实验结果可信。当检测线和质控线处都有显色，则表示待测样品中含有马源性成分，样品可能是马皮或骡皮，不是驴皮(试纸条3-6)；当仅质控线处有显色，则表示待测样品中不含有马源性成分，样品则既不是马皮也不是骡皮，而是驴皮(试纸条2)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的引物对、试剂盒及方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacggtccat cttgaccaca cgccggca 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcttgcctcg gcggaagtct gtaagtag 28

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agccggtggc aggtgagccg agctgcgctg 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcgactcgc ctggcgcacg cagttcgtcc c 31

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccacggtcc atcttgacca cacgccggca 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgggtgtgt ttgctccttg ggattccgtg 30

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacacacagg cacacacacg cacaaaagca tg 32

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaacccttgg catcctttgc atccctctca 30

Claims (10)

1.用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的RPA标记引物对，其特征在于，其RPA标记引物包括正向引物和反向引物，其序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中正向引物5’端标记荧光素FITC，反向引物5’端标记生物素Biotin。

2.包含权利要求1所述的用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测RPA标记引物对的检测试剂。

3.含有权利要求1所述的用于马皮和骡皮中马源性成分快速检测的RPA标记引物对或如权利要求2所述检测试剂的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其包括RPA反应缓冲液，280mM醋酸镁、阳性对照DNA、灭菌双蒸水。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，该试纸条包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有抗生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

6.一种马皮和骡皮中马源性成分快速检测的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)用权利要求1所述的RPA标记引物对进行RPA扩增；

3)利用金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有抗生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗的胶体金试纸条对RPA扩增产物进行检测。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述RPA扩增的反应体系中含有DNA模板的终浓度为0.5～2ng/μL，RPA标记引物对的终浓度各为0.3～0.6μmol/L。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，同时设置以马基因组DNA的模板为阳性对照，以灭菌双蒸水为模板检测的空白对照。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述RPA扩增的反应程序如下：恒温反应40℃，40分钟。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，根据显色条带进行判定：阳性对照的RPA反应中，马的特异性序列得到扩增，试纸条在检测线和质控线处都有显色；同时空白对照中无扩增产物，仅在质控线处有显色，表明RPA反应体系正常工作，否则重新检测；

当检测样品的试纸条在检测线和质控线处都有显色，则表示待测样品中含有马源性成分，样品可能是马皮或骡皮，不是驴皮；当检测样品仅在质控线处有显色，则表示待测样品中不含有马源性成分，样品则既不是马皮也不是骡皮，而是驴皮；若检测线和质控线处均无显色，则表示无扩增或试纸条无效。

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