KR100277289B1 - 한국인 집단에서 변별력을 가진 에스티알 유전자좌들로 구성된 콰드루플렉스 피씨알시스텀 및 이를 이용한 유전자 감식방법 - Google Patents

한국인 집단에서 변별력을 가진 에스티알 유전자좌들로 구성된 콰드루플렉스 피씨알시스텀 및 이를 이용한 유전자 감식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 시스템에서 한국인 집단에서 변별력을 가진 유전자 마커의 검출 및 이들의 조합을 이용한 유전자 감식방법에 관한 것으로서, 중합효소연쇄반응을 이용하여 STR 유전자좌들의 조합을 동시에 증폭함으로써 신속하게 유전자감식을 할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법은 동시에 증폭될 수 있는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 4개의 STR유전자좌들을 갖고 있는 하나이상의 분석 DNA 샘플을 얻는 단계, 상기 DNA 샘플에서 특정 프라이머들을 사용하여 STR 서열을 PCR 증폭하는 단계, 증폭된 산물을 전기영동을 통해 검출하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고, 이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명자에 의해 완성된 상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

Description

한국인 집단에서 변별력을 가진 에스티알 유전자좌들로 구성된 콰드루플렉스 피씨알 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식방법 {Quadruplex PCR systems consisting of STR loci which are high discriminating in Korean population and the methods of human identification using them}
본 발명은 유전자 시스템에서 한국인 집단에서 변별력을 가진 유전자마커(genetic markers)의 검출 및 이들의 조합을 이용한 유전자 감식방법에 관한것으로서, 보다 상세하게는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을이용하여 여러 다형성 유전자좌들의 조합, 특히 STR 유전자좌들(short tandem repeat loci)의 조합을 동시에 증폭함으로써 신속하게 유전자감식을 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 친자확인, 강력사건에 있어서의 범인지목을 목적으로 한 유전자 감식법에는 1990년대 들어 비약적으로 그 기술이 발전된 PCR을 이용한 amp-FLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 타이핑 방법이 사용되고 있으며, 간단하면서도 정확한 DNA 타이핑을 위해 STR이 유전자 감식의 마커로서 아주 유용한 것으로 확인되었다. 그 동안 많은 연구들을 통해 다양한 VNTR(Variable Number of Tandem Repeats)과 STR(Short Tandem Repeat)이 발견되었고, 이들 중 일부의 STR 유전자좌들은 법과학분야(Forensic Science)에서 널리 사용되기에 이르렀다.
STR 유전자좌들(Short Tandem Repeat loci)은 2 내지 7개의 염기쌍의 짧은 반복서열로 구성되어 있는데, 인간 유전자에는 약 2백만개의 삼량체 및 사량체 STR들이 15 kb당 한 번씩 존재하는 것으로 추정되고 있다(Edwards et al., 1991, 'DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeat.' Am. J. Hum. Genet. 49:746-756). 상기 Edwards 등의 문헌에 따르면, STR 유전자좌들의 거의 절반이 다형성을 나타내는데, 이는 STR이 유전자 마커로서 매우 유용함을 시시하고 있다.
통상, 이러한 유전자 감식의 신뢰성을 높이기 위해서는 많은 STR을 대상으로조사가 수행되어야 하는데, 많은 STR을 대상으로 유전자 감식을 수행할 경우에는 수많은 STR 대립유전자의 확인에 따른 시간과 인력의 소모라는 문제점이 있었다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해 한 번의 PCR 반응에 여러 유전자좌의 프라이머를 넣고 동시에 반응을 수행하는 멀티플렉스 PCR 시스템이 대안으로 제시되고있다. 예를 들어, 3개의 유전자좌의 반응을 동시에 수행하는 트리플렉스 시스템(triplex system)을 사용할 경우 소요시간, 시약, 장비 및 인력을 3분의 1정도로 줄일 수 있게 된다. 이와 같이 멀티플렉스 PCR 시스템이 갖는 장점 때문에 미국 및 유럽 등지의 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 멀티플렉스 PCR 시스템을 확립하는데 박차를 가하고 있으며, 이미 미국의 프로메가 등은 트리플렉스 PCR 키트를 상용 시판하고 있으며 (Triplex I: HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1PO; TriplexⅡ: HumvWA, HumFES/FPS, HumF13AO1), Kimpton 등은 이를 바탕으로 트리플렉스 PCR 시트템 위주의 연구를 활발히 진행하였고(Kimpton et al., 1995, Report on the second EDNAP collaborative exercise Forensic Sci Inter. 71:137-152; Urquhart et al., Sequence variability of the tetranucleotide repeat of the human beta-actin related pseudogene H-beta-AC-psi-2(ACTBP2) locus. Humn Genet. 92:637-6384), 최근에는 미국특허공보 제 5,843,660 호에 개시된 바와 같이 4가지의 유전자좌들을 동시에 분석하는 콰드루플렉스 시스템(quadruplex system) 및 그 이상의 유전자좌들을 동시에 분석하는 멀티플렉스 시스템이 제안되고 있다.
이러한 멀티플렉스 시스템의 지속적인 개발성과는 강력 사범 유전자정보은행(DNA Intelligence Database)의 설립 및 운용에 박차를 가할 만한 획기적인 성과로서 1998년 10월 현재 영국, 미국, 독일, 오스트리아, 네덜란드 등이 유전자정보은행을 운용하고 있으며, 특히 영국의 경우에는 1995년부터 대상자들의 입력을 시작한 이래 현재 400,000명 이상의 데이터를 보유하고 있으며 이 데이터베이스를 통하여 범인을 검거한 제이스가 28,000건을 넘어선 성과를 올리고 있다. 미국의 경우도 주(state) 단위로 운용하던 데이터베이스를 미연방수사국이 관리하는 CODIS(combined DNA Index system)을 이용하여 연방전체의 내셔널 DNA 데이터베이스를 구축하는 단계로 접어들었다.
그런데, 전술한 바와 같이 이들 국가들에서 운용하고 있는 유전자정보은행의특징을 살펴보면, 1O개 이상의 STR 유전자좌들을 사용함을 알 수 있는데, 이는 정확한 범인검거를 위해 요구되는 중복되는 유전자형이 없는 데이터베이스 구축을 위해 필수적이며, 또한 1O개 이상의 STR 유전자좌들의 증폭을 효율적으로 수행하기 위해서 멀티플렉스 시스템을 채택하고 있음을 알 수 있다.
한편, 간과해서는 안되는 중요한 점이 있는데, 유전자정보은행을 실시중인 대부분의 국가가 백인이 주류를 이루는 국가이기 때문에 선정한 STR 유전자좌들은백인들에게서 변별력이 높은 것이며, 상용화된 감식 키트 역시 이러한 유전자정보은행 시스템에 맞게 개발되어 있어 한국인과 같은 동양인의 유전자 감식에는 그 만큼 변별력이 낮아질 수밖에 없는 문제점이 있었다. 특히, 전술한 바와 같은 미국특허공보 제 5,843,660 호에 기재된 멀티플렉스 STR 시스템은 백인집단에 알맞는 STR유전자좌들의 조합이며 한국인과 같은 동양인의 다형성 확인 및 유전자 감식을 위해서는 백인집단에 비하여 변별력이 떨어지는 조합이다.
따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 독자적인 유전자정보은행의 구축을 위해 한국인 등 동양인 집단에 맞는 STR 유전자좌들의 선별과 유전자감식법의 개발이 절실히 요구되어 왔다. 특히, STR 유전자좌들의 확인 즉, 마커의 확인시에은염색(silver staining)을 사용할 경우 한 유전자좌의 증폭산물의 크기와 다른 유전자좌의 증폭산물의 크기가 중복될 경우에는 확인이 어렵게 되므로 대립유전자 크기가 서로 중복되지 않는 STR 유전자좌들의 조합만이 은염색에 대해 식별가능한 점을 감안할 때, 한국인 집단에 대한 높은 변별력을 가지는 동시에 전기영동 후 은염색에 대해 검출가능한 STR 유전자좌들의 조합의 개발은 매우 중요하다고 할 것이다. 또한, 동일 염색체에 존재하는 유전자좌들을 선택할 경우 유전자좌들의연관(linkage)에 의해 변별력에 있어 신뢰성이 떨어지기 때문에 각기 다른 염색체에 존재하는 유전자좌들의 선정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 매우 중요한 의미를 갖고 있다. 뿐만 아니라 이러한 STR 유전자좌들의 선별과 멀티플렉스 증폭을뒷받침해 줄 수 있는 프라이머의 제공 역시 매우 중요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 가지는 STR 유전자좌들의 조합을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 지닐 뿐만 아니라 전기영동후 검출가능한 STR 유전자좌들의 조합을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 가지는 STR 유전자좌들의멀티플렉스 증폭에 적합한 프라이머를 제공하는데 있다.
나아가, 본 발명은 상기와 같은 STR 유전좌들의 조합과 프라이머를 이용한 PCR 증폭의 조건을 확립하여 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식법을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 상기와 같은 프라이머와 STR 유전자좌들의 조합을 채택함으로써 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식방법을 구현하고 있는 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 2는 실시예 2에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예 3에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 4는 실시예 4에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 5에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 6은 실시예 6에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
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도 12는 실시예 12에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
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도 44는 실시예 44에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 45는 실시예 45에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 46은 실시예 46에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 47은 실시예 47에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
도 48은 실시예 48에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 대상 STR 유전자좌들의 한국인집단내 대립유전자(allele) 빈도를 일차적으로 고려해야 하는데, 이를 위해 대상 STR 유전자좌들의 조합은 변별력의 척도가 되는 PI(Probability of Identity)가 충분히 낮아야 하며, 이형성(heterozygosity)이 높은 것들이 유리하다. 주지된 바와같이 각각의 유전자좌는 인종간 변이가 심하며 동 인종내에서도 국가마다 약간의 차이를 보이기 때문에 일정한 수의 한국인집단의 대립유전자 빈도를 조사한 후 이중에서 적합한 유전자좌들을 조합하여 멀티플렉스 PCR 시스템을 채택해야만 한다.
또한, 본 발명의 증폭의 효율성 측면에서 유사한 PCR 조건을 가지는 유전자좌들을 조합하여 멀티플렉스 PCR 시스템을 만들어야 한다. 이때 가장 중요하게 고려되어야 할 사항이 PCR 상의 어닐링(annealing) 온도이다. 조합된 유전자좌들의 프라이머가 어닐링 온도가 맞지 않는 것이라면 PCR 산물인 증폭단편들은 현저한 농도의 차이를 보일 것이며, 또한 많은 오류밴드(artifact band)들도 생성될 가능성이 있으므로 어닐링 온도의 편차가 크지 않은 프라이머들의 조합으로 이루어진 유전자좌들을 찾는 것이 중요하다.
또한, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템은 형광표지물질 검출 뿐만아니라 은염색을 통한 통상적인 전기영동이나 자동 DNA 시퀀서를 이용하여 전기영동을 수행할 것이므로 증폭단편들의 크기가 겹치는 유전자좌들을 조합해서는 안된다. 이밖에도 각 유전자좌 별로 일정한 농도의 밴드패턴을 얻기 위해서는 각 유전자좌의 프라이머 농도를 적절히 조절하는 것이 요구된다.
또 한가지로, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템에 포함될 유전자좌들은 재소자의 유전자형 분석을 위해서만 사용될 것이 아니고 강력사건의 증거물에도 똑같이적용될 기법들이므로 상태가 나쁜 감정물에서도 유전자형 검출이 잘 되는 민감도(sensitivity)가 높은 것이어야 하며 2인 이상의 유전자형이 섞인 감정물의 감식에 대비하여 스터터 밴드(stutter band)와 같은 오류밴드가 생성되지 않는 유전자좌들이 선정되어야 한다.
이러한 조건들을 감안하여 본 발명자들은 STR 유전자좌들의 PCR 조건을 검토하여 증폭 및 전기영동 조건을 설정한 후 일정 숫자의 한국인집단에 대한 대립유전자 빈도를 조사하였으며, 이중 변별력이 높은 것들을 조합하여 16개의 유전자좌들로 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템(multiplex STR system), 바람직하게는 콰드루플렉스 STR 시스템(quadruplex STR system)을 개발하였다.
이러한 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법은
동시에 증폭될 수 있는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 4개의 STR 유전자좌들을 갖고 있는 하나 이상의 분석 DNA 샘플을 얻는 단계;
상기 DNA 샘플에서 특정 프라이머들을 사용하여 STR 서열을 PCR 증폭하는 단계;
증폭된 산물을 전기영동을 통해 검출하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고,이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자에 의해 완성된 상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 다음과 같은 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270.
상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 바람직하게는 콰드루플렉스 STR 시스템이며, 본 발명의 콰드루플렉스 STR 시스템은 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
D21S1437, D16S3253 , D14S608 , D18S1270;
D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;
D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;
D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;
D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;
D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;
D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;
D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;
D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;
D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;
D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;
D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;
D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;
D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; 및
D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.
더욱 바람직하게는, 상기 콰드루플렉스 STR 시스템은 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.
본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템은 증폭되는 각 유전자좌를 플랭킹하는 프라이머의 쌍을 이용하는데, 전술한 바와 같이 프라이머의 선정은 전기영동후 다른유전자좌의 대립유전자와의 중복을 방지하고, PCR 어닐링 온도의 편차가 크지 않도록 하기 위해 매우 중요하다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템에서 사용되는 프라이머들의 각 쌍들은 다음과 같은 프라이머 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다:
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D5S818인 경우에는 서열 1 및 서열 2;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D13S317인 경우에는 서열 3 및 서열 4;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D19S253인 경우에는 서열 5 및 서열 6;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D3S2406인 경우에는 서열 7 및 서열 8, 또는 서열 9 및 서열 10;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D2S1371인 경우에는 서열 11 및서열 12;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D8S1477인 경우에는 서열 13 및서열 14;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D12S391인 경우에는 서열 15 및서열 16;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D20S470인 경우에는 서열 17 및서열 18;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D6S1043인 경우에는 서열 19 및서열 20;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D9S925인 경우에는 서열 21 및 서열 22;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D7S821인 경우에는 서열 23 및 서열 24;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D4S2368인 경우에는 서열 25 및서열 26;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D21S1437인 경우에는 서열 27 및서열 28;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D16S3253인 경우에는 서열 29 및서열 30;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D14S608인 경우에는 서열 31 및서열 32; 및
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D18S1270인 경우에는 서열 33 및서열 34.
한편, 본 발명의 다른 구체예는 하기와 같은 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합 및 선택된 유전자좌 각각에 해당되는 프라이머들을 가지는 용기를 포함하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트에 관한 것이다:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270.
한편, 상기 유전자 감식키트의 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합은 바람직하게는 콰드루플렉스 STR 시스템이며, 본 발명의 유전자 감식키트는 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌들의 조합을 갖는 것을 특징으로 한다:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
D21S1437, D16S3253 , D14S608, D18S1270;
D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;
D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;
D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;
D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;
D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;
D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;
D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;
D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;
D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;
D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;
D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;
D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;
D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; 및
D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 유전자 감식키트는 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자좌들의 조합을 갖는 것을특징으로 한다:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368; 및
D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.
한편, 이하에서 설명되는 실시예들에서 사용되는 본 발명의 방법론적 기법들을 간략히 설명하면 다음과 같다.
가. 혈액으로부터 DNA 추출
혈액성분 중 먼저 적혈구를 제거하기 위해서 적혈구 용해용액(1OmM Tris-Cl(pH 8.0), 1OmM NaCl, 5mM MgCl2)을 두 번 처리한 후, 남아 있는 세포에 백혈구 용해용액(1OmM Tris-Cl(pH 8.0), 1mM EDTA, 10OmM NaCl, 1% SDS, 프로테나제 K(200㎍/㎖)를 가하여 2시간 동안 56℃에 둔다. 그런 다음, 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1)을 처리하여 DNA를 추출한다. DNA는 100% 에틸알콜을 1.5배 넣어서 응축시킨 후 유리막대로 건져낸다. 건져낸 DNA는 잘 말린 후 증류수에 녹인 다음호퍼 형광미터 TKO 1O0(Hoefer fluorometer TKO 1OO)으로 정량한다.
나. 프라이머
하기 실시예들에서 사용된 34개의 증폭 프라이머들은 한국 바이오니어사(Bioneer), 한국 제노텍(Genotech)사 또는 라이프 테크놀로지사(Life Technology)로부터 합성하여 사용하였다.
다. PCR 시약 및 장치
또한, 본 발명의 PCR 반응에 사용된 Taq 폴리머라제는 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer)에서 구입가능한 AmpliTaq, AmpliTaq Gold이며, dNTP는 파마시아 바이오텍사(Pharmacia Biotech) 또는 베링거만하임사(Boehringer Manheim)에서 구입한 것, 그리고 1O×완충용액은 퍼킨 엘머사에서 구입한 것을 사용하였으며, PCR 써멀 사이클러(PCR thermal cycler)는 퍼킨 엘머사의 Perkin Elmer 2400 또는 9600모델을 사용하였다.
라. 전기영동
증폭된 산물들은 GIBCO-BRL 모델 SA32의 전기영동장치를 사용하여 50W로 크실렌 시아놀 염색약(Xylene Cyanol Dye)가 겔의 밑바닥에서 약 1Omm 내지 40mm 될 때까지 전기영동을 수행하였다. 겔은 5%T5%C, 7M 우레아 아크릴아미드 겔이며 런닝버퍼 및 겔버퍼는 TBE 버퍼를 사용하였다.
마. 은염색
전기영동이 끝난 겔은 은염색과정을 거쳐 보관하는데 우선 1%의 질산용액에 5분동안 산화시켰다. 그런 다음 증류수로 잘 수세한 후, O.012M 질산은(silver nitrate)에서 20분 동안 반응시키고 증류수로 다시 한번 세척하였다. 수세된 겔은 0.28M 무수 소디움 카르보네이트와 0.19% 포르말린 용액에서 환원시키면서 나타나는 밴드의 양상에 따라 10% 아세트산 용액으로 염색반응을 중지시켰다. 이렇게 염색된 겔은 3M 종이에 흡착시켜 겔 건조기에서 말린 후 보관한다.
바. 형광물질(fluorescent dye) 표지(labeling)를 이용한 검출
형광물질이 표지된 프라이머는 PE 바이오시스템즈 (PE Biosystems)로부터 합성하여 사용하였다. 형광물질은 한 쌍의 증폭 프라이머 중 한 가지 서열에만 표지시켰으며 표지에 사용되는 형광물질은 하기 물질 중 적당한 것을 골라 표지하였다:
TET ( 4,7,2' ,7' -Tetrachloro-6-carboxyfluorescein );
6-FAM ( 6-carboxyfluorescein );
HEX (4,7,2' ,4' ,5' ,7'-Hexachloro-6-carboxylfluorescein);
TAMRA ( N,N,N' ,N',-teramethyl-6-carboxyrhodamine );
ROX ( 6-carboxy-X-rhodamine);
JOE ( 6-carboxy-2' ,7' -dimethoxy-4' ,5' -dichlorofluorescein );
5-FAM ( 5-carboxyfluorescein);
R110 ( 6-carboxyrhodamine); 및
R6G ( N,N'-diethyl-2' ,7'-dimethyl-6-carboxyrhodamine).
형광물질이 표지된 프라이머를 이용하여 증폭된 각 유전자좌의 증폭산물들은 ABI PRISM 377 자동 DNA 시퀀서(PE Biosystems사 제품)를 이용하여 전기영동을 수행하고 대립유전자를 가시화하였다. 전기영동조건은 제조회사가 매뉴얼에 명시한 방법에 의거하였다. 가시화된 대립유전자들은 PE 바이오시스템즈사가 제공하는 유전자 스캔 분석(Gene Scan Analysis)이나 게노파입퍼(Genotyper) 소프트웨어로 분석하였다.
이하에서는 본 발명을 구현하고 있는 바람직한 실시예들 및 종래의 유전자 감식방법을 구현하고 있는 비교예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 한편, 이하에서 설명되는 실시예들은 본 발명의 권리범위를 축소하거나 제한하고자 하는 것이아니며 본 발명의 특징을 보다 상세히 설명하기 위해 제시되는 것임을 밝혀둔다.
실시예 1
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20), 0.30 μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.10μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), O.0875 μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험걸과는 도 1에 도시된 바와 같다.
실시예 2
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액(PE), O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2), 0.1 μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), O.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.25 μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 바와 같은 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
실시예 3
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액(PE), 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125 μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 바와 같은 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
실시예 4
D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 1 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 2.15μM D18S1270 프라이머(서열 33 및 서열 34), 0.3μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), O.5μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.25 μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
94℃에서 1분, 55℃에서 1분 10초, 그리고 72℃에서 10초씩을 30회 반복; 및
72℃에서 7분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 바와 같은 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
실시예 5
D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25 μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열10), 0.05 μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.25 μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.1 μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 5에 도시된 바와 같다.
실시예 6
D4S2368, D19253, D9S925, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875 μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.075μM D19253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.15 μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로트콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 7
D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및서열 26), O.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.15 μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.15μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 7에 도시된 바와 같다.
실시예 8
D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 2.15μM D18S1270 프라이머(서열 33 및 서열 34), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로트콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 8에 도시된 바와 같다.
실시예 9
D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 9에 도시된 바와 같다.
실시예 10
D20S470, D19S253, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 1O에 도시된 바와 같다.
실시예 11
D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 11에 도시된 바와 같다.
실시예 12
D20S470, D12S391, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), O.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), O.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 12에 도시된 바와 같다.
실시예 13
D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.3μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로트콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 13에 도시된 바와 같다.
실시예 14
D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), O.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 14에 도시된 바와 같다.
실시예 15
D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.3μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.075μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 15에 도시된 바와 같다.
실시예 16
D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 16에 도시된 바와 같다.
실시예 17
D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), O.075μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 17에 도시된 바와 같다.
실시예 18
D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 18에 도시된 바와 같다.
실시예 19
D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 19에 도시된 바와 같다.
실시예 20
D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), O.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 2O에 도시된 바와 같다.
실시예 21
D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), O.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 21에 도시된 바와 같다.
실시예 22
D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 22에 도시된 바와 같다.
실시예 23
D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 23에 도시된 바와 같다.
실시예 24
D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 24에 도시된 바와 같다.
실시예 25
D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 25에 도시된 바와 같다.
실시예 26
D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 O.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), O.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.15μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 26에 도시된 바와 같다.
실시예 27
D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 27에 도시된 바와 같다.
실시예 28
D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및서열 26), 0.1μM D7S82l 프라이머(서열 23 및 서열 24), O.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
60℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 28에 도시된 바와 같다.
실시예 29
D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전슬한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 29에 도시된 바와 같다.
실시예 30
D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 30에 도시된 바와 같다.
실시예 31
D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.
최종 시험결과는 도 31에 도시된 바와 같다.
실시예 32
D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), O.25μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 32에 도시된 바와 같다.
실시예 33
D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반웅용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 33에 도시된 바와 같다.
실시예 34
D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 34에 도시된 바와 같다.
실시예 35
D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), O.075μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), O.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.2μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 35에 도시된 바와 같다.
실시예 36
D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 36에 도시된 바와 같다.
실시예 37
D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), O.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 37에 도시된 바와 같다.
실시예 38
D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.15μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 38에 도시된 바와 같다.
실시예 39
D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075 μMD4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.075μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.125μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 39에 도시된 바와 같다.
실시예 40
D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 40에 도시된 바와 같다.
실시예 41
D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.2μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.3μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.5μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.25μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 56℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 41에 도시된 바와 같다.
실시예 42
D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), O.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 42에 도시된 바와 같다.
실시예 43
D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 O.05μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), O.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 43에 도시된 바와 같다.
실시예 44
D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.05μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.075μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 44에 도시된 바와 같다.
실시예 45
D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.075μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.1μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 45에 도시된 바와 같다.
실시예 46
D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.075μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.1μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 46에 도시된 바와 같다.
실시예 47
D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.05μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.15μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), O.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 3분간 예열;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및
72℃에서 5분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.
최종 시험결과는 도 47에 도시된 바와 같다.
실시예 48
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 형광물질 표지를 이용하여 증폭된 유전자형의 검출
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 1.0㎕의 10×PCR 완충용액(PE), 0.2mM dNTPs, 160 ㎍/ml BSA, 0.5 유니트의 AmpliTaq Gold 폴리머라제, 0.5 내지 2ng DNA 주형 및 0.125μM D5S818 프라이머(서열 1 및 HEX로 표지된 서열 2), 0.14 μM D13S317 프라이머(HEX로 표지된 서열 3 및 서열 4), 0.09μM D19S253 프라이머(HEX로 표지된 서열 5 및 서열 6), 0.25 μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 HEX로 표지된 서열 8)로 구성된 전체 부피가 1O㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:
95℃에서 11분간 예열;
94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 60초로 10회 반복;
90℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 60초로 20회 반복; 및
64℃에서 45분간 최종 연장.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동은 전술한 바와 같이 ABI PRISM 377 자동 DNA 시퀀서를 이용하였고 유전자 스캔분석(Gene Scan Analysis) 및 게노파이퍼(Genotyper) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
최종 시험결과는 도 48에 도시된 바와 같다.
한편, 본 발명의 한국인 집단에서의 변별력을 검증하기 위해서 D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270 유전자좌 각각에 대한 한국인 집단 대립유전자 분포 데이터를 산출하였다. 이들 유전자좌의 변별력이나 다형성의 척도인 PI(Probability of Identity) 및 예측 이형성(Expected heterozygosity) 등은 하기 수학식 1 및 수학식 2에 의하여 산출하였다.
[수학식 1]
여기서, qi는 예측 유전자형 빈도임. 예측 유전자형 빈도는 하아디 바인베르크 평형(Hardy-Weinberg Equilibrium) 유전법칙에 따라 각 대립유전자의 빈도로부터 계산된다.
[수학식 2]
여기서, Pi는 각각의 대립유전자 빈도임.
a. D6S1043 유전자좌의 대립유전자 분포
D6S1043 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 13개의 대립유전자가 밝혀졌으며 그 반복단위는 (AGAT)/(ACAT)의 염기서열을 기본단위로 10번 반복에서 22번 반복까지이며 가장 작은 대립유전자 10번은 그 크기가 102bp이며 가장 큰 대립유전자 22번은 149bp 이었다(이하, 대립유전자는 반복단위의 실제 반복수에 따라 명명한다).
b. D9S925 유전자좌의 대립유전자 분포
D9S925 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 총 7개의 대립유전자가 밝혀졌으며 그 반복단위는 (ATAG)/(GTAG)의 염기서열을 기본단위로 13번 반복에서 19번 반복까지이다. 이들 대립유전자는 176bp 내지 200 bp의 크기를 가지고 있었다.
c. D7S821 유전자좌의 대립유전자 분포
D7S821 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 총 10개의 대립유전자가 밝혀졌으며 (TGTC)/(TATC)의 염기서열을 기본단위로 구성되어 있다. 가장 작은 대립유전자는 반복단위가 11회 반복되어 있었고, 이들 대립유전자는 218bp 내지 254bp의 크기를 가지고 있었다.
d. D4S2368 유전자좌의 대립유전자 분포
D4S2368 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 총 7개의 대립유전자가 밝혀졌으며 CTAT의 염기서열을 기본단위로 구성되어 있다. 반복 염기단위가 8회 반복되어있는 대립유전자가 가장 작은 대립유전자였다. 이들 대립유전자는 307bp 내지 331bp의 크기를 가지고 있었다.
e. D5S818 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(338명)에 따라 총 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 133bp로 GATA를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.
f. D13S317 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(338명)에 따라 총 8개의 대립유전자가 발견되었는데 이중가장 작은 크기의 대립유전자는 173bp로 TATC와 AATC를 반복단위로 하여 10번 반복된 형태였다. 염기서열이 밝혀진 대립유전자 모두는 TATC 반복단위 외에 AATC를 반복단위로 가지고 있었는데 모든 샘플에서 1회 혹은 2회의 AATC 반복을 지니고 있었으므로 AATC가 반복단위로 간주되어야 한다.
g. D19S253 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(268명)에 따라 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 209bp로 ATAG를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.
h. D3S2406 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(216명)에 따라 18개의 대립유전자가 발견되었으며 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 298bp(서열 7 및 서열 8의 프라이머로 증폭시) 혹은 260bp(서열 9 및 서열 10의 프라이머로 증폭시)로 TATC, TGTC, CGTC, CATC를 반복단위로 하여 28번 반복된 형태였다.
I. D2S1371 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(130명)에 따라 발견된 8개의 대립유전자가 발견되었으며 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 96bp로 TCTA를 반복단위로 하여 9번 반복된 형태였다.
j. D8S1477 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(100명)에 따라 8개의 대립유전자가 발견되었으며 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 158bp로 CCTT를 반복단위로 하여 13번 반복된 형태였다.
k. D12S391 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(100명)에 따라 9개 이상의 대립유전자가 발견되었으며 이중 217bp의 대립유전자는 AGAT, AGAC, AGAT를 반복단위로 하여 17번 반복된 형태였다.
l. D20S470 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(337명)에 따라 12개 이상의 대립유전자가 밝혀졌으며 이 중 273bp의 대립유전자는 CCTT를 반복단위로 하여 8번 반복된 형태였다.
m. D18S1270, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌의 대립유전자 분포
한국인 표본조사(106명)에 따라 상기 4 유전자좌에서 모두 8개의 대립유전자가 발견되었다. 하기 표 13의 각 대립유전자들의 번호는 실제의 염기서열 결정에의한 반복 숫자가 아니며 발견된 대립유전자들 중 가장 작은 것을 1번으로 하여 임의로 정한 것이니 만큼 외국이나 타 기관과의 자료비교를 위해 대조 DNA인 K562에 대한 유전자형도 명시하였다.
또한, 본 발명에서 가장 대표적인 4가지 콰드루플렉스에 사용된 유전자좌에대한 대립유전자 크기 범위를 요약하면 다음의 표 14 내지 표 17과 같다.
대립유전자의 크기 범위가 제일 작은 것은 D2S1371로 96 내지 124bp의 크기범위를 가지고 있으며 D3S2406은 서열 7 및 서열 8의 프라이머로 증폭시 298 내지 366bp의 크기범위로 가장 큰 대립유전자들을 갖는 것으로 나타나 상기 4종의 콰드루플렉스는 모두 90 내지 370bp 정도의 크기범위에서 분리될 수 있는 것으로 나타났다. 이 범위는 은염색을 이용한 폴리아크릴아미드 변성겔에서 분리가 무리없이 이루어 질 수 있는 범위이다.
비교실시예
한편, 현재 상용화된 유전자좌들 중 일반적으로 사용되는 HumvWA, HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1P0의 4가지 유전자좌들에 대한 대립유전자 분포데이터를 본 발명의 대표적인 4종의 콰드루플렉스 시스템의 변별력과 대조하기 위해 분석하였다.
상기 대립유전차 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.066이며, 예측이형성은 0.805이다.
상기 대립유전자 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.176이며, 예측이형성은 0.650이다.
상기 대립유전자 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.167이며, 예측이형성은 0.672이다.
상기 대립유전자 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.123이며, 예측이형성은 0.723이다.
전술한 수학식 1및 수학식 2를 이용하여 상기 유전자좌들의 변별력을 조사하였다. PI는 임의의 두 사람이 해당 유전자좌에서 같은 유전자형을 지닐 확률을 의미하게 되는데, 본 발명의 유전자좌들의 4가지 조합인 콰드루플렉스 시스템은 모두 비교실시예 보다 변별력이 높은 것으로 나타났다. 이중 대표적인 콰드루플렉스 시스템인 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4의 콰드루플렉스 시스템에 대한 각 유전자좌의 PI 값 및 예측 이형성을 종합하여 변별력에 따른 각 유전자좌의 순위를 정리하면 다음의 표 22 내지 표 25와 같다. 한편, 결합 PI 값(Combined PI)은 각 구성 유전자좌의 PI 값을 곱하여 산출한다.
PI 값은 유전자정보은행 운용시 데이터 베이스 크기에 따른 적용 유전자좌의숫자를 결정짓는 변수인데, 유전자 정보은행 검색을 통하여 색출된 용의자가 범인으로 확실히 지목되자면 데이터 베이스 내에 그 용의자와 우연히 동일한 유전자형을 지니는 사람이 존재하지 않아야 한다. 즉, 데이터 베이스에 입력된 유전자형들은 이론적으로 그들만의 유일성을 지녀야 하는 것이다. 예를 들어, 어느 한 유전자좌의 PI 값이 0.01이라는 의미는 임의의 두 사람을 비교했을 때 유전자형이 같을확률이 0.01 이므로 100쌍의 비교를 하였을 때 한 번 유전자형이 같을 수 있다는 것이며 이러한 1OO이란 수치는 1/PI로 얻을 수 있다. 그런데, 총 n명의 자료를 보유한 데이터 베이스로부터 만들어지는 임의의 비교쌍은 n(n-1)/2 가지가 되므로 이경우의 수에서 임의의 비교쌍이 서로 같은 유전자형이 되지 않기 위해서는 적어도 n(n-1)/2＜100의 관계를 만족하여야 할 것이다. 상기 식에서 n을 구하면 n＜14가 되므로 0.01의 PI 값을 갖는 유전자좌 하나로는 14명 미만의 데이터 베이스를 만드는 것이 타당한 수치이다. 한편, 본 발명의 바람직한 실시예들인 실시예 1 내지 실시예 4의 콰드루플렉스 시스템에 대한 각각의 결합 PI 값(combined PI)은 3.6×10-5에서 4.2×1O-6까지의 수치를 나타내었는데 현재 상용화된 유전자좌들 중 가장 일반적으로 사용되는 HumvWA, HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1P0의 4가지 유전자좌들을 조합했을 때 한국인 집단에서 결합 PI 값(Combined PI)(상기 4 유전자좌 각각의 PI값을 곱한 것으로 표 18, 표 19, 표 20 및 표 21의 대립유전자 분포 데이터를 통하여 산출하였음)이 2.4×10-4에 불과한 것을 감안하면 본 발명의 콰드루플렉스 시스템은 한국인 집단에서 매우 변별력이 뛰어나 유전자 감식에 매우 유용한 것임을 알수 있다.

Claims (18)

  1. 분석대상이 되는 DNA 샘플을 얻는 단계;
    D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270 유전자좌들로 구성된 군으로부터 동시에 증폭될 수 있는 적어도 3개 이상의 STR 유전자좌들을 선택하는 단계;
    상기 DNA 샘플과 선택된 유전자좌들에 해당하는 특정 프라이머들을 사용하여 STR 서열을 PCR 증폭하는 단계; 및
    증폭된 산물을 전기영동을 통해 검출하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고, 이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 콰드루플렉스 STR 시스템이며, 하기와 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법:
    D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
    D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
    D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
    D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270;
    D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;
    D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;
    D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;
    D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;
    D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;
    D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;
    D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;
    D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;
    D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;
    D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;
    D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;
    D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;
    D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;
    D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;
    D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;
    D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;
    D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;
    D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;
    D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;
    D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;
    D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;
    D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;
    D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;
    D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;
    D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;
    D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;
    D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;
    D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;
    D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;
    D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;
    D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;
    D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;
    D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;
    D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;
    D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;
    D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;
    D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;
    D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; 및
    D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 콰드루플렉스 STR 시스템은 하기와 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법:
    D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
    D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
    D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
    D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PCR 증폭과정에서 사용된 특정 프라이머 쌍들 중 하나는 하기의 서열 쌍들로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 서열 쌍임을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법:
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D5S818인 경우에는 서열 1 및 서열 2;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D13S317인 경우에는 서열 3 및 서열 4;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D19S253인 경우에는 서열 5 및 서열 6;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D3S2406인 경우에는 서열 7 및 서열 8, 또는 서열 9 및 서열 10;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D2S1371인 경우에는 서열 11 및서열 12;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D8S1477인 경우에는 서열 13 및서열 14;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D12S391인 경우에는 서열 15 및서열 16;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D20S470인 경우에는 서열 17 및서열 18;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D6S1043인 경우에는 서열 19 및서열 20;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D9S925인 경우에는 서열 21 및 서열 22;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D7S821인 경우에는 서열 23 및 서열 24;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D4S2368인 경우에는 서열 25 및서열 26;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D21S1437인 경우에는 서열 27 및서열 28;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D16S3253인 경우에는 서열 29 및서열 30;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D14S608인 경우에는 서열 31 및서열 32; 및
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D18S1270인 경우에는 서열 33 및서열 34.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 대립유전자들을 평가하는 것은 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 사용하여 상기 대립유전자들을 분리함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 증폭된 대립유전자들을 평가하는 것은 폴리아크릴 아미드겔 전기영동을 사용하여 상기 대립유전자들을 분리함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 것은 은염색을 통하여 유전자형들을 가시화함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  8. 제 4 항에 있어서, DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 것은 은염색을 통하여 유전자형들을 가시화함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 것은 형광물질 표지를 통하여 유전자형들을 가시화함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  10. 제 4 항에 있어서, DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 것은 형광물질 표지를 통하여 유전자형들을 가시화함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법.
  11. D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합 및 선택된 유전자좌 각각에 해당되는 프라이머들을 가지는 용기를 포함하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트의 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합은 콰드루플렉스 STR 시스템이며, 상기 유전자 감식키트는 하기와 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌들의 조합을 함유하는 것을 특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트.
    D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
    D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
    D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
    D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270;
    D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;
    D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;
    D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;
    D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;
    D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;
    D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;
    D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;
    D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;
    D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;
    D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;
    D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;
    D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;
    D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;
    D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;
    D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;
    D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;
    D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;
    D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;
    D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;
    D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;
    D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;
    D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;
    D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;
    D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;
    D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;
    D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;
    D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;
    D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;
    D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;
    D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;
    D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;
    D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;
    D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;
    D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;
    D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;
    D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;
    D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;
    D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;
    D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; 및
    D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트는 하기와 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자좌들의 조합을 포함하는 것을특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트:
    D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
    D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
    D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368; 및
    D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트의 PCR 증폭과정에서 사용된 특정 프라이머 쌍들 중 하나는 하기의 서열 쌍들로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 서열 쌍임을 특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트:
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D5S818인 경우에는 서열 1 및 서열 2;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D13S317인 경우에는 서열 3 및 서열 4;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D19S253인 경우에는 서열 5 및 서열 6;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D3S2406인 경우에는 서열 7 및 서열 8, 또는 서열 9 및 서열 10;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D2S1371인 경우에는 서열 11 및서열 12;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D8S1477인 경우에는 서열 13 및 서열 14;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D12S391인 경우에는 서열 15 및서열 16;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D20S470인 경우에는 서열 17 및서열 18;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D6S1043인 경우에는 서열 19 및서열 20;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D9S925인 경우에는 서열 21 및 서열 22;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D7S821인 경우에는 서열 23 및 서열 24;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D4S2368인 경우에는 서열 25 및서열 26;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D21S1437인 경우에는 서열 27 및서열 28;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D16S3253인 경우에는 서열 29 및서열 30;
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D14S608인 경우에는 서열 31 및서열 32; 및
    유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D18S1270인 경우에는 서열 33 및 서열 34.
  15. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트는 은염색을 통하여 유전자형들을 가시화하는 것을 특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트는 은염색을 통하여 유전자형들을가시화하는 것을 특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트.
  17. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트는 형광물질 표지를 통하여 유전자형들을 가시화하는 것을 특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 유전자 감식키트는 형광물질 표지를 통하여 유전자형들을 가시화하는 것을 특징으로 하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트.
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