CN110106234A - Pcr反应增强剂组合物、微滴式逆转录数字pcr反应液及应用 - Google Patents
Pcr反应增强剂组合物、微滴式逆转录数字pcr反应液及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任意一种。本发明还提供一种微滴式逆转录数字PCR反应液，其特征在于，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任一种；优选地，所述PCR反应液包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白、0.1～2mol/L海藻糖、0.02～1％w/v诺纳德P‑40。本发明还涉及包含所述PCR反应液的试剂盒以及利用所述PCR反应液进行微滴式逆转录数字PCR的方法。利用本发明提供的PCR反应液能提高阳性微滴逆转录PCR扩增效率，减少假阴性的产生，有利于核酸靶分子的精准定量分析。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种微滴式逆转录数字PCR反应液及其应用。
背景技术
微滴式逆转录数字PCR(reverse transcription droplet digital polymerasechain reaction，RT-ddPCR)是一种对目标核糖核酸(RNA)进行绝对定量的方法。相较于定量RT-PCR(quantitative RT-PCR，qRT-PCR)，其在精密度、准确度和灵敏度方面具有无与伦比的优势；同时，RT-ddPCR消除了对定量标准曲线的依赖，并提高了对扩增抑制物的耐受能力。
RT-ddPCR的工作原理是在RT-PCR扩增前对反应液进行微滴化处理，即将含有模板RNA的反应液分散成数万个纳升级的微滴，每个微滴不含或含有一至数个模板RNA，且每个微滴都作为一个独立的RT-PCR反应单元。经RT-PCR扩增后，含有模板RNA的微滴产生荧光信号，不含模板RNA的微滴不产生荧光信号。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出模板RNA的起始浓度或拷贝数。
纳升级微滴是RT-ddPCR的基本反应单元。微滴体积的减小增大了其比表面积，有助于RT-PCR扩增过程中热量的快速传导。然而，纳升级微滴的界面效应显著增强，导致疏水的逆转录酶和DNA聚合酶倾向于吸附在油水界面，并可能在油水界面发生蛋白质变性(Williams R.et al.Amplification of complex gene libraries by emulsionPCR.Nature methods，2006，3(7):545-550)。逆转录酶和DNA聚合酶的界面吸附作用降低了RT-ddPCR的扩增效率，导致含有模板RNA的微滴不产生荧光信号，使核酸靶分子的绝对定量出现错误。因此需要一种优化的PCR反应液，消除逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面的吸附作用。
发明内容
为解决上述逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面的吸附问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。
优选地，本发明的PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。
较优选地，本发明的PCR反应增强剂组合物，其由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。
本发明提供一种微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。
优选地，本发明的微滴式数字PCR反应液中的PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。
优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白。
较优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.05～0.5mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白。
进一步优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.2～0.5mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白。
优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.1～2mol/L海藻糖。
较优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.1～1mol/L海藻糖。
进一步优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.3～0.7mol/L海藻糖。
优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.02～1％w/v诺纳德P-40。
较优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.02～0.5％w/v诺纳德P-40。
进一步优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.02～0.1％w/v诺纳德P-40。
优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其还包含Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、和Taq DNA聚合酶；
优选地，所述PCR反应液还包含10～50mM Tris-HCl、50～100mM KCl、1.5～4mMMgSO4、0.2～0.4mM dNTP mix、0.5～2U/μL核糖核酸酶抑制剂、10～20U/μL逆转录酶和0.05～0.1U/μL Taq DNA聚合酶。
本发明还提供一种微滴式逆转录数字PCR试剂盒，其中，其包含上述任一种微滴式逆转录数字PCR反应液。
本发明还提供一种使用前述任一种微滴式逆转录数字PCR反应液的微滴式逆转录数字PCR方法。
在本发明中，对于T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40的来源没有具体限定，可以使用本领域技术人员熟知的可以使用的任何相关物质。
发明的效果
本发明优化了微滴式逆转录数字PCR实验的反应液，特别是在反应液中加入PCR反应增强剂组合物，其中，所述T4噬菌体基因32编码蛋白和诺纳德P-40可以竞争性的聚集在油水界面，从而减少逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面的吸附作用；T4噬菌体基因32编码蛋白能稳定互补DNA(cDNA)结构，增加反转录过程的产量和延伸能力；诺纳德P-40能减少非特异性扩增；海藻糖能增加逆转录酶和DNA聚合酶的稳定性，从而提高微滴式逆转录数字PCR扩增效率。从而解决了逆转录数字PCR微滴中逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面吸附的问题，从而提高了微滴式逆转录数字PCR的扩增效率，促进了核酸靶分子的精准定量分析。
附图说明
图1(a)～(c)为本发明实施例13中的PCR反应液用于检测十倍梯度稀释的A型禽流感病毒血球凝集素基因的微滴式逆转录数字PCR反应后的荧光图像(分别地，实际RNA浓度为5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL)。
图2(a)～(c)为对比例6中的PCR反应液用于检测十倍梯度稀释的A型禽流感病毒血球凝集素基因的微滴式逆转录数字PCR反应后的荧光图像(分别地，实际RNA浓度为5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL)。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
使用标准命名法来描述化合物。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明中的术语
本发明中，微滴式逆转录数字PCR反应液是指包含KCl、Tris-HCl、dNTP、MgSO4、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、热启动DNA聚合酶和PCR反应增强剂组合物等组分的PCR反应体系。
本发明中，逆转录数字PCR微滴是指将逆转录数字PCR反应液分散后的独立反应单元，其体积可微量化至数皮升，其数量可高达数百万个。
本发明中，dNTP是脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。dNTP mix是由dATP、dGTP、dTTP、dCTP以等摩尔数混合制得的混合物。
本发明中，荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端标记荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，其3’末端标记淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，热启动DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将荧光探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的完全同步。
本发明中，Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶。
本发明中，逆转录酶(reverse transcriptase)是指一类存在于部分RNA病毒中具有逆转录活性、能以单链RNA为模板合成DNA的酶。由逆转录酶催化逆转录合成的DNA称为互补DNA(cDNA)。
本发明中，SuperScriptTMIII逆转录酶是在MMLV逆转录酶基础上，通过基因工程诱导多个点突变改造制成，该酶降低了RNase H的活性，延长半衰期，且增加了酶的热稳定性，合成第一链cDNA最高温度可达55℃。SuperscriptTMIII逆转录酶提高了cDNA的长度、产量、特异性，并且对于富含GC的片段，也能有很好的表现，总体比野生型MMLV以及MMLV RNaseH-优异很多。生成的cDNA片段长度从100bp～12.3kb。
本发明中，T4噬菌体基因32编码蛋白(T4 gene 32 protein)是指是一种单链DNA(ssDNA)结合蛋白，为T4噬菌体DNA复制和修复所必需。它协调性地结合并稳定瞬时形成的ssDNA区域，在T4噬菌体DNA复制过程中起着重要的结构性作用。
本发明中，海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等。是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。
本发明中，诺纳德P-40分子式为：C15H24O·(C2H4O)n，为无色或淡黄色液体，有吸湿性，在软水、硬水、盐、碱和酸性溶液中都很稳定。在贮存时可能变混浊，但加热至40℃即能澄清，能与水混溶，溶液呈中性，溶于极性有机溶剂，有刺激性。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白和诺纳德P-40。优选所述PCR反应增强剂组合物由T4噬菌体基因32编码蛋白和诺纳德P-40构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR反应增强剂组合物，其包含海藻糖和诺纳德P-40。优选所述PCR反应增强剂组合物由海藻糖和诺纳德P-40构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白和海藻糖。优选所述PCR反应增强剂组合物由T4噬菌体基因32编码蛋白和海藻糖构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。优选所述PCR反应增强剂组合物由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白和海藻糖。优选所述PCR反应增强剂组合物由T4噬菌体基因32编码蛋白和海藻糖构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白和诺纳德P-40。优选所述PCR反应增强剂组合物由T4噬菌体基因32编码蛋白和诺纳德P-40构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含海藻糖和诺纳德P-40。优选所述PCR反应增强剂组合物由海藻糖和诺纳德P-40构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。优选所述PCR反应增强剂组合物由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖、诺纳德P-40、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶和Taq DNA聚合酶。具体地，所述逆转录酶可为SuperScriptTMIII逆转录酶，所述Taq DNA聚合酶可为PlatinumTMTaq DNA聚合酶。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖、诺纳德P-40、模板、引物、荧光探针和水。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖、诺纳德P-40、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白、0.1～2mol/L海藻糖和0.02～1％w/v诺纳德P-40。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.05～0.5mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白、0.1～1mol/L海藻糖和0.02～0.5％w/v诺纳德P-40。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含其包含0.05～0.5mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白、0.1～1mol/L海藻糖、0.02～0.5％w/v诺纳德P-40、10～50mM Tris-HCl、50～100mM KCl、1.5～4mM MgSO4、0.2～0.4mM dNTP mix、0.5～2U/μL核糖核酸酶抑制物、10～20U/μL逆转录酶和0.05～0.1U/μL Taq DNA聚合酶。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由T4噬菌体基因32编码蛋白、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由海藻糖、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由诺纳德P-40、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由T4噬菌体基因32编码蛋白、诺纳德P-40、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由海藻糖、诺纳德P-40、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液，其由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖、诺纳德P-40、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、模板、引物、荧光探针和水组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液中，所述引物包括正向引物和反向引物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微滴式逆转录数字PCR反应液中，所述水为去离子水。
本发明中，逆转录PCR(RT-PCR)扩增可以常规的反应程序进行，包括但不限于：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，57℃退火延伸40s，共40个循环。
在本发明中，可以使用多种本领域已知的制备逆转录数字PCR微滴的方法，包括但不限于垂直界面振动法。
本发明中，所述T4噬菌体基因32编码蛋白和诺纳德P-40可以竞争性的聚集在油水界面，从而减少逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面的吸附作用。同时，T4噬菌体基因32编码蛋白能稳定互补DNA(cDNA)结构，增加反转录过程的产量和延伸能力；诺纳德P-40能减少非特异性扩增。此外，PCR反应液中海藻糖能增加逆转录酶和DNA聚合酶的稳定性，从而提高微滴式逆转录数字PCR扩增效率。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施方式涉及的各实验材料：
(1)模板、探针和引物
模板：利用Trizol(ThermoFisher)提取A型禽流感病毒H5N1的总RNA。以提取的总RNA为模板逆转录扩增血球凝集素(hemagglutinin，HA)基因。其中，H5N1病毒的目标基因序列查询自Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data(GISAID)数据库和GenBank。扩增产物经纯化后被克隆到pGEM-T Easy vector system I(Promega，Germany)，然后利用T7 RNA聚合酶(MBI Fermentas)将1μg线性核糖体进行转录。5U RNase-freeDNase I(Ambion，Germany)用于去除转录样品中痕量DNA。最后，利用苯酚氯仿提取法提取和纯化样品中转录产物。使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定样品中目标RNA浓度后，将其进行十倍梯度稀释：50copies/μL、500copies/μL和5000copies/μL。
荧光探针序列：5’-CGA TAA ACT CTA GTA TGC CAT TCC ACA ACA-3’，在其5’末端标记有荧光基团5-FAM(5-羧基荧光素)，3’末端标记有淬灭基团BHQ-1(美国LifeTechnologies)。
正向引物：5’-GAG TAA TGG AAA TTT CAT TG-3’。
反向引物：5’-CGC AAG GAC TAA TCT GTT TGA-3’。
(2)试剂
MgSO4、dNTP mix、5×RT-PCR buffer(200mM Tris-HCl和375mM KCl)、SuperScriptTMIII逆转录酶、PlatinumTMTaq DNA聚合酶均购自ThermoFisher。牛血清白蛋白(BSA)、T4噬菌体基因32编码蛋白(T4 gene 32 protein)、丙三醇、甜菜碱、海藻糖、吐温80、曲拉通X-100和诺纳德P-40均购自Sigma公司。引物和探针由上海生工合成。
实施例1
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
对比例1
加入下述物质，制备得到本对比例的PCR反应液：
结果分析
将实施例1和对比例1的PCR反应液分别利用垂直界面振动法制备逆转录数字PCR微滴。随后将含有逆转录数字PCR微滴的收集装置转移至BIO-GENERPCR仪(杭州柏恒)中进行扩增，逆转录PCR扩增反应条件为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，57℃退火延伸40s，共40个循环。逆转录PCR扩增结束后，经荧光显微镜拍照和图像处理软件Image J分析，读取阳性微滴比例，再根据泊松分布原理计算样品中RNA浓度，具体实验结果见下表1。BSA和T4 gene 32 protein为可竞争性的聚集在油水界面的两种蛋白质，表1中可看出，相对于加入BSA的对比例1的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度，加入T4 gene 32 protein的实施例1的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度更接近实际RNA浓度。
表1
实施例2
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
对比例2
加入下述物质，制备得到本对比例的PCR反应液：
对比例3
加入下述物质，制备得到本对比例的PCR反应液：
结果分析
将实施例2、对比例2和对比例3的PCR反应液分别利用垂直界面振动法制备逆转录数字PCR微滴。随后将含有逆转录数字PCR微滴的收集装置转移至BIO-GENERPCR仪(杭州柏恒)中进行扩增，逆转录PCR扩增反应条件为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，57℃退火延伸40s，共40个循环。逆转录PCR扩增结束后，经荧光显微镜拍照和图像处理软件Image J分析，读取阳性微滴比例，再根据泊松分布原理计算样品中RNA浓度，具体实验结果见下表2。诺纳德P-40、吐温80和曲拉通X-100为可竞争性的聚集在油水界面的非离子表面活性剂，表2中可看出，相对于加入吐温80的对比例2的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度以及加入曲拉通X-100的对比例3的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度，加入诺纳德P-40的实施例2的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度更接近实际RNA浓度。
表2
实施例3
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
对比例4
加入下述物质，制备得到本对比例的PCR反应液：
对比例5
加入下述物质，制备得到本对比例的PCR反应液：
结果分析
将实施例3、对比例4和对比例5的PCR反应液分别利用垂直界面振动法制备逆转录数字PCR微滴。随后将含有逆转录数字PCR微滴的收集装置转移至BIO-GENERPCR仪(杭州柏恒)中进行扩增，逆转录PCR扩增反应条件为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，57℃退火延伸40s，共40个循环。逆转录PCR扩增结束后，经荧光显微镜拍照和图像处理软件Image J分析，读取阳性微滴比例，再根据泊松分布原理计算样品中RNA浓度，具体实验结果见下表3。海藻糖、甜菜碱和丙三醇为可提高逆转录酶和DNA聚合酶热稳定性的生物相容性试剂，表3中可看出，相对于加入甜菜碱的对比例4的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度以及加入丙三醇的对比例5的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度，加入海藻糖的实施例3的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度更接近实际RNA浓度。
表3
实施例4
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
实施例5
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
实施例6
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
实施例7
加入下述物质，制备得到本实施例的PCR反应液：
实施例4～7的PCR反应液中，作为PCR反应增强剂的各组分含量如下表4中所示。
表4
| T4 gene 32 protein | 海藻糖 | 诺纳德P-40 | |
| 实施例4 | 0.1mg/mL | 0.6mol/L | 0 |
| 实施例5 | 0.1mg/mL | 0 | 0.05％w/v |
| 实施例6 | 0 | 0.6mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例7 | 0.1mg/mL | 0.6mol/L | 0.05％w/v |
结果分析
将实施例4～7的PCR反应液分别利用垂直界面振动法制备逆转录数字PCR微滴。随后将含有逆转录数字PCR微滴的收集装置转移至BIO-GENERPCR仪(杭州柏恒)中进行扩增，逆转录PCR扩增反应条件为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，57℃退火延伸40s，共40个循环。逆转录PCR扩增结束后，经荧光显微镜拍照和图像处理软件Image J分析，读取阳性微滴比例，再根据泊松分布原理计算样品中RNA浓度，具体实验结果见下表5。表5中可看出，相对于实施例4～6的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度，加入T4 gene 32 protein、海藻糖和诺纳德P-40的实施例7的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度更接近实际RNA浓度。
表5
实施例8～19
在实施例7的基础上，调整T4 gene 32 protein、海藻糖、诺纳德P-40和去离子水的含量，其它组分不变，制备总体积均为20μL的实施例8～19的各PCR反应液。实施例8～19的PCR反应液中，作为PCR反应增强剂的各组分含量如下表6中所示。
表6
| T4 gene 32 protein | 海藻糖 | 诺纳德P-40 | |
| 实施例8 | 0.1mg/mL | 0.6mol/L | 0.02％w/v |
| 实施例9 | 0.1mg/mL | 0.6mol/L | 0.1％w/v |
| 实施例10 | 0.1mg/mL | 0.6mol/L | 0.5％w/v |
| 实施例11 | 0.1mg/mL | 0.6mol/L | 1％w/v |
| 实施例12 | 0.05mg/mL | 0.6mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例13 | 0.2mg/mL | 0.6mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例14 | 0.5mg/mL | 0.6mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例15 | 1mg/mL | 0.6mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例16 | 0.1mg/mL | 0.1mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例17 | 0.1mg/mL | 0.5mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例18 | 0.1mg/mL | 1mol/L | 0.05％w/v |
| 实施例19 | 0.1mg/mL | 2mol/L | 0.05％w/v |
结果分析
将实施例8～19的PCR反应液分别利用垂直界面振动法制备逆转录数字PCR微滴。随后将含有逆转录数字PCR微滴的收集装置转移至BIO-GENERPCR仪(杭州柏恒)中进行扩增，逆转录PCR扩增反应条件为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，57℃退火延伸40s，共40个循环。逆转录PCR扩增结束后，经荧光显微镜拍照和图像处理软件ImageJ分析，读取阳性微滴比例，再根据泊松分布原理计算样品中RNA浓度，具体实验结果见下表7。表7中可看出，相对于其它组分配比的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度，包含0.05～0.5mg/mL T4 gene 32 protein、0.1～1mol/L海藻糖、0.02～0.5％w/v诺纳德P-40的PCR反应增强剂组合物的PCR反应液制备的逆转录数字PCR微滴计算的RNA浓度更接近实际RNA浓度。
表7
对比例6
对比例6的PCR反应液采用文献报道的逆转录PCR增强剂及含量：5％v/v二甲基亚砜(Sidhu M.K.et al.Dimethyl sulfoxide improves RNAamplification.BioTechniques，1996，108(21):44–47)，对比例6采用与实施例13相同的逆转录数字PCR微滴制备方法，扩增条件相同，最终，对比例6的的微滴式逆转录数字PCR结果，如图2(a)～(c)和表8所示，图中每一个亮点代表一个阳性微滴。实施例13的微滴式逆转录数字PCR结果如图1(a)～(c)和表8所示。对比可看出，实施例13中阳性微滴比例计算的RNA浓度与实际RNA浓度更接近；利用对比例6中阳性微滴比例计算的RNA浓度与实际RNA浓度差别很大，模板浓度低时甚至读取不到阳性微滴。
表8
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
Claims (9)
1.一种PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。
2.根据权利要求1所述的PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40，优选由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。
3.一种微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种，优选所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。
4.根据权利要求3所述的微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，所述PCR反应液包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白，优选所述PCR反应液包含0.05～0.5mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白。
5.根据权利要求3或4所述的微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，所述PCR反应液包含0.1～2mol/L海藻糖，优选所述PCR反应液包含0.1～1mol/L海藻糖。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，所述PCR反应液包含0.02～1％w/v诺纳德P-40，优选所述PCR反应液包含0.02～0.5％w/v诺纳德P-40。
7.根据权利要求3～6中任一项所述的微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，所述PCR反应液包含Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP mix、核糖核酸酶抑制剂、逆转录酶和Taq DNA聚合酶；优选地，所述PCR反应液包含10～50mM Tris-HCl、50～100mM KCl、1.5～4mM MgSO4、0.2～0.4mM dNTP mix、0.5～2U/μL核糖核酸酶抑制剂、10～20U/μL逆转录酶和0.05～0.1U/μLTaq DNA聚合酶。
8.一种微滴式逆转录数字PCR试剂盒，其中，其包含权利要求3～7中任一项所述的微滴式逆转录数字PCR反应液。
9.一种使用如权利要求3～7中任一项所述的微滴式逆转录数字PCR反应液的微滴式逆转录数字PCR方法。
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