CN106521013A - 一种针对微量、降解检材的str试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对微量、降解检材的STR试剂盒及其应用，所述试剂盒包括17对STR基因座的特异性扩增引物，共分为5组，涉及6中颜色的荧光标记。本发明针对微量、降解等疑难检材的检测，具有快速、灵敏度高和抗抑制能力强的优点；本发明建立的17个基因座的迷你型扩增体系，扩增片段短，适用于微量、高度降解或抑制剂含量高的疑难样本，在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、接触性脱落细胞、土壤中的血液样本等特殊生物检材的STR分型；本发明所述的体系中引入DYS391基因座，能够对性别基因Amelogenin起到辅助判定的作用；本发明所述试剂盒能够快速检出，整个PCR过程不超过50分钟。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及分子遗传学，具体涉及一种针对微量、降解检材的STR试剂盒及其应用。
背景技术
短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI选择了13个STR基因座用于建立DNA数据库—CODIS(Combined DNA Index System):CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA。这些STR基因座联用具有较高的个体识别率，通常被称为13个核心基因座。
正因为STR所具备的优点和应用前景，法医学界以及一些大的公司均投入大量的资金对其进行了开发性的研究。90年代中后期以美国AB公司为代表的研发商建立起荧光复合扩增体系。经历多年的发展已经升级到六色荧光系统，法医常用试剂盒从最初的ABI(Applied Biosystems，USA)Identifiler，Promega(USA)的PowerPlex16到现在ABI的包含24个STR基因座的AmpFeSTR global filer和Promega包含27个STR的PowerPlex fusion。国内厂家包括中德美联的17+1，EX20，基点认知的20A、25A，海尔施的STRtyper21G、STRtyper26G和物证鉴定中心的mini和Typer15等。
自90年代中期公安部提出“统一规划、统一标准、分步实施、滚动发展”的DNA数据库建设原则开始，我国的DNA数据库已有15年的历史。10余年来，DNA数据库集聚了3000万以上STR数据，在超过100万起的案件中发挥了作用，已经初步实现了跨时空多化应用的建设目标，在精准打击犯罪中发挥了具大的作用。
然而，在实际检测过程中，由于样本的多样性和其他各种条件的限制，出现了数量较多的疑难检材，即无法获得分型结果的样本。这些疑难样本主要为以下几类：1)高度降解检材。法医物证是人体各种体液与组织，具有容易变性、变质、降解和腐败的特点。不同检材所受环境因素的影响千差万别，尤其是来源自犯罪现场的检材，自身的变性、降解和腐败等改变的程度是不能人为控制的，也是无法预知。STR基因座片段小，相对于其他方法来说，对降解检材的适应性更好，但高度降解检材，用常规STR试剂盒无法取得完整分型结果。2)微量检材。现场检材多为微量，珍贵，样本中DNA含量非常少，通常只有几个细胞的DNA含量，无法达到常规STR试剂盒的最低检出限，导致无扩增结果或只有部分扩增结果。3)含高浓度抑制剂的检材。现场检材来源广泛，可能存在的抑制成分多样，对试剂盒的抗抑制能力有较高要求。一些样本的来源特殊如土壤中的血迹等，即使经过DNA提取的步骤，仍有大量的PCR抑制剂如血红素、腐殖酸等的存在，破坏PCR的扩增过程，导致无法获得完整的分型结果。Chelex等粗提DNA的提取方法也会残留较多的抑制剂成分。
我国在DNA数据库建设初期，使用STR试剂盒是被国外产品，主要是ABI公司垄断的，随着中德美联17+1、EX20；基点认知的20A；二所的typer15的研发生产，才逐步打破国外垄断，目前在DNA数据库建设中，国产试剂盒占有率超过50％。但由于案件现场样本的复杂性和对STR试剂盒要求高，暂时使用均为国外厂商试剂盒，主流是ABI 2010年根据IdentifilerTM优化推出的IdentifilerTM plus。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，开发一种针对来源于犯罪现场的微量、降解等疑难检材的STR试剂盒，且同时具有快速、高灵敏度和强抗抑制能力的优点，本发明提供了一种针对微量、降解检材的STR试剂盒及其应用。
技术方案：一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，所述试剂盒包括17对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D18S51、D2S1338、vWA、D21S11、DYS391、D8S1179、D5S818、CSF1PO、D19S433、FGA及Amelogenin。
优选的，所述17对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：D3S1358、SEQ IDNO.1～2；D13S317、SEQ ID NO.3～4；D7S820、SEQ ID NO.5～6；D17S539、SEQ ID NO.7～8；TPOX、SEQ ID NO.9～10；TH01、SEQ ID NO.11～12；D18S51、SEQ ID NO.13～14；D2S1338、SEQ ID NO.15～17；vWA、SEQ ID NO.17～18；D21S11、SEQ ID NO.19～20；DYS391、SEQ IDNO.21～22；D8S1179、SEQ ID NO.23～24；D5S818、SEQ ID NO.25～26；CSF1PO、SEQ IDNO.27～28；D19S433、SEQ ID NO.29～30；FGA、SEQ ID NO.31～32；Amelogenin、SEQ IDNO.33～34。
优选的，所述引物的浓度如下：D3S1358、0.6μM；D13S317、0.45μM；D7S820、0.5μM；D16S539、0.6μM；TPOX、0.8μM；TH01、0.55μM；D18S51、0.9μM；D2S1338、1.0μM；vWA、0.6μM；D21S11、0.86μM；DYS391、0.7μM；D8S1179、0.95μM；D5S818、0.75μM；CSF1PO、0.65μM；D19S433、0.8μM；FGA、1μM；Amelogenin、0.65μM。
所述试剂盒中的引物及其序列和在扩增体系中的浓度如下表所示：
优选的，所述引物的PCR产物均小于300bp。
优选的，所述引物分为五组：第一组，D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539；第二组，Amelogenin、TPOX、TH01、D18S51；第三组，D2S1338、vWA、D21S11；第四组，DYS391、D8S1179、D5S818、CSF1PO；第五组，D19S433、FGA；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
优选的，所述荧光染料为6-FAM、HEX、VIG550、VIG590、VIG620中任意一种，且每组采用的荧光标记不同；其中6-FAM为蓝色荧光，HEX为绿色荧光，VIG550为黄色荧光，VIG590为红色荧光，VIG620为紫色荧光。
优选的，所述试剂盒中含有分子内标，且分子内标由橙色荧光SIZ标记。
优选的，所述试剂盒的组分如下：Reaction Mix，2mL；基因组DNA，10ng；引物混合物，1mL；5U/μL的热启动Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的Reaction Mix成分为：MgCl2 7.5mM，pH8.3Tris-HCl 125mM,KCl 125mM,dNTPs 7.5mM,BSA 2mg/ml，PCR增强剂。
优选的，所述PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40中的任意一种。
所述针对微量、降解检材的STR试剂盒在检测高浓度血迹、精液样本，微量、高度降解、高抑制剂含量的样本，以及白骨化尸骨、接触性脱落细胞、土壤中的血液样本中的应用。
有益效果：(1)本发明针对微量、降解等疑难检材的检测，具有快速、灵敏度高和抗抑制能力强的优点；具体为：本发明对于模板含量30pg的样本，29个循环扩增后能够获得完整分型，灵敏度远高于行标GA/T 815-2009所制定的125pg的灵敏度要求，也高于目前已经公开的法医STR检测试剂盒，如专利CN103451311A，CN 105018597A等；(2)本发明建立的17个基因座的迷你型扩增体系，扩增片段短，适用于微量、高度降解或抑制剂含量高的疑难样本，在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、接触性脱落细胞、土壤中的血液样本等特殊生物检材的STR分型；(3)本发明建立的六色STR荧光检测系统，17个位点扩增子控制在300bp以内，提高了检材中基因座的检出数目；(4)本发明所述的体系中引入DYS391基因座，能够对性别基因Amelogenin起到辅助判定的作用；(5)本发明所述试剂盒能够快速检出，整个PCR过程不超过50分钟。
附图说明
图1是本发明所述试剂盒等位基因分型标准物结果图；
图2是高浓度血迹提取样本ID plus扩增图；
图3是高浓度血迹提取样本六色mini扩增图；
图4是高浓度精液样本(chelex)本发明所述试剂盒扩增图；
图5是高浓度精液样本(chelex)ID plus扩增图；
图6是高浓度精液样本(稀释后)ID plus扩增图；
图7是陈旧骨骼样本ID Plus扩增图；
图8是陈旧骨骼样本本发明所述试剂盒扩增图；
图9是某一入室盗窃伤人案的案发现场某擦拭样本本发明所述试剂盒扩增图；
图10是女性受害者血样本发明所述试剂盒分型图；
图11是某案发现场含微量男性DNA擦拭样本本发明所述试剂盒扩增图；
图12是含微量男性DNA擦拭物Y-STR试剂盒扩增图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
实际案件中的烟蒂、血迹、精液等样本分别使用本发明试剂盒和ID plus(美国公司ABI)试剂盒检测。本发明所述的试剂盒由如下组成：Master Mix，2mL；基因组DNA，10ng；引物混合物，1mL；sdH2O，2mL；其中，所述的Reaction Mix成分为：MgCl2 7.5mM,pH8.3Tris-HCl 125mM,KCl 125mM,dNTPs 7.5mM,BSA 2mg/ml，5U/μL的热启动Taq酶，PCR增强剂，增强剂可以为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、NP40等。IDplus使用ABI成品试剂盒标准体系及程序。
1、各种检材样品由苏州市公安局提供。
2、各种检材的基因组DNA提取
各种检材基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行，采用磁珠和Chelex-100提取。
3、操作步骤如下：
3.1扩增体系为：
| 组分 | 体积 |
| Master Mix | 6.0μL |
| 提取样本 | 1-6μL |
| 引物 | 3.0μL |
| sdH2O | 补足至15μL |
3.2扩增程序为：
本发明试剂盒
ID Plus
3.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic Ladder混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
3.4、分型分析
用片段分析软件GeneMapper IDX分析遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和分型标准物(图1)比较。
4、结论
分别应用使用本发明所述试剂盒和ID Plus对实际案件中的烟蒂、血迹、精液样本共计213份。两个试剂盒的检出率分别是93.9％(200/213)和92.95％。大部分样本扩增较好，两个试剂盒均能正常分型，相比较而言，IDplus的高浓度样本容易出现加A不全和前高后低。如图2为现场案件中容易出现的高浓度血迹样本的ID plus扩增结果，D8S1179、D13S317、TH01、vWA、TPOX这五个基因座均出现加A不全的现象，小片段扩增子与大片段扩增子存在明显的不均衡现象如D3S1358与D2S1338。而同一样本本发明所述试剂盒表现相对较为优异，不存在此类情况，无明显加A问题及不均衡。高浓度的精液样本(Chelex-100提取)，由于精液样本DNA模板高，同时具有特殊的抑制成分，IDplus无扩增峰，本发明所述试剂盒具有很好的抗抑制效果和特殊添加，扩增正常分型，见图4和图5。对高浓度Chelex提取的精液样本做稀释，ID plus重新扩增正常分型见图6。
实施例2
实际案件中的各类痕迹、擦拭、陈旧降解检材分别使用本发明试剂盒和ID plus(美国公司ABI)试剂盒检测。
本发明所述的试剂盒由如下组成：Master Mix，2mL；基因组DNA，10ng；引物混合物，1mL；sdH2O，2mL；其中，所述的Reaction Mix成分为：MgCl2 7.5mM,pH8.3Tris-HCl125mM,KCl 125mM,dNTPs 7.5mM,BSA 2mg/ml，5U/μL的热启动Taq酶，PCR增强剂，增强剂可以为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、NP40等。
1、各类检材样品由苏州市公安局提供。
2、各类检材的基因组DNA提取
各种检材基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行，此类样本均由磁珠法提取。
3、操作步骤如下：
3.1扩增体系为：
| 组分 | 体积 |
| Master Mix | 10.0μL |
| 提取样本 | 6μL |
| 引物 | 5.0μL |
| sdH2O | 补足至25.0μL |
3.2扩增程序为：
本发明试剂盒
ID Plus
3.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic Ladder混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
3.4、分型分析
用片段分析软件GeneMapper IDX分析遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和分型标准物(图1)比较。
4、结论
分别应用使用本发明所述试剂盒和ID Plus对实际案件中的各类痕迹、擦拭、陈旧降解检材样本共计572份。两个试剂盒的检出率分别是26.8％(154/572)和26.3％(152/572)。在微量的痕迹检材上，两个试剂盒均有较好表现，本发明所述试剂盒由于扩增片段更短，在降解的检材中表现更好，如图7、图8所示的陈旧骨骼样本。如图7所示，IDplus扩增结果显示大片段的D7S820、CSF1PO、D2S1338、D13S317、D18S51、FGA均无扩增峰，而本发明所述试剂盒全部正常分型，如图8所示。
实施例3
实际案件中的混合样本检材分别使用本发明试剂盒试剂盒检测。
本发明所述的试剂盒由如下组成：Master Mix，2mL；基因组DNA，10ng；引物混合物，1mL；sdH2O，2mL；其中，所述的Reaction Mix成分为：MgCl2 7.5mM,pH8.3Tris-HCl125mM,KCl 125mM,dNTPs 7.5mM,BSA2mg/ml，5U/μL的热启动Taq酶，PCR增强剂，增强剂可以为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、NP40等。
1、各类检材样品由苏州市公安局提供。
2、各类检材的基因组DNA提取
各种检材基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行，此类样本均由磁珠法提取。
3、操作步骤如下：
3.1扩增体系为：
| 组分 | 体积 |
| Master Mix | 10.0μL |
| 提取样本 | 6μL |
| 引物 | 5.0μL |
| sdH2O | 补足至25.0μL |
3.2扩增程序为：
本发明试剂盒
ID Plus
3.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic Ladder混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
3.4、分型分析
用片段分析软件GeneMapper IDX分析遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和分型标准物(图1)比较。
4、结论
1、图9是某一入室盗窃伤人案的案发现场某擦拭样本，从性别和DYS391可以判断是男女混合样本。此案的受害者是独居女性，对受害者的血样做扩增，得到基因座分型如图10。根据受害者分型及各个等位基因座的均衡性，剥离出来男性的可能分型如下表，并输入数据库中比对，比中前科人员吴某。
2、性别基因Amelogenin广泛用于各类法医STR试剂盒作为性别的判断，但多篇文献报道Y缺失，及X缺失。本发明体系中包含了Y染色体基因座DYS391，可对性别基因Amelogenin起到辅助判定的作用，并在混合样本中起到指示模版中男性DNA含量的作用。在图11中可见，Ameloginen基因座只有X。根据这结果会判断混合样本中均为女性。而且DYS391有峰，为10号等位基因座。造成这种情况是由于混合样本中男性成分非常微量，Ameloginen X等位基因的优势扩增造成Y等位基因无法识别，单纯的只是有DYS391基因座而试剂盒灵敏度不够，是无法识别这种微量的混合样本。加做Y试剂盒，得到完整的Y基因座分型图谱，见图12。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种针对微量、降解检材的STR试剂盒及其应用
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atagagggat aggtaggcag gca 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttttgtattt catgtgtaca tt 22
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtatcccat tgcgtgaata tgcc 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttttcctctt tggtatcctt a 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
taagcaaaaa agtaattgtc tc 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acccaaccca catggtgcca 20
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgccaaggac tagcaggttg ct 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaagctata attgtaccac tgca 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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tacatgaata agttctttag cagt 24
<210> 31
<211> 26
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<213> 人工序列
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cacagattaa actgtaacca aaataa 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctgagtgatt tgtctgtaat tgccagc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtgttgatt ctttatccca g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gacacaggct tgaggccaac c 21
Claims (10)
1.一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括17对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D18S51、D2S1338、vWA、D21S11、DYS391、D8S1179、D5S818、CSF1PO、D19S433、FGA及Amelogenin。
2.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述17对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：D3S1358、SEQ ID NO.1～2；D13S317、SEQ IDNO.3～4；D7S820、SEQ ID NO.5～6；D17S539、SEQ ID NO.7～8；TPOX、SEQ ID NO.9～10；TH01、SEQ ID NO.11～12；D18S51、SEQ ID NO.13～14；D2S1338、SEQ ID NO.15～17；vWA、SEQ ID NO.17～18；D21S11、SEQ ID NO.19～20；DYS391、SEQ ID NO.21～22；D8S1179、SEQID NO.23～24；D5S818、SEQ ID NO.25～26；CSF1PO、SEQ ID NO.27～28；D19S433、SEQ IDNO.29～30；FGA、SEQ ID NO.31～32；Amelogenin、SEQ ID NO.33～34。
3.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度如下：D3S1358、0.6μM；D13S317、0.45μM；D7S820、0.5μM；D16S539、0.6μM；TPOX、0.8μM；TH01、0.55μM；D18S51、0.9μM；D2S1338、1.0μM；vWA、0.6μM；D21S11、0.86μM；DYS391、0.7μM；D8S1179、0.95μM；D5S818、0.75μM；CSF1PO、0.65μM；D19S433、0.8μM；FGA、1μM；Amelogenin、0.65μM。
4.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述引物的PCR产物均小于300bp。
5.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述引物分为五组：第一组，D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539；第二组，Amelogenin、TPOX、TH01、D18S51；第三组，D2S1338、vWA、D21S11；第四组，DYS391、D8S1179、D5S818、CSF1PO；第五组，D19S433、FGA；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
6.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为6-FAM、HEX、VIG550、VIG590、VIG620中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
7.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有分子内标，且分子内标由SIZ标记。
8.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组分如下：Reaction Mix，2mL；基因组DNA，10ng；引物混合物，1mL；5U/μL的热启动Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的Reaction Mix成分为：MgCl2 7.5mM，pH8.3Tris-HCl125mM,KCl 125mM,dNTPs 7.5mM,BSA 2mg/ml，PCR增强剂。
9.根据权利要求1所述的一种针对微量、降解检材的STR试剂盒，其特征在于，所述PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40中的任意一种。
10.权利要求1～9任一所述针对微量、降解检材的STR试剂盒在检测高浓度血迹、精液样本，微量、高度降解、高抑制剂含量的样本，以及白骨化尸骨、接触性脱落细胞、土壤中的血液样本中的应用。
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