JP7272202B2 - 標的核酸の検査方法および検査装置 - Google Patents

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Description

本発明は、標的となる核酸（以下、標的核酸と称する場合がある）を含む検体から、標的核酸を検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。より詳細には、標的核酸を含む検体用容器内へ陽性コントロール核酸を混合し、検体中の標的核酸を検出する方法、および該方法に用いるキットに関する。
核酸の増幅および検出に関する技術は、感染症の診断、農作物の核酸検査、遺伝子診断などの様々な分野において幅広く利用されている。核酸の増幅や検出を行う方法として、様々な方法が用いられている。
核酸の増幅法としては、代表的なポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する場合がある）を利用するＰＣＲ法の他、転写-逆転写協奏反応（以下、ＴＲＣと称する場合がある）法、転写媒介性増幅（以下、ＴＭＡと称する場合がある）法、核酸配列ベース増幅（以下、ＮＡＳＢＡと称する場合がある）法、ループ媒介性等温増幅（以下、ＬＡＭＰと称する場合がある）法、Ｓスマート増幅プロセス（以下、ＭＡＰと称する場合がある）法、等温キメラプライマー開始核酸増幅（以下、ＩＣＡＮと称する場合がある）法などが知られている。
例えばＰＣＲ法を用いる感染症の診断として、ぶどう膜炎の診断が挙げられる。ぶどう膜炎は眼内に炎症を起こす疾患の総称であり、重症例では、高率に失明などの視覚障害を引き起こす。ぶどう膜炎は、非感染性ぶどう膜炎と、病原体による感染性ぶどう膜炎とに分類される。非感染性ぶどう膜炎は、免疫抑制剤による薬物治療が行われるが、感染性ぶどう膜炎では、原因となる病原体に対応する薬剤により治療する必要がある。
しかし、感染性ぶどう膜炎と非感染性ぶどう膜炎との鑑別は、臨床所見のみでは困難である場合があり、診断の遅れまたは不適切な治療により症状が重篤化する症例が存在する。このため、ぶどう膜炎における病原体の存在および病原体の同定を早期に行うことは、適切な治療方法の選択および症状の重篤化の防止のために重要である。
感染性ぶどう膜炎の原因となる病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫などが挙げられるが、ウイルスを原因とする感染性ぶどう膜炎の発症頻度が最も高い。原因となるウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのヘルペスウイルス属、ならびにヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ-１）などが挙げられる。感染性ぶどう膜炎の診断や治療を行う上で感染体の同定は重要な情報となる。このため、眼内局所における感染ウイルスを同定するためには、前房から採取された前房水や眼内から採取された硝子体などを検体として使用する必要がある。
前房は、角膜と水晶体との間にある空間であり、その空間を満たす前房水を検体として、病原体の同定のためにＰＣＲによる遺伝子検査が行われている。しかしながら前房水の採取量は、通常１００μＬ以下であり、複数の病原体を検出するには検体量が不足する場合がある。
さらに、感染性ぶどう膜炎においては、原因となる病原体は、主要なもので、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ-１）および２型（ＨＳＶ-２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ-６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ-１）、細菌である梅毒トレポネーマならびに原虫であるトキソプラズマの９種類が挙げられる。
これらの病原体を個別に検出するためには、それぞれの病原体ごとにＰＣＲ試薬およびＰＣＲプライマー等を調製する必要があるが、検出対象の数が多くなると、試薬の入れ間違いなどのヒューマンエラーが生じる可能性が高くなり、誤った検出結果を与える危険性もある。
ヒューマンエラー以外にも、以前に行った核酸増幅反応の増幅産物が、新たに行う核酸増幅反応の容器内に混入する（コンタミネーション）ことにより、偽陽性等が生じる場合がある。このようなコンタミネーションを防止する方法として、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法（非特許文献１）や、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法を改良した方法が開示されている（特許文献１）。
また核酸の増幅および検出を行うとき、実際には陽性であるにもかかわらず、何らかの原因で陰性の結果（偽陰性）が出る場合がある。このような偽陰性の結果は本来検出すべき核酸が検出されていないということから、偽陰性をできるだけ防止する方法も提案されている（例えば特許文献２）。
特表２００４－５０７２４８号公報 ＷＯ２０１６／０５９７９８号公報 Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．９３（１）， １２５-１２８ （１９９０）
本発明の目的は、微量の検体であっても、複数の病原体を、同時に、かつ迅速に検出することができる検出方法、および該方法を実行するためのキットを提供することにある。さらに本発明の目的は、簡便な検出工程を採用することにより、病原体の検出操作におけるヒューマンエラーを回避し、偽陰性の確率を低減することのできる検出方法、および該方法を実行するためのキットを提供することにある。
すなわち、本発明は、
下記（１）から（５）の工程を含む標的核酸の検査方法に関する。
（１）標的核酸を含む検体と陽性コントロール核酸を混合し前記検体と陽性コントロール核酸の検体混合物を得る工程（１）
（２）前記検体混合物を、界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液と混合し緩衝液混合物を得る工程（２）
（３）前記緩衝液混合物の一部をＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物に添加する工程（３）
（４）前記緩衝液混合物の一部をＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加する工程（４）
（５）前記工程（３）および（４）の結果生成したＰＣＲ産物を検出する工程（５）
さらに本発明は、下記（１）から（４）を含む標的核酸の検査用キットに関する。
（１）陽性コントロール核酸を備えた検体採取容器
（２）界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液を備えたＰＣＲ反応液容器
（３）ＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた少なくとも１以上のＰＣＲ反応容器
本発明によれば、標的核酸を含む微量の検体（例えば前房水）であっても、複数の病原体を、同時に、かつ迅速に検出することができる検出方法、および該方法を実行するためのキットを提供することができる。さらに本発明によれば、簡便な検出工程で、病原体の検出操作におけるヒューマンエラーを回避し、特に偽陽性の頻度を低減することのできる検出方法、および該方法を実行するためのキットを提供することができる。
本発明の一実施形態を示す模式図である。 本発明の方法およびキットならびに定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を用いて、病原体の存在が疑われる９７例のヒト前房水または硝子体を分析した結果を示す図である。 図２において、本発明の方法およびキットを用いて得たＣｑ値ならびに定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法で得た定量値（コピー／ｍＬ）の相関性を示す図である。 本発明の方法およびキットならびに定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を用いて、非感染性ぶどう膜炎と診断された５２例のヒト前房水または硝子体を分析した結果を示す図である。
本発明の方法は標的核酸を含む検体と陽性コントロール核酸を混合し、前記検体と陽性コントロール核酸の検体混合物を得る工程（以下、工程（１）と称する場合がある）を含む。
本発明における標的核酸とは、被検試料中から検出または定量を行う対象となる核酸を意味し、後述する工程でＰＣＲプライマー対を用いた核酸増幅反応により増幅される領域の核酸を意味する。
標的核酸は、疾患の診断や、疾患の発症リスクの判定などの目的に応じて適宜選択することができ、例えば以下のような遺伝子が挙げられる。
１．疾患の原因または増悪と関連する遺伝子等（非コード領域も含む）またはその一部またはそれらの転写産物
２．疾患の発症により異常発現する遺伝子等（非コード領域も含む）またはその一部またはそれらの転写産物
３．疾患の発症リスクと関連する遺伝子等（非コード領域も含む）またはその一部またはそれらの転写産物
上記遺伝子等の具体例として、疾患の原因等となり得るウイルス、細菌、真菌、原虫の遺伝子等が挙げられる。
ウイルスには、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス１型（以下、ＨＳＶ-１と称する場合がある）および２型（以下、ＨＳＶ-２と称する場合がある）、水痘帯状疱疹ウイルス（以下、ＶＺＶと称する場合がある）、エプスタイン・バール・ウイルス（以下、ＥＢＶと称する場合がある）、ヒトヘルペスウイルス６型（以下、ＨＨＶ-６と称する場合がある）、サイトメガロウイルス（以下、ＣＭＶと称する場合がある）などが、またＲＮＡウイルスとしては、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（以下、ＨＴＬＶ-１と称する場合がある）などが挙げられるが、これらに限定されない。細菌としては、梅毒トレポネーマなどが、また原虫としては、トキソプラズマなどが検出対象となるが、これらに限定されない。
なお本発明において、検体は上記標的核酸を含むものであり、検体を採取する生物種と、標的核酸が由来する生物種は、異種であっても同種であってもよい。異種である場合の例としては、哺乳動物が病原微生物に感染しているかどうかを確認する目的で、該病原微生物の特定の核酸を標的核酸とし、哺乳動物から検体を採取する場合が挙げられる。同種である場合の例としては、哺乳動物が疾患に罹患しているかどうかを確認する目的で、その疾患に関連する哺乳動物遺伝子の特定の核酸を標的核酸とし、当該哺乳動物から検体を採取する場合が挙げられる。
検体の具体例として、眼組織から得られる固形物、粘性物または液性物が挙げられる。例えば、ぶどう膜炎における病原体の感染を診断するためには、前房水または硝子体が好ましく用いられる。前房水の採取量は、一般に５０～１００μＬ程度である。本発明においては、１２～２０μＬの前房水または硝子体を使用して微生物の感染を検出することができるが、測定対象とする微生物の数に応じて、１２μＬ未満であっても検出が可能である。
工程（１）で混合される陽性コントロール核酸は、標的核酸の陽性コントロールとなる。工程（１）で検体と陽性コントロールを混合し、後述の各工程を行うことで、ＰＣＲプライマー対が目的通りの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われていること、および、標的核酸用プローブが目的通りの機能を果たしていることを確認することができる。
陽性コントロール核酸は検体が由来する生物種、または標的核酸が由来する生物種から、予め抽出、増幅させたものでもよいし、別途、異なる生物種から抽出したものでもよい。また陽性コントロール核酸は人工的に合成した核酸であってもよい。
上記陽性コントロール核酸は、検体を採取する生物種に含まれている核酸が好ましく、ハウスキーピング遺伝子が上記効果の観点からより好ましい。
ハウスキーピング遺伝子としては、ＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＴＢＰと称する場合がある）遺伝子、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（以下、ＧＡＰＤＨと称する場合がある）遺伝子、β-アクチン遺伝子、β2-マイクログロブリン遺伝子、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（以下、ＨＰＲＴ １と称する場合がある）、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子、5-ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（以下、ＡＬＡＳと称する場合がある）遺伝子、βグロンビン（β-ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子、Ｇｌｕｃｏｓｅ－6－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（以下、Ｇ６ＰＤと称する場合がある）遺伝子、β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（以下、ＧＵＳＢと称する場合がある）遺伝子、ｉｍｐｏｒｔｉｎ８（以下、ＩＰＯ８と称する場合がある）遺伝子、ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（以下、ＰＢＧＤと称する場合がある）遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １（以下、ＰＧＫ１と称する場合がある）遺伝子、ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ａ（以下、ＰＰＩＡと）遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１３ａ（以下、ＲＰＬ１３Ａと称する場合がある）遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｒｇｅ Ｐ０（以下、ＲＰＬＰ０と称する場合がある）遺伝子、ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ（以下、ＳＤＨＡと称する場合がある）遺伝子、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下、ＴＦＲＣと称する場合がある）遺伝子、３－ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ／ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ５－ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ, ｚｅｔａ（以下、ＹＷＨＡＺと称する場合が）遺伝子などが挙げられる。
工程（１）で得られた検体混合物を、界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液と混合し緩衝液混合物を得る（以下、工程（２）と称する場合がある）。
前房水および硝子体など標的核酸を含む検体は、界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液と混合することにより、標的核酸の溶解がＰＣＲ中に促進されると考えられる。ＰＣＲ緩衝液に含まれる界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤を選択することができる。好ましくは、非イオン界面活性剤であり、検体との混合時に０.０５～５％（w/v）であることが好ましい。
前記ＰＣＲ緩衝液は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ５′－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄＮＴＰ）ミックスを含むことが標的核酸の溶解の観点から好ましい。なお、ｄＮＴＰミックスとは、予めｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＡＴＰと称する場合がある）、ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＧＴＰと称する場合がある）、ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＣＴＰと称する場合がある）および ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＴＴＰと称する場合がある）を所定濃度で混合した水溶液である。また前記ＰＣＲ緩衝液は標的核酸の溶解の観点からトリス塩酸が好ましい。ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌおよび緩衝液の濃度については、検体の種類、標的核酸、後述する工程で用いるＰＣＲプライマー対により、適宜設定することができる。例えば検体が前房水または硝子体の場合、ＭｇＣｌ２が約１.５ｍＭ、ＫＣｌが約３５ｍＭ、ｄＮＴＰが約２００μＭおよびトリス塩酸が約１０ｍＭであることが好ましい。
前記ＰＣＲ緩衝液は、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質（例えば、ある種の糖および色素等）およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質（例えば、ある種のタンパク質等）であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む。前記ＰＣＲ緩衝液として、遺伝子増幅用試薬Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標、島津製作所）またはＡｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｐｌｕｓ（登録商標、島津製作所）を使用することができる。固相抽出や液液抽出のようなＤＮＡを精製する処理が不要となり、液を廃棄する必要もなくなるため、より少量の試料でＰＣＲ反応などを行うことができるという観点から、このような遺伝子増幅用試薬の使用は好ましい。
工程（２）で得られた緩衝液混合物の一部はＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物に添加される（以下、工程（３）と称する場合がある）。
工程（３）で用いられる陽性コントロール核酸は工程（１）で添加した陽性コントロール核酸と同じでも異なっていてもよいが、方法の簡便性の観点から同じ核酸を用いる方が好ましい。工程（３）で用いられる陽性コントロール核酸の具体例は上述と同じものが挙げられる。
ＰＣＲ反応コントロール核酸は陽性の増幅曲線を示すことで分析が正しく行われた、すなわち、検体が、後述するＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に正しく添加されたことを示す指標となる。
ＰＣＲ反応コントロール核酸は検体が由来する生物種、または標的核酸が由来する生物種から、予め抽出、増幅させたものでもよいし、別途、異なる生物種から抽出したものでもよい。またＰＣＲ反応コントロール核酸は人工的に合成した核酸であってもよい。
上記ＰＣＲコントロール核酸は、検体を採取する生物種に含まれている核酸が好ましく、ハウスキーピング遺伝子が上記効果の観点からより好ましい。
ハウスキーピング遺伝子としては、上記陽性コントロール核酸と同じ核酸が例示できるが、陽性コントロール核酸とは異なる核酸を用いるのが、検体が正しくＰＣＲ反応用固体組成物に添加されたことを確認するという観点から好ましい。
検出精度の観点から、陽性コントロール核酸とＰＣＲ反応コントロール核酸の組み合わせとして、ＧＡＰＤＨおよびＴＢＰの組み合わせが好ましい。ＧＡＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子として、多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であり、ＰＣＲの進行を確認する陽性コントロールとして使用する。ＴＢＰは、ＴＡＴＡボックスと呼ばれるＤＮＡ配列に結合する基本転写因子であり、細胞数を反映するので、細胞が採取され、検体に含まれることを確認するＰＣＲ反応コントロールとして使用する。
本発明の陽性コントロール核酸は、被検試料中の標的核酸の定量（絶対定量や相対定量）にも有用である。絶対定量に用いる場合は、例えば、既知濃度の陽性コントロール核酸の測定結果に基づいて検量線を作成することにより、未知濃度の被検試料サンプル中の標的核酸の定量を精度よく行うことができる。また、相対定量に用いる場合は、例えば、一定濃度に達するまでに要するサイクル数を、陽性コントロール核酸サンプルと被検試料サンプルの間で比較し、１サイクルで２倍に増幅するＰＣＲ原理に基づいて、相対的な濃度差を算出することもできる。
工程（２）で得られた緩衝液混合物の一部は、別途用意されたＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加される（以下、工程（４）と称する場合がある）。
上記工程（４）によりＰＣＲが開始され、標的核酸が増幅される。前記ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるという観点から、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼとしては、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
複数の標的核酸を同時に検出できるという観点から、１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を２以上用意し、前記工程（２）で得られた緩衝液混合物の一部をそれぞれのＰＣＲ反応用固体組成物に添加する方法が好ましい。例えば前記工程（２）で得られた緩衝液混合物を、ＰＣＲプライマー対を含む複数のＰＣＲ反応用固体組成物に添加し、ＰＣＲを行うことにより、複数の標的核酸を同時に検出することができる。
工程（４）で用いられるＰＣＲプライマー対の例として、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ-１）もしくは２型（ＨＳＶ-２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ-６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ-１）、梅毒トレポネーマまたはトキソプラズマの標的遺伝子領域の増幅を行うためのＰＣＲプライマー対が挙げられる。
これらＰＣＲプライマー対は、２種以上を組み合わせて、ＰＣＲ反応用固体組成物に加えることができる。これにより、一つのＰＣＲ反応用個体組成物で２種類以上の標的核酸を検出することができる。検出の迅速性の観点から、２種以上のＰＣＲプライマー対を組み合わせたＰＣＲ反応用固体組成物を用いることが好ましい。
検体量を節約し、複数の標的遺伝子を同時に増幅する方法としてマルチプレックスＰＣＲが提案されている（Sugita S, et al. Br J Ophthalmol. 2008;92:928-932.およびSugita S, et al. Ophthalmology. 2013;120:1761-1768.）。マルチプレックスＰＣＲは、ひとつのＰＣＲ反応系において複数のＰＣＲプライマー対を使用することにより、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。この方法では、検体量の節約ができることに加えて、複数の病原微生物を同時に検出することができるという利点がある。しかしながら、ＰＣＲを実施する前に、検体から核酸を抽出する必要があった。また、マルチプレックスＰＣＲにおいては、それぞれのＰＣＲプライマー対による標的遺伝子領域の増幅が、ひとつのＰＣＲ反応系において良好に進行するように、使用するプライマーの設定および反応条件の検討が必要である。
ＰＣＲプライマー対の例として、（ｉ）ＨＳＶ-１検出用プライマー対およびＶＺＶ検出用プライマー対、（ｉｉ）ＨＳＶ-２検出用プライマー対およびＨＨＶ-６検出用プライマー対、（ｉｉｉ）ＥＢＶ検出用プライマー対およびＣＭＶ検出用プライマー対、ならびに（ｉｖ）ＨＴＬＶ-１検出用プライマー対および梅毒トレポネーマ検出用プライマー対の組み合わせが挙げられる。また、３種類の病原微生物を同時に検出するために、３種以上のＰＣＲプライマー対を加えてもよい。各プライマーの塩基配列は、標的核酸の配列データーベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）の塩基配列情報に基づいて適宜、設計することができる。
上記工程（３）および（４）で用いられるＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物は、通常、凍結乾燥により調製されるが、これら固体組成物に含まれる酵素などの活性が維持される限りにおいて、凍結乾燥に限定されない。固体組成物とすることにより、前記工程（２）で得られた緩衝液混合物を添加するだけで、ＰＣＲを開始することができるので、測定操作が簡便なものとなる。また、使用する前の保管も簡易なものとなる。
前記工程（３）および（４）におけるＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物は、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むことが、検出精度の観点から好ましい。ＰＣＲ反応用固体組成物が１種類のＰＣＲプライマー対を含む場合には、後述するようなリアルタイム測定するための蛍光色素は１種類でよいが、２種類以上のＰＣＲプライマー対を含む場合は、２種類以上の異なる蛍光色素が必要となる。この蛍光色素の例としては、６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以下、ＦＡＭと称する場合がある）、６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（以下、ＲＯＸと称する場合がある）、Ｃｙａｎｉｎｅ系色素（以下、Ｃｙ５と称する場合がある）および４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以下、ＨＥＸと称する場合がある）が挙げられる。オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、ＰＣＲ増幅産物の配列データーベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）の塩基配列情報に基づいて適宜、設計することができる。
上述したＰＣＲ反応用固体組成物に、緩衝液混合物を添加すると、ＰＣＲ反応用固体組成物が溶解し、サーマルサイクリングを行うことでＰＣＲが進行する。ＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、標的核酸の種類等により、適宜設定される。ＰＣＲが進行し標的核酸が緩衝液混合物に入っていれば、後述のＰＣＲ産物を検出する工程で陽性の結果が得られ、疾患の診断や、疾患の発症リスクの判定などが行われる。
前記工程（３）および（４）の結果生成したＰＣＲ産物を検出する（以下、工程（５）と称する場合がある）。
ＰＣＲ産物を検出する方法は、例えば、アガロースゲルを用いた電気泳動法、熱融解曲線による検出、蛍光検出等の方法が挙げられる。また検出の迅速性の観点からリアルタイム測定と呼ばれる検出方法が好ましい。
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲでは、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素の例は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが挙げられる。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
蛍光標識プローブとしては、加水分解プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどが挙げられる。加水分解プローブは、５'末端が蛍光色素で、また３'末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。加水分解プローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした加水分解プローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。
前記蛍光色素の例としては、上述した蛍光色素と同様な蛍光色素が挙げられる。前記クエンチャーの例としては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、登録商標）１、ＢＨＱ２、ＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）およびＤＡＢＣＹＬなどが挙げられる。２種類以上の標的核酸を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素で標識した２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば加水分解プローブ）を用いてＰＣＲを行ことが、検出精度の観点から好ましい。
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定の場合、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターすることで、ＰＣＲの進行状況をリアルタイムで確認することができる。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における標的核酸の存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。この時、ＰＣＲサイクル数に応じて上記陽性コントロール核酸の蛍光強度が増加すれば、検体が間違いなく緩衝液混合物中に含まれ、工程（４）に供されていると判断される。またＰＣＲサイクル数に応じて上記ＰＣＲ反応コントロール核酸の蛍光強度が増加すれば、検体が間違いなく工程（４）に供されているとともに、ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲプライマー対が正常に働いていると判断できる。したがって、標的核酸の存在が陰性であるとの判定の信頼性が向上する。
上記方法を効率的に行うために、本発明はさらに、下記（１）から（４）を含む標的核酸の検査用キットを提供する。
（１）陽性コントロール核酸を備えた検体採取容器
（２）界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液を備えたＰＣＲ反応液容器
（３）ＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた少なくとも１以上のＰＣＲ反応容器
上記検査用キットは、ごく少量の検体を採取し、上述した各工程に従って複数の標的核酸を検査する場合に、効率的に検査を行うことを可能とする。
本発明の検査用キットは陽性コントロール核酸を備えた検体採取容器を少なくとも一つ含む。含まれる陽性コントロール核酸は上記したとおりである。検体検出容器の形状、大きさ等については特に制限はなく、取り扱いが簡便で耐薬品性に優れる材質が好ましい。また視認性に優れる材質が好ましい。
標的核酸を含む検体を上記検体採取容器に必要量滴下することで検体と陽性コントロール核酸の検体混合物が得られる。少量の検体で標的核酸を検査でき、かつヒューマンエラーを抑制する観点から、検体採取容器は一つであることが好ましい。
本発明の検査用キットは、界面活性剤を含有するＰＣＲ緩衝液を備えたＰＣＲ反応液容器を少なくとも一つ含む。界面活性剤およびＰＣＲ緩衝液は上記したとおりである。
前記検体採取容器で得られた検体混合物をＰＣＲ反応容器に必要量滴下することで、緩衝液混合物を得ることができる。操作の煩雑さを抑制する観点から、ＰＣＲ反応容器は一つであることが好ましい。
本発明の検査用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器を少なくとも一つ含む。前記ＰＣＲ反応液容器で得られた緩衝液混合物の一部を採取し、前記ＰＣＲ反応コントロール容器に必要量滴下し、上述のとおりサーマルサイクリングを行うことで、ＰＣＲ反応コントロール容器内でＰＣＲ反応が進行し、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸の増幅が行われる。
ＰＣＲ反応コントロール用固体組成物に含まれるＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸は上述のとおりである。またＰＣＲ反応コントロール用個体組成物についても上述のとおりである。
ＰＣＲ反応コントロール容器は１つでも２以上でもよい。操作の簡便性の観点から、ＰＣＲ反応コントロール容器は１つであることが好ましい。一方、ＰＣＲ反応の結果をより確度の高いものとするという観点から、ＰＣＲ反応コントロール容器は２つ以上が好ましい。標的核酸の種類の数、検体の量等からＰＣＲ反応コントロール容器の数は適宜設定される。また上記ＰＣＲ反応コントロール容器は、上述のＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むＰＣＲコントロール用固体組成物を含んでいてもよい。
本発明の検査用キットは、ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えたＰＣＲ反応容器を少なくとも一つ以上含む。前記ＰＣＲ反応液容器で得られた緩衝液混合物の一部を採取し、前記ＰＣＲ反応容器に必要量滴下し、上述のとおりサーマルサイクリングを行うことで、ＰＣＲ反応容器内でＰＣＲ反応が進行し、標的核酸が検体中に存在していれば、標的核酸の増幅が行われる。
ＰＣＲ反応用固体組成物に含まれるＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対は上述のとおりである。またＰＣＲ反応用固体組成物についても上述のとおりである。
ＰＣＲ反応容器は、標的核酸の種類の数、ＰＣＲ反応用固体組成物に含まれるＰＣＲプライマー対の種類の数によって、適宜、設定される。
また上記ＰＣＲ反応容器は、上述のＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むＰＣＲ反応用固体組成物を含んでいてもよい。検体の量を削減できるという観点から、複数のＰＣＲプライマー対、および／または２種以上の蛍光色素を含有するＰＣＲ反応用固体組成物を用いることが好ましい。
上記検査用キットにより得られたＰＣＲ産物は、電気泳動法、熱融解曲線による検出、蛍光検出等の分析方法に供され、分析される。
上記検体採取容器、ＰＣＲ反応液容器、ＰＣＲ反応コントロール容器およびＰＣＲ反応容器は材質、形状、容量等が互いに異なっていてもよいし、同じでもよい。材質については取り扱いが簡便で耐薬品性に優れる材質が好ましい。また視認性に優れる材質が好ましい。これら材質の例としては、ガラス、ポリプロピレン等が挙げられる。
形状、容量等は例えば、取り扱いの観点からすべて同じであることが好ましいが、色彩、符号、番号等により各容器を識別できるようしておくことが検体や各混合物の添加漏れ等のヒューマンエラーを抑制する観点から好ましい。
各容器に使用されるものとしては、複数のチューブを連結したチューブストリップが挙げられ、ウェルが連結されたチューブストリップが好ましい。数は通常、２から１２、好ましくは２から１０、より好ましくは２から８である。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
〔９７例の感染性ぶどう膜炎陽性検体の分析〕
感染性ぶどう膜炎が疑われる９７例の患者から得られた検体の前房水または硝子体２０μＬを、陽性コントロール核酸としてＴＢＰを含む検体採取容器に採取し、検体混合物を得た。得られた検体混合物をＰＣＲ反応容器内で、１８０μＬのＰＣＲ緩衝液と混合し緩衝液混合物を得た。混合後のＰＣＲ緩衝液の組成は、０.０５％（w/v）非イオン性界面活性剤、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ ＫＣｌおよびそれぞれ２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）であった。得られた緩衝液混合物２０μＬを、陽性コントロール核酸としてＧＡＰＤＨ、ＰＣＲ反応コントロール核酸としてＴＢＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応コントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器、および下記のＰＣＲプライマー対とＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた各ＰＣＲ反応容器に分注した。ＰＣＲ反応コントロール固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物は、さらに各容器に異なるＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。
ＰＣＲ反応容器内のＰＣＲプライマー対の組み合わせは以下のとおりとした。
（ｉ）ＨＳＶ-１検出用プライマー対およびＶＺＶ検出用プライマー対
（ｉｉ）ＨＳＶ-２検出用プライマー対およびＨＨＶ-６検出用プライマー対
（ｉｉｉ）ＥＢＶ検出用プライマー対およびＣＭＶ検出用プライマー対
（ｉｖ）ＨＴＬＶ-１検出用プライマー対および梅毒トレポネーマ検出用プライマー対
（ｖ）トキソプラズマ検出用プライマー対
緩衝液混合物により溶解したＰＣＲ反応コントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物を含む各容器は、リアルタイムＰＣＲ装置（Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real-Time PCR装置）を用いて、加水分解プローブ法によりＰＣＲ反応をモニターした。ＰＣＲ条件として、９５℃／１０秒間の初期変性を行い、次いで９５℃／５秒間－６０℃／２０秒間のＰＣＲを４５サイクル行った。標的核酸である病原微生物の存在（陽性）または非存在（陰性）は、Ｃｑ値（増幅曲線が閾値線（Threshold Line）と交差するサイクル数）を基に判断した。また、対照として、各検体よりＤＮＡを精製した後、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法によってコピー数を定量した。
本発明の方法により測定した病原体について、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法と比較した結果を図２に示す。また、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法による定量値と本発明の方法により測定したＣｑ値との相関を図３に示す。
図２の結果より、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法で定量することのできた９７例の陽性検体は、本発明の方法を用いて測定した場合でもすべて陽性であった。また、図３の結果より、定量値とＣｑ値の間に相関性があることが示された。図３の結果より、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＨＴＬＶ－１、ＥＢＶ、梅毒トレポネーマおよびトキソプラズマが同定されていることが示された。また、図３の結果より、定量値とＣｑ値の間に相関性があることが示された。
〔非感染性ぶどう膜炎と診断された検体の分析〕
非感染性ぶどう膜炎と診断された患者から得られた５２例の検体について、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法および本発明の方法により測定した結果を図４に示す。リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法ではすべての検体において陰性であったが、本発明の方法においてもすべて陰性であった。すなわち、両法から得られる測定結果は一致することが示された。
［態様］
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
［１］下記（１）から（５）の工程を含む標的核酸の検査方法。
（１）標的核酸を含む検体と陽性コントロール核酸を混合し前記検体と陽性コントロール核酸の検体混合物を得る工程（１）
（２）前記検体混合物を、界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液と混合し緩衝液混合物を得る工程（２）
（３）前記緩衝混合物の一部をＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物に添加する工程（３）
（４）前記緩衝混合物の一部をＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加する工程（４）
（５）前記工程（３）および（４）の結果生成したＰＣＲ産物を検出する工程（５）
上記［１］の発明によれば、標的核酸を含む微量の検体（例えば前房水）であっても、複数の病原体を、同時に、かつ迅速に検出することができる。さらに上記［１］の発明によれば、簡便な検出工程で、病原体の検出操作におけるヒューマンエラーを回避し、特に偽陽性の頻度を低減することのできる検出方法を提供することができる。
［２］前記検体が、前房水または硝子体である、上記［１］に記載の方法。
［３］前記検体の量が、１２～２０μＬである、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記検体が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ-１）および２型（ＨＳＶ-２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ-６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ-１）、梅毒トレポネーマおよびトキソプラズマからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む上記［１］から［３］のいずれか１項に記載の方法。
上記［２］から［４］の発明によれば、感染性ぶどう膜炎の原因となる病原体を同時に、かつ迅速に検出することができる。
［５］前記工程（１）において、陽性コントロール核酸がハウスキーピング遺伝子である上記［１］から［４］のいずれか１に記載の方法。
［６］前記工程（１）において、陽性コントロール核酸がTATA-binding protein（ＴＢＰ）である上記［５］に記載の方法。
上記発明［５］および［６］の発明によれば、ＰＣＲプライマー対が目的どおりの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われていること、および、標的核酸用プローブが目的どおりの機能を果たしていることをより確実に確認することができる。
［７］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、前記［１］から［６］のいずれか１に記載の方法。
［８］ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、前記［１］から［７］のいずれか１に記載の方法。
［９］ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、前記［１］から［８］のいずれか１に記載の方法。
上記［７］から［９］の発明によれば、標的核酸の溶解がより容易となり、検体の使用量をより低減することができる。
［１０］前記工程（３）において陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸の少なくともいずれか一方がハウスキーピング遺伝子である前記［１］から［９］のいずれか１に記載の方法。
［１１］前記工程（３）において陽性コントロール核酸が前記工程（１）の陽性コントロール核酸と同じである前記［１］から［１０］のいずれか１に記載の方法。
［１２］前記工程（３）において陽性コントロール核酸がＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＴ）、ＰＣＲ反応コントロール核酸がｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）である前記［１］から［１１］のいずれか１に記載の方法。
前記［１０］から［１２］の発明によれば、ＰＣＲプライマー対が目的どおりの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われていること、および、標的核酸用プローブが目的どおりの機能を果たしていることをさらに確実に確認することができる。
［１３］ＰＣＲプライマー対が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ-１）もしくは２型（ＨＳＶ-２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ-６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ-１）、梅毒トレポネーマまたはトキソプラズマを検出するためのＰＣＲプライマー対である、前記［１］から［１２］のいずれか１に記載の方法。
［１４］２種のＰＣＲプライマー対が、以下の組み合わせである、前記［１］から［１３］のいずれか１に記載の方法。
（ｉ）ＨＳＶ-１検出用プライマー対およびＶＺＶ検出用プライマー対
（ｉｉ）ＨＳＶ-２検出用プライマー対およびＨＨＶ-６検出用プライマー対
（ｉｉｉ）ＥＢＶ検出用プライマー対およびＣＭＶ検出用プライマー対
（ｖｉ）ＨＴＬＶ-１検出用プライマー対および梅毒トレポネーマ検出用プライマー対
前記発明［１３］および［１４］によれば、感染性ぶどう膜炎の原因となる病原体を同時に、かつ迅速に検出することができる。
［１５］前記工程（３）および（４）において、ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、前記［１］から［１４］のいずれか１に記載の方法。
［１６］前記蛍光色素が、ＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＲＯＸ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ系色素）およびＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記［１５］に記載の方法。
前記発明［１５］および［１６］によれば、より検出精度の高い結果が得られる。
［１７］前記工程（３）および（４）において、ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、凍結乾燥により調製された、前記［１］から［１６］のいずれか１に記載の方法。
上記発明［１７］によれば、標的核酸の検査の操作が簡便なものとなり、また使用する前の保管も簡易なものとなる。
［１８］前記工程（３）において、ＰＣＲ産物の検出が、リアルタイム測定によって行われる、前記［１］から［１７］のいずれか1に記載の方法。
前記発明［１８］によれば、標的核酸の検出が迅速となる。
［１９］下記（１）から（４）を含む標的核酸の検査用キット。
（１）陽性コントロール核酸を備えた検体採取容器
（２）界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液を備えたＰＣＲ反応液容器
（３）ＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた少なくとも１以上のＰＣＲ反応容器
上記発明［１９］によれば、標的核酸を含む微量の検体（例えば前房水）であっても、複数の病原体を、同時に、かつ迅速に検出することができる標的核酸の検査を実行する検査キットを提供することができる。さらに上記［１９］の発明によれば、簡便な検出工程で、病原体の検出操作におけるヒューマンエラーを回避し、特に偽陽性の頻度を低減することのできる検出方法を実行することができる検査用キットを提供することができる。
［２０］前記検体採取容器に含まれる陽性コントロール核酸がハウスキーピング遺伝子である前記［１９］に記載の検査用キット。
［２１］前記検体採取容器に含まれる陽性コントロール核酸がTATA-binding protein（ＴＢＰ）である前記［１９］または［２０］に記載の検査用キット。
前記［２０］および［２１］の発明によれば、ＰＣＲプライマー対が目的どおりの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われ、標的核酸用プローブが目的どおりの機能を果たす検査キットを提供することができる。
［２２］前記界面活性剤が、非イオン界面活性剤である、前記［１９］に記載の検査用キット。
［２３］前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、前記［１９］から［２２］のいずれか１に記載の検査用キット。
［２４］前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、前記［１９］から［２３］のいずれか１に記載の検査用キット。
上記［２２］から［２４］の発明の検査用キットを用いれば、標的核酸の溶解がより容易となり、検体の使用量をより低減することができる。
［２５］前記ＰＣＲ反応コントロール容器に含まれる陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸のすくなくともいずれか一方がハウスキーピング遺伝子である前記［１９］から［２４］のいずれか１に記載の検査用キット。
［２６］前記ＰＣＲ反応コントロール容器に含まれる陽性コントロール核酸が前記検体採取容器に含まれる陽性コントロール核酸と同じである前記［１９］から［２５］のいずれか１に記載の検査用キット。
［２７］前記ＰＣＲ反応コントロールに含まれる陽性コントロール核酸がＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＴ）、ＰＣＲ反応コントロール核酸がｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）である前記［１９］から［２６］のいずれか１に記載の検査用キット。
前記［２５］から［２７］の発明による検査用キットを用いることで、ＰＣＲプライマー対が目的どおりの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われていること、および、標的核酸用プローブが目的どおりの機能を果たしていることをさらに確実に確認することができる。
［２８］前記ＰＣＲ反応容器を２から１２含む、前記［１９］から［２７］のいずれか１に記載の検査用キット。
前記［２８］の発明の検査用キットを用いることで複数の標的核酸を同時に、かつ迅速に検査することができる。
［２９］前記ＰＣＲプライマー対が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ-１）もしくは２型（ＨＳＶ-２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ-６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ-１）、梅毒トレポネーマまたはトキソプラズマを検出するためのＰＣＲプライマー対である、前記［１９］から［２８］のいずれか１に記載の検査用キット。
［３０］前記各チューブに含まれる２種のＰＣＲプライマー対が、以下の組み合わせである、前記［１９］から［２９］のいずれか１に記載の検査用キット。
（ｉ）ＨＳＶ-１検出用プライマー対およびＶＺＶ検出用プライマー対
（ｉｉ）ＨＳＶ-２検出用プライマー対およびＨＨＶ-６検出用プライマー対
（ｉｉｉ）ＥＢＶ検出用プライマー対およびＣＭＶ検出用プライマー対
（ｖｉ）ＨＴＬＶ-１検出用プライマー対および梅毒トレポネーマ検出用プライマー対
前記発明［２９］および［３０］の検査用キットを用いれば、感染性ぶどう膜炎の原因となる病原体を同時に、かつ迅速に検出することができる。
［３１］前記ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、前記［１９］から［３０］のいずれか１に記載の検査用キット。
［３２］前記蛍光色素が、ＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＲＯＸ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ系色素）およびＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）からなる群より選ばれる、前記［３１］に記載の検査用キット。
前記発明［３１］および［３２］の検査用キットを用いれば、より検出精度の高い結果が得られる。
［３３］前記ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、凍結乾燥により調製された、前記［１９］から［３２］のいずれか１に記載のキット。
上記発明［３３］の検査用キットは、標的核酸の検査の操作が簡便なものとなり、また使用する前の保管も簡易なものとなる。

Claims (33)

  1. 下記（１）から（５）の工程を含む標的核酸の検査方法。
    （１）標的核酸を含む検体と陽性コントロール核酸を混合し前記検体と陽性コントロール核酸の検体混合物を得る工程（１）
    （２）前記検体混合物を、界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液と混合し緩衝液混合物を得る工程（２）
    （３）前記緩衝混合物の一部をＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物に添加する工程（３）
    （４）前記緩衝混合物の一部をＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加する工程（４）
    （５）前記工程（３）および（４）の結果生成したＰＣＲ産物を検出する工程（５）
  2. 前記検体が、前房水または硝子体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記検体の量が、１２～２０μＬである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記検体が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）および２型（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ－６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、梅毒トレポネーマおよびトキソプラズマからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記工程（１）において、陽性コントロール核酸がハウスキーピング遺伝子である請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記工程（１）において、陽性コントロール核酸がＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）である請求項５に記載の方法。
  7. 前記工程（２）において、界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記工程（２）において、ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記工程（２）において、ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記工程（３）において陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸の少なくともいずれか一方がハウスキーピング遺伝子である請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記工程（３）において陽性コントロール核酸が前記工程（１）の陽性コントロール核酸と同じである請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記工程（３）において陽性コントロール核酸がＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＴ）、ＰＣＲ反応コントロール核酸がｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）である請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記工程（４）において、ＰＣＲプライマー対が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）もしくは２型（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ－６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、梅毒トレポネーマまたはトキソプラズマを検出するためのＰＣＲプライマー対である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記工程（４）において、２種のＰＣＲプライマー対が、以下の組み合わせである、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
    （ｉ）ＨＳＶ－１検出用プライマー対およびＶＺＶ検出用プライマー対
    （ｉｉ）ＨＳＶ－２検出用プライマー対およびＨＨＶ－６検出用プライマー対
    （ｉｉｉ）ＥＢＶ検出用プライマー対およびＣＭＶ検出用プライマー対
    （ｖｉ）ＨＴＬＶ－１検出用プライマー対および梅毒トレポネーマ検出用プライマー対
  15. 前記工程（３）および工程（４）において、ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記蛍光色素が、ＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＲＯＸ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ系色素）およびＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記工程（３）および（４）において、ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、凍結乾燥により調製された、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記工程（３）において、ＰＣＲ産物の検出が、リアルタイム測定によって行われる、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 下記（１）から（４）を含む標的核酸の検査用キット。
    （１）陽性コントロール核酸を備えた検体採取容器
    （２）界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液を備えたＰＣＲ反応液容器
    （３）ＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器
    （４）ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた少なくとも１以上のＰＣＲ反応容器
  20. 前記検体採取容器に含まれる陽性コントロール核酸がハウスキーピング遺伝子である請求項１９に記載の検査用キット。
  21. 前記検体採取容器に含まれる陽性コントロール核酸がＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）である請求項１９または２０に記載の検査用キット。
  22. 前記界面活性剤が、非イオン界面活性剤である、請求項１９に記載の検査用キット。
  23. 前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の検査用キット。
  24. 前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、請求項１９から２３のいずれか１項に記載の検査用キット。
  25. 前記ＰＣＲ反応コントロール容器に含まれる陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸のすくなくともいずれか一方がハウスキーピング遺伝子である請求項１９から２４のいずれか１項に記載の検査用キット。
  26. 前記ＰＣＲ反応コントロール容器に含まれる陽性コントロール核酸が前記検体採取容器に含まれる陽性コントロール核酸と同じである請求項１９から２５のいずれか１項に記載の検査用キット。
  27. 前記ＰＣＲ反応コントロールに含まれる陽性コントロール核酸がＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＴ）、ＰＣＲ反応コントロール核酸がｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）である請求項１９から２６のいずれか１項に記載の検査用キット。
  28. 前記ＰＣＲ反応容器を２から１２含む、請求項１９から２７のいずれか１項に記載の検査用キット。
  29. 前記ＰＣＲプライマー対が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）もしくは２型（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ－６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、梅毒トレポネーマまたはトキソプラズマを検出するためのＰＣＲプライマー対である、請求項１９から２８のいずれか１項に記載の検査用キット。
  30. 前記各ＰＣＲ反応容器に含まれる２種のＰＣＲプライマー対が、以下の組み合わせである、請求項１９から２９のいずれか１項に記載の検査用キット。
    （ｉ）ＨＳＶ－１検出用プライマー対およびＶＺＶ検出用プライマー対
    （ｉｉ）ＨＳＶ－２検出用プライマー対およびＨＨＶ－６検出用プライマー対
    （ｉｉｉ）ＥＢＶ検出用プライマー対およびＣＭＶ検出用プライマー対
    （ｖｉ）ＨＴＬＶ－１検出用プライマー対および梅毒トレポネーマ検出用プライマー対
  31. 前記ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１９から３０のいずれか１項に記載の検査用キット。
  32. 前記蛍光色素が、ＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＲＯＸ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ系色素）およびＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）からなる群より選ばれる、請求項３１に記載の検査用キット。
  33. 前記ＰＣＲコントロール用固体組成物およびＰＣＲ反応用固体組成物が、凍結乾燥により調製された、請求項１９から３２のいずれか１項に記載の検査用キット。
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