CN114672576B - 一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测体液斑的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于法医常见体液斑RT‑RPA‑LFD快速检测方法。本发明针对唾液斑和阴道分泌物斑对应设计特异性检测引物对和探针，利用本发明所述引物组可对体液斑进行快速鉴定，简化了检测流程，约30min即可完成整套检测。

Description

一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测体液斑的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于法医常见体液斑RT-RPA-LFD快速检测方法。

背景技术

进行法医鉴定的过程中，法医工作者经常会在案发现场遇到各种单一来源的体液斑或者混合体液斑，对这些体液斑检材进行DNA分析然后在短串联重复序列(short tandemrepeat，STR)数据库中比对犯罪嫌疑人是必不可少的一环。但由于DNA的同一性，在没有确定体液斑来源的前提下，仅根据体液斑的STR分型就确定犯罪嫌疑人，很可能造成冤假错案；另外一方面，犯罪现场衣物上的斑痕是精液还是唾液亦或是阴道分泌液，将会对案件的性质和侦查方向产生截然不同的影响。

目前用于法医鉴定DNA分析的检测技术主要有酶学检测法、PCR技术和环介导等温扩增技术等，但是上述现有技术需要PCR仪器，且反应时间很长，需要付出大量精力和时间，成本也较高。因此建立准确快速的体液斑溯源方法不仅有助于STR分型结果的解释，而且有利于确定案件的性质和侦查的方向以及案发现场的重建。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD方法，以本发明中所述的引物组可对体液斑进行快速可视化鉴定，不需要PCR仪，成本较低、且简化了检测流程，缩短了检测时间。

本发明提供了一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD快速可视化引物组，所述RT-RPA-LFD快速可视化引物组包括引物组A和/或引物组B；

所述引物组A包括引物对STATH-RPA和探针STATH-RPA-P；所述引物对STATH-RPA的上游引物STATH-RPA-F1、下游引物STATH-RPA-R1和探针STATH-RPA-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述引物组B包括引物对SPINK5-RPA和探针SPINK5-RPA-P，所述引物对SPINK5-RPA的上游引物SPINK5-RPA-F1、下游引物SPINK5-RPA-R1和探针SPINK5-RPA-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，所述检测体系包括上述技术方案所述的引物组和核酸试纸条；

所述下游引物STATH-RPA-R1和下游引物SPINK5-RPA-R1的5’端均修饰生物素基团Biotin；

所述探针STATH-RPA-P和探针SPINK5-RPA-P的5’端均修饰异硫氰酸荧光素基团FITC、3’端均修饰间臂C3-spacer、中间均修饰四氢呋喃THF。

优选的，所述检测体系包括试剂盒。

优选的，所述核酸试纸条为侧流层析试纸条。

优选的，所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系中还包括恒温快速扩增试剂和质量浓度为0.1％的Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

优选的，所述恒温快速扩增试剂包括RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒。

本发明还提供了上述技术方案所述的RT-RPA-LFD快速可视化引物组或所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系在体液斑检测中的应用。

优选的，所述体液斑包括唾液斑、阴道分泌物斑、包括唾液斑的混合体液斑和包括阴道分泌物斑的混合体液斑任意中的一种或多种。

本发明还提供了一种检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法，所述RT-RPA-LFD快速可视化检测方法包括如下步骤：

以上述技术方案所述的引物组对体液斑RNA进行RT-RPA扩增，得到体液斑RT-RPA扩增产物；

将所述体液斑RT-RPA扩增产物和0.1％的Tris-HCl混合，将得到的混合物用核酸试纸条进行检测，后进行结果判读；

试纸条上同时出现C线和T线，则检测样本为目标体液；

试纸条上只出现C线，无T线，则检测样本不是目标体液；

试纸条上未出现C线，则检测试纸条失效。

优选的，所述体液斑包括唾液斑、阴道分泌物斑、包括唾液斑的混合体液斑和包括阴道分泌物斑的混合体液斑中的任意一种或多种；

所述体液斑RT-RPA扩增产物和0.1％的Tris-HCl的体积比为1：19。

有益效果：

本发明提供了一种用于体液斑检测RT-RPA-LFD快速可视化引物组，本发明针对唾液斑和阴道分泌物斑对应设计特异性检测引物对和探针，利用本发明所述引物组可对体液斑进行快速鉴定，简化了检测流程，约30min即可完成整套检测。

其次，本发明还提供了一种用于体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测的试剂盒及检测方法，将RT-RPA扩增技术与试纸条检测技术进行结合，可对目标体液进行快速鉴定，尤其可将唾液斑和阴道分泌物斑有效与其他体液斑进行快速区分，且可实现无PCR仪，可视化检测，方便快速且成本较低，适合各种场景下的体液斑检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中唾液斑基因STATH和HTN3的检测结果；

图2为实施例1中阴道分泌物斑基因SPINK5和MYOZ1的检测结果；

图3为实施例2中以不同浓度的唾液斑RNA进行RT-RPA-LFD快速可视化检测的结果图；

图4为实施例2中以不同浓度的阴道分泌物斑RNA进行RT-RPA-LFD快速可视化检测的结果图；

图5-1～5-2为实施例3中以唾液斑RT-RPA-LFD引物组对不同体液样本进行检测的结果；

图6-1～6-2为实施例3中以阴道分泌物斑RT-RPA-LFD引物组对不同体液样本进行检测的结果；

图7为实施例4中以唾液斑RT-RPA-LFD引物组对陈旧唾液斑样本进行检测的结果；

图8为实施例4中以阴道分泌物斑RT-RPA-LFD引物组对陈旧阴道分泌物斑样本进行检测的结果；

图9为实施例5中以唾液斑RT-RPA-LFD引物组对模拟混合斑进行检测的结果，1-5分别代表表3中编号为1-5的样本；

图10为实施例5中以阴道分泌物斑RT-RPA-LFD引物组对模拟混合斑进行检测的结果，1-5分别代表表3中编号为1-5的样本。

在本发明的附图中以阴道斑指代阴道分泌物斑。

具体实施方式

本发明提供了一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD快速可视化引物组，所述RT-RPA-LFD快速可视化引物组包括引物组A和/或引物组B；所述引物组A包括引物对STATH-RPA和探针STATH-RPA-P；所述引物对STATH-RPA的上游引物STATH-RPA-F1、下游引物STATH-RPA-R1和探针STATH-RPA-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述引物组B包括引物对SPINK5-RPA和探针SPINK5-RPA-P，所述引物对SPINK5-RPA的上游引物SPINK5-RPA-F1、下游引物SPINK5-RPA-R1和探针SPINK5-RPA-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

当本发明所述体液斑为包括唾液斑的体液斑时，采用引物组A进行检测；当所述体液斑为包括阴道分泌物斑体液斑时，采用引物组B进行检测；所述引物组A和引物组B中引物对和探针序列分别具体如下：

本发明还提供了一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，所述检测体系包括上述技术方案所述的引物组和核酸试纸条；所述下游引物STATH-RPA-R1和下游引物SPINK5-RPA-R1的5’端均修饰生物素基团Biotin；所述探针STATH-RPA-P和探针SPINK5-RPA-P的5’端均修饰异硫氰酸荧光素基团FITC、3’端均修饰间臂C3-spacer、中间均修饰四氢呋喃THF。

在本发明中，标记后的引物组序列如下：

本发明所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系优选包括试剂盒。本发明所述核酸试纸条优选包括侧流层析试纸条。本发明所述核酸试纸条的加样区胶体金优选标记FITC抗体；T线(检测线)区优选标记生物素配体，更优选为链霉亲和素；C线(质控线)区优选标记FITC抗体的抗体，更优选为抗兔抗体。

本发明所述探针STATH-RPA-P和探针SPINK5-RPA-P的5’端修饰的异硫氰酸基团FITC与所述核酸试纸条上的FITC抗体结合；四氢呋喃THF通过碱基替换方式对探针STATH-RPA-P和探针SPINK5-RPA-P进行修饰，所述四氢呋喃THF在所述探针STATH-RPA-P和探针SPINK5-RPA-P的位置的优选为距离探针5’端最少30bp，距离探针3’端最少15bp。其可在RPA反应过程中由双链特异性大肠杆菌核酸内切酶(nfo)切割，释放3’-OH作为引物进行延伸；3’端均修饰间臂C3-spacer可阻断反应过程中引物的延伸。

本发明所述下游引物STATH-RPA-R1和下游引物SPINK5-RPA-R1的5’端修饰的生物素基团Biotin可与所述核酸试纸条上的生物素配体结合。

本发明所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系优选还包括恒温快速扩增试剂，进一步优选为RT-nfoRNA恒温快速扩增试剂盒，更优选为武汉君诺德生物技术有限公司生产的RT-nfoRNA恒温快速扩增试剂盒。

本发明所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系优选还包括质量浓度为0.1％的Tris-HCl；所述Tris-HCl的pH值优选为8。本发明所述Tris-HCl可用于稀释RT-RPA扩增产物，获得后续核酸试纸条检测的稀释产物。

本发明还提供了上述技术方案所述的RT-RPA-LFD快速可视化引物组或所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系在体液斑检测中的应用。本发明所述体液斑优选包括唾液斑、阴道分泌物斑、包括唾液斑的混合体液斑和包括阴道分泌物斑的混合体液斑中的任意一种或多种，更优选包括唾液斑或阴道分泌物斑。采用本发明提供的RT-RPA-LFD快速可视化引物组或RT-RPA-LFD快速可视化检测体系可以对唾液斑或阴道分泌物斑进行可视化鉴定，快速鉴定得到唾液斑或阴道分泌物斑样本，流程简便快速，适用于各种检测场景。

本发明还提供了一种检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法，所述RT-RPA-LFD快速可视化检测方法包括如下步骤：

以上述技术方案所述的引物组对体液斑RNA进行RT-RPA扩增，得到体液斑RT-RPA扩增产物；

将所述体液斑RT-RPA扩增产物和0.1％的Tris-HCl混合，后将得到的混合物用核酸试纸条进行检测，后进行结果判读；

阳性：试纸条上同时出现C线和T线，则检测样本为目标体液；

阴性：试纸条上只出现C线，无T线，则检测样本不是目标体液。

无效：试纸条上未出现C线，无论是否出现T线，试纸条均无效。

本发明以上述技术方案所述的引物组对体液斑RNA进行RT-RPA扩增，得到体液斑RT-RPA扩增产物。本发明所述体液斑优选为唾液斑或阴道分泌物斑。本发明对体液斑RNA进行RT-RPA扩增前，优选还包括提取体液斑RNA。本发明对提取体液斑RNA的方式没有特殊限定，采用本领域常规RNA提取方式即可。本发明用于RT-RPA扩增的试剂优选为恒温快速扩增试剂，进一步优选为RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒，更优选为武汉君诺德生物技术有限公司生产的RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒。本发明对RT-RPA扩增的体系没有特殊限定，依据实际采用的试剂或试剂盒类型进行调整即可，本发明下述以武汉君诺德生物技术有限公司生产的RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒对RT-RPA扩增的体系进行说明，但不能仅仅将其认定为本发明全部的保护范围。本发明所述武汉君诺德生物技术有限公司生产的RT-nfoRNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系总体积优选为30μL，体系配置优选如下：

本发明所述武汉君诺德生物技术有限公司生产的RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒进行RT-RPA扩增的反应条件优选为在20～42℃温度下，反应5～25min，更优选为37℃，反应15min。本发明优选在金属浴中进行上述反应。

得到所述体液斑RT-RPA扩增产物后，本发明将所述体液斑RT-RPA扩增产物和0.1％的质量浓度为Tris-HCl混合，后将得到的混合物用核酸试纸条进行检测，后进行结果判读。本发明所述体液斑RT-RPA扩增产物和质量浓度为0.1％的Tris-HCl的体积比优选为1：19。本发明采用核酸试纸条进行检测时混合物的加样量优选为50μL。本发明将得到的混合物用核酸试纸条进行检测的时间优选为2～6min，更优选为5min。

本发明在结果判读的标准优选包括：阳性：试纸条上同时出现C线和T线，则检测样本为目标体液；阴性：试纸条上只出现C线，无T线，则检测样本不是目标体液。

具体的：当采用引物组A检测待测样本时，试纸条上同时出现C线和T线，则检测样本为包括唾液斑的体液斑样本，试纸条上只出现C线，无T线，则检测样本不是包括唾液斑的体液斑样本；

当采用引物组B检测待测样本时，试纸条上同时出现C线和T线，则检测样本为包括阴道分泌物斑的体液斑，试纸条上只出现C线，无T线，则检测样本不是包括阴道分泌物斑的体液斑样本。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

唾液斑/阴道分泌物斑特异性mRNA基因的筛选

由如下步骤组成：

(1)样品处理：使用RNAiso Plus试剂从待测样品中提取总RNA；

(2)基因筛选、引物设计及RT-RPA反应：本发明参考近10年研究唾液和阴道斑特异性mRNA的相关文献，筛选出对唾液斑和阴道分泌物斑特异性较好的mRNA基因。最终筛选得到2个唾液斑特异mRNA(STATH和HTN3)和2个阴道分泌物斑特异mRNA(SPINK5和MYOZ1)。

本发明通过在ensembl数据库中查找唾液和阴道斑特异性mRNA的所有转录本和转录本上的突变，选择不存在SNP或者存在SNP但是最小等位基因频率(MAF)小于0.05的转录本。筛选到合适的转录本后，利用Primer Premier v5.0软件对这4个mRNA标记设计RPA引物和探针，所有设计的引物都同时骑跨两个外显子以避免扩增出DNA片段，引物和探针序列如表1：

表1唾液斑和阴道分泌物斑特异mRNA标记RPA引物

注：表1中SEQ ID NO.7～12在序列表中不包括各标记基团。

RT-RPA扩增的反应体系及条件如下：根据RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒(武汉君诺德生物技术有限公司)的说明，对体系进行优化后，体系总反应体积30μL，反应体系按照下表进行体系配置，如表2。

表2RT-RPA扩增的反应体系

反应条件为：混匀后于37℃金属浴15min。

(3)结果检测：将RT-RPA产物和0.1％的Tris-HCL(pH＝8)按照1:19的体积比稀释后取50μL于试纸条加样区进行侧向层析。

(4)检测标准：侧流层析试纸条(LFD)检测扩增产物，根据检测条带判读检测样品是否为唾液或阴道分泌物。

(5)结果判读：若试纸条只出现C线，无T线，则不是目标体液；若试纸条同时出现C线和T线，则检测的样品为目标体液。

唾液斑/阴道分泌物斑特异性mRNA基因的扩增结果图1和图2。

结果显示唾液斑的STATH基因的扩增稳定，效率高，T线明显；HTN3基因的扩增效率较低，T线亮度较低，所以本发明选择STATH基因。阴道斑的SPINK5基因的扩增稳定，效率高，T线明显；MYOZ1基因的扩增效率较低，T线亮度较低，所以本发明选择SPINK5基因。

实施例2

体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法灵敏度的检测

按照实施例1中筛选的唾液斑/阴道分泌物斑的特异性mRNA基因和建立RT-RPA-LFD快速可视化检测方法，对体系的检测灵敏度进行评估，将唾液斑和阴道斑分泌物斑的RNA按照10倍稀释为一系列浓度梯度，唾液斑RNA稀释为5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、100fg/μL、50fg/μL；阴道分泌物斑RNA稀释为5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL、5fg/μL，同时以无菌无酶水为阴性对照进行检测。

结果如图3～4所示：检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法具有良好的灵敏度。唾液斑RT-RPA-LFD可视化检测方法最低可以检测100fg/μL的唾液RNA；阴道分泌物斑RT-RPA-LFD可视化检测方法最低可以检测50fg/μL的阴道分泌物斑RNA。

实施例3

体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法特异性的检测

按照实施例1中优化的检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法，使用阴道分泌物斑/唾液斑、精液、皮肤、血液、月经血、鼻涕、汗液、女性尿液和男性尿液RNA评估唾液斑/阴道分泌物斑RT-RPA-LFD检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法进行评估。唾液斑/阴道分泌物斑RNA为阳性对照，无菌无酶水为阴性对照。

检测结果如图5-1～5-2及图6-1～6-2所示：对于唾液RT-RPA-LFD体系，只有唾液斑和鼻涕检测到了阳性扩增，试纸条检测线上出现了明显的酒红色条带；对于阴道斑RT-RPA-LFD体系，只有阴道分泌物斑和月经血检测到了阳性扩增，试纸条检测线上出现了明显的酒红色条带。

上述实验结果说明采用本发明提供的引物组和方法可以将唾液斑与大部分体液斑区分开，鉴定得到唾液斑和解剖位置相邻的鼻腔产生的鼻涕，进一步通过本领域中相关技术即可将唾液斑和鼻涕进行有效区分；同理，采用本发明提供的引物组和方法可以将阴道分泌物斑与大部分体液斑区分开，鉴定得到阴道分泌物斑和流出通路相同的月经血，进一步通过本领域中相关技术即可将阴道分泌物和月经血进行有效区分。由此可见，上述实验结果表明体液斑的RT-RPA-LFD检测引物和方法的特异性良好，为体液斑尤其是唾液斑和阴道分泌物斑的鉴定工作进一步提供了便利。

实施例4

体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法对陈旧斑痕的检测能力

本发明收集来自3个志愿者的唾液并制备成唾液斑分别保存1天、90天、180天，然后提取唾液斑样本的RNA并定量至0.5ng/μL；

本发明收集来自3个志愿者的阴道分泌物并制备成阴道分泌物斑分别保存1天、90天、210天、300天后提取阴道斑样本的RNA并定量至0.5ng/μL。

分别用实施例1中的检测方法检测陈旧唾液斑RNA和陈旧阴道分泌物斑RNA。同时以无菌无酶水为空白对照。

实验结果如图7～8所示，本发明所述引物组和方法对陈旧的唾液斑和阴道分泌物斑依旧具备检测能力，且检测结果准确。

实施例5

体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法对混合斑的检测能力

为了评估实施例1中检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法对混合斑的检测能力，本发明制备了5份模拟混合斑样本，模拟混合斑的制备见表3：

表3模拟混合斑样本

对制作的5份模拟检材提取RNA并定量至1ng/μL后，取1μLRNA产物按照实施例1中的检测方法，进行反应体系配置，分别对混合斑进行检测，无菌无酶水为阴性对照。结果如图9～10所示：唾液斑/阴道分泌物斑RT-RPA-LFD体系有较高的特异性和灵敏度并成功检测到含有唾液斑/阴道分泌物斑的混合斑。

由以上实施例可知，采用本发明提供的检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化引物组和检测方法可以对唾液斑样本或阴道分泌物样本进行快速准确地检测，并且方便快速，整个过程在30min内可以完成。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山西医科大学

<120> 一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测体液斑的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgcgtagaa ttggaagatt cggttatggg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtagaagtc gtatttgcca atcaagcctc 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agccagttcc agaacaacca ctatacccac aaccatacca accaca 46

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatgtgccct gtgtgctgaa attttcaagc 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgattttg atattgactg cagagtttca ca 32

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggaaaacag taaaacagat caaaatttgg gaaaagctga agaaaa 46

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacttctgga ttctcctctt gagtaaaagg ac 32

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atagcctcga tgtgaatgat gcttttcatg 30

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttggctctc atgctttcca tgactggagc gattcacatg caaag 45

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaactcactg gaggtggaca ggagagctca g 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttctggaag tgatccattg agctgtcaga g 31

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaaagatca gtgtcccaag ggatgtgatg tggaggaact gtcgc 45

Claims (9)

1.一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD快速可视化引物组，其特征在于，所述RT-RPA-LFD快速可视化引物组包括引物组A和/或引物组B；

所述引物组A包括引物对STATH-RPA和探针STATH-RPA-P；所述引物对STATH-RPA的上游引物STATH-RPA-F1、下游引物STATH-RPA-R1和探针STATH-RPA-P的核苷酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述引物组B包括引物对SPINK5-RPA和探针SPINK5-RPA-P，所述引物对SPINK5-RPA的上游引物SPINK5-RPA-F1、下游引物SPINK5-RPA-R1和探针SPINK5-RPA-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.一种用于体液斑检测的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，其特征在于，所述检测体系包括权利要求1所述的引物组和核酸试纸条；

所述下游引物STATH-RPA-R1和下游引物SPINK5-RPA-R1的5’端均修饰生物素基团Biotin；

所述探针STATH-RPA-P和探针SPINK5-RPA-P的5’端均修饰异硫氰酸荧光素基团FITC、3’端均修饰间臂C3-spacer、中间均修饰四氢呋喃THF。

3.根据权利要求2所述的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，其特征在于，所述检测体系包括试剂盒。

4.根据权利要求2所述的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，其特征在于，所述核酸试纸条为侧流层析试纸条。

5.根据权利要求2～4任一项所述的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，其特征在于，所述RT-RPA-LFD快速可视化检测体系中还包括恒温快速扩增试剂和质量浓度为0.1％的Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

6.根据权利要求5所述的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系，其特征在于，所述恒温快速扩增试剂包括RT-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒。

7.权利要求1所述的RT-RPA-LFD快速可视化引物组或权利要求2～6任一项所述的RT-RPA-LFD快速可视化检测体系在体液斑检测中的应用；

所述体液斑由唾液斑、阴道分泌物斑、包括唾液斑的混合体液斑和包括阴道分泌物斑的混合体液斑中的任意一种或多种组成。

8.一种检测体液斑的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法，其特征在于，所述RT-RPA-LFD快速可视化检测方法包括如下步骤：

以权利要求1所述的引物组对体液斑RNA进行RT-RPA扩增，得到体液斑RT-RPA扩增产物；

将所述体液斑RT-RPA扩增产物和0.1％的Tris-HCl混合，将得到的混合物用核酸试纸条进行检测，进行结果判读；

试纸条上同时出现C线和T线，则检测样本为目标体液；

试纸条上只出现C线，无T线，则检测样本不是目标体液；

试纸条上未出现C线，检测试纸条失效；

所述体液斑由唾液斑、阴道分泌物斑、包括唾液斑的混合体液斑和包括阴道分泌物斑的混合体液斑中的任意一种或多种组成。

9.根据权利要求8所述的RT-RPA-LFD快速可视化检测方法，其特征在于，所述体液斑RT-RPA扩增产物和0.1％的Tris-HCl的体积比为1：19。