JP7385471B2 - Phi6内部対照組成物、装置、および方法 - Google Patents
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- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Description
(a)試料分注品(aliquot)を受け入れるように作られた試料導入口。
(b)上記の実施形態のいずれか1種の組成物を含む内部対照区画。および、
(c)試薬調製、標的の濃縮、阻害物質の除去、核酸抽出、逆転写、増幅、およびリアルタイム検出を含む前記核酸分析の1つ以上の工程をそれぞれ実行するように構成された1つ以上の追加区画を備えた核酸分析領域。
(a)10mMトリス、pH8.0、0.1mMEDTA、0.05%アジ化ナトリウム、および25mg/mlBSA中に、最大4×105cp/mlのPhi6を含み、または、
(b)10mMトリス、pH8.0、0.1mMEDTA、0.05%アジ化ナトリウム、および1%ゼラチン中に、4×105cp/mlのPhi6を含み、または、
(c)10mMトリス、pH8.0、0.1mMEDTA、0.05%アジ化ナトリウム、および20mg/lポリrA‐RNA中に、最大4×105cp/mlのPhi6を含み、または、
(d)10mMトリス、pH8.0、0.1mMEDTA、0.05%アジ化ナトリウム、20mg/lポリrA‐RNA、および40%グリセロール中に、最大4×105cp/mlのPhi6を含む、
ことが提供される。
本明細書中で他に定義しない限り、本明細書中で使用する科学的・技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。 冠詞「1つ(a)」および「1つ(an)」は、本明細書では冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用する。例として、「1つの要素」は1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
バクテリオファージΦ6(Phi6)は、分節ゲノムおよびエンベロープを有する2本鎖RNAウイルスである。aRNAのような1本鎖RNAゲノムとは異なり、Phi6はタンパク質キャプシドと脂質膜の2層の保護層を有する。これを図1に示す。
表1は、適切なPhi6製剤の非限定的な例を提示する。
本明細書に記載の対照材料は、任意の手動の増幅分析法、または自動化された核酸増幅システムもしくは試料調製システムで使用できる。一実施形態では、対照材料は、限定されないが、the cobas(登録商標) 6800/8800 System、the cobas(登録商標) 4800 System、the cobas(登録商標) AmpliPrep Instrument、the cobas(登録商標) LIAT(登録商標) System、the cobas(登録商標) p630 Instrument、the cobas(登録商標) s201 System、the cobas(登録商標) TaqMan(登録商標) 48 Analyzer、the cobas(登録商標) TaqMan(登録商標) Analyzer、the LightCycler(登録商標) 1536 System、the LightCycler(登録商標) 2.0 System、the LightCycler(登録商標) 480 System、the LightCycler(登録商標) 96 System、the MagNA Pure 96 System、the MagNA Pure Compact System、the MagNA Pure LC 2.0 System、または、the FLOW Solution (例として、www.molecular.roche.com/systemsを参照)を含む、任意の適切な市販のPCR機器および/または試料調製システムで使用できる。
実施形態によっては、本明細書に記載の組成物は、キット(用具一式)またはその構成要素に含まれる。本明細書中で意図するキットは、本明細書中に記載されるような標的核酸配列を特異的に増幅、捕捉、標識化/変換または検出するための少なくとも1つの装置を含む任意の製品(例えば、包装物または容器)を含み、本明細書に記載の組成物は、装置に含まれるか、または別個のキット構成要素、バイアルまたは容器として提供される。さらに、キットは取扱説明書、補充試薬、対照材料、および/または本明細書に記載の増幅方法またはその工程で使用される構成要素または部品を含むことができる。1つ以上のキット構成要素を別個の構成要素、例えば一緒に包装された別個のバイアルまたは容器としてキットに含めることができ、または1つ以上のキット構成要素を同じバイアルまたは容器内のキットに含めることができる。
本明細書に記載の組成物は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、西ナイルウイルス(WNV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、インフルエンザウイルス、ノロウイルスなどを含むがこれらに限定されない任意のウイルス病原体を分析するために使用できる。また、組成物は他の形態のRNA、例えば、非ウイルス性生物(例えば、ヒト、細菌など)由来のmRNAまたはmiRNAを検出するためにも使用できる。特定の実施形態では、組成物を使用して、HIV‐1およびHIV‐2を含むHIVの任意の病原性株、ならびにその任意の群または亜型、ならびに肝炎またはサイトメガロウイルスを検出できる。例えば、組成物はHIV‐1のM群、N群、O群、P群、およびそれらの組み合わせを分析する分析法に使用できる。特定の例では、組成物はHIV‐1のM群および/またはO群、および任意に選択される1種または複数のさらなるHIV‐1の群を分析するために使用される。これらの組成物は、亜型A、A1、A2、CRF19、B、C、D、F、G、CRF02_AG、H、CRF04_cpx、J、K、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないHIV‐1の1種以上の亜型を分析するためにも使用できる。 さらに、この方法はHIV‐2、A~H群、特にHIV‐2A群およびB群の検出にも使用できる。さらに、A型、B型またはC型を含むがこれらに限定されない肝炎も本明細書に記載の組成物を使用して分析でき、特にB型またはC型肝炎を本明細書に記載の組成物を使用して分析できる。
(試料処理装置における全血からのウイルスRNAの単離および検出)
RNAの単離および配列検出は、可剥性シールで分割され、かつ事前に充填された試薬を含む9つの区画を有する可撓性装置と、その中に収納された廃液保存容器を有する蓋を含む管1(図2)で達成される。装置の1つの区画または小区分から他所への流体の流れは、装置の1つ以上の区画または小区分内に動作可能に接続した1つ以上の駆動装置および保持器具が選択的に係合することで本明細書に記載のように制御される。装置の第1区画は全血試料を受け入れることができる。装置の追加的な区画は以下の構成要素を以下の順序で含む。
(1)試料分解。第1の保持器具を除く全ての保持器具は装置上で閉められている。第1区画と動作可能に接続した駆動装置を用いて血液量を区画内で約100μlに保持するように調整した後、関連する区画の保持器具を用いて第1区画を閉じる。第2区画と動作可能に接続した駆動装置は、全体的または部分的に、第2区画の第1小区分を圧縮して可剥性シールを破り、対照材料と試料を混合する。第1小区分と動作可能に接続した駆動装置は、小区分を交互に圧縮して対照材料と試料を混合することができる。その区画/小区分内の関連する駆動装置および保持器具を係合させることで、試料は第3区画に移動し、試料が下流の試料と混合するのを防ぐために保持器具が第3区画の上で閉められ、次に第4区画に移動して試料と分解緩衝液を混合する。第3区画と第4区画の混合物を50℃で2分間培養する。
(2)核酸の捕捉。分解培養後、駆動装置はそれらが対応する区画を交互に圧縮し、混合物を室温で2分間攪拌および培養し、DNAが粒子に結合するのを促進する。次に、区画に近い磁気源により磁場を発生させ、懸濁溶液中の粒子を捕捉する。駆動装置は、区画を交互に圧縮して粒子を捕獲することができる。駆動装置および保持器具は連続的に開閉され、未結合の試料および廃液を廃液保存容器に移動させる。
(3)洗浄。捕捉工程に続き、洗浄工程を行うことで、粒子および今後試料処理に用いる区画から残留組織片および反応抑制剤を除去する。希釈を利用した洗浄をエタノール洗浄緩衝液で行い、薄層流を利用した洗浄をMES洗浄緩衝液で行う。最初に保持器具と駆動装置が開き、次に駆動装置が閉じてエタノール緩衝液が第5区画に移動し、保持器具を閉める。磁場を止め、駆動装置および少なくとも1つの隣接する駆動装置でそれらの対応する区画を交互に圧縮し、粒子を再懸濁する流れを生成する。次に磁場を発生させ、実質的に全ての粒子を捕捉し、液体を廃液保存容器に移動する。最初の洗浄が完了した後、MES洗浄緩衝液をある区画から別の区画に移動させ、対応する駆動装置および保持器具を順次稼働および開放して緩衝液を操作し、流路を通る洗浄緩衝液が実質的に層流になるようにする。洗浄が完了すると、駆動装置および保持器具が閉じられ、実質的に全ての廃液が廃液保存容器に移動する。
(4)核酸の溶出。溶出緩衝液は、前述と同様の手順で第7区画から移動する。磁場を切り、粒子を第4区画と第5区画の間の流れによって溶出緩衝液中に再懸濁する。粒子懸濁液を定常流または撹拌条件のもと95℃・2分間培養する。磁場を発生させ、実質的に全ての粒子を固定化し、溶出した核酸溶液を稼働装置および保持器具を順次開閉して第7区画に移動させる。駆動装置で第7区画を圧縮し、溶出した核酸溶液の容量を40μlに調整し、次いで保持器具を装置に対して閉じてDNA抽出工程を完了することができる。
(5)核酸の増幅および検出。次いで、核酸溶液を第8区画に移動させ、37℃で1分間UNG280と共に混合および培養し、生物試料中に存在する可能性がある、あらゆる混入PCR産物を分解する。培養後、温度を95℃に上げて核酸およびUNGを2分間変性させる。次に、核酸溶液を第9区画に移し、RT‐PCR試薬と65℃で10分間混合した後、60℃で培養してホットスタートPCRを開始する。95℃で2秒間、および60℃で15秒間を50回繰り返す典型的な2温度増幅分析は、第8区画を95℃、第9区画を60℃に設定し、関連する駆動装置を開閉して反応混合液を区画間で交互に移動させることで実施できる。95℃で2秒間、60℃で10秒間、および72℃で10秒間を50回繰り返す典型的な3温度増幅分析は、第7区画を95℃、第8区画を72℃、および第9区画を60℃に設定し、関連する駆動装置を開閉して反応混合液を区画間で交互に移動させることで実施できる。第9室に光学的に接続した光度計などの検出素子は、レポーター色素に由来するリアルタイムの蛍光発光を装置壁の一部を通して監視できる。分析完了後、試験結果が報告される。
(LightCycler 480を用いた試料中のウイルスRNAの単離および検出)
HIV‐1M (50000cp/ml、Roche)の試料を、LightCycler 480 (Roche Molecular Systems)を用いて分析する。試料調製のため、以下の試薬、ReservCyt(Thin Prepから入手可能)、K3 EDTA Plasma、およびPCR neg.(Rocheから入手可能)を希釈剤として使用する。
(外装RNAの熱安定性の評価)
外装RNA(aRNA)の熱安定性を試験するため、さまざまなロットのpEF070 aRNAについて耐性試験を実施した(以下のロット、PD6701、RD4675、RD4676、およびSV6610を試験した)。所定の濃度で各ロットを分注したものを、ある範囲の温度(4~45℃)で長期間保管した。結果を図3に示す。0日目は4つのロットすべてのCtが約32.5を示し、時間経過および高い温度で、測定可能なCtは急速に低下し、45℃・4週間で試験した4つのロットのうち3つで完全に失われた。
(Phi6組成物の熱安定性の評価)
Phi6の熱安定性を試験するため、異なる緩衝液中の精製Phi6の培養物について耐性試験を実施した。簡単に説明すると、完全に処理を制御した所定濃度の分注品を、ある範囲の温度(4~45℃)で長期間保存し、性能(複製数の維持)について評価した。性能はqPCRにおけるCtおよび振幅測定で測定した。
Claims (13)
- キレート剤および保存剤を含み、pH7~9で核酸増幅反応に適した緩衝液に懸濁された未改変Phi6バクテリオファージを含む内部対照として使用するための組成物であって、前記未改変Phi6バクテリオファージが、1000~1,000,000コピー/mlの濃度で存在する、前記組成物。
- 前記緩衝液が、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリシン緩衝液、PIPES、またはHEPESから選択される、請求項1に記載の組成物。
- BSA、ゼラチン、ポリrA‐RNA、グリセロール、アミノ酸、トレハロース、カゼイン、またはポリエチレングリコールを含む群から選択される1種以上の追加の成分をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記未改変Phi6バクテリオファージが最大4×105cp/mlの濃度で存在する、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記キレート剤がEDTAおよびEGTAから選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記保存剤が、アジ化ナトリウムおよびプロクリン300から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- (a)10mMのトリス、pH8.0、0.1mMのEDTA、0.05%のアジ化ナトリウム、25mg/mlのBSA、およびそれらに含まれる最大4×105cp/mlの未改変Phi6バクテリオファージ、または、
(b)10mMのトリス、pH8.0、0.1mMのEDTA、0.05%のアジ化ナトリウム、1%のゼラチン、およびそれらに含まれる最大4×105cp/mlの未改変Phi6バクテリオファージ、または、
(c)10mMのトリス、pH 8.0、0.1 mMのEDTA、0.05%のアジ化ナトリウム、および20mg/lのポリrA‐RNA、およびそれらに含まれる最大4×105cp/mlの未改変Phi6バクテリオファージ、または、
(d)10mMのトリス、pH8.0、0.1mMのEDTA、0.05%のアジ化ナトリウム、20mg/lのポリrA‐RNA、40%のグリセロール、およびそれらに含まれる最大4×105cp/mlの未改変Phi6バクテリオファージ
を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。 - 0日目と、45℃で最大28日間経過後とのΔCtが5~7以下である、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 0日目と、1回以上の凍結融解サイクル後とのΔCtが5~7以下である、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。
- ‐ 少なくとも1つの増幅可能な標的核酸配列を含む核酸試料を提供し、
‐ 前記核酸試料を請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、かつ
‐ 増幅反応を開始できる酵素を用いて前記標的核酸配列を増幅すること
を含み、ここで未改変Phi6バクテリオファージ由来の未改変Phi6RNAが、定性及び/又は定量的核酸検出において、RNA標準として逆転写され、及び/又は増幅される、核酸増幅法。 - 前記核酸試料がRNAであり、また、
‐ 逆転写を開始できる酵素を用いて前記標的核酸配列を逆転写すること、
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 前記標的核酸配列を逆転写および増幅することが、逆転写および/または増幅反応を開始できる複数種の酵素の組み合わせを用いて、または逆転写および増幅反応を開始できる酵素を用いて実施される、請求項11の方法。
- (a)試料分注品を受け入れるように作られた試料導入口、
(b)請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物を含む内部対照区画、および、
(c)試薬調製、標的の濃縮、阻害物質の除去、核酸抽出、逆転写、増幅、およびリアルタイム検出を含む核酸分析の1つ以上の工程をそれぞれ実行するように構成された、1つ以上の追加区画を備えた核酸分析領域、
を備える、試料中の核酸分析を実施するように構成された装置。
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