CN112266952A - 针对疑难检材的补充str位点复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包含17对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：Amelogenin、D3S1358、D6S477、D1S1656、D19S253、D2S441、D6S1043、D15S659、D3S3045、Penta E、D8S1132、Penta D、D10S1435、D22S1045、D10S1248、D12S391和DYS391。本发明所述试剂盒对于现场案件中的微量、降解、含抑制剂等疑难检材具有快速、高效检测的优点；同时，本试剂盒针对疑难案件检材扩增高效，且优选的基因座信息可对已有案件数据库进行补充，缩短案件排查时间，锁定嫌疑人。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及采用分子标记进行基因检测，具体为针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒及其应用。
背景技术
短串联重复序列基因座(short tandem repeat，STR)首次提出于上个世纪90年代初，其核心序列一般为2-6个碱基构成，常见的是4个碱基。由于不同个体之间、不同基因座之间的核心序列重复数存在差异，而呈现出长度多态性。基因座的片段扩增子相对较小，多个STR基因座也可以复合扩增，较RFLP等技术相比，能够同时获得多个基因座丰富信息，在微量、降解检材方面，具高效、灵敏、准确等明显优势。
复合STR-DNA分型技术因上述明显优势，受到学术界、各大公司的青睐和大量注资研究，试剂盒开发技术和检测平台均有很大发展。关于试剂盒内基因座的选择，各国政府也陆续出台相关规定，以规范法医STR检测市场。1997年，美国公布了CSF1PO、D16S539、FGA、D18S51、TH01、D5S818、TPOX、VWA、D3S1358、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11共13个核心基因座。2017年初，FBI又公布了7个新增的STR核心基因座，即D1S1656、D2S441、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433、D22S1045和Amelogeni。中国于2019年公布的常染色体核心和优选基因座共30个，这30个基因座在完全包括了FBI的20个核心基因座的基础上，增加了三个中国人群遗传多态性高的基因座Penta D、Penta E、D6S1043，和6个优选基因座D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435。
STR分型鉴定在我国已被广泛应用，法医物证STR-DNA分型检测帮助公安机关破获了大量的案件。目前，国内已建立应用DNA数据库，不同地区可以跨时空多应用DNA数据库，进行DNA分型比对，快速、高效缩小排查范围，锁定犯罪嫌疑人。
然而，在实际检测过程中，由于样本的多样性和采样环境、保存条件等多种条件的限制，数量庞大的疑难检材，难以获得完整、准确的DNA分型结果。疑难样本主要特点有高度降解、DNA微量、含有高浓度抑制剂。即使采用磁珠法、硅珠法等提取技术，如腐殖酸等多种抑制剂仍然残留，影响PCR扩增过程。故现场案件检材，尤其是疑难检材，对试剂盒性能要求高于常规试剂盒。现有的常规体试剂盒扩增子片段较大，灵敏度低，抗抑制剂能力弱，无法满足疑难检材检测需求。鉴于上述疑难检材检测难度，目前案件现场检材多使用国外厂商试剂盒，主流是ABI的IdentifilerTM plus，其次是Promega的
21System。该两种试剂盒所含基因座分别为16和21个，主要包括FBI推荐的核心基因座，相对而言，基因座信息较少。目前现场案件检测急需补充试剂盒，该类试剂盒要求既包含中国推荐的优选基因座和中国人群多态性高的基因座又能够适应疑难检材的检测要求。该类补充试剂盒可实现对疑难检材进行检测，对原有DNA数据库进行基因座信息补充，帮助缩小嫌疑人范围，也能结合现有IdentifilerTM plus或
21System在人类个体识别和亲权鉴定中发挥重要作用。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，采用Mini的概念设计引物，开发一种针对来源于案件现场的微量、降解、含有高抑制剂等疑难检材的补充STR引物组、及其试剂盒和应用，且同时具有高效、快速、高灵敏度和强抗抑制能力的优点。本发明试剂盒包含了现在市场上案件检材常用试剂盒Identifiler plus缺少的新增核心基因座和现有国家推荐的全部优选基因座，一个Amelogenin以及一个辅助性别判断的Y染色体基因座DYS391。与Identifiler plus或
21System试剂盒信息相互补充，可得到中国推荐的20个核心和10个优选基因座的全部信息。该发明能够对现有DNA数据库进行基因座信息补充，极大地提高了疑难检材利用率。鉴于此，本发明提供了针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒及其应用。
技术方案：针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含17对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：Amelogenin、D3S1358、D6S477、D1S1656、D19S253、D2S441、D6S1043、D15S659、D3S3045、Penta E、D8S1132、Penta D、D10S1435、D22S1045、D10S1248、D12S391和DYS391。
优选的，所述17对STR基因座的特异性扩增引物序列如下：D3S1358、SEQ ID NO.1～2；D6S477、SEQ ID NO.3～4；D1S1656、SEQ ID NO.5～6；D19S253、SEQ ID NO.7～8；D2S441、SEQ ID NO.9～10；D6S1043、SEQ ID NO.11～12；D15S659、SEQ ID NO.13～14；D3S3045、SEQ ID NO.15～16；Amelogenin、SEQ ID NO.17～18；Penta E、SEQ ID NO.19～20；D8S1132、SEQ ID NO.21～22；DYS391、SEQ ID NO.23～24；Penta D、SEQ ID NO.25～26；D10S1435、SEQ ID NO.27～28；D22S1045、SEQ ID NO.29～30；D10S1248、SEQ ID NO.31～32；D12S391、SEQ ID NO.33～34。
优选的，所述17对STR基因座的特异性扩增引物的浓度如下：D3S1358引物对0.30μM；D6S477引物对0.27μM；D1S1656引物对0.30μM；D19S253、0.30μM；D2S441、0.32μM；D6S1043、0.44μM；D15S659、0.32μM；D3S3045、0.33μM；Amelogenin、0.25μM；Penta E、0.40μM；D8S1132、0.37μM；DYS391、0.32μM；Penta D、0.32μM；D10S1435、0.37μM；D22S1045、0.26μM；D10S1248、0.37μM；D12S391、0.32μM。
所述试剂盒中的引物及其序列和浓度如下表所示：
优选的，所述17对STR基因座的特异性扩增引物的PCR扩增产物长度均小于320bp。
优选的，所述17对STR基因座的特异性扩增引物分为5组：第1组，D3S1358、D6S477、D1S1656和D19S253；第2组，D2S441、D6S1043、D15S659和D3S3045；第3组，Amelogenin、PentaE和D8S1132；第4组，DYS391、Penta D和D10S1435；第5组，D22S1045、D10S1248和D12S391；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
优选的，所述荧光染料为6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。其中，6-FAM为蓝色荧光染料，HEX为绿色荧光染料，SUM为黄色荧光染料，LYN为红色荧光染料，PUR为紫色荧光染料。
优选的，所述试剂盒包括：基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Master Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；其中，PCR缓冲液Master Mix成分为：热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL，pH8.25～8.4的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA2mg/ml～5mg/ml；PCR增强剂为明胶、聚乙二醇、二甲亚砜、Triton X-100和二硫苏糖醇中的至少一种。
优选的，所述试剂盒包括分子内标，且分子内标由橙色荧光SIZ标记。
以上任一所述试剂盒在检测血迹、精液样本，微量、高度降解、高抑制剂含量的样本，白骨化尸骨、接触性脱落细胞、毛发、衣服上的血斑样本中的应用。
优选的，所述试剂盒在各样本中的检测最低模板含量为30pg。
有益效果：1、本发明针对微量、降解、含高抑制剂等案件现场疑难检材的检测，具有高效、快速、高灵敏度和抗抑制能力强的优点；具体为：本发明对于模板含量30pg的样本，29个循环扩增后能够获得完整分型，灵敏度远高于行标GA/T 815-2009所制定的125pg的灵敏度要求，也高于ABI公司公布的Identifiler plus灵敏度62.5pg等。
2、本发明建立的17个基因座的Mini-STR扩增体系，扩增片段短，适用于微量、高度降解或含高抑制的案件现场疑难检材，在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、接触性脱落细胞、毛发、衣服上的血斑样本等特殊生物检材的STR分型。
3、本发明建立的六色STR荧光检测系统，其17个基因座包含我国公安部建议的10个优选基因座，和针对中国人群遗传多态性高的三个基因座Penta D、Penta E、D6S1043，作为补充试剂盒较ABI只含有9个位点的Mini试剂盒补充基因座信息的能力更高。不仅能够高效检测案件现场疑难检材，同时也能够更好的为前期使用Identifiler plus或者Promegapowerplex-21检测的陈年检材做位点信息补充，提高数据库利用率，克服现有常染色体试剂盒虽然位点多，但检测疑难案件检材漏检的困难。
4、本发明所述的体系中引入DYS391基因座，能够对性别基因Amelogenin起到辅助判定的作用，在检测多人混合样本时，更具有识别能力。
5、本发明所述试剂盒能够快速检出，整个PCR过程不超过63分钟。同时优化的引物和更合理的位点排布，使17个基因座排布控制在320bp以内。较小的扩增子，在检测降解检材时更有优势。
附图说明
图1是本发明所述试剂盒扩增0.5ng 9948标准品结果图；
图2是本发明所述试剂盒扩增30pg 9948结果图；
图3是本发明所述试剂盒扩增某血迹检材结果图；
图4是本发明所述试剂盒扩增某脱落细胞检材结果图；
图5是本发明所述试剂盒扩增某陈旧检材结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明所述的试剂盒由如下组成：引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Master Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂。
所述PCR缓冲液Master Mix成分为：热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL，pH8.25～8.4的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml。
PCR增强剂可选的种类为：明胶、聚乙二醇、二甲亚砜、Triton X-100或二硫苏糖醇，选择其中的一种或两种直接加入到PCR缓冲液Master Mix中。
1、操作步骤如下：
1.1扩增体系
| 组份 | 体积 |
| Master Mix | 10.0μL |
| 提取样本 | 6μL |
| 权力要求1所述的引物 | 5.0μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至25μL |
1.2扩增程序为：
1.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
将扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL扩增产物或Allelic Ladder与0.5μL AGCUMarker SIZ-500和12μL去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，通过毛细管电泳检测；用遗传分析仪检测分析。
2、结论
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。对标准品9948(Promega公司美国)梯度稀释至30pg后进行扩增，分型结果如图2示。从图中可以看出，对标准品9948的检测结果与其基因型一致，3500电泳可检出全部基因座分型，该发明涉及的试剂盒最低可以检出30pg微量DNA模版。
实施例2
实际案件中的检材血迹、唾液斑、脱落细胞、陈旧降解检材等样本共469份，分别使用本发明试剂盒和本公司前期开发同类试剂盒EX25检测。
本发明所述的试剂盒由如下组成：引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Master Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂。
所述PCR缓冲液Master Mix成分为：热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL，pH8.25～8.4的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml。
PCR增强剂可选的种类为：明胶、聚乙二醇、二甲亚砜、Triton X-100或二硫苏糖醇，选择其中的一种或两种直接加入到PCR缓冲液Master Mix中。
1、样本准备：采用磁珠法提取，具体方法参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》。
2、操作步骤如下：
2.1扩增体系
| 组份 | 体积 |
| Master Mix | 10.0μL |
| 提取样本 | 6μL |
| 权力要求1所述的引物 | 5.0μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至25μL |
2.2扩增程序为：
本发明试剂盒
EX25试剂盒
2.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
将扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL扩增产物或Allelic Ladder与0.5μL AGCUMarker SIZ-500和12μL去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，通过毛细管电泳检测；用遗传分析仪检测分析。
3、结论
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析遗传分析仪检测收集的数据，将样本数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较。共检测血迹、唾液斑、脱落细胞、陈旧降解检材等样本共469份。本发明所述试剂盒检出率为41.58％(195/469)，EX25试剂盒检出率为35.39％(166/469)。在脱落细胞和陈旧检材检测方面，该发明所述试剂盒检出率明显高于EX25试剂盒检出率。血迹作为案件常见检材，一般携带有效DNA较高，大部分情况下可获得检材完整分型，以某血迹检材扩增结果作为示例(图3)。脱落细胞检材一般含有DNA量较低，对试剂盒灵敏度要求更高，以某脱落细胞检材扩增结果作为示例(图4)。陈旧检材一般会存在DNA降解和抑制剂存在的情况，需要试剂盒基因座扩增子较小、抗抑制剂能力更强，才可能获得较好扩增结果，以某陈旧检材扩增结果作为示例(图5)。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒及其应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catctcttat actcatgaaa tc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacagagcaa gaccctgtct ca 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaaatatt tctgtttctc ct 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaatcacta gggaaccaa 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaatgtatt tatttctcc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cataaacatg agtcaattcc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taaattggag ctaagtggct gt 22
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagccacttc ccataataa 19
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<212> DNA
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<212> DNA
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ggaatgctct cttcttataa a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtggttagt ggagaatatt 20
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctctgggc agagtagaac aa 22
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agacagcaca gatccaatgt 20
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<212> DNA
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<400> 17
gctccctgta aaagctacc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catcagagct taaactggga a 21
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<212> DNA
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cttagtatca tgattgatac a 21
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<212> DNA
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gtaggcacct gtaatcccag ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtattaaat cacatccttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttacatctct ctctccctct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtatctattc attcaatcat acac 24
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggaataaaat ctccctggt 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtgagccat gatcacacca 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgctgcctaa cctatggtca t 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtggagtg ctagcacgtt 20
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agattgcacc actgcactcc ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtattatagc tgctatgggg 20
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgcgaatgta tgattggcaa 20
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagcattagc cccaggacca 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atcccctgga tattataatt a 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caggcttctc cagagagaaa g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtcctctaat aaatcccctc t 21
Claims (10)
1.针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含17对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：Amelogenin、D3S1358、D6S477、D1S1656、D19S253、D2S441、D6S1043、D15S659、D3S3045、Penta E、D8S1132、Penta D、D10S1435、D22S1045、D10S1248、D12S391和DYS391。
2.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述17对STR基因座的特异性扩增引物序列如下：D3S1358、SEQ ID NO.1～2；D6S477、SEQID NO.3～4；D1S1656、SEQ ID NO.5～6；D19S253、SEQ ID NO.7～8；D2S441、SEQ ID NO.9～10；D6S1043、SEQ ID NO.11～12；D15S659、SEQ ID NO.13～14；D3S3045、SEQ ID NO.15～16；Amelogenin、SEQ ID NO.17～18；Penta E、SEQ ID NO.19～20；D8S1132、SEQ ID NO.21～22；DYS391、SEQ ID NO.23～24；Penta D、SEQ ID NO.25～26；D10S1435、SEQ ID NO.27～28；D22S1045、SEQ ID NO.29～30；D10S1248、SEQ ID NO.31～32；D12S391、SEQ ID NO.33～34。
3.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述17对STR基因座的特异性扩增引物的浓度如下：D3S1358引物对0.30μM；D6S477引物对0.27μM；D1S1656引物对0.30μM；D19S253、0.30μM；D2S441、0.32μM；D6S1043、0.44μM；D15S659、0.32μM；D3S3045、0.33μM；Amelogenin、0.25μM；Penta E、0.40μM；D8S1132、0.37μM；DYS391、0.32μM；Penta D、0.32μM；D10S1435、0.37μM；D22S1045、0.26μM；D10S1248、0.37μM；D12S391、0.32μM。
4.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述17对STR基因座的特异性扩增引物的PCR扩增产物长度均小于320bp。
5.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述17对STR基因座的特异性扩增引物分为5组：第1组，D3S1358、D6S477、D1S1656和D19S253；第2组，D2S441、D6S1043、D15S659和D3S3045；第3组，Amelogenin、Penta E和D8S1132；第4组，DYS391、Penta D和D10S1435；第5组，D22S1045、D10S1248和D12S391；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
6.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
7.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Master Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；其中，PCR缓冲液Master Mix成分为：热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL，pH8.25～8.4的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml；PCR增强剂为明胶、聚乙二醇、二甲亚砜、Triton X-100和二硫苏糖醇中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的针对疑难检材的补充STR位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分子内标，且分子内标由橙色荧光SIZ标记。
9.权利要求1-8任一所述试剂盒在检测血迹、精液样本，微量、高度降解、高抑制剂含量的样本或白骨化尸骨、接触性脱落细胞、毛发、衣服上的血斑样本中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒在各样本中的检测最低模板含量为30pg。
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