JP6760983B2 - ウイルスおよび細菌病原体の直接増幅および検出 - Google Patents
ウイルスおよび細菌病原体の直接増幅および検出 Download PDFInfo
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づいて、2011年7月6日に出願された米国特許出願第61/505,055号および2011年10月27日に出願された米国特許出願第61/552,405号の利益を主張する。前記出願のそれぞれの開示は本出願の開示の一部であると見なされ、参照により本出願の開示に組み込まれるものとする。
本発明は、例えば、インフルエンザAおよびBウイルスならびに呼吸器合胞体ウイルス(RSV)などの呼吸器ウイルス、エンテロウイルス、単純ヘルペスウイルス1および2(それぞれ、HSV-1およびHSV-2)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV);ならびにクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)などの(病原性)細菌を含むヒト病原体の検出のための診断方法であって、PCRの前にウイルス/細菌(すなわち標的)核酸を単離するための抽出または精製工程を含まないPCR法を用いて、特定の抽出または精製プロトコールを用いる同様のアッセイと実質的に同等の(またはより優れた)感度を提供する、前記方法に関する。
試料からの検出アッセイのためのウイルス核酸の入手は、液体試料の収集、固体または半固体試料の抽出、表面をスワブでぬぐうこと、またはさらなる技術を用いて行うことができる。ウイルスRNAは、存在する濃度がRT-PCR反応のための標的RNAを十分に提供するものである場合には直接アッセイすることができる。あるいは、ビリオンは遠心分離、免疫吸着もしくは他の相互作用による表面への結合、または濾過などの方法により濃縮することができる。
試料からの検出アッセイのための細菌細胞の入手は、液体試料の収集、固体または半固体試料の抽出、表面をスワブでぬぐうこと、またはさらなる技術を用いて行うことができる。細菌細胞は、存在する濃度がRT-PCR反応のための標的RNAを十分に提供するものである場合には直接アッセイすることができる。あるいは、細菌細胞は遠心分離、免疫吸着もしくは他の相互作用による表面への結合、または濾過などの方法により濃縮することができる。さらに、細菌細胞数は、濃縮または直接アッセイの前に培養プレート上または液体培地中で細胞を増殖させることにより増大させることができる。
標的核酸としてアッセイされ得るRNA型としては、rRNA、mRNA、トランスファーRNA(tRNA)、または他のRNAポリヌクレオチドが挙げられる。rRNAの種としては、関連する細菌の群に特有の1つ以上の部分配列を含む5S、16S、および23Sポリヌクレオチドが挙げられる。特徴的な配列の検出能力はさまざまであり、アッセイにより検出されるべきウイルスまたは細菌の関連性のレベルに依存する。他のRNAポリヌクレオチドを、それらが所望の関連性レベルで他の細菌から適切に識別する特有の部分配列を含む限り、診断標的RNAとして使用してもよい。その例は、tRNAおよびmRNA種から、ならびに1つ以上の特徴的な部分配列を含む細菌細胞において製造される任意のRNAから、見いだすことができる。当業者は、プライマーが逆転写反応において鋳型として標的RNAを用いるコピーDNAの合成を開始するようにプライマーを設計することができる。また、PCRにおける鋳型としてコピーDNAを用いて標的RNAの特有の部分配列を増幅するためのプライマーの対を設計する方法は当業者に公知である。PCRにおいて同調的に使用されるプライマーは同じハイブリダイゼーション融解温度を持たなければならないことは当業者に周知である。細菌細胞内の診断標的RNAは、RTまたはRT-PCR反応組成物に到達可能にしければならない。収集された後、核酸試料は反応組成物に直接加えてよく、次にそれに熱サイクルを行う。
本発明の方法において、診断標的RNAの存在を逆転写単独により、または、好ましくは逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応により試験する。一緒に使用する場合、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応は、2工程で順次、または試料にすべての反応組成物試薬を加えて1工程で、行うことができる。逆転写反応組成物中で試料をインキュベートすることにより、標的RNAからDNAコピーを合成することができる。試薬ミックスは、標的RNAにハイブリダイズしてコピーDNAの合成を開始させるプライマーを含む。さらに、試薬ミックスは、dNTP、MgC12、KCl(ウイルス試料のみ)、逆転写酵素および逆転写酵素緩衝液(ウイルス試料のみ)、ならびに、便試料の場合には、BSA(細菌試料のみ)を含む。2種以上の標的RNAからDNAコピーを作成することが望まれる場合には、2種以上のプライマーを含んでもよい。しかしながら、RNA分解酵素阻害剤は使用しない。次に、逆転写反応の産物を別の試験管に移して、そこで当業者に公知のプロトコールに従ってPCRを行う。PCR組成物は、典型的には、逆転写された鋳型からの所望のDNAセグメントの合成を開始する1対のプライマーを含む。さらに、PCRミックスは、通常、dNTP、Taqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼ、およびポリメラーゼ緩衝液を含む。複数のDNAセグメントの合成が望まれる場合には、2対以上のプライマーを含んでもよい。1つの新しいプライマーを加えて、その対の第2のプライマーとして元のRT-PCRプライマーと共にDNAセグメントを増幅するようにしてもよい。ウイルス試料に使用し得るさらなる逆転写酵素としては、HIV逆転写酵素(Ambion)、Transcriptor逆転写酵素(Roche)、Thermoscript逆転写酵素(Invitrogen)が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るさらなるDNAポリメラーゼとしては、Pfu、Vent、およびSequitherm DNAポリメラーゼ(EPICENTRE)が挙げられるが、これらに限定されない。
RT反応のcDNA産物を直接検出する方法は当業者に公知であり、cDNA産物中に組み込まれた、またはcDNA産物に付着した標識を使用する。使用し得るシグナル発生標識は当業者に公知であり、例えば、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、または発光部分もしくは分子が挙げられる。蛍光部分が特に有用であり、特に核酸に付着して蛍光シグナルを放射することが可能な蛍光染料が有用である。フルオレセイン、テキサスレッド(Texas Red)、およびローダミンなどのさまざまな染料が当業者に公知である。特に有用なのは、一反応性染料Cy3およびCy5であり、どちらも市販されている(例えば、Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Ill.より)。標識DNAを特異的に検出するためのさらに感度の高い方法は、ナイロン膜またはスライドガラスなどのマトリックス中に固定化された標的DNA配列分子に対して産物をハイブリダイズすることである。次に、ハイブリダイゼーション後のシグナルを、使用した特定の染料を検出するための適切なフィルター処理を使用してレーザースキャナーによりスキャンすることができる。これは、特にDNAマイクロアレイ技術において、当業者に公知である。標識はRT反応におけるcDNAの合成の間にcDNAの中に組み込まれてもよく、または、標識はcDNAの合成の後にcDNA産物に付着させてもよい。例えば、RT反応を標識されたプライマーを用いて実施することができる。1つのタイプの標識されたプライマーは、多数のシグナル発生分子を有する付着した粒子を有する。染料標識UTPおよび/またはCTPなどの標識ヌクレオチドを用いる逆転写は、標識を転写された核酸の中に組み入れる。あるいは、cDNA産物を検出するために合成後カップリング反応を使用することができる。核酸への標識の付着は当業者に公知であり、例えば、例えば標識RNAによる末端標識により、または核酸をキナーゼにより処理した後に核酸リンカーを付着させて試料の核酸を標識(例えば発蛍光団)と結合させることにより、行うことができる。別の標識法において、RT反応からのDNA産物をin vitro転写反応と組み合わせることにより増幅する。例えば、T7プロモーター領域をRT反応に使用するプライマーの中に組み入れる。次に、T7 in vitro転写キットを使用して大量のRNAを生成して検出感度を増大させる。T7 in vitro転写キットは、Ambion(2130 Woodward, Austin, Tex.)または他の商業的供給者から購入することができる。
RT-PCR産物の検出法としては、ゲル電気分解による分離および臭化エチジウム染色、または産物中に組み込まれた蛍光標識もしくは放射線標識の検出が挙げられる。検出前の増幅産物の分離工程を必要としない方法も使用することができる。これらの方法は一般にリアルタイムPCRまたはホモジニアス検出と呼ばれる。大部分のリアルタイム法は、熱サイクル中の蛍光の変化をモニターすることにより増幅産物の形成を検出する。これらの方法としては、TaqMan(登録商標)二重標識プローブ(Applied Biosystems, Foster City, Calif. 94404)、分子ビーコン(Molecular Beacons)(Tyagi S and Kramer FR (1996) Nat BiotechnoI14:303-308)、およびSYBR(登録商標)Green染料(Molecular Probes, Inc Eugene, Oreg. 97402-0469)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの同じホモジニアス法のいくつかを、増幅産物のエンドポイント検出にも使用することが可能である。このタイプの方法の例は、SYBR(登録商標)Green染料解離曲線分析である。解離曲線分析において、蛍光のモニタリングと組み合わされた、一般に約60℃〜90℃の温度における最後の遅い傾斜(final slow ramp)により融点を検出し、それにより増幅産物の存在を検出することができる(Ririe et al. (1997) Anal. Biochem. 245: 154-60)。
直接増幅アッセイの感度は、アッセイに使用する緩衝液に1種以上の感度増大成分を加えることにより増大することができる。このような成分としては、KCl、界面活性剤およびアルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アルブミンはウシ血清アルブミンである。いくつかの実施形態において、界面活性剤はカチオン性界面活性剤である。直接増幅アッセイの感度は、試薬を加える前の試料の前加熱のように、アッセイに追加の加熱を与えることにより増大することも可能である。いくつかの実施形態において、感度は感度増大成分と追加の加熱との組合せにより増大することができる。
他に特記されない限り、2.5Xユニバーサルマスターミックス(UMM)は下記の比率で調製される。下記の表は15 mlのUMMを調製するのに好適な試薬の体積を示すが、必要に応じて任意の好適な体積を調製することができる。
インフルエンザBウイルスを含む人工的に作ったスワブ検体を、培養されたインフルエンザBウイルス(「Flu B」)(Great Lakes株)を内部対照核酸と共にウイルス輸送媒体試料に加えることにより調製した。Flu Bおよび対照核酸のCt値を、UMMからKClを除き、さらに1または2μlのいずれかの逆転写酵素(Improm II逆転写酵素、Promega カタログ番号A3800)を含有する実施例1のユニバーサルマスターミックスを用いて、25 mM KClの存在下および不在下で測定した。Flu Bウイルスの鋳型コピーの連続希釈を158および39.5のTCID50/mlで評価した。RT-PCR反応は下記の通りに実行した。
段階2:47℃で10分間(1回)
段階3:97℃で2分間(1回)
段階4:102℃で1秒間、次いでデータ収集のため60℃で20秒間(45回反復)。
さまざまな臨床試料(口腔スワブおよび脳脊髄液)をHSV-1および/またはHSV-2の存在について評価した。実施例1のユニバーサルMMを、MgCl2およびKClに対して特記された修正を行って使用した。
段階2:47℃で10分間(1回)
段階3:97℃で2分間(1回)
段階4:102℃で1秒間、次いでデータ収集のために60℃で10秒間(50回反復)。
対照ウイルスをウイルス輸送媒体に加えて、上記の直接増幅RT-PCRアッセイを用いる分析のための合成試料を作った。それぞれのアッセイにおいて、10μlの試料を、1μlのRNA分解酵素阻害剤(「RNAsin」)(Promegaカタログ番号N261B)の存在下または不在下で、40μlの実施例1に記載したUMMに加えた。RT-PCR反応は下記の通りに実行した。
段階2:97℃で2分間(1回)
段階3:102℃で1秒間、次いでデータ収集のために58℃で20秒間(50回反復)。
ウイルス輸送媒体にインフルエンザA、インフルエンザB、およびRSVウイルスの組合せをおよそ5,000ウイルスコピー/mlで加えて、「FABR」合成試料を形成し、またはインフルエンザBウイルス(10-4)単独を加えた。これらの試料を、1μlのImprom II逆転写酵素および0.25μlのRNAsinを加えた実施例1のユニバーサルマスターミックスを用いて直接増幅により評価した。内部対照としてMS2ファージを加えた。実験試料を75℃に3分間前加熱し、それぞれのアッセイに対して10μlの試料を40μlのユニバーサルマスターミックスに加えた。RT-PCR反応は以下の通りに実行した。
段階2:97℃で2分間(1回)
段階3:102℃で1秒間、次いでデータ収集のために58℃で20秒間(50回反復)。
ヒト便試料を標準的な臨床的方法を用いて患者から得る。試料は輸送および短期保存のために2〜25℃に維持し、使用の前に2回以上の冷凍/解凍サイクルを行わない。評価のために、フロックスワブを完全に混合した便検体中に浸し、スワブを検体容器の側面に押しつけることにより過剰な便を除去する。次に、スワブを1 mlのTris-EDTA(TE)緩衝液中で回し、捨てる。試料を97℃に10分間加熱する。次に、試料を実施例1のUMM(下に記載するUMMの修正を行う)を用いて1:4に希釈する(すなわち、2μlの試料を8μlのUMMに加える)。場合により、正の内部対照核酸を含有する2μlの溶液を8μlのUMMに加え得る(4μlのUMM、ならびに0.35 mg/mlのBSA、それぞれ600 nMのフォワードおよびリバースプライマー、それぞれ300 nMの内部対照プライマー、および0.5μlの内部対照DNAを含む)。クロストリジウム・ディフィシル標的プライマーはFAM蛍光団により標識し、内部対照標的はQuasar670蛍光団により標識した。熱サイクルを97℃で2分間の初期変性工程により開始し、次いで97℃で10秒間、および60℃で30秒間を40サイクル行った。リアルタイムPCRは40サイクル行い、標的核酸(この実験においてはクロストリジウム・ディフィシルTCD-B遺伝子であった)に特異的な蛍光標識プローブを用いて増幅曲線を測定した。
BSAの添加が便材料によりもたらされる検出の阻害を減少させるかどうかを決定するために、BSAの存在下および不在下の両方で、標的としてクロストリジウム・ディフィシルDNAを用いて、BSAを含む試料を試験するために使用したプロトコールに従ってRT-PCRアッセイを行った。実施例6Aに示した処方に従って、ただしBSAを含まない試料では100X BSAを加えずに、便試料を調製した。核酸の精製にMagnaPureシステム(Roche)を使用した。BSAを含まないPCR製剤をウェル1〜20にプレートし、BSAを含むPCR製剤をウェル21〜40にプレートして、上記の通りにPCR反応を行った。
インフルエンザAの試料および内部対照を直接増幅を用いて評価して、実施例1において定義されたユニバーサルマスターミックス中で使用した酵素が直接検出アッセイを促進するそれらの能力において唯一のものであるかどうかを決定した。600 nMインフルエンザAスコーピオン/プライマー(マトリックス遺伝子に対するもの)、500 nMブタH1スコーピオン/プライマー(ヘマグルタニン(hemaglutanin)遺伝子に対するもの)、および150 nMのMS2ファージに特異的なアーマード(armored)RNA内部対照(IC)スコーピオンプライマーからなるハイブリッドプライマー濃度が使用された。反応ミックスは、2つの別個の酵素および緩衝系:GoTaq(登録商標)Flexi、およびそれに付随するユニバーサルMMの成分である5X PCR緩衝液(Promega; カタログ番号M891AまたはM890A)、ならびにFastStart High Fidelityおよびそれに付随するRNA MMの成分である10x緩衝液(Roche)を、以下の濃度で使用して調製した。
段階2:97℃で10分間(1回)
段階3:97℃で15秒間、次いで60℃で30秒間(40回反復)。
段階2:97℃で2分間(1回)
段階3:97℃で5秒間、次いで58℃で30秒間(40回反復)。
段階2:97℃で2分間(1回)
段階3:97℃で5秒間、次いで58℃で30秒間(40回反復)。
臨床検体(スワブ)および対照試料からの核酸を直接核酸増幅アッセイを用いて増幅して、結果を核酸抽出を含む方法を用いた増幅結果と比較した。増幅プライマーの配列を下記の表に示す。
臨床検体ならびに人工試料からの核酸を直接核酸増幅アッセイを用いて増幅して、結果を核酸抽出を含む方法を用いた増幅結果と比較した。反応混合物を下記の通りに調製した。
32検体(13検体のスワブ、2検体の硝子体液、17検体のCSF)のうち合計32検体が、核酸抽出を含む増幅法を用いてVZV陽性であると検出された一方で、32検体のうち31検体が直接増幅法により陽性であると検出された。試験結果が陰性であったCSF試料は、ヌクレアーゼ阻害剤を加えて試験した場合にはCt 37.1を有することが検出された。
臨床検体(スワブ):
核酸抽出を含む増幅法を用いて陽性と検出された2つのHSV-1試料は、直接増幅法を用いても陽性であった。同様に、核酸抽出を含む増幅法を用いて陽性と検出された2つのHSV-2試料は、直接増幅法を用いても陽性であった。
HSV-1およびHSV-2について、人工試料を用いて直接増幅と増幅の前に核酸抽出を行う方法とを比較した検出結果を下に示す。
上記の通り、直接増幅法および核酸抽出を用いる方法を用いた結果は、HSV-1およびHSV-2の検出において同等である。
試料からの核酸を直接核酸増幅アッセイを用いて増幅して、結果を核酸抽出を含む方法を用いた増幅結果と比較した。反応混合物を下記の通りに調製した。
上記の通り、直接増幅法および核酸抽出を用いる方法を用いた結果は、エンテロウイルスの検出において同等である。
直接核酸増幅アッセイを用いて試料からの核酸を増幅して、結果を核酸抽出を含む方法を用いた増幅結果と比較した。
クロストリジウム・ディフィシル細菌ストックを加えた便-TE緩衝液マトリックス中の人工試料を用いて再現性の研究を行った。パネルには、陰性(無添加のマトリックス)、低い陽性(LODのおよそ2〜4倍)、および中程度の陽性(LODのおよそ8〜10倍)の試料が含まれた。再現性の研究は、2つの統合されたサイクラー装置を用いて5日間(連続した日ではない)に渡って行った。それぞれの日に、それぞれの装置で2回の実行を行った。それぞれの実行は各パネルメンバーおよび正の対照(PC)の4回の反復ならびに鋳型を含まない対照(NTC)の1回の反復を含んだ。Integrated Cycler装置のそれぞれの実行において、パネルおよびPCを4回繰り返してアッセイし、NTCを1回アッセイした。1ロットの直接増幅アッセイを使用して、1日に装置あたり2回の実行で5日間(連続する日ではない)に渡ってパネルを実行した。装置あたり少なくとも1人のオペレーターを有する最低2台の装置が存在した。結果の再現性の概要を下に示す。
このアッセイの性能を、下記の表に示した濃度の、便試料中に存在し得る潜在的干渉物質を加えて評価した。合計21種の潜在的干渉物質(それぞれ4回ずつ反復)およびベースライン(陽性)試料(5回反復)を最初に試験した。2種を除くすべての干渉試料が最初の実行の4回の反復すべてにおいて「陽性」と判定された。2種の干渉物質(バンコマイシン(Vancomycin)およびペプトビスモール(Pepto-Bismol))について、再度の確認のための実行において、5回の反復のすべてが「陽性」であった。干渉は観察されなかった。
さまざまな可能性のある交差反応体について分析特異性を実施した。合計47種の潜在的交差反応生物体を試験した。ロタウイルス生物体のみが、最初の試験において3回の反復すべてで「陰性」と判定された。「ロタウイルス」についての5回反復した確認のための実行も「陰性」と判定された。交差反応性は確認されなかった。
試料からの核酸を直接核酸増幅アッセイを用いて増幅して、結果を核酸抽出を含む方法を用いた増幅結果と比較した。
実施例8の実験プロトコールを用いて、臨床検体からの核酸を下記の表に挙げられたさまざまな干渉物質の存在下で直接核酸増幅アッセイを用いて増幅した。
結果は、負の対照でFAM、JOEまたはCFR610チャネルにおいて有効な増幅シグナルがなく、Q670チャネルにおいてCt < 40であったことに基づいて正確であることが確認された。また、PCの反応はFAM、JOEおよびCFR610チャネルにおいてCt < 40を与えた。
実施例3の実験プロトコールを用いて、陰性スワブマトリックス上および合成脳脊髄液中の核酸を、下記の表に挙げられたさまざまな干渉物質の存在下で直接核酸増幅アッセイを用いて増幅した。
下記のデータは改善された性能を与える直接増幅アッセイの成分を表す。一実施形態において、これらの成分のすべてを組合せることにより、公知の阻害剤(例えば、血液およびヘパリン)の存在下でさえも有効なリアルタイムPCRを可能にする系が提供される。
直接増幅アッセイへのKCl(20〜40 mMまで)の添加は蛍光シグナルを改善し、反応に改善された感度を与える。図5のデータは、KClの存在下および不在下でのMRSAの検出を示す。KClが存在しなくてもいくらかの検出が可能であるが、KClの存在は反応の有効性を改善する。図5のデータは、カチオン性界面活性剤などの他の反応成分の存在下で得られたものである。
クロストリジウム・ディフィシルを含む便試料にさまざまな濃度でBSAを加えた。下に3500 ng/反応として表される高濃度では、いくつかの患者試料から阻害が除去された。下の表(Ct値を表す)に見られる通り、5 ng/反応の低いBSA濃度において、クロストリジウム・ディフィシル標的は検出されず、内部対照は3つの試料のうち2つで検出されなかった。具体的には、内部対照は試料Aを用いて検出された。しかしながら、高濃度の試料と比較して、低いCt値は遅い増幅を証明し、阻害の特徴を示している(Ct値は問題の標的を検出するために十分なシグナルが作り出されるPCRサイクルである)。
カチオン性界面活性剤を加えると蛍光シグナルが改善し、直接増幅アッセイに改善された感度を与える。図6に示される通り、シンプレキサ・ボルデテラ(Simplexa Bordetella)に対して直接増幅アッセイを行った場合に、界面活性剤を添加しなくてもいくらかの検出は可能である。しかしながら、界面活性剤を使用した場合、より高いシグナル高さにより示される通り、反応の有効性が改善し、それにより改善された感度が得られる。
試験したいくつかの生物体はアッセイ性能を改善するために追加の加熱工程を必要とする。例えば、図7に示される通り、Flu Bについて、標準的な反応において提供されるもの(例えば前加熱)以上の追加の加熱を用いた場合に、感度の改善が観察された。Flu Bを用いた改善は70℃の温度で見られた。クロストリジウム・ディフィシルおよびA群連鎖球菌などの他の生物体を検出するアッセイの性能は95℃の温度で見られた。阻害剤を破壊し、生物体を溶解するための試料の加熱は、熱が試薬を破壊する可能性とのバランスを取らなければならない。いくつかの実施形態において、試料の加熱は試薬(例えば、緩衝液)を加える前に行う。
下記のデータ(百日咳菌/パラ百日咳菌(Bordetella pertussis/parapertussis)PCR)は、直接増幅アッセイが30%までの輸送媒体(Copan UTM)を阻害なしで許容し得ることを示す。下で直接検出法により試験したすべての試料は、30%の試料および70%の直接増幅反応ミックスを使用した。直接検出の結果を、増幅の前にDNA抽出および精製を使用した結果と比較した。患者の検体を使用した場合、直接法は抽出および精製試験と比較して99%の感度および特異性を有した。
全血
全血を使用してヒト遺伝子試験を行った。全血は1:4希釈または10μlの反応体積中に0.5μlのいずれかで使用することができた。いずれの場合にも、ヘム(PCR阻害剤として知られる)はアッセイに影響を与えなかった。直接増幅法を用いて第V因子ライデン(Leiden)変位または第II因子変位の存在について試験した場合と、増幅および突然変異の検出の前に核酸抽出を利用する標準的方法を用いた場合とで完全な一致が達成された。
図8のデータは、1つの血液試料を3本の管に収集してそれぞれ異なる抗凝血剤(ヘパリン、EDTA、クエン酸塩)を加えたものからの増幅プロットを示す。図に示される通り、増幅プロットは、公知のPCR阻害剤であるヘパリンを抗凝血剤として使用した場合でさえも、すべての試料が有効な増幅を与えることを示す。
図9のデータは、突然変異(第V因子ライデン変位領域の検出)についてヒト遺伝子DNAの2つの試料および1つの負の対照のそれぞれを4回反復した結果を表す。すべての反復において効率的な増幅が見られた。試料は頬の内側を約10秒間スワブで拭くことにより収集し、スワブ表面全体が使用されたことを確認した。次に、スワブを500μLの1X TE緩衝液2μL中に入れ、これを抽出を行わずにPCR試料に直接入れた。
以前に刊行された結果は、有効な検出を行うためには試料を希釈しなければならないことを示している。これらの刊行物、例えば、参照文献Pandori et al., BMC Infect. Dis., 6:104 (2006)と比較すると、前記のデータは、10倍の量の試料が、刊行された方法よりも10倍低い検出限界を提供することを証明している。
本発明は以下の態様も提供する。
[1] ヒトから得られた生体試料中の微生物由来の標的核酸の存否を確認するための方法であって、該方法が、
(a) 試料から標的核酸を抽出することなく、試料由来の標的核酸の増幅に好適な条件下で試料をDNAポリメラーゼおよび緩衝液と接触させる工程;
(b) 工程(a)により得られた試料に、存在する場合には標的核酸が増幅されるように熱サイクルを行う工程;ならびに
(c) 存在する場合には工程(b)により製造された増幅された標的核酸を検出する工程
を含み、
試料中の核酸を増幅の前に試料から抽出しない、
前記方法。
[2] 試料を工程(a)の前に希釈しない、[1]に記載の方法。
[3] 試料を工程(b)の前に加熱する、[1]に記載の方法。
[4] 試料を工程(a)の前に加熱する、[3]に記載の方法。
[5] 試料を工程(b)の前に、約2分間以上、約70℃以上の温度に加熱する、[1]に記載の方法。
[6] 緩衝液が塩化カリウム(KCl)を含む、[1]に記載の方法。
[7] KClが約5 mM〜約50 mMの濃度で存在する、[6]に記載の方法。
[8] 緩衝液がGoTaq(商標)Flexi緩衝液を含む、[1]に記載の方法。
[9] GoTaq(商標)Flexi緩衝液が工程(b)の間1X〜5Xの濃度で存在する、[8]に記載の方法。
[10] DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、[1]に記載の方法。
[11] 標的核酸がDNAである、[1]に記載の方法。
[12] 標的核酸がRNAである、[1]に記載の方法。
[13] 増幅の前に、試料をさらに逆転写酵素と接触させる、[12]に記載の方法。
[14] 試料をDNAポリメラーゼおよび逆転写酵素と同時に接触させる、[13]に記載の方法。
[15] 試料が血液、血清、血漿、脳脊髄液、口腔液、および便からなる群より選択される、[1]に記載の方法。
[16] 血液が全血である、[15]に記載の方法。
[17] 試料が口腔領域から得られる、[1]に記載の方法。
[18] 微生物がウイルスである、[1]に記載の方法。
[19] ウイルスが、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびエンテロウイルスからなる群より選択される、[18]に記載の方法。
[20] 微生物が細菌である、[1]に記載の方法。
[21] 細菌がクロストリジウム属または連鎖球菌属である、[20]に記載の方法。
[22] 緩衝液がさらにアルブミンを含む、[1]に記載の方法。
[23] アルブミンがBSAである、[22]に記載の方法。
[24] 緩衝液がさらに界面活性剤を含む、[1]に記載の方法。
[25] 界面活性剤がカチオン性界面活性剤である、[24]に記載の方法。
[26] ヒトから得られた生体試料中の微生物由来の標的核酸の存否を確認するための方法であって、該方法が、
(a) 試料から標的核酸を抽出することなく、試料由来の標的核酸の増幅に好適な条件下で試料をDNAポリメラーゼおよび緩衝液と接触させる工程;
(b) 工程(a)により得られた試料に、存在する場合には標的核酸が増幅されるように熱サイクルを行う工程;ならびに
(c) 存在する場合には工程(b)により製造された増幅された標的核酸を検出する工程
を含み、
試料中の核酸を増幅の前に試料から抽出せず、かつ、
緩衝液が、KCl、ウシ血清アルブミンおよび界面活性剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含む、
前記方法。
[27] 界面活性剤がカチオン性界面活性剤である、[26]に記載の方法。
[28] さらに工程(a)または工程(b)の前に試料を加熱することを含む、[26]に記載の方法。
Claims (7)
- ヒトから得られた生体試料中の微生物由来の標的核酸の存否を確認するための方法であって、該方法が、
(a) 生体試料から標的核酸を抽出することなく、試料由来の標的核酸の増幅に好適な条件下で生体試料をDNAポリメラーゼおよび緩衝液を含む反応混合物と接触させ、試料混合物を得る工程;
(b) 工程(a)により得られた試料混合物に、存在する場合には標的核酸が増幅されるように熱サイクルを行う工程;ならびに
(c) 存在する場合には工程(b)により製造された増幅された標的核酸を検出する工程
を含み、
該生体試料が便試料であり、
該便試料は、ヒト便検体をスワブで採取し、スワブで採取した該便検体を1 ml緩衝液中に混合して便試料とすることによって調製され、
工程(a)後の該試料混合物の全量の20〜30%が該生体試料であり、
該標的核酸は、微生物を含まない生体試料中には存在せず、
該反応混合物がカチオン性界面活性剤を含む、
前記方法。 - さらに工程(a)または工程(b)の前に試料を加熱することを含む、請求項1に記載の方法。
- 生体試料が工程(a)または工程(b)の前に加熱される、請求項2に記載の方法。
- 反応混合物がさらに、塩化カリウム及び/又はウシ血清アルブミンを含む、請求項2に記載の方法。
- 微生物がウイルス又は細菌である、請求項2に記載の方法。
- ウイルスが、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびエンテロウイルスからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 細菌がクロストリジウム属または連鎖球菌属である、請求項5に記載の方法。
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