JP2002514905A - リボヌクレアーゼ耐性ｒｎａの調製および利用 - Google Patents

リボヌクレアーゼ耐性ｒｎａの調製および利用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般にはヌクレアーゼ耐性核酸に関し、そして詳細にはリボヌクレアーゼ耐性RNAに関する。このような核酸を作製する方法および使用する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 リボヌクレアーゼ耐性RNAの調製および利用 発明の背景 本出願は、1996年７月３日に提出した同時係属中の出願番号第08/675,153号の 一部継続出願であり、そして1996年７月３日に提出した同時係属中の仮出願番号 第60/021,145号の一部継続出願である。 最近の数年において、診断アッセイおよび特定のmRNA種のアッセイが、特定の 核酸配列の検出に基づいて開発されている。これらのアッセイは、RT-PCRTM（Mu lder，1994）、等温層増幅(NASBA)(Van Gemen，1994)および分枝鎖DNA（Pachl， 1995）のような技術に依存する。これらのアッセイの多くは、特定のRNA種の絶 対濃度を決定するために適合されている。これらの絶対的定量アッセイは、その 正確な量が以前に決定されているRNA標準の使用を必要とする。これらのRNA標準 は、通常、インビトロ転写によって合成されるか、または感染性の因子それ自体 である。RNAは、精製され、次いでいくつかの異なる方法（例えば、OD260での吸 光度、ホスフェート分析、過度色素沈着(hyperchromicity)またはアイソトープ トレーサー分析）によって定量される（Collins，1995）。 血漿中のウイルスRNA配列を定量することは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、 Ｃ型肘炎ウイルス（HCV）、および他のウイルス（例えば、HTLV-1、HTLV-2、Ｇ 型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、デング熱ウイルス、および狂犬病ウイルス ）を有する患者におけるウイルス負荷を評価するための重要な手段である。ウイ ルス負荷は、ある時間点での所定の患者内のウイルス粒子の総量の尺度である。 慢性感染において、ウイルス負荷は、ウイルス複製および免疫媒介性の宿主除去 の高度な動的平衡の関数である。ウイルス負荷を決定することの利点は、１）診 断の時間のウイルス複製の程度を評価する能力−予後暗示を含む推定、２）疾患 過程における初期の抗ウイルス薬剤の効果をモニターする能力、および３）変化 する抗ウイルス薬剤の効果を迅速に評価する能力を含む。 現在、血漿におけるHIV定量に利用可能な最も感度の高い方法は、PCRTMを使用 する。HIVのPCRTM分析には、４つの主要な工程が含まれる：１）サンプル調製、 ２）逆転写、３）増幅、および４）検出。これらの工程のいずれにおける可変性 もが最終結果に影響する。正確な定量アッセイは、各工程が、変化に対して強固 に制御されることを必要とする。より厳密なPCRTMアッセイ形式において、裸のR NA標準は、血漿からのウイルスRNAの単離の直前に変性剤に添加される（Mulder ，1994）。あまり正確でない方法は、ウイルスRNAを精製した後にウイルスRNAに 標準を添加することである（Piatak，1993）。RNA標準が、正確に較正され、そ してアッセイの手順の厳密さに耐えることが重要である。 リポヌクレオアーゼ耐性のRNA標準について必要性が存在する。RNAは、環境性 のリポヌクレアーゼに対して感受性である。リボヌクレアーゼ非含有試薬を産生 することは重要である。裸のRNAを定量の標準として使用することにおける危険 は、リボヌクレアーゼ消化に対する感受性である。汚染された標準は、不正確な 値を産生する。この問題は、職員が通常、RNA取り扱いにおいて訓練されていな い臨床研究室環境においてより深刻になり得る。これらの因子は、産生されるデ ータの正当性について疑いを誘導する。 裸のRNA標準は、リボヌクレアーゼ消化に非常に感受性である。いくつかのRNA ベースアッセイは、使用者が一度だけRNA標準チューブに接近し、次いでリボヌ クレアーゼでRNA標準を汚染する可能性を最小化するためにそれを廃棄するよう に構成されている。しかし、標準は、リボヌクレアーゼフリーであることが保証 されていない微量遠心管に分注されて、別の潜在的な汚染の供給源を導入する。 同様に、RNAが、変性溶液に入れられる前にピペットチップに曝される短い時間 が存在する。ピペットチップがリボヌクレアーゼで汚染されている場合、RNA標 準は分解され、アッセイは損なわれる。裸のRNA標準を使用する別の欠点は、そ れらが凍結保存されねばらならないことである。Chiron Corp.によって構成され る分枝DNA HIVアッセイにおいては、RNA分解の可能性が非常に危険であるので、 それらのアッセイは標準としてRNAの代わりに一本鎖DNAを含む（Pachl，1995） 。DNAは、RNAに対して較正される。DNA標準はより分解されにくいようである。 従って、リボヌクレアーゼに耐性であり、そして標準の完全性に関して疑いがな いRNA標準の必要性が存在する。これらの標準はまた、凍結保存の必要がない場 合 には解凍が必要なく、すぐに使用され得るのでより簡便である。 RNAの化学変化を引き起こす方法は、当業者に公知である。このような変化は 、RNAへの取り込みの前にヌクレオチドに対して、またはそれが形成された後にR NAに対してなされ得る。リボース改変（Piecken 1991）およびホスフェート改変 （Black，1972）は、ヌクレアーゼの存在下でRNA安定性を増強することが示され ている。2'ヒドロキシルおよびヌクレオチド間ホスフェートの改変は、リボヌク レアーゼにより使用される分解機構に必要である化学基を変化させることによっ てヌクレアーゼ耐性を付与する（Heidenreich，1993）。このような化学改変は 、リボヌクレアーゼ耐性を付与し得るが、このようなリボヌクレアーゼ耐性構造 がRNA標準として有用であり得ることの既知の示唆は存在しない。 RNAバクテリオファージは、RNA複製および翻訳の機構を研究するためのモデル 系として長く使用されている。RNAバクテリオファージ内のRNAゲノムは、バクテ リオファージのタンパク質被覆のためにリボヌクレアーゼ消化に対して耐性であ る。バクテリオファージは、増殖および精製が簡単であり、そしてそのゲノムRN Ａは、バクテリオファージからの精製が容易である。これらのバクテリオファー ジは、血清型に基づいてサブグループに分類される。血清学的に、バクテリオフ ァージの４つのサブクラスが存在し、一方、遺伝学的には、２つの主要なサブク ラス、ＡおよびＢが存在する（Stockley，1994;Witherell，1991）。バクテリオ ファージMS2/R17（血清学的群Ｉ）は、広範に研究されている。他の十分に研究 されたRNAバクテリオファージとしては、GA(群II)、Q-β（群III)、およびSP（ 群IV）が挙げられる。RNAバクテリオファージのみがEscherichia coliの雄株（ すなわち、F'プラスミドを保有し、そして結合のためのF線毛を産生する株）に 感染する。 MS2バクテリオファージは、正二十面体構造、直径275Åであり、そして尾部ま たは任意の他の明白な表面付属物を欠失する（Stockley，1994）。このバクテリ オファージは、細菌感染の間のRNAの出口であり得る5-および3-ひだ軸（fold ax is）の両方に大きな穴を有する。MS2バクテリオファージは、バクテリオファー ジゲノムをキャプシド化する180ユニットのバクテリオファージ被覆タンパク質 （Coat Protein）（約14kDa）からなる（総説については、Stockley，1994;Wit hereli，1991を参照のこと）。MS2 RNAゲノムは、3569ヌクレオチドのセンス（ ＋）をコードする一本鎖である。遺伝子は、以下のように5'末端から組織されて いる：AプロテインのMaturase、バクテリオファージ被覆タンパク質、75アミノ 酸のLysis Protein、およびReplicaseサブユニット。Lysis遺伝子は、被覆タン パク質遺伝子およびReplicase遺伝子とオーバーラップし、そして被覆タンパク 質の＋１リーディングフレーム中で翻訳される。各々のバクテリオファージ粒子 は、F線毛との相互作用および従って細菌感染の媒介に必要とされる単一コピー のMaturaseを有する。 被覆タンパク質によるRNAゲノムのパッケージングは、バクテリオファージRep licase遺伝子の5'に位置されるRNAゲノムの特定のステム-ループ領域（Operator または「pac」部位）への被覆タンパク質ダイマーの結合によって開始される。 この結合事象は、完全なキャプシド化プロセスを引き起こすようである。Operat orの配列は、ステム-ループ構造ほどには重要ではない。Operatorは、約21ヌク レオチドからなり、そしてこれらの残基の内の２つだけが被覆タンパク質結合の ために絶対的に保存されなければならない。 ウイルスMaturaseタンパク質は、ゲノム中の最小の２つの部位でバクテリオフ ァージゲノムRNAと相互作用する（Shiba，1981）。これは、パッケージングのた めには明らかに必要とされない。しかし、バクテリオファージ粒子におけるそれ の存在は、リボヌクレアーゼ消化に対するゲノムRNAの完全性を保存するために 必要とされる（Argetsinger，1966;Heisenberg，1966）。 生存する感染性の組換えRNA（reRNA）バクテリオファージを産生する試みは、 失敗している。バクテリオファージは、異種配列の削除に非常に効率的であり、 そしてReplicaseの忠実度は、点変異が約1×10-4の割合で生じるほど低い。 PickettおよびPeabody（1993）は、非バクテリオファージRNAがMS2被覆タンパ ク質によってキャプシド化される研究を行った。彼らの明白な目標は、21ヌクレ オチドOperator（pac部位）がMS2-特異的パッケージング能力をインビボで非バ クテリオファージRNAに付与するかどうかを決定することであった。E.coliは、 ２つのプラスミドで同時形質転換された：その一方はMS2被覆タンパク質をコー ドし、そして他方はβ-ガラクトシダーゼ（lacZ）をコードする。lacZ遺伝子は 、 それの上流にクローン化されたMS2 Operator配列を有するように改変された。E. coliは、Operator-lacZハイブリッドRNAがMS2被覆タンパク質とともに同時発現 されるように誘導された。被覆タンパク質ダイマーは、Operatorに結合し、「ウ イルス様粒子」を形成するためにlacZ RNAのキャプシド化を引き起こした。ウイ ルス様粒子は、CsCl勾配によって精製された。これらのウイルス様粒子の浮遊密 度は、野生型MS2バクテリオファージの場合よりも大いに大きな密度分布を有し た。MS 2は、1.45g/ccで緊密に結束し、一方、ウイルス様粒子は、1.3〜1.45g/c cの密度の範囲であった。このことは、ウイルス様粒子のRNA含量における実質的 な不均一性を示唆する。換言すれば、PickettおよびPeabodyのウイルス様粒子は 、種々の長さのRNAおよび/または種々の種のRNAをパッケージングしたものであ った。 PickettおよびPeabodyの研究の結果は、予想される通りにはいかなかった。こ れらのウイルス様粒子から精製されたlacZ RNAは、予想される全長3000塩基とは 反して、約500塩基の主要な種に分解された。この500塩基のRNAは、高感度なNor thernブロッティング手順によってのみ検出可能であった。著者らは、分解がキ ャプシド化の前後に生じるかどうかを知らなかったが、これらのウイルス様粒子 がリボヌクレアーゼ消化に感受性であり得ることを示唆した。パッケージングさ れたRNAの大多数は、事実上２つの種、1800塩基および200塩基のサイズであった 。これらの２つのRNAフラグメントは、ゲル電気泳動およびメチレンブルー染色 の後に容易に検出された。500塩基のOperator-lacZ RNAフラグメントは、メチレ ンブルー染色によっては可視ではなかった。それは、lacZプローブを使用するNo rthernブロッティングによってのみ検出された。これらの著者は、0.2および1.8 kbRNAは、E.coliプレ16S rRNA由来であったと結論付けた。宿主E.coli RNAは、O perator-lacZ RNAに優先してパッケージングされた。このことは、Pickettおよ びPeabodyのバクテリオファージパッケージング系の特異性が低いことを示す。 他の研究において、PickettおよびPeabodyは、E.coli中で産生される被覆タン パク質およびOperator-lacZ RNAの比を変化させることによって、Operator-lac ZRNAのパッケージングを改変した。Operator-lacZ RNAの濃度を増大させること および被覆タンパク質の濃度を減少させることによって、彼らは、Operator-lac Z RNAを主にキャプシド化し得、そしてプレ16Sr RNAを検出し得ないようにした 。これらの結果は、最初のPickettおよびPeabodyのパッケージングストラテジー が特異性で苦しんでいたことを示唆した。なぜなら、彼らは、標的RNAをパッケ ージングするのに至適な被覆タンパク質対Operator-lacZ RNAの適切なモル比を 達成し、そして維持し得たからである。さらに、パッケージング研究の第２のセ ットにおいて、被覆タンパク質およびOperator-lacZ RNAの濃度は、粗く調整さ れただけであった。PickettおよびPeabodyの系は、パッケージングのための被覆 タンパク質対Operator-lacZ RNAの至適な比を維持するためのフィードバック機 構を有していなかった。 彼らのパッケージング研究の第２のセットにおいて、PickettおよびPeabodyは 、改変手順でパッケージングされたRNAを特徴付けなかった。RNAは、ウイルス様 粒子から精製されず、そして例えば、ゲル電気泳動によって評価された。さらに 、この研究または以前の研究におけるウイルス様粒子は、リボヌクレアーゼから キャプシド化されたlacZ RNAを保護する能力について特徴付けられていない。Pi ckettおよびPabody研究から得られたウイルス様粒子またはOperator-lacZ RNAの 収量に関する考察は存在しない。 現在、特定の配列のRNA種の合成に関する２つの主要な方法が存在する：化学 合成およびインビトロ転写。RNAの化学合成は、非常に純粋な産物を産生し得る が、それは両方とも高価であり、そして30塩基ほどのオリゴヌクレオチドの合成 に限定される。化学合成は、アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを作製するの に最も適切であり、これは、一般に15〜30塩基の長さである。しかし、RNAへの 適用のほとんど（例えば、プローブ合成、ならびにインビトロおよびインビボ翻 訳）は、100塩基〜数キロ塩基の範囲のより長いRNA産物を必要とする。 インビトロ転写によるRNA合成は、Meltonら(1984)によって開発されたような 実用的な方法になった。バクテリオファージSP6由来のRNAポリメラーゼは、SP6 バクテリオファージプロモーターを含有するDNAテンプレートを転写するために 使用された。次いで、プロモーター/ポリメラーゼ系は、同様にT7およびT3バク テリオファージのために開発されている。これらのインビトロ系は、バクテリオ ファージRNAポリメラーゼ、転写されるべき配列の上流のファージプロモーター をコードするDNAテンプレート、適切な緩衝液およびリボヌクレオチドを必要と する。これらの各々の成分は、一旦転写されたRNA産物の分解を防止するために 超純粋かつリボヌクレアーゼ非含有でなければならない。条件は至適化されてお り、１μgのテンプレートから100〜150μgのRNAを産生する（MEGAscript米国特 許第5,256,555号）。インビトロ転写は、長いRNA配列を合成する現在最良の方法 であるが、必要とされる大量の超純粋な酵素、ヌクレオチドおよび緩衝液に起因 する産物のグラム量に関して非常に大規模な産生には高価である。なおも、この ような大量のRNAが、一過性の遺伝子発現が所望される、例えば、ワクチン接種 または遺伝子治療において必要とされる。 RNAバクテリオファージキャプシドは、薬物送達系として作用するようにイン ビトロで組み立てられる(Synthetic Virions)(Stockley，1994)。Operator RNA は、化学合成され、次いで治療用オリゴヌクレオチド（アンチセンスDNA/RNAま たはリボザイム）または細胞傷害剤（リシンA鎖）に結合される。次いで、結合 されたOperatorは、非ファージ分子の特異的なキャプシド化を引き起こすために インビトロで被覆タンパク質と混合される。Synthetic Virionは、レセプター媒 介性エンドサイトーシスによって細胞への取り込みを促進するリガンドに結合さ れる。一旦細胞内に入ると、Synthetic Virionは、分解され、そして治療用分子 を放出する。Synthetic Virionの分解は、エンドソーム区画の低pHによって促進 される。 RNAは、コードされるタンパク質の一過性発現を産生するためにインビトロお よびインビボで細胞をトランスフェクトするために使用されている。RNAトラン スフェクションへの適用の１つは、ガンワクチン接種である（Conry，1995）。R NAは、発現がその不安定さのために一過性であり、そして宿主のゲノムに組み込 まれ得ないという利点を有する。オンコジーンでの核酸ワクチン接種のためのDN Aの使用は、新生物をおそらく誘導し得る。DNAは、宿主ゲノムに組み込まれ得、 悪性の形質転換を導き得る。オンコジーンをコードするDNAは、数ヶ月の期間に わたって細胞内で複製し得、同一の期間にわたってオンコジーン産物の発現を導 く。細胞内でのいくつかのオンコジーンの延長された発現が、それらの形質転換 を生じ得ることが実証されている。細胞内にRNAを送達する現在の方法は、裸のR NA、裸のRNAと混合した組織培養物由来の細胞、または動物の組織内でカチオン 性リポソームと複合体化したRNAのいずれかを注射することである（Lu，1994;Dw arki，1993）。これらの送達系が有する問題は、組織培養培地または宿主の細胞 外流体におけるリボヌクレアーゼに対するRNAの感受性である。トランスフェク ション効率は、mRNAがその標的に到達し得る前に分解される場合に減少する。ト ランスフェクション効率は、細胞内へのRNAの侵入の前にRNAの半減期を増大する ことによって改善される。 発明の要旨 本発明は、ヌクレアーゼ耐性核酸の種々の局面および使用を意図する。本発明 は、このようなヌクレアーゼ耐性核酸を作製する種々の方法を意図する。本発明 は、大量の核酸を産生するためのウイルス様系の使用を意図する。好ましい実施 態様では、この核酸はリボヌクレアーゼ耐性である。本発明は、種々の診断アッ セイにおける、ヌクレアーゼ耐性核酸（特にリボヌクレアーゼ耐性核酸）の使用 を意図する。 本発明の最初の局面は、ヌクレアーゼ耐性核酸標準の調製および使用である。 内部標準は、試験結果を確認することにおいて重要な役割を演じる。それらはま た、定量の手段を提供する。サンプル中の特定のRNAの検出および定量は、RT-PC RTMの出現によって広く行われるようになっている。RT-PCRTM研究のための内部 標準は、それが逆転写およびPCRTM増幅工程の両方を対照するように、RNA分子で あるべきである。これは、RNAがRNase分解に特に敏感である場合に問題がある。 変化した試験結果は、保存の間またはサンプルへの導入の後のいずれかにおける RNA標準の部分的または完全な分解によって産生され得る。多くのRNA検出スキー ムが血清サンプル（比較的に多い量の種々のRNaseが位置する）中のウイルスRNA を検出するために設計される場合、少なくとも部分的なRNA分解の可能性は非常 に高い。RNA診断アッセイのための理想的な内部標準は、アッセイ形式のRNAに機 能的に等価であるが、ヌクレアーゼによる分解に耐性である分子である。RNase が活性である環境において酵素媒介分解からRNAを保護するために、３つの一般 的な方法が想像され得る：(1)透過不能な構造内にRNAをマイクロカプセル化する こ と、(2)標準へのヌクレアーゼの接近を拒否する分子とRNAとを非共有結合させる こと、および(3)もはやヌクレアーゼの基質ではないが、そのアッセイ形式にお いてRNAに依然として機能的に等価であるようにRNAの構造を化学的に変化させる こと。各々に関するより詳細な記載、例、および可能性は、以下に提供される。 本発明の標準において核酸は、アッセイを定量するために使用され得る。これ らの標準は、定量的RNA標準（特定のRNA配列の絶対的なコピー数を測定するため の）のような種々の目的（特に、血漿、血清、または髄液中のHIV-1、HIV-2、HC V、HTLV-1、HTLV-2、G型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、デング熱ウイルス、 または狂犬病ウイルスの数を定量するため）に使用され得る。それらはまた、RT -PCRTMアッセイによって細胞または組織中の特定のmRNAの発現を定量するために 使用され得る。この標準は、内部または外部であり得る。内部標準は、既知の濃 度でサンプルと混合されて、サンプルおよび標準が、１つのものとしてプロセス およびアッセイされる。従って、サンプル間のアッセイの効率の差異は、内部標 準によって作製されるシグナルを用いて標準化される。外部標準は、サンプルと 平行して既知の濃度でプロセスおよびアッセイされるが、サンプルとは別々にプ ロセスされる。いくつかの異なる濃度の外部標準は、同時にプロセスされて、次 いで、未知のサンプルの値を決定するために使用され得る標準曲線を産生する。 内部および外部標準は両方とも定量のために使用され得るが、一般に、内部標準 がより正確であると見なされる。標準は、診断RNAベースである診断（例えば、 細菌、真菌、または寄生体の疾患）またはRT-PCRTMアッセイにおいて、全ての試 薬が適切に機能することを示すためのポジティブコントロールとして作用する、 定量的標準として使用され得る。これらの標準は、Northernブロッティングの前 の単離手順に曝された後に、保護されたRNAにおいて観察される分解の量を測定 することによってRNA単離手順の完全性を測定するために使用され得る。これら は、地下水の流れを追跡するための、または問題となる企業に追跡して戻り得る 独特の核酸配列を有する個々の企業の廃棄物を標識するための環境トレーサーと して使用され得る。 本発明は、ウイルス定量に特に有用である。開発中および/または市販されて いるプロセス（すなわち、Roche Diagnostic Systems，AmplicorTM HIV MonitorT M およびAmplicorTM HCV Monitor試験：Organon Teknika，NASBA HIVキット；Gen Probe，Transcription Mediated Amplification HIVキット；およびHIVおよびHC VのためのChiron Corp.，分枝DNA（bDNA）シグナル増幅アッセイ）において多数 の新規の核酸ベースアッセイが存在する。これらのアッセイは、ヒト血漿または 血清中のHIVおよびHCVのような病原性ヒトウイルスを検出する。これらのアッセ イは、非常に感度が高く、1.0mlの血漿あたり300ビリオン未満でさえ検出する。 それらの現在の形式では、これらの核酸ベースアッセイのいくつかは、それらの 定量標準として裸のRNAを使用する。不運なことに、これらの裸のRNA標準は、リ ボヌクレアーゼ分解に非常に感受性が高く、従ってアッセイの結果は損なわれ得 る。 本発明の１つの主要な実施態様は、標準核酸をコードする配列を含むヌクレア ーゼ耐性組換え核酸セグメントを含む核酸標準に関する。いくつかの好ましい実 施態様において、核酸標準は、標準RNAをコードする配列を含むリボヌクレアー ゼ耐性RNAセグメントを含むRNA標準である。本明細書中に使用される場合、用語 「標準核酸」および「標準RNA」は、それぞれ、使用されるべき特定のアッセイ において標準としての使用に適切である核酸およびRNAをいう。本発明は、RNAウ イルスの定量のためのRNA標準として高度に適切であるリボヌクレアーゼ耐性組 換えRNAを意図するが、それは、組換えである必要はなく、そして任意の供給源 （例えば、組織培養由来の細胞）から単離されたRNAのためのRNA標準として使用 され肩る。特に、RNAバクテリオファージの構造は、組換えRNA（reRNA）分子を パッケージングするために改変され得る。reRNA配列は、特定のRNA配列/標的の 定量のためのRNA標準として働く。 本発明に関して、用語「ヌクレアーゼ耐性」および「リボヌクレアーゼ耐性」 は、核酸が、同一配列の裸の未改変核酸を上回ってヌクレアーゼに対してある程 度の増大した耐性を示すことを意味する。 核酸セグメントにヌクレアーゼ耐性を付与するために使用され得る種々の方法 が存在する。核酸セグメントは、化学的に改変されるか、ヌクレアーゼ耐性コー ティングで被覆されるか、またはヌクレアーゼ耐性構造中にケージ化され得る。 例えば、RNA標準は、リボヌクレアーゼに対して耐性である化学的改変されたRNA であり得る。組換えRNAセグメントにリボヌクレアーゼ耐性を付与する別の方法 は、リボヌクレアーゼ耐性コーティングでそれをコートすることである。このよ うなコーティングは、配列依存性または非依存性様式でRNAに結合し、そしてそ のRNAにリボヌクレアーゼ耐性を付与する任意のものであり得る。いくつかの場 合に、RNA標準は、リボヌクレアーゼ耐性構造中にケージ化される組換えRNAであ る。RNAをケージ化する方法としては、ウイルスタンパク質でのRNAの部分的キャ プシド化、RNAの部分的脂質キャプシド化、ポリマーマトリックスでのRNAの部分 的トラッピングなどが挙げられる。 本発明のいくつかの好ましい実施態様において、リボヌクレアーゼ耐性構造は 、RNA標準を部分的にキャプシド化するウイルスCoatタンパク質から構成される 。RNAは、細菌宿主においてインビボで転写され、次いでバクテリオファージタ ンパク質によってキャプシド化される。このRNAの「ケージ化」は、リボヌクレ アーゼから保護されるRNAを生じる（Armored RNATM）。核酸またはRNAは、ヌク レアーゼ耐性構造中に完全にまたは実質的にケージ化され得るが、部分的にケー ジ化された核酸およびRNAもまた、その部分的ケージ化が核酸またはRNAにヌクレ アーゼまたはリボヌクレアーゼ耐性を付与する限り、本発明の範囲内にある。従 って、本明細書中で使用される場合、用語「キャプシド化」、「カプセル化」、 「トラッピング」などは、生じる構造がヌクレアーゼ耐性またはリボヌクレアー ゼ耐性（それらの用語が本明細書中で使用されるように）である限り、キャプシ ド化、カプセル化、トラッピングなどが、部分的ならびに実質的または実質的に 完全である構造を含む。 特定の好ましい実施態様において、本発明は、リボヌクレアーゼ耐性組換えRN A（「reRNA」）標準に関する。これらのArmored RNATM（AR）標準は、バクテリ オファージタンパク質によるreRNAのキャプシド化に起因してリボヌクレアーゼ 耐性である。完全なRNAは、一般的なRNA抽出法（例えば、グアニジニウム(guani dinium)およびフェノール法(Chomczynski，1987)）によって、Armored RNATM標 準粒子から容易に抽出される。非バクテリオファージRNAは、以下のような多く の応用において使用され得る：定量のためのRNA標準として、RNAサイズ標準とし て、およびインビトロおよびインビボでの一過性遺伝子発現のため。 Armored RNATMは、定量アッセイにおいてRNA標準として働くように較正されて 、血漿サンプル内のRNAウイルスの絶対数が決定され得る。Armored RNATMは、RN A標準のいかなる分解も伴うことなく極度のリボヌクレアーゼ処理に曝され得る 。Armored RNATMは、非常に耐久性があり、そしてリボヌクレアーゼの存在下で ４℃でまたは室温でさえも、無限時間保存され得る。これらの質を有する公知の RNA標準は存在しない。Armored RNATMは、先行技術のウイルス様粒子（例えば、 PickettおよびPeabodyのもの）とはいくつかの特徴で異なる。PickettおよびPea bodyの粒子のreRNAのバクテリオファージ配列は、パッケージングを開始するた めのRNAの被覆タンパク質認識のために必要とされるOperator配列（またはpac部 位）のみからなる。Armored RNATMは、Maturase、被覆タンパク質およびpac部位 をコードする約1.7kbのバクテリオファージRNA配列を含む。パッケージングされ たreRNA内へのバタテリオファージ配列の長いストレッチの封入は、野生型MS2構 造にほとんど類似したマクロ分子構造を形成することに実質的に寄与し得る。さ らに、パッケージングされたRNAを保護する構造内においてバクテリオファージ 粒子を組み立てることに寄与する被覆タンパク質およびMaturaseを認識するバク テリオファージRNA内のまだ特徴付けられていない配列のような、他の配列が存 在し得る。非バクテリオファージRNAは、PickettおよびPeabodyにより実証され たように被覆タンパク質単独によってパッケージングされ得るが、これらの非バ クテリオファージRNA配列は、完全にリボヌクレアーゼ耐性ではない。正確なバ クテリオファージ構造を想定することの可能性を最大化することに加えて、Armo red RNATM内の余分のバクテリオファージ配列の封入はまた、PickettおよびPeab odyのウイルス様粒子とは異なり、バクテリオファージタンパク質によってパッ ケージングされるべきRNAの特異性を増大させる。PickettおよびPeabodyウイル ス様粒子は、被覆タンパク質対reRNAの比が減少されない限りは、標的RNAを上回 って主として宿主E.coliプレrRNAを含んでいた。 Armored RNATMを合成するための好ましいストラテジーは、会合のためのreRNA に対する被覆タンパク質の至適な比率を維持するための、自己調節フィードバッ ク機構を生成することにより至適化されたストラテジーである。被覆タンパク質 は、reRNA中にコードされ、そしてreRNAは、その会合されていない形態での翻訳 のためにのみ利用可能である。従って、適切な濃度の被覆タンパク質がreRNAか ら翻訳された場合、それはreRNAをパッケージングし始める。より多いreRNAが組 換えプラスミドから転写されるまで、より多い被覆タンパク質は翻訳され得ない 。PickettおよびPeabodyのストラテジーは、これら２つの分子の間の一定の比率 を維持するための機構を欠いた。PickettおよびPeabodyは、Operator-lacZ RNA をパッケージングするために、トランスの機構を使用した。被覆タンパク質RNA は異なるプラスミドから転写され、それゆえ、被覆タンパク質はそれがパッケー ジングするべきRNAとは異なるRNAから翻訳された。被覆タンパク質RNA上にはOpe ratorは存在しないので、被覆タンパク質RNAは連続的に転写され、そして被覆タ ンパク質は連続的に翻訳される。誘導後、被覆タンパク質の合成の調節は存在し ない。同様に、Operator-lacZ RNAの転写の制御は存在しない。従って、両方のR NAの転写は構成的であり、そして被覆タンパク質の翻訳は構成的である。対照的 に、いくつかの実施態様において、Armored RNATM法は、シスの方法であり、こ こで被覆タンパク質はパッケージングされるべきRNAと同じRNAから翻訳される。 被覆タンパク質の産生は、翻訳のレベルにおいて調節される。なぜなら、一旦被 覆タンパク質の濃度が十分に高くなると、被覆タンパク質は、そこからそれが翻 訳されるRNAをキャプシド化し、従って、任意のさらなる被覆タンパク質がそのR NAから翻訳されることを防止するからである。この自己調節方法により、被覆タ ンパク質のレベルは、RNAが非特異的様式でキャプシド化されるほど高くはなり 得ない。 Armored RNATMは、Maturaseおよび被覆タンパク質をトランスで提供しながら 、Maturaseおよび被覆タンパク質のための結合部位をコードする最小のバクテリ オファージ配列（またはなおより少ない）を使用して、産生され得る。キャプシ ド化され得、そしてリボヌクレアーゼ耐性のままであり得るRNAの最大サイズは 規定されるべきままである。しかし、野生型MS2バクテリオファージは約3.6kbの RNAゲノムを含む。これらのバクテリオファージの構造は二十面体（iscosahedra l）であるので、最大サイズは約４kbであるようである。従って、Maturaseおよ び被覆タンパク質をコードする配列を使用者に関係のある外来配列で置換する潜 在能力は、有利であり得る。当業者は、Armored RNATMを産生するために必要な バクテリオファージ配列の最小量を決定するために、組織的な１組の研究を容易 に 実施し得る。これらの適用におけるArmored RNATMの１つの利点は、それらが非 複製性であり、それゆえ、ウイルス複製に起因して異常に高いシグナルが検出さ れないことである。 Armored RNATMの安定性は、パッケージングされたRNAが、極限の環境条件に耐 え得ることを示す。この特性は、汚染物の起源を追跡するための分子マーカーと してのArmored RNATMの使用において有用であり得る。例えば、Armored RNATMは 、異なる会社の廃棄物容器中にスパイクされ得る。各々の会社に対するArmored RNATMは、その会社を同定する特有のヌクレオチド配列を含む。流出の場合、サ ンプルが取られ、RNAが単離され、そしてRT-PCRTMが実施されて、Armored RNATM の特有の配列を決定し、そして流出の原因となる会社を同定する。関連する適用 において、Armored RNATMは、環境問題研究者により、地下水の流れを迫跡する ために使用され得る。 インビボにおいて発現される場合に、その中で、インビボにおいて合成された ウイルス被覆タンパク質中でリボヌクレアーゼに対してRNAが保護されるArmored RNATM組成物を生じる、遺伝子を作製する多数の可能な方法が存在する。 本発明のいくつかの局面を理解するために、バクテリオファージ（例えば、MS 2バクテリオファージ）の成分を理解することが必要である。RNAゲノムは約3.6k bであり、そして以下の４つの異なるタンパク質をコードする：Maturase、被覆 タンパク質、Lysis Protein、およびReplicase。被覆タンパク質は、MS2バクテ リオファージ粒子の体積の大部分を構成する。被覆タンパク質は、サイズが約14 kDの小さなタンパク質であるが、このタンパク質の180の分子が存在し、これら はバクテリオファージRNAゲノムの各々の分子をキャプシド化する。全体で、被 覆タンパク質分子は、約3,500kDの全バクテリオファージ体積の約2,500kDを提供 する。１つのバクテリオファージ粒子当たり１分子のMaturaseタンパク質が存在 し、このMaturaseタンパク質はサイズが約44kDである。Maturaseは、RNAゲノム をリボヌクレアーゼ分解から保護するために役立ち、そしてこれはE．coli感染 のためのＦ線毛に対するレセプターである。Lysis ProteinおよびReplicaseは、 バクテリオファージ分子の成分ではない。Lysis Proteinは、E．coli細胞を溶菌 してバクテリオファージ粒子を放出することに関与する。Replicaseタンパク質 および３つの他のE．coli宿主タンパク質は、RNAゲノムの複製、およびパッケー ジングのための多数のコピーの合成を担うタンパク質複合体を構成する。 この出願において、シスは、そこからそれが翻訳されたRNA転写物種と同じRNA 転写物種へのタンパク質の結合をいう。トランスは、それが翻訳されたRNA転写 物種以外のRNA転写物種へのタンパク質の結合をいう。 最も単純な組成物は、被覆タンパク質、および１つ以上のOperator配列をコー ドすることを伴うかまたは伴わないかのいずれかの非バクテリオファージ配列を コードするRNAであり得る。別の組成物は、被覆タンパク質、および１つ以上のO peratorおよび非バクテリオファージ配列をコードするreRNAを含み得る。 別の組成物は、被覆タンパク質およびMaturase、ならびに１つ以上のOperator 配列、一方または両方のMaturase結合部位、および非ファージ配列をコードする reRNAであり得る。被覆タンパク質およびMaturaseはトランスで提供される。 別の組成物は、被覆タンパク質、ならびに被覆タンパク質、１つ以上のOperat or配列、および非ファージ配列をコードするreRNAであり得る。１つより多いOpe ratorを含めることは、リボヌクレアーゼに対する付加的な保護を与え、そして 宿主RNAを上回るreRNAに対する被覆タンパク質の特異性を増加させるように作用 し得る。 別の組成物は、被覆タンパク質およびMaturase、ならびに被覆タンパク質、Op erator配列、Maturase結合部位、および非ファージ配列をコードするreRNAであ り得る。Maturaseタンパク質は、トランスで提供される。 別の組成物は、被覆タンパク質およびMaturase、ならびに被覆タンパク質、Ma turase（これは、Maturase結合部位を含む）、１つ以上のOperator配列、および 非ファージ配列をコードするreRNAであり得る。 別の組成物は、被覆タンパク質およびMaturase、ならびに被覆タンパク質、Ma turase（これは、Maturase結合部位を含む）、１つ以上のOperator配列、MS2ゲ ノムの3'末端に位置するMaturase結合部位、および非ファージ配列をコードする reRNAであり得る。 別の組成物は、被覆タンパク質およびMaturase、ならびに被覆タンパク質、Ma turase、１つ以上のOperator配列、（タンパク質がインビボにおいて合成されな いように）ReplicaseのＣ末端コード領域の大部分をコードするreRNAであり得る 。さらに、この組成物は、Replicaseが機能するように、全体の活性なReplicase をコードする配列を含み得る。 別の組成物は、被覆タンパク質およびMaturase、ならびに被覆タンパク質、Ma turase、１つ以上のOperator配列、ReplicaseのＣ末端コード領域の大部分（タ ンパク質がインビボにおいて合成されないように）、およびMS2ゲノムの3'末端 に位置するMaturase結合部位、および非ファージ配列をコードするreRNAであり 得る。 いくつかの実施態様において、RNAをパッケージングするためにOperator配列 を有する必要は存在しない。被覆タンパク質およびRNAの同時発現は、オペレー ターなしのRNAが、パッケージングされ、そしてOperator配列が存在する場合に 生成されるより低く特異的であり得る様式で保護されることを導き得る。 他の組成物は、Lysis Proteinとともに、上記のいずれかを含み得る。Lysis P roteinはいずれにおいても提供され得る。 これらの組成物の各々において、非ファージRNAは、reRNAの種々の異なる領域 に配置され得る。例えば、第１の組成物において、reRNAは、２つのOperatorお よび非ファージRNAをコードし得る。両方のOperatorは非ファージRNAの5'もしく は3'に位置し得るか、または非ファージRNAの各々の末端において１つのOperato rが存在し得る。単一のOperatorのみが存在する場合、完全長転写物のみがパッ ケージングされるように、Operatorを完全長転写物の3'末端に配置することが好 ましくあり得る。Maturase結合部位を3'末端付近に含めることは、完全長RNAの パッケージングに関する同様の利点を有し得る。野生型ファージゲノムにおいて 、Maturase結合部位は、Maturaseコード配列内およびゲノムの3'末端に位置され る。被覆タンパク質がトランスで提供される組成物において、被覆タンパク質と 同じRNA転写物上にコードされるOperator配列が存在しないか、または被覆タン パク質が、被覆タンパク質RNA転写物および非ファージOperator RNAの両方に結 合し得、キャプシドの混合集団を産生し得ることが好ましい。 １つのRNA分子当たり１つより多いOperator配列を使用することは、Pickettお よびPeabodyの研究におけるように、標的RNAに対する被覆タンパク質の特異性を 増加し、そしてインビボにおいて宿主RNAをパッケージングする可能性を減少す ることが予想され得る。被覆タンパク質のOperator配列との結合速度を研究する インピトロ研究は、被覆タンパク質が、協同的様式で２つのOperator配列をコー ドするRNA分子に結合すること、および被覆タンパク質が、２つのOperatorを有 するRNAに単一のOperatorを有するRNAよりずっと低い濃度で結合することを実証 した（Witherell，1990）。結合の特異性を増加させることはまた、野生型配列 より高い被覆タンパク質に対する親和性を有する変異型Operator配列を使用して 達成され得る（Witherell，1990）。 本発明の主な局面は、以下のように要約され得る。本発明の１つの主な実施態 様は、標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントを含む 核酸標準に関する。いくつかの好ましい実施態様において、核酸標準は、標準RN Aをコードする配列を含むリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントを含むRNA標準で ある。 用いられ得る種々の形態のリボヌクレアーゼ耐性RNA標準が存在する。RNAは、 リボヌクレアーゼに対して耐性である化学的に修飾されたRNAであり得る。化学 的に修飾されたRNAは、化学的に修飾されたヌクレオチドからなり得る。これら のヌクレオチドは、リボヌクレアーゼがRNAに対して作用し得ないように修飾さ れる。化学的に修飾されたRNAは、RNAまたは以前に転写されたRNA転写物の化学 的修飾により調製される。あるいは、化学的に修飾されたRNAは、既に化学的に 修飾されているヌクレオチドから転写または合成され得る。 RNA標準はまた、リボヌクレアーゼ耐性コーティングに非共有結合されている か、またはリボヌクレアーゼ耐性コーティングで被覆されているRNAを含み得る 。そのような結合（これは、配列依存性または配列非依存性であり得る）は、RN Aをリボヌクレアーゼ耐性にする。いくつかの実施態様において、結合した分子 はタンパク質からなる。そのような結合タンパク質の例は、MS2/R17被覆タンパ ク質、HIV-1ヌクレオキャプシドタンパク質、gp32、T4のregAタンパク質、また はバクテリオファージT4のgp32である。他の場合において、非共有結合されてい る分子は、低分子からなる。例えば、ポリアミン、スペルミン、および／または スペルミジン。リボヌクレアーゼ耐性コーティングはまた、核酸からなり得る。 い くつかの好ましい実施態様において、核酸は組換えRNAにハイブリダイズし、ヌ クレアーゼをブロックし、そして逆転写酵素のためのプライマーとして作用し得 る。他の場合において、ポリ-L-リジンおよびカチオン性界面活性剤（例えば、C TAB）が、RNAを被覆しそして保護するために使用され得る。 本発明の他の実施態様において、リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントは、か ごに入れられた（caged）ヌクレアーゼ耐性構造である。すなわち、RNAセグメン トは、リボヌクレアーゼ耐性構造中に部分的にキャプシド化される。例えば、リ ボヌクレアーゼ耐性構造は、脂質からなり得る。いくつかの場合において、脂質 リボヌクレアーゼ耐性構造は、リポソームを含む。他の実施態様において、リボ ヌクレアーゼ耐性構造は、ポリマーマトリックスのような合成マイクロカプセル である。有用なポリマーマトリックスのいくつかの例は、アガロースまたはアク リルアミドを含む。 いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、ウイルス被覆タンパク質中 にキャプシド化された標準核酸セグメントを含むリボヌクレアーゼ耐性構造を含 む核酸標準を意図する。本発明の好ましい実施態様は、標準RNAをコードする配 列を含むリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントを含むRNA標準を意図する。ウイル ス被覆タンパク質中のRNAセグメントのキャプシド化は、それをリボヌクレアー ゼに対して耐性（従って、用語Armored RNATM）を与え得る。 ウイルス被覆タンパク質は、任意の天然または改変されたウイルス被覆タンパ ク質であり得るが、多くの好ましい実施態様において、ウイルス被覆タンパク質 は、バクテリオファージウイルス被覆タンパク質である。そのようなバクテリオ ファージウイルス被覆タンパク質は、遺伝的サブクラスＡまたはＢのE．coliバ クテリオファージのものであり得；いくつかの好ましい実施態様において、バク テリオファージウイルス被覆タンパク質は、遺伝的サブクラスＡのE．coliバク テリオファージのものである。バクテリオファージウイルス被覆タンパク質は、 血清学群Ｉ、II、III、またはIVのE．coliバクテリオファージのものであり得、 いくつかの好ましい実施態様は、血清学群ＩのE．coliバクテリオファージ由来 のバクテリオファージウイルス被覆タンパク質を用いる。特定の特に好ましい実 施態様において、バクテリオファージウイルス被覆タンパク質はMS2/R17バクテ リオファージのものである。バクテリオファージウイルス被覆タンパク質はまた 、Pseudomonas aeruginosa RNAバクテリオファージ（例えば、Pseudomonas aeru ginosa PRR1またはPP7バクテリオファージ）のものであり得る。バクテリオファ ージウイルス被覆タンパク質はさらに、繊維状バクテリオファージのものであり 得、そしてそのようなバクテリオファージは多くの他のバクテリオファージより 長いRNAセグメントを含み得るので、これは特に目的とする実施態様である。古 細菌のバクテリオファージが本発明において有用であることもまた意図される（ Ackerman，1992）。当然、ウイルス被覆タンパク質はバクテリオファージ由来で ある必要はなく、そして本発明は、植物または動物ウイルス由来のウイルス被覆 タンパク質を意図する。例えば、タバコモザイクウイルス（Hwang 1994a；Hwang ，1994b；Wilson，1995）、アルファウイルス（Frolov，1996）、HBV、ネコ免疫 不全ウイルス、およびラウス肉肺ウイルスが全て有用である。ウイルス被覆タン パク質は、天然または改変されたウイルス被覆タンパク質であり得る。改変され たウイルス被覆タンパク質は、より高いかまたはより低いウイルス被覆耐性のよ うな、特定の所望される特徴を得るために使用され得る。改変されたウイルス被 覆タンパク質は、PCRTMに基づきそして他の形態の部位特異的変異誘発を含む、 当業者に公知の任意の多数の方法により作製され得る。 特定の好ましい実施態様において、リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントは、 ウイルスMaturaseタンパク質に結合される。例えば、RNA標準は、組換えRNAセグ メント上のウイルスMaturase結合部位に結合されたウイルスMaturaseタンパク質 を含み得る。ウイルスMaturaseタンパク質および／またはウイルスMaturaseタン パク質結合部位は、天然であり得るかまたは改変され得る。Maturase結合部位の 塩基配列における改変、およびMaturaseのアミノ酸配列における改変は、当業者 に公知の任意の多数の方法により作製され得る。ウイルスMaturase結合部位は、 天然のMaturaseをコードするRNA配列において見出される。それゆえ、RNA配列は 、それ自体の中に、MaturaseをコードするRNAを含み得る。さらに、Maturaseの 結合はRNAセグメントの安定性に対していくらかの効果を有するとされているの で、複数のMaturase結合部位および／またはMaturaseコード配列がRNAセグメン ト中に含まれ得ることが意図される。 標準リボ核酸をコードするRNAセグメントはまた、Replicaseタンパク質をコー ドする配列を含み得、そしてReplicaseタンパク質は、その配列から発現される かもしくは発現可能であってもよくまたはそうでなくてもよい。特定の好ましい 実施態様において、Replicaseタンパク質をコードする配列は、活性でない改変 されたReplicaseタンパク質をコードする。 RNAセグメントは、代表的には、Operatorコード配列、および多くの好ましい 実施態様において、ウイルスMaturaseタンパク質結合部位（これは、ウイルスMa turaseタンパク質コード配列中に含まれ得る）を含み得る。RNAセグメントは、 上記で考察された型のウイルス被覆タンパク質コード配列をさらに含み得る。 標準RNAをコードする配列を含むRNAセグメントの多くの実施態様が存在し、そ の少しの例を以下で与えられる。いくつかの非常に基本的な実施態様において、 RNAセグメントは、Operator配列およびウイルス被覆タンパク質配列を含む。他 の基本的な実施態様において、RNAセグメントは、Operator配列、ウイルス被覆 タンパク質配列、および非バクテリオファージ配列を含む。他の実施態様におい て、RNAセグメントは、少なくとも２つのOperator配列および非バクテリオファ ージ配列を含む。RNAセグメントは、Operator配列、ウイルスMaturaseタンパク 質をコードする配列、および非バクテリオファージ配列を含み得る。さらに、い くつがの好ましい実施態様において、RNAセグメントは、Operator配列、ウイル スMaturaseタンパク質をコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする 配列、および非バクテリオファージ配列を含む。RNAセグメントは、Operator配 列、少なくとも２つのウイルスMaturase結合部位、Maturaseタンパク質をコード する配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、および非バクテリオファ ージ配列を含み得る。あるいは、RNAセグメントは、Operator配列、少なくとも ２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配 列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、非バクテリオファージ配列、お よびReplicaseタンパク質をコードする配列を含み得る。RNAは、pAR-1またはpAR -2の配列中にコードされる組換えRNAセグメントの全部または一部を含み得る。 いくつかの好ましい実施態様において、RNAセグメントは、RNAバクテリオファ ージ由来のバクテリオファージ配列および非バクテリオファージ配列を含む。非 バクテリオファージ配列は、マルチクローニング部位中に挿入され得る。非バク テリオファージ配列は、ウイルス配列、細菌配列、真菌配列、動物配列、植物配 列、または他の配列であり得るが、特定の好ましい実施態様において、それはウ イルス配列である。複数のOperatorは、非バクテリオファージ配列のいずれかの 末端に存在し得るか、またはその配列に隣接し得る。複数のOperator配列は、よ り大きな非バクテリオファージ配列をパッケージングするために有用であり得る 。 非バクテリオファージ配列はしばしば、例えば、PCRTMに基づく手順によるRNA の検出および／または定量における標準としての使用のために適合された配列で ある。特定の実施態様において、非バクテリオファージ配列は、診断値のRNAの 検出および／または定量におけるにおける使用のために適合された配列である。 例えば、非バクテリオファージ配列は、HIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2、 Ｇ型肝炎、腸内ウイルス、または血液媒介性病原体の検出および／または定量に おける標準としての使用のために適合された配列であり得る。いくつかの特に目 的とする実施態様において、非バクテリオファージ配列は、HIV-1、HIV-2、HCV 、HTLV-1、またはHTLV-2のようなウイルス性疾患の検出における使用のために適 合される。非バクテリオファージ配列の適合は、試験されるRNAの検出および／ または定量のために適した配列を与える、任意の方法で達成され得る。いくつか の実施態様において、非バクテリオファージ配列は、それが天然の配列から区別 可能なように、検出またはモニターされるべき天然のRNA配列を改変することに より、目的のRNAの検出および／または定量における標準としての使用のために 適合した。例えば、HIV-1の検出および／または定量は、改変されたHIV-1配列を 含む非バクテリオファージ配列を用いて達成され得る。RNA標準は、血液媒介性 病原体（例えば、マラリア原虫、プラスモデイウム、Francisella tularensis、 またはWucheria bancrofti）の検出および／または定量における標準としての使 用のために適合された非バクテリオファージ配列を含み得る。 RNA標準のバクテリオファージ配列は、任意の遺伝子サブクラス（例えば、サ ブクラスＡ）の任意のE．coliバクテリオファージ由来の配列であり得る。さら に、バクテリオファージ配列は、血清学群Ｉ、II、III、またはIVのE．coliバク テリオファージ由来の配列であり得る。特定の実施態様において、バクテリオフ ァージ配列は、MS2/R17バクテリオファージ由来の配列である。当然、バクテリ オファージ配列はまた、Pseudomonas aeruginosa RNAバクテリオファージ（例え ば、PRR1もしくはPP7バクテリオファージ）、または繊維状バクテリオファージ 由来の配列であり得る。 本発明の他の実施態様は、上記で論じた種々の配列を含むRNAセグメントを意 図する。RNA標準セグメントは、ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化され 得るか、またはウイルス被覆タンパク質なしであり得る。例えば、組換えRNAは 、RNA標準産生プロセスの間、またはウイルス被覆タンパク質からの組換えRNAセ グメントの単離後のアッセイの間に、ウイルス被覆タンパク質なしであり得る。 RNAは、上記で論じた任意の種々の形態のものであり得、そしてOperator部位（ 単数もしくは複数）、Maturase結合部位（単数もしくは複数）、被覆タンパク質 コード配列（単数もしくは複数）、Maturaseコード配列（単数もしくは複数）、 非バクテリオファージ配列（単数もしくは複数）、制限酵素配列（単数もしくは 複数）、活性もしくは非活性Replicaseコード配列（単数もしくは複数）、活性 もしくは非活性Lysis Proteinコード配列（単数もしくは複数）、および/または 他の配列を含み得る。 本発明はまた、ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化された組換えRNAセ グメントを含むRNA標準の合成における使用のために適合されたDNAベクターを意 図する。そのようなベクターは、細胞（例えば、E．coli)中にトランスフェクト され、そして細胞に、ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化されたRNAを産 生させるように機能する。基本的なベクターは、Operator配列およびウイルス被 覆タンパク質配列をコードする配列を含み得る。あるいは、ベクターは、２つの Operator配列および非バクテリオファージ配列をコードする配列を含み得る。い くつかの実施態様において、ベクターは、Operator配列をコードする配列、ウイ ルスMaturase結合部位をコードする配列、およびマルチクローニング部位を含み 得る。マルチクローニング部位は、ウイルスMaturase結合部位をコードする配列 の下流または上流のいずれかであり得る。ベクターは、ウイルスMaturaseタンパ ク質および／またはMaturase結合部位をコードする配列をさらに含み得る。ウイ ルスMaturase結合部位をコードする配列は、ウイルスMaturaseタンパク質をコ ードする配列内に含まれ得る。特定の好ましい実施態様は、ウイルス被覆タンパ ク質遺伝子、Operator配列、およびマルチクローニング部位をコードする配列を 含む。非バクテリオファージをコードするDNA配列は、そのようなDNAベクターの マルチクローニング部位中に挿入され得、そして非バクテリオファージ配列は、 上記で論じた任意の配列であり得る。 本発明は、ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化された組換え核酸を含む 核酸標準を含む採集チューブを意図する。そのような採集チューブは、血液、尿 、または脳脊髄液のような体液の採集における使用のために適合され得る。例え ば、採集チューブは、血液採取のための真空チューブであり得る。そのような採 集チューブは、液体の採集の時点で体液サンプル中に核酸標準を提供し、そして アッセイ手順の一部として標準を添加する必要を排除することにより、診断手順 を合理化し得る。 本発明は、上記の核酸標準を使用して核酸サンプル中の試験される核酸の存在 についてアッセイするための方法を意図する。「核酸サンプル」はまた、核酸組 成物として本明細書中で記載され得る。本明細書中で用いられる核酸組成物は、 １つ以上の核酸分子またはポリマーを含む任意の組成物（通常は、液体組成物） を意味するように理解される。組成物はまた、緩衝液、塩、溶媒、または溶質な どを含み得、これらは、核酸組成物とともにサンプルに由来するか、または単離 の間または単離の後に組成物に添加されている。そのような組成物は、代表的に は、水溶液から沈澱され、そして再懸濁される。核酸標準は、内部標準または外 部標準であり得る。そのような方法は、一般に、以下の工程を包含する：（１） サンプルを得る工程；（２）標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性 核酸セグメントを含む核酸標準を得る工程；（３）試験される核酸の存在につい てサンプルをアッセイする工程；および（４）アッセイにおける標準として標準 核酸をコードする配列を含む核酸セグメントを用いる工程。方法は、サンプルか ら核酸組成物を単離する工程を、さらに包含し得る。サンプルは、無機物質（例 えば、土壌サンプル）、任意の有機物質、植物または動物由来のサンプルを含み 得るがそれらに限定されず、そして組織サンプル、または血液もしくは血液成分 のサンプルであり得ることが意図される。この方法は、標準核酸をコードする配 列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントを、標準核酸をコードする配列を含む ヌクレアーゼ耐性核酸セグメントをヌクレアーゼ耐性にする分子から単離して、 標準核酸をコードする配列を含む核酸セグメントを得る工程を、さらに包含し得 る。 あるいは、この方法は、サンプルまたは核酸組成物と、標準核酸をコードする 配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントを含む核酸標準とを、試験される核 酸配列の存在についてアッセイする前に混合する工程を、さらに包含し得る。こ の代替法は、標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメント を、標準核酸をコードする配列を含む核酸セグメントにヌクレアーゼ耐性を与え る分子から単離して、標準核酸をコードする配列を含む核酸セグメントを得る工 程を、さらに包含し得る。さらに、サンプルおよび核酸標準は、サンプルからの 核酸組成物の単離、および標準核酸をコードする配列を含む核酸セグメントの単 離の前に混合され得、その結果、サンプル、および標準核酸をコードする配列を 含む核酸セグメントからの核酸組成物の単離が、同一の単離手順において実施さ れる。これは、手順を合理化し、そして全ての試験される核酸および核酸標準が 、同一の反応中で平行して処理されることを確実にする。そのような平行処理は 、アッセイの結果を損ない得る多くの可変性を排除する。 アッセイは、核酸標準を用いる任意のアッセイであり得るが、多くの好ましい 実施態様はPCRTM分析を含む。本発明の核酸標準の利点の１つは、それらが、定 量的RT-PCRＴＭのような定量的アッセイを可能にすることである。RT-PCRTM手順 において、核酸セグメントは、代表的には、標準RNAをコードする配列を含むRNA である。代表的には、定量的アッセイは、試験されるRNA PCRTM産物の量を、標 準RNA PCRTM産物の量と比較する工程を包含する。RT-PCRTM分析は、通常以下の 工程を包含する：（１）逆転写手順を用いる工程；（２）核酸配列を増幅し、そ してPCRTM産物を生成する工程；および（３）PCRTM産物を検出する工程。特定の 実施態様において、増幅工程は、任意の試験されるRNA PCRTM産物の、標準RNA P CRTM産物との同時増幅を含む。そのような同時増幅は、RT-PCRTM手順からの、試 験されるRNA PCRTM産物および標準RNA PCRTM産物の両方の増幅のために適合され た、単一のプライマーセットの使用を介して達成され得る。 核酸標準は、先に明らかにまたは盲目的に記載されている任意の組成物であり 得る。例えば、リボ核酸標準が使用される場合、化学的改変、リボヌクレアーゼ 耐性コーティング、またはリボヌクレアーゼ耐性ケージを含むがこれらに限定さ れない、標準RNAをコードする配列を含む任意の形態のリボヌクレアーゼ耐性RNA セグメントが、使用され得る。 RNA標準をコードする配列は、ウイルス配列のような非バクテリオファージ配 列を含み得る。非バクテリオファージ配列は一般に、RNAの検出および／または 定量における標準としての使用のために適合された配列であり得る。いくつかの 好ましい実施態様において、アッセイは、HIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体（blood-borne pathog en）での感染におけるウイルスの負荷を検出および／または定量するために使用 され得る。本発明にさらに好ましい実施態様は、改変したHIV-1、HIV-2、または HCV配列を有する組換えRNAを含むRNA標準を使用する、HIV-1、HIV-2、またはHCV の検出および／または定量を意図する。 本発明の１つの具体的な方法は、以下を含む方法により診断的に価値のあるRN Aの存在についてアッセイすることを意図する：（１）アッセイされるサンプル を得る工程；（２）バクテリオファージ被覆タンパク質中にキャプシド化された 標準RNAをコードする配列を含むRNA標準を得る工程；（３）RNA標準とサンプル とを混合する工程；（４）混合物からRNAを単離する工程；および（４）RT-PCRT M 分析を用いて診断的に価値のあるRNAの存在をアッセイする工程。 本発明は、以下を含む、ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化された組換 え核酸セグメントを含む核酸標準を作製する方法を意図する：（１）Operator配 列および非バクテリオファージ配列をコードする配列を含む組換え核酸セグメン トをコードする核酸配列を含むベクターを得る工程；（２）細胞にベクターをト ランスフェクトする工程；（３）ウイルス被覆タンパク質質を提供する工程；お よび（４）組換え核酸セグメントの転写および組換え核酸セグメントのウイルス 被覆タンパク質中へのキャプシド化を可能にする条件下で細胞を培養する工程。 組換え核酸セグメントは、RNAまたはDNAであり得る。核酸標準は、細胞から精製 され得、ここで、核酸標準は、細胞からのウイルス粒子の分離のための当業者に 公知の多数の任意の様式によって発現される。細胞は、任意の形態の細胞であり 得るが、代表的にはE．coliのような細菌細胞が使用される。 ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化される組換えRNAセグメントを含むR NA標準を作製する方法が、特に好ましい。この方法は、以下を包含する：（１） Operator配列および非バクテリオファージ配列をコードする配列を含む組換えRN AセグメントをコードするDNA配列を含むベクターを得る工程；（２）細胞にベク ターをトランスフェクトする工程；（３）ウイルス被覆タンパク質を提供する工 程；および（４）組換えRNAセグメントの転写および組換えRNAセグメントのウイ ルス被覆タンパク質中へのキャプシド化を可能にする条件下で細胞を培養する工 程。多くの好ましい実施態様において、組換えRNAは、Maturase結合配列を含む 。 ウイルス被覆タンパク質の供給は、多数の手段により得る。例えば、タンパク 質は、組換えRNAセグメントの転写から別々に発現され得、そして組換えRNAが一 旦転写されるとキャプシド化される濃度で培養培地に添加される。しかし、最も 好ましい実施態様において、被覆タンパク質の提供は以下を含む：（１）ウイル ス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントを得る工程；（２）ウイルス被覆 タンパク質をコードする核酸セグメントを細胞にトランスフェクトする工程；（ ３）ウイルス被覆タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程。 この実施態様において、ウイルス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントは 、組換えRNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクター中に含まれるDNA配 列であり得る。ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列は、組換えRNAセグ メントをコードするDNA配列にシスで配置され得る。さらに、ウイルス被覆タン パク質をコードするDNA配列は、組換えRNAセグメントをコードするDNA配列中に 配置され得る。あるいは、ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列は、組 換えRNAセグメントをコードするDNA配列に対してトランスで配置され得る。しか し、このことは、好ましい実施態様の典型ではない。 RNA標準を生成する方法は、ウイルスMaturaseタンパク質を提供するさらなる 工程を包含し得る。ウイルスMaturaseタンパク質の提供は、多数の手段により得 る。例えば、タンパク質は、組換えRNAセグメントの転写から別々に発現され得 、そして、組換えRNAが一旦発現されるとキャプシド化される濃度で培養培地に 添 加される得る。しかし、最も好ましい実施態様において、Maturaseタンパク質の 提供は以下を含む：（１）ウイルスMaturaseタンパク質をコードする核酸セグメ ントを得る工程；（２）ウイルスMaturaseタンパク質をコードする核酸セグメン トを細胞にトランスフェクトする工程；および（３）ウイルスMaturaseタンパク 質の発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程。この場合、ウイルスMatura seタンパク質をコードする核酸セグメントは、組換えRNAセグメントをコードす るDNA配列を含むベクター中に含まれるDNA配列であり得る。ウイルスMaturaseタ ンパク質をコードするDNA配列は、組換えRNAセグメントをコードするDNA配列に シスで配置され得る。さらに、ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配 列は、組換えRNAセグメントをコードするDNA配列中に配置され得る。あるいは、 ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列は、組換えRNAセグメントをコ ードするDNA配列にトランスで配置され得るが、このことは好ましい実施態様の 典型ではない。もちろん、組換えRNA配列は、先に明らかにまたは盲目的に記載 されるかまたは示唆される任意の配列であり得る。 ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化される組換えRNAセグメントを含むR NA標準を作製する方法の好ましい実施態様は、以下を含む：（１）Operator配列 をコードする配列、ウイルスMaturase結合部位をコードする配列、および非バク テリオファージ配列を含む組換えRNAセグメントをコードするDNA配列を含むベク ターを得る工程；（２）ベクターを細胞にトランスフェクトする工程；（３）ウ イルス被覆タンパク質をコードするDNAセグメントを得る工程、およびウイルス 被覆タンパク質をコードする核酸セグメントを細胞にトランスフェクトする工程 ；（４）ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNAセグメントを得る工程、 およびウイルスMaturaseタンパク質をコードする核酸セグメントを細胞にトラン スフェクトする工程；ならびに（５）組換えRNAセグメントの転写、ウイルス被 覆タンパク質およびウイルスMaturaseタンパク質の発現、ならびにウイルス被覆 タンパク質中での組換えRNAセグメントのキャプシド化を可能にする条件下で細 胞を培養する工程。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、ウイルス被 覆タンパク質をコードするDNAセグメントが、組換えRNAフラグメントをコードす るDNA配列を含むベクター中に含まれる。より好ましくは、ウイルス被覆タンパ ク質をコードするDNA配列は、組換えRNAセグメントをコードするDNA配列に対し てシスで配置される。本発明の好ましい実施態様において、ウイルスMaturaseタ ンパク質をコードするDNAセグメントは、組換えRNAセグメントをコードするDNA 配列を含むベクター中に含まれ、そしてさらに好ましくは、組換えRNAセグメン トをコードするDNA配列にシスで配置される。 本発明はまた、以下を包含する、インビボでRNAを作製する方法を意図する： （１）Operator配列をコードする配列、ウイルスMaturase結合部位をコードする 配列、および非バクテリオファージ配列を含む組換えRNAセグメントをコードす るDNA配列を含むベクターを得る工程；（２）ベクターを細胞にトランスフェク トする工程；（３）ウイルス被覆タンパク質をコードするDNAセグメントを得る 工程、およびウイルス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントを細胞にトラ ンスフェクトする工程；（４）ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNAセ グメントを得る工程、およびウイルスMaturaseタンパク質をコードする核酸セグ メントを細胞にトランスフェクトする工程；ならびに（５）組換えRNAセグメン トの転写、ウイルス被覆タンパク質およびウイルスMaturaseタンパク質の発現、 ならびにウイルス被覆タンパク質中への組換えRNAセグメントのキャプシド化を 可能にする条件下で細胞を培養する工程。これらの方法は、被覆タンパク質から 組換えRNAセグメントを単離する工程をさらに包含し、そしてこの工程は、イン ビボ（すなわち、細菌細胞内）での大量の所望のRNAの産生を可能にする。次い で、単離されたRNAセグメントは、非バクテリオファージ配列を含むRNAセグメン トを得るために処理され得る。例えば、リボザイム配列、RNase H、およびRNA中 に配列特異的切断を生じるように機能する相補DNAオリゴヌクレオチド、ならび に他の分子生物学的手段が、非バクテリオファージ配列またはその一部から所望 されないRNAを除くために使用され得る。次いで、所望のRNAセグメントは、当該 分野で公知の手段によって精製され得る。例えば、インビボでの転写のこの方法 において使用され、そして得られるDNAベクター、RNAセグメント、細胞などは、 上記の任意のものであり得る。 本発明はまた、以下を包含する、インビトロでウイルス被覆タンパク質中のRN Aセグメントをキャプシド化する方法を意図する：（１）標準RNAをコードする配 列を含むRNAセグメントを得る工程；（２）ウイルス被覆タンパク質を得る工程 ；および（３）ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化される標準RNAをコー ドする配列を含むRNAセグメントを生じる条件下で、標準RNAおよびウイルス被覆 タンパク質をともに含むRNAセグメントを配置する工程。 本発明はさらに、以下を包含する、インビトロまたはインビボで細胞にRNAを 送達する方法を意図する：（１）ウイルスコートタンパク質中にキャプシド化さ れる標準RNAをコードする配列を含むRNAセグメントを含むArmored RNATMを得る 工程；（２）Armored RNATM培養物を細胞と一緒に配置する工程；および（３）A rmored RNATMの細胞への取り込みを生じる条件下で細胞を培養する工程。 このような方法において、Armored RNATMは、細胞へのRNAの送達を容易にする ように改変されているバクテリオファージタンパク質を含み得る。例えば、改変 されたバクテリオファージタンパク質は、ウイルス被覆タンパク質またはMatura seタンパク質である。 E．coliおよび他の細菌に感染する、多くの種々の一本鎖および二本鎖DNAバク テリオファージが存在する。一本鎖DNAバクテリオファージの例として、φX174 およひM13が挙げられる。二本鎖DNAバクテリオファージの例として、T4、T7、ラ ムダ（λ）、およびファージP2が挙げられる。M13およびλが、分子生物学者に よって広範に使用されており、そしてこれらのバクテリオファージの組み換え体 を作製することはどちらかといえば簡単である。RNAバクテリオファージを使用 する場合、DNAバクテリオファージの組換え体は、核酸に基づくアッセイを使用 する特定のDNAウイルスについての定量的標準として作用する特定のDNA配列を用 いて構築および定量され得る。いくつかのヒトDNAウイルスは、HSV、EBV、CMV、 HBV、Parvoviruses、およびHHV6である。これらの標準の利点は、これらのDNA標 準がDNaseに対して保護され得ることである。 インビトロでの転写によって合成されるRNAは、インビトロでバクテリオファ ージタンパク質でパッケージされ得る。この方法は、非常に特異的な配列のRNA 種を保護するために有用である。すなわち、reRNAは被覆タンパク質およびMutur ase配列をコードすることを必要としない。被覆タンパク質および／またはMutur aseに対する結合配列のみが、RNA転写物中に含まれ、そして被覆タンパク質およ び／またはMaturaseは外因的に提供される。キャプシド化は、転写と同時または 転写後に生じ得る。適切な条件下でのRNAと被覆タンパク質との組合せによって 、RNAが被覆タンパク質でキャプシド化されて、ファージ様粒子を形成すること が示されている（LeCuyer，1995）。被覆タンパク質によるキャプシド形成は、O perator配列または長いRNA転写物（Beckett，1988）によって刺激される。キャ プシドは、Operator配列または任意のRNAを含まずに形成するが、次いで、被覆 タンパク質の濃度はさらにより高くならなければならない。従って、被覆タンパ ク質は、RNAに添加されない限りはキャプシド形成を導かない濃度で保存され得 る。このストラテジーを使用して、RNAの長さおよび濃度に依存して、RNAはOper ator配列を必要とし得るか、または必要とし得ない。このストラテジーは、それ 自体をmRNA（5'キャップおよび3'ポリＡテイルを有するRNA）をパッケージする ように導き得、これは次いで、トランスフェクション研究において使用され得る （以下を参照のこと）。Maturaseは、パッケージされたRNAがリボヌクレアーゼ に対して保護される構築物を形成するために必要とされ得る。 種々の別々の長さのRNAが、Armored RNATMとして大量に産生され得る。この大 きさは、それらのArmored RNATM形態において等量で混合され得る。この混合物 は、変性溶液中で加熱され得、そして変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で 直接泳動され得るか、またはRNAは、混合物から精製され得、次いでRNAサイズ標 準として変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で泳動され得る。あるいは、リ ボヌクレアーゼ耐性である種々の長さの化学的に改変されたRNAが、転写され得 る。これらのRNAは、ゲル電気泳動においてサイズ標準として使用され得る。 図面の簡単な説明 図１。４℃で保存されたAR-2標準により生じたシグナルの濃度（consistency ）。AR-2標準（80 QS RNA相当物）を、0.2mlのHIV陽性血清に添加し、そしてAmp licorTM HIV MonitorTM試験を使用して処理した。21のアッセイを、水中で４℃ で保存したAR-2標準の同じストックを使用して38日の期間にわたって行った。 図２。ヒト血清中でのインタクトなAR-2標準または裸のAR-2 RNAのインキュベ ーション効果。AR-2（500 RNA相当物）またはAR-2から単離された裸のRNA（5000 RNA相当物）のいずれかとしてキャプシド化された規定量のRNAを、延長した期間 、室温（21℃）にてヒト血清とともにインキュベートした。コントロールとして 、裸のAR-2 RNAおよびインタクトなAR-2標準を、両方を平行してTris緩衝液中で 共インキュベートした。パーセント回収率を、［（ゼロ時点でのサンプルのOD45 0 ×希釈因子(DF)）／（各インキュベーションの終わりでのOD450×DF）］×100 として計算する。 例示的な実施態様の説明 以下の実施例は、リボヌクレアーゼ耐性RNAの産生および使用を記載し、reRNA がリポヌクレアーゼ活性によって保護され得る程度、および本発明の適用を示す 。 実施例１ HIVを定量するためのArmored RNATMの産生およびArmored RNATMの使用 １．Armored RNATMの構築 Armored RNATM標準は、Maturaseおよび被覆タンパク質遺伝子のみを含むRNAバ クテリオファージMS2の改変バージョンである。RNAバクテリオファージMS2の全 長のcDNAクローン（pMS27）は、野生型の感染性MS2バクテリオファージの産生に 必要な全ての遺伝子を含む（Shaklee，1990）。 MS2のMaturaseおよび被覆タンパク質をコードするDNAのフラグメントを、プラ イマー5’CCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT3'（センスプライマー、配列番号１）および 5’GATTAGATCTGAGTTGAACTTCTTTGTTGTCTTC3'（アンチセンスプライマー、配列番 号２）を使用して、PCRTMによってpMS27から合成した。BglII制限配列を、発現 ベクターpSE380（Invitrogen Corporation）へのこのPCRTM産物のクローニング を媒介するように、アンチセンスプライマー中に組み込んだ。PCRTM産物を、Gen iePrepTM（Ambion，Inc.）を使用して精製し、そして70μlの水を用いてガラス 線維パッドから溶出した。GeniePrepTMは、通常のアルカリ溶解手順に基づいて プラスミドDNAを精製するDNA単離キットである（Birnboim，1983）。PCRTMフラ グメントを、NcoIおよびBglIIで消化した。10μlの10×React 3 Buffer（BRL;0. 5M Tris[pH8.0];0.1M MgCl2;1M NaCl）、20μlの水、および３μlのNcoIおよびB glII を、精製したPCRTM産物に添加し、そして37℃で2.5時間インキュベートした。Nc oI部位は、Maturase遺伝子の開始コドンのすぐ5'に位置するMS2ゲノム中の天然 に存在する配列である。消化したPCRTM産物を、GeniePrepTM（Ambion．Inc.）で 再度精製し、そして70μlの水で溶出した。 消化したPCRTMフラグメントを、ベクターpSE380のNcoIおよびBglII部位に連結 した。BglIIおよびNcoIで予め消化したpSE380を、BglIIおよびNcoI消化したPCRT M 産物と、１×Ligation Buffer（50mM Tris[pH7.8];10mM MgCl2、10mM DTT;１mM ATP;0.025mg/mlアセチル化BSA、Ambion，Inc.）中でT4 DNA Ligase（Ambion，I nc.）を用いて組み合わせた。連結反応物を、室温（約21℃）で４時間インキュ ベートした。連結産物を、コンピテントE．coli DH5α株細胞に形質転換し、次 いでCb100-LBプレート上で37℃で16時間拡大させた。生じたコロニーのいくつか を採取し、Cb25-LB培地中で増殖させ、プラスミドDNAをGeniePrepTM（Ambion，I nc.）を使用して単離し、次いでNcoIおよびBglIIでのDNAの消化によるPCRTM産物 と同じ大きさを有するDNAインサートをスクリーニングした。pSE380ベクターは 、E．coli RNA Polymeraseターミネーター配列rrnBT1T2、マルチクローニング部 位の3'、709から866位を含む。 生じた構築物を、pAR-1と命名する。配列番号３。両方のバクテリーファージ 遺伝子は、pSE380によって発現されるlacIタンパク質により調節される強力なtr cプロモーターの下流に存在する。Operator配列（pac部位）は、被覆タンパク質 配列のすぐ下流のNcoI/BglIIフラグメント中に存在する。Lysis遺伝子の短縮バ ージョンもまた存在するが、コードされるペプチドは活性形態のタンパク質では ない。pSE380は、IPTGの存在下で不活化されるサプレッサーであるlac 1qをコー ドする。従ってバクテリオファージ遺伝子の転写は、IPTGが培養培地に添加され 、そしてtrcプロモーターが活性化されるまで下方調節される。転写は、rrnBT1T2 ターミネーター配列によって停止される。 Maturaseタンパク質、被覆タンパク質、およびこれらのタンパク質をコードす るRNAを、安定なバクテリオファージ様Armored RNATM粒子の産生に使用した。Ma turaseタンパク質は、バクテリオファージ様粒子を安定化させそしてバクテリオ ファージ様粒子内に含まれるRNAにさらなる保護を与えると推測されるArmored R NATMの重要な成分であると推測される。従って、本発明の多くの好ましい実施態 様は、Maturaseタンパク質を含む。Maturaseコード配列中には、Maturaseタンパ ク質の結合部位が存在する（Shiba，1981）。Maturase結合部位は、reRNAのパッ ケージングに寄与する配列としてreRNA中に含まれるために必要であると推測さ れる。被覆タンパク質は、これがバクテリオファージ粒子の塊を作製するので、 重要な成分である。Lysis遺伝子またはReplicase遺伝子を含むことは必要ではな いと推測される。なぜなら、どちらの遺伝子もパッケージングには関与しないか らである。一旦転写が誘導されると、E．coli RNA Polymeraseが、Maturaseおよ び被覆タンパク質をコードするプラスミドDNAのRNAセンス（＋）鎖から転写する ので、Replicaseは必要ではない。しかし、以前に記載したように、RNA標準にシ スで存在するMaturaseおよび被覆タンパク質の遺伝子を有する必要はない。これ らは、別のベクターからトランスで供給され得るか、またはE．coli染色体中に 組み込まれ得る。 Armored RNATMを、pAR-1組換えプラスミドを使用して産生した。このプラスミ ドを有するE．coli DH5α株を、25μg/mlのカルベニシリン（Cb25）を含むLB培 地（水中10g/lトリプトン、５g/l酵母エキス、10g/l NaCl、pH7.0〜7.5）中で20 Orpmで37℃にて一晩増殖させた。0.2mlの一晩培養物を使用して、２mlの新鮮なC b25-LB培地に接種し、そして1.5時間37℃にて200rpmでインキュベートした。発 現を、IPTGを１mMまで添加し、そして３時間37℃にて200rpmでインキュベートす ることによって誘導した。 細胞をペレット化し、次いで0.25mlの5mM MgSO4:0.1M NaCl:50mM Tris（pH8.0 ）(Sonication Buffer)中に再懸濁した。細胞を小さな超音波処理プローブ50％ 効率サイクル、５パルスのプローブあたり５単位の出力（power）で超音波処理 した（Branson Sonifier 450）。超音波処理物を１分間氷冷し、次いで超音波処 理工程を繰り返した。超音波処理物を遠心分離して、細胞の破片をペレット化し た。20μlの上清を100ユニットのE．coli RNase 1および２ユニットのウシ膵臓D Nase 1とともに37℃にて40分間インキュベートして、E．coli RNAおよびDNAを除 去した。ヌクレアーゼ処理後、15μlの上清をTBS緩衝液中でアガロースゲル上で 電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色してArmored RNATMについてア ッセイした。 Armored RNATMは、Armored RNATMとともにゲル上で泳動した２つの異なるDNA のサイズ標準（HindIIIで消化したλDNA、およびSau 3Aで消化したpUC19プラス ミドDNA）と比較して、900〜1000塩基対の二本鎖DNAフラグメントの移動度を有 した。この移動度は、野生型MS2バクテリオファージの移動度と非常に類似して いた。DNaseまたはRNaseでのArmored RNATMの処理は、それらの染色の強度また はそれらの電気泳動移動度に影響を与えなかった。リボヌクレアーゼ１（100ユ ニット、Ambion，Inc.）およびDNase １（２ユニット；Ambion，Inc.）を別々に 添加するか、または同時に20μlのArmored RNATM上清に添加した。上清をこれら の酵素とともに37℃で40分間インキュベートし、次いでTBE緩衝液中で0.8％のア ガロースゲル上で分画した。高分子量のE．coliゲノムDNAおよびE．coli RNAを 適切な酵素で消化したが、Armored RNATMのシグナルがスメアになる傾向にある 上清中のE．coli核酸の存在のために、シグナルがより強くなり、そして分解さ れた以外は、Armored RNATMのシグナルに変化はなかった。しかし、ヌクレアー ゼは、ゲノムDNAおよび宿主RNAを分解した。 非誘導性細胞は、いくつかのArmored RNATMを合成するが、非誘導性細胞より もはるかに少ない。E．coli中のpAR-1の２つの培養物は、中間対数増殖期のCb25 -LBまで培養した。次いで、１つの培養物を１mMのIPTGとともにインキュベート し、そして他はそうしなかった。両方の培養物を、さらに３時間、37℃にて200r pmで増殖させ、次いで培養物をArmoreld RNATM産生についてアッセイした。ゲル 電気泳動およびエチジウムブロミド染色によるアッセイによると、非誘導性細胞 よりも多くのArmored RNATMが誘導性細胞において合成された。細胞をまた16時 間インキュベートし、そしてこのプロトコルによって、３時間の誘導よりもさら に多いArmored RNATMの産生を生じた。1.7kbの短縮型バクテリオファージRNAを 含むArmored RNATMのリボヌクレアーゼ耐性は、全長3.6kbのMS2バクテリオファ ージゲノムがArmored RNATM粒子の産生に必要とされないことを示す。 ２．Armored RNATM HIV標準の構築 pAR-1は、AmplicorTM HIV MonitorTMキット（Roche Diagnostic Systems）で 比 較される定量的HIV RNA標準の作製のための骨格として作用する。この研究は、A rmored RNATMが使用され得る方法の１つの例を示す。 QS RNAは、AmplicorTM HIV MonitorTM試験における裸のRNA標準である。QS RN Aは、HIV由来のgag遺伝子の保存された配列をコードするが、ランダム化された 配列の26bpの置換もまた含む。このランダム配列は、HIV RNAおよびQS RNAがMon itor試験において同時に増幅されるので、QSアンプリコンから野生型HIVアンプ リコンを区別するために使用される。 RT-PCRTMを裸のQS RNAに適用して、QS配列をコードし、そしてBglIIおよびKpn I制限部位を含むDNAフラグメントを産生した。以下のプライマーを使用した：5 ’GATTGGTACCTGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT 3'（配列番号４）および5’GATTAGA TCTAAGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT 3'（配列番号５）。これらのプライマー は、KpnI配列がSK431プライマーに付加され、そしてBglII配列がSK462プライマ ー中に組み込まれたことを除いて、Monitorキット（Mulder，1994）において使 用されるSK431プライマーおよびSK462プライマーにそれぞれ対応する。QS PCRTM 産物を、BglIIおよびKpnIで消化し、そしてpAR-1のBglIIおよびKpnI部位に連結 して、組換えプラスミドpAR-2（配列番号６）を作製した。pAR-2のNcoI/KpnIフ ラグメントのDNA配列。 Maturase、被覆タンパク質、およびQS RNA配列を含むNcoI/KpnIフラグメント を、発現ベクターpSE380（Invitrogen Corp.）のNcoI/KpnI制限部位にクローニ ングして、pAR-2（配列番号６）を産生した。インサートの重要な領域は以下を 含む：NcoI（１＞６）、BglII（1713＞1718）、KpnI（1862＞1867）、Maturase コード配列（53＞1231）、被覆タンパク質コード配列（1258＞1647）、Lysis Pr otein（1601＞1711）、QS配列内のCapture配列（1757＞1782）、QS Amplicon領 域（1720＞1861）、SK462プライマー（1720＞1749）、SK431プライマー（1861＞ 1835）、Maturase結合部位（311＞337）、およびOperator配列またはpac部位（1 667＞1687）。配列番号６。 E．coli中のpAR-2を、37℃200rpmで３時間、中間対数期でCb25-LB中で１mMのI PTGでインキュベートした。誘導した細胞をペレット化し、次いでAR-1粒子に使 用されるSonication Buffer中で超音波処理した。次いで、細胞の断片を遠心分 離 によってペレット化した。超音波処理物の上清を、RNase １（５ユニット／μl ）およびDNase １（0.1ユニット／μl）とともに37℃で30分間インキュベートし 、次いでアガロースゲル上で分画してエチジウムブロミド染色によって可視化し た。AR-2粒子を、同じゲル上で泳動したDNAマーカーと比較して約900塩基対に移 動する蛍光バンドとして検出した。 AR-2粒子を含むAR-2超音波処理物の上清を、インキュベーションを16時間行っ たことを除いて上記と同じ条件下でRNase 1およびDNase 1とともにインキュベー トした。AR-2の別のサンプルを、16時間37℃でインキュベートしたが、ヌクレア ーゼを添加しなかった。これらのサンプルを、アガロースゲル上で分画し、そし て４℃で保存したAR-2調製物と比較した。AR-2シグナルは、ヌクレアーゼで処理 したサンプルにおいて最も強かった。なぜなら、ヌクレアーゼが、AR-2シグナル を覆っていた核酸を分解したからである。 AR-2をまた、培養上清から単離した。pAR-2形質転換E．coliを、1mMのIPTGと ともに16時間、50mlのCb50-LB培地中でインキュベートした。接種および誘導を 同時に行った。0.4mlのリゾチーム（50mg/ml）を培養物に添加し、そして37℃に て200rpmで１時間インキュベートし、続いて、0.4mlの1-ブロモ-3-クロロ-プロ パン-とともに37℃にて200rpmで10分間インキュベートした。細胞の破片を、SS3 4ローター中での４℃での9000rpm、10分間の遠心分離によってペレット化した。 培養上清を新鮮なチューブに移し、そして0.015mlの1-ブロモ-3-クロロ-プロパ ンを添加した。培養上清を４℃で保存した。0.015mlの培養上清をアガロースゲ ル上で分画し、そしてエチジウムブロマイド染色およびUV蛍光によって検出した 。AR-2を、上清ならびにE．coli由来のゲノムDNA中で検出した。しかし、E．col i細胞質から単離されたAR-2とは異なり、このAR-2調製物は、検出可能なE．coli RNAを含まなかった。使用した増殖培地由来のAR-2の0.5mlのプレップを、10ユニ ットのDNase 1とともに37℃で70分間処理した。ゲル電気泳動によって評価する と、DNase 1は宿主DNAを完全に分解したが、AR-2には影響を与えなかった。 超音波処理によりE．coliの細胞質から単離された0.02mlのAR-1およびAR-2粒 子を、２ユニットのDNase1および100ユニットのRNase1で37℃、２時間、そして 次いで全ての宿主E．coli RNAおよびDNAを分解させるために21℃、16時間処理し た。ARプレップを、QSアンプリコンに特異的なプライマー対SK431およびSK462（ Mulder、1994）ならびにMS2バクテリオファージ配列に特異的なプライマー対MS2 -1およびMS2-2を用いて、単一なチューブRT-PCRTMに供した。Armored RNATMプレ ッブをPBS中で10、100、および1000倍に希釈した。RT-PCRTMを、SK431/SK462お よ娘4S2-1/MS2-2プライマー対を使用して、１μlの各Armored RNATM希釈液を用 いて行った。逆転写工程の前に、Armored RNATMプレップを、95℃で５分インキ ュベートし、Armored RNATMの保護タンパク質コートを分解した。RNAを、プライ マーの存在下で氷上で冷却し、そして次いで100ユニットのMMLV-RTで42℃、１時 間インキュベートした。2.5μlのTaqポリメラーゼを添加し、その後PCRTMを行っ た。PCRTM産物を、ゲル電気泳動により分画した。AR-2のみがSKプライマーを伴 った142bpの予期されたPCRTM産物を生成し、一方、AR-1およびAR-2は、MS2プラ イマーを用いた411bp産物を生成した。これらの結果は、QS RNA標的およびMS2 R NA標的を含むAR-2粒子と一致し、一方、AR-1はMS2配列のみを含んだ。 当然、上記のプロトコルは、DNA配列（目的のRNA配列をコードする）のpAR-1 （配列番号３）のような組換えプラスミドへのクローニングにより、任意のほと んどのRNA標準を生成するために改変され得る。このプラスミドはMaturase、被 覆タンパク質、およびOperator配列をコードし、そしてpAR-1のBglII制限部位の すぐ下流（3'）に好都合な多くの制限酵素部位が存在する。これらの制限部位は 、pSE38Oのマルチプルクローニング部位（ヌクレオチド396〜622）において本来 コードされる制限部位と同じである。したがって、DNAフラグメントは、pSE380 へのクローニングのために化学的に合成され得る。あるいは、PCRTMまたはRT-PC RTMは、DNAフラグメントの両末端に制限部位を導入するプライマーを使用して、 長いDNAフラグメント(＞100bp)を合成するために使用され得る。PCRTM DNAフラ グメントは、pAR-1へのクローニングのために消化され得る。 より大きい遺伝子フラグメントを使用することの利点は、これらの遺伝子の異 なる領域に対するPCRTMプライマーが、単一のArmored RNATM標準と共に使用され 得ることであり、使用され得る各PCRTMプライマーのための異なるArmored RNATM 標準を構築する必要はない。HIV RNA配列（１〜３kb）の大きいフラグメントがA rmored RNATM中にパッケージングされる場合、使用者は、RT-PCRTMを行うための 種々のプライマー対を使用することの選択肢を有する。この型の構成物は、研究 者が現在使用しており、そして研究者がArmored RNATM標準を使用するためにプ ライマー対を変える必要がないプライマー対に、より容易に適合し得る。使用者 は、例えば、HIVモニターアッセイにおいて使用される短い142塩基対の領域を使 用する場合のように、１セットのプライマー対のみに限定されない。 当然、HIV配列は野生型配列からの改変を含み得、これは、定量的標準として 競合的PCRTMにおいてArmored RNATMを使用する目的のために、標準配列が野生型 から区別されることを可能にする。このような改変は、挿入、欠失、および制限 酵素配列を含む。 Armored RNATMとしてパッケージされ得る非バクテリオファージRNAの最大限界 は知られていない。しかし、MS2の全長ゲノムは約3.6kbであり、そしてpAR-1は 約1.7kbのMS2ゲノムのみコードする。それゆえ、最小として、少なくとも２kbの 非バクテリオファージRNA配列がArmored RNATMとしてキャプシド化され得る可能 性が非常にあり、そしてMaturaseおよび被覆タンパク質遺伝子がトランスで提供 される場合、おそらくより可能性がある。 ３．HIVのための定量的RNA標準として使用されるAR-2 AmplicorTM HIV MonitorTM試験において、血漿または血清からHIV RNAを単離 するために、裸のQS RNA標準を、Lysis緩衝液を使用する直前にLysis緩衝液に添 加する。このようにすれば、QS RNAが血漿サンプルに添加され、そして、HIV RN AおよびQS RNAが同時精製される。単離の後、RNAを、逆転写酵素および熱安定性 DNAポリメラーゼとして機能するTth DNAポリメラーゼを使用して、RT−PCRTMに 供する。RT-PCRTM後、PCRTM産物を、ウェル底に固定化されたオリゴヌクレオチ ド（捕捉プローブ）を含むELISAプレートのウェル内でインキュベートする。１ セットのウェルは、HIVの野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有す る。他の捕捉プローブは、QSアンプリコンにおける特有の配列を認識する。従っ て、HIV捕捉プローブは、QS捕捉プローブが、RT-PCRTM同時増幅から生じるQSア ンプリコンにハイブリダイズする場合、HIVアンプリコンにハイブリダイズする 。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしたアンプリコンの量を、西洋 ワサビペルオキシダーゼを使用して、酵素学的および比色的に定量する。製造者 により 推奨される標準アッセイ形式において、キットのロット番号に依存して、約60〜 80コピーのQS RNA標準を分析用の各サンプルに添加する。 AmplicorTM HIV MonitorTM試験におけるArmored RNATMを試験するために、裸 のQS RNA、および濃縮されたAR-1およびAR-2を、AmplicorTM HIV MonitorTM試験 に供した。QS RNA、AR-1、およびAR-2をLysis緩衝液に添加し、RNAを単離し、次 いでRT-PCRTM手順に供した。PCRTM産物をアッセイプレート上で検出した。QS RN Aは予期されたシグナルを生成し、AR-1はネガティブであり、一方AR-2は目盛り を超えるほど強いシグナルを生成した。一旦濃縮されたAR-2プレップが30,000,0 00倍希釈されると、シグナルはQS RNA標準に匹敵するようになった。AR-2プレッ プを30,000,000倍希釈し、１mlあたり8,000コピーのQS RNAと等価であるArmored RNATMのストックを生成した。この10μlのAR-2ストックは、AmplicorTM HIV Mo nitorTMアッセイにおいて、キットと共に提供される推奨される量の裸のQS RNA 標準と同じシグナルを生成した。 AR-2を水中で希釈し、そして数ヶ月の期間にわたり４℃で貯蔵した。希釈した AR-2を、AmplicorTMアッセイにおいてQS RNAと同様のシグナルを生成するように 較正した。多数のAmplicorTMアッセイを、同じ希釈されたAR-2のストックと共に 行った。38日間の間、AR-2と共に生成されるシグナルにおいて検出可能な減少は なく、これらのRNA標準の耐久性が強調される（図１）。この結果は、このAR-2 ストックがE．coliからの粗調製物であり、そしてリボヌクレアーゼを含んだこ とを考慮すると顕著である。 ４．裸のRNAと比較したArmored RNATMの耐久性 Armored RNATMの１つの利点は、溶解手順の前に溶解溶液にArmored RNATM標準 を添加することよりもむしろ、Armored RNATM標準が、RNA単離の前に血漿サンプ ルまたは血清サンプルに添加され得、従って、アッセイにおけるピペッティング 誤差を最小化することである。Armored RNATMは、裸のRNAと比較して非常に良好 に血漿／血清ヌクレアーゼに耐性である。 AR-2から精製された10μlのRNA（約5000のQS RNAに等価）およびインタクトな AR-2（約500のQS RNAに等価）を、0.2mlの正常なヒト血清に各々添加し、そして 21℃で０秒、15秒、30秒、１分、５分、15分、１時間、および４時間でインキュ ベートした。インキュベーションを、４Ｍのグアニジンチオシアネートおよび１ ％のSarkosyl溶液の添加により停止し、そしてRNAをChomczynski（1987）の方法 に従って、血清から抽出した。50μlの精製したRNA調製物を、SK431/SK462プラ イマー対を使用して26サイクルでRT-PCRTMにより増幅した。PCRTM産物を、固相E LISAシステムを用いて定量した（Mulder、1994）。 AR-2は、AR-2から精製したRNAからのシグナルはほぼすぐに消失したが、全時 間経過にわたり同じシグナルを生成した（図２）。明らかに、AR-2におけるRNA は、裸のQS RNAと比較して、血漿リボヌクレアーゼに対して保護された。 実施例II HIVを定量するためのArmored RNATMの使用 １． AmplicorTM HIV MonitorTMアッセイにおけるArmored RNATM標準の使用 AmplicorTM HIV MonitorTMアッセイを行うために、既知量の定量的RNA標準を 、患者の血漿サンプルに添加し、次いでRNAを血漿から単離する。標準およびHIV RNAが、単一のプライマーセットを用いて同時増幅されるように、RT-PCRTMをRNA において行った。両方のPCRTM産物を測定し、そして次いでHIV RNAの濃度を、定 量的標準から得られるシグナルを使用して計算する。 QS配列を含むArmored RNATM標準（AR-2）を、以下のようにAmplicorTM HIV Mo nitorTM試験において使用する。既知量（約10μl）のAR-2を、0.2mlのサンプル 血漿に添加する。0.6mlのLysis Reagentを、AR-2を含む血漿サンプルに添加する 。サンプルを３〜５秒撹拌することにより混和し、そして次いで室温で10分間イ ンキュベートする。0.8mlのイソプロパノールをサンプルチューブに添加し、そ してサンプルを３〜５秒撹拌することにより混和する。サンプルを最大速度（約 16,000×g）で15分間遠心分離する。上清を、ペレットを壊さないで廃棄する。1 mlの70％エタノールを添加し、そしてサンプルを３〜５秒撹拌し、続いて５分間 、約16,000×gで遠心分離する。 ペレットを、0.4mlのSpecimen Diluentに再懸濁する。50μlの抽出サンプルを 、Master Mixを含むMicroAmpチューブに添加し、そしてTth Polymeraseを使用し てRT-PCRTMを行う。 増幅後、0.1mlのDenaturation Solutionをアンプリコンに添加する。0.1mlのH ybridization Solutionを、アンプリコンの検出のために使用されるMicrowell P late（MWP）の各ウェル中に配置する。25μlの変性されたアンプリコンを、第一 のウェルに添加し、そして次の４連ウェルにおいて25μlを使用して１：５希釈 を行い、その結果、HIVアンプリコンの検出のための１：５、１：25、１：125、 １：625および１：3125の希釈物が存在する。１：５および１：25の希釈物を、Q Sアンプリコンの検出のために適切なウェルにおいて作成する。MWPを１時間、37 ℃でインキュベートする。 ウェルをWorking Wash Solutionで５回洗浄し、そして次いで0.1mlのAV-HRPを 各ウェルに添加し、そして15分間37℃でインキュベートする。 MWPをWorking Wash Solutionで５回洗浄する。次いで0.1mlのWorking Substra teを各ウェルに添加し、そしてMWPを、暗室で室温にて10分間インキュベートす る。0.1mlのStop Solutionを各ウェルに添加し、そして吸光度を450nmで測定す る。血漿中のHIVの濃度を、患者の血漿に添加された既知濃度のQS標準から得ら れたシグナルに基づいて計算する。 HIV MonitorTMアッセイにおける裸のQS RNA標準のための代用としてArmored R NATMを使用することに加えて、Armored RNATMはまた、アッセイにおいてポジテ ィブコントロールとしても使用され得る。HIV MonitorTM試験と適合性のあるHIV の野生型配列を、それが野生型HIVのように挙動するように、Armored RNATM中に パッケージングし得る。この実施態様において、Armored RNATM HIV Positiveコ ントロールを既知量で正常血漿に添加し、次いで、使用者がアッセイにおいて特 定の所定の値を得ることを予期し得ることを除いて、患者のサンプルのように加 工する。この標準は、このアッセイが適切に機能していることを使用者に示すた めに使用され得る。 ２．Armored RNATMに良好に適した改変されたAmplicorTM HIV MonitorTM試験手 順 AmplicorTMアッセイにおいてHIVの検出感度を増加するために、HIVウイルス粒 子が血漿サンプルから高速度遠心分離によりペレット化される手順を開発した。 従って、ここでは、1mlの血漿が、アッセイが使用されていた通常の0.2mlの代わ りにアッセイされ得る。この手順は、遠心分離工程が100％のHIVウイルス粒子 をペレット化する場合、感受性を理論的に５倍増加させるべきである。このプロ トコルは、HIVの定量アッセイとしてのみ有用である。 この新しい手順において、裸のQS RNAは、最適の標準ではあり得ない。裸のQS RNAは、それを分解する血漿中のリボヌクレアーゼのために血漿サンプルに添加 され得ず、そして裸のQS RNAは、HIVウイルス粒子と共に遠心分離によりペレッ ト化され得ない。従って、血漿が遠心分離後に除去されるとき、HIVペレットの 損失についてのコントロールは存在しない。Armored RNATMは、遠心分離の前に 血漿に添加し得る。それはHIVと同様にペレット化するべきである。従って、ペ レットの任意の損失が、Armored RNATM標準から得られるシグナルにおける等し い損失に反映され得る。重要なことには、Armored RNATM標準の使用は、定性的 アッセイから定量的アッセイに遠心分離プロトコルを変え得る。 ３．他のアッセイにおけるArmored RNATMの使用 当然、本発明は、単一の例示的なアッセイに限定されない。HIVの他のRNAに基 づくアッセイが存在し、以下を含む：等温性増幅に基づくNASBA（van Gemen，19 94；Organon Teknikaにより販売された）；Chironにより開発された分枝DNAアッ セイ；抗体がDNA/RNA二重鎖を認識するDiGeneによるアッセイ；および転写媒介 増幅（Gen-Probeにより開発されたNASBAと同様の技術）。これらの各アッセイの ために、当業者は、定量標準として適切に機能する適切な配列（単数または複数 ）を含むArmored RNATM標準を構築し得る。 HIV NASBAアッセイは、３つの異なる定量的RNA標準を使用する。これらの標準 の配列は、van Gemen（1994）において入手可能である。これらのNASBA標準の各 々は、QS配列がpAR-1にクローニングされてNASBAアッセイのためのArmored RNAT M 標準を生成する様式と同様の様式でpAR-1にクローニングされ得る。RT-PCRTMは 、pAR-1へクローニングするための各標準を増幅するために使用され得る。 Chironによる分枝DNAアッセイは、RNA標準として１本鎖DNAを使用する。これ はHIV SF2株のgagおよびpol遺伝子をコードする。HIVのこの株についての配列は 、GenBank（登録番号K02007）から入手可能である。このHIV標準配列は約３kbで あり、そしてその全長がArmored RNATM合成のためのベクターとしてpAR-1を使用 してパッケージングされるには、長すぎるかもしれない。より長い配列がパッケ ー ジングされることが可能であり得る異なる構築物を使用することが必要であり得 る。このようなArmored RNATM組成物の１つは、Maturaseタンパク質、被覆タン パク質、およびreRNAコード被覆タンパク質、Operator部位（複数または単数）M aturase結合部位、ならびにgagおよびpolをコードするHIV配列で構成され得る。 Maturaseは、transで供給される別のプラスミド上でコードされ得る。この構築 物において、reRNAからのMaturase Coding配列の欠失は、より多くの非バクテリ オファージ配列のパッケージングを可能にし得る。 実施例III HIVゲルベースAssayにおけるArmored RNATMの使用 Armored RNATMは、外部定量的標準として使用され得る。SK431およびSK462プ ライマーにより結合される領域、またはpol遺伝子をコードする配列のようない くつかの他の領域のようなHIVゲノムのフラグメントが、pAR-1骨格にクローニン グされ得る。この構築物は、クローニングされたHIVフラグメントの全長が野生 型HIV配列であるArmored RNATMを合成するために使用され得る。このようなアッ セイは、特有の捕獲配列を必要としない。なぜなら、各アンプリコンは、エチジ ウムブロマイド染色または32P取り込みでのPCRTM産物の標識およびオートラジオ グラフィーのいずれかにより、アクリルアミドゲルまたはアガロースゲルで検出 されるからである。検量線を、RT-PCRTMアッセイにHIV配列の既知量を導入し、 そして次いでゲル上で生成された産物の量を定量することにより作成する。次い で、試験サンプルの実際のコピー数を、検量線を用いて導き得る。Armored RNAT M を較正し、そして実際のHIVのようにRT-PCRTM反応において使用する。PCRTMフ ラグメントを、アガロースゲル電気泳動またはアクリルアミドゲル電気泳動のい ずれかにより分画し得、そしてエチジウム染色または放射活性により定量し得る 。検量線を、異なる濃度のArmored RNATMを含む血漿を加工することにより作成 し得る。次いで検量線を使用して、補間法により患者のサンプルの力価を計算し 得る。 実施例IV 非感染標準としてのArmored RNATMの使用 Armored RNATMは、非感染検定標準（アッセイの器具使用および方法の正確さ の検認のために設計された、保証されたまたは良好に特徴付けられた、血漿、血 清、または尿に基づく生成物）またはポジティブコントロールとして使用され得 る。標準HIV株の遺伝子フラグメントをArmored RNATM組換えプラスミドにクロー ニングし、Armored RNATM-HIV標準のファミリーを生成する。これらは、HIVで良 好に保存されているpolおよびgag遺伝子を含む。本発明者らは、AR-gag、AR-pol 、およびAR-gag/pol RNA標準を予期する。これらのArmored RNATM標準は正確に 定量され、そして次いでRT-PCRTMまたは他の増幅技術のための外部定量的標準と して使用され得る。Armored RNATMが直接血漿に添加され得、そしてそのような ものとして使用され得るか、またはAR-HIV RNAがPBSまたはTris:NaClのような標 準塩緩衝液において精製されたArmored RNATMから抽出され得る。 実施例Ｖ HCVアッセイで使用されるArmored RNATM標準 Armored RNATM技術は、培養が困難または危険であるウイルスのためのRNA標準 の作製において有用である。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、組織培養に おいて信頼性のある増殖をし得ず、一方HCVのためのArmored RNATM標準は、容易 に構築され、そして産生され得る。HCV単離物は、コア遺伝子領域またはNS5領域 におけるヌクレオチド配列変異に基づいて６つの異なる遺伝子型に分類され得る （Simmonds，1994）。遺伝子型特異的Armored RNATM標準は、特異的なHCV遺伝子 型およびHCVサブタイプ（例えば、1a、1b、2a、2b、2c、３、4a、4b、5a、およ び6a）を同定するために設計されるアッセイにおいて、コントロールとして作用 するように構築され得る。遺伝子型ストラテジーは、配列決定、RFLP分析、タイ プ特異的プライマーを用いるPCRTMに基づくアッセイ、および系統プローブアッ セイに基づいている（van Doorn，1994）。例えば、後者のアッセイは、HCVゲノ ムの56位から299位でプライマーから生成される244塩基対産物の分別捕獲を含む 。これらの株の各々を同定するために使用されるアンプリコンは、pAR-1にクロ ーニングされるDNAフラグメントを化学的に合成し、そして従って、これらの遺 伝子型配列をクローニングするために感染性の物質を扱う必要性を回避すること に 直結するのに十分に短い。ヒト血清サンプルからの保護された組換えRNAは、プ ライマーKY80（5’GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT）（KY80-配列番号７）およびKY78 （5’GTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT）（KY78-配列番号８）を用いて構築され得る。 定義された遺伝子型と共にサンプルを使用することにより、遺伝子型特異的組換 え標準は、構築され得る。HCVのためのArmored RNATM標準は、HIV標準と同様の ストラテジーを使用して構築され得る。これらのRNA標準は、株タイピングのた めのポジティブコントロールまたは定量的RNA標準のいずれかとして使用され得 る。 株タイピングのために、プライマーKY78およびKY80は、異なるHCV株からのRT- PCRTMによってDNAフラグメントを合成するために使用され得る。これらの株特異 的DNAフラグメントは、株特異的HCVをコードするRNAが、Armored RNATMとしてパ ッケージングされるように、pAR-1へクローニングされ得る。同様に、株特異的 配列もまた、HCVゲノムの56位から299位の間のHCVについて実証されている。こ れらの配列を化学的に合成し、そしてそれらをパッケージングのために直接pAR- 1にクローニングすることが可能である。この方法は、感染性HCVを操作する必要 性を回避し得る。従って、分別捕獲アッセイにおいて、HCVの各株特異的PCRTM産 物は、プラスチックウェルの底に固定化された特有の捕獲プローブにハイブリダ イズし得る。 定量的HCV Armored RNATM標準を作製するために、KY78およびKY80プライマー により生成されたアンプリコンが、HIVのためのQS配列において使用される同じ 捕獲配列において置換することにより改変され得るか、またはこのアンプリコン 内のいくつかの他の25〜30塩基対の領域が、それが野生型アンプリコンから区別 され得るようにランダム化され得る。置換はPCRTMにより当業者により行われ得 る。AmplicorTM HIVアッセイにおけるように、HCV定量的標準は、野生型RNAと共 に同時増幅され得る。HCV Armored RNATM標準は、RNA単離工程の前にサンプル血 漿に添加され得る。 実施例VI Armored RNATMの所定の量を含む回収チューブ Armored RNATMの耐久性および安定性により、Armored RNATMは、所定の量で血 液回収容器または他の液体回収容器中に分注され得る。次いでArmored RNATMを 、長期貯蔵のために室温で凍結乾燥するか、または緩衝化塩溶液中に残し、そし て４℃または室温（約21℃）においてさえ貯蔵され得る。使用の際、血液をArmo red RNATM標準と共に回収チューブ内に吸い出す。血液サンプルを、何回も撹拌 し、完全にArmored RNATM標準をサンプル中に混合する。血液を、定量的アッセ イに供するまで、通常通りに貯蔵され得る。このストラテジーは、血漿からのRN A単離の前に、RNA標準を血漿サンプルに添加する必要を除外する。それは、血液 細胞画分と血漿画分または血清画分との間のウイルスの分離のためのコントロー ルであり得る。 さらに、HIVおよびHCV標準のようなマルチプルArmored RNATM標準が、片方ま たは両方の病原体についての定量が行われ得るように、回収チューブ内に含まれ 得る。 実施例VII 獣医学的診断におけるArmored RNATMの使用 飼育された動物は、頻繁にRNAウイルスに感染する。ネコについては、レトロ ウイルスは自動車事故以外の早期死の最大原因を示す。曝露されたネコの３／１ までが、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）およびネコ白血病ウイルス（FeLV）（Ess ex，1995）（それらのヒト相当物であるHIVおよびヒトＴ細胞リンパ向性ウイル ス１型（HTLV）と同様）に感染する。当業者は、HIVについて記載されたAR-2標 準に類似した、FIVおよびFTLVについてのArmored RNATM標準を構築し得た。これ らの標準は、RT-PCRTMによりFIVおよびFeLV診断において定量またはポジティブ コントロールとして使用し得る。 実施例VIII 二本鎖RNAバクテリオファージの使用 バクテリオフアージφ６は、インビトロで非バクテリオファージRNAをパッケ ージングし、生存可能な、遺伝子的に安定なバクテリオファージを産生し得る二 本鎖RNAバクテリオファージである（Qiao，1995）。バクテリオファージφ６は 、 ヌクレオキャプシドに関連した３つの別々の断片の連続的なゲノムを有すること が示されている。ヌクレオキャプシドは、５つの成分タンパク質を含み、１つの P8は外側の殻を形成し、そして４つの他のP1、P2、P4、およびP7は内部粒子を形 成する。φ６ヌクレオカプセルは、インビトロで想定され得る（Olkkonen,1990 ）。これらのバクテリオファージ内のRNAは、リボヌクレアーゼから保護される ことが実証されている。当業者は、標準RNA配列を含む組換え体を生成し得、そ の結果、組換えバクテリオファージφ６は、ヒト感染性の二本鎖RNAウイルス（ 例えば、ロタウイルスおよび水痘性口内炎ウイルス）のための定量的標準として 作用し得る。この明細書の教示および当該技術に従えば、Armored RNATM標準と 同様に、バクテリオファージφ６でパッケージングすることが可能である（それ によりパッケージングされた物質は、生存可能／感染性ではない）。たとえば、 さらなるRNA配列は、バクテリオファージゲノムに添加または置換され得る。他 の二本鎖RNAバクテリオファージが同様に使用され得る。 二本鎖非感染性RNAバクテリオファージは、治療剤としての適用を有し得る。 二本鎖RNAは、インターフェロンのような抗ウイルス薬剤として作用する重要な 免疫調節因子を生成する細胞を刺激することが知られている（Stiehm,1982）。 実施例IX 細胞性mRNAの定量 当業者は、細胞により発現されたmRNAの定量にArmored RNATM標準を使用し得 る。ある期間にわたり特定のmRNAの誘導または抑制を決定する研究において、等 しい数の細胞を、調査の下で細胞が処置に曝露される前および後の各時点で、収 集し得た。Armored RNATM標準を、細胞からのRNAの精製の前の各時点に、既知量 で添加し得る。次いで、Armored RNATM標準を、例えば、サイトカイン、細胞周 期遺伝子、またはオンコジンのような標的mRNAの量を定量するために使用し得る 。Armored RNATM標準を標的遺伝子と同じプライマー対結合部位を含んで構築し 得る。Armored RNATM標準は、制限部位または欠失を組み込むような上記の方法 の１つを使用して、プライマー対間の配列を変化させることにより、野生型RT-P CRTM産物から区別され得る。当業者は、野生型配列と比較して挿入、欠失、また は置換を有 するアンプリコンを生成し得る。部位特異的変異誘発について入手可能ないくつ かの異なる方法が存在する。その各々は、所望の標準の配列をコードするオリゴ ヌクレオチドを含む。 欠失、挿入、および制限部位を含む標準は、しばしばゲルに基づくアッセイに 好ましい。なぜなら、それらはアガロースゲルまたはアクリルアミドゲル上での 分画により、野生型のアンプリコンから容易に区別されるからである。これらの 各標準について、約10％のサイズ差がしばしば使用される。PCRTMは、これらの 任意の標準配列を生成するために使用され得る。欠失変異体を生成するために、 プライマー配列ならびに他のアンプリコン配列を含むオリゴヌクレオチドが合成 される。アンプリコン配列およびプライマー配列は、欠失される野生型配列中の 配列に隣接する。このオリゴヌクレオチドが野生型にハイブリダイズするとき、 ポリメラーゼ伸長の間、欠失される配列はループアウトされ、そして新しいDNA 鎖中に組み込まれない。当業者は同様のストラテジーを使用し得、挿入および置 換を作製し、それによりPCRTM反応中のプライマーの１つは所望の変異を含む。 ２つのこのようなストラテジーは、Schneeberger(1996)およびHughes(1996)に詳 細に記載されている。 実施例Ｘ 商業的使用のためのArmored RNATM標準の調製 Armored RNATM標準は、RT-PCRTMによる定量に影響を及ぼし得る宿主DNAまたは RNAをまったく含まないことが重要である。均一なロットのArmored RNATM標準を 産生するために、粗抽出物を、E.coli形質転換体の16時間誘導後の培養上清から 調製する（実施例Ｉを参照のこと）。この調製物は、E.coli由来のゲノムDNAで 汚染されている。RNaseおよびDNaseを粗抽出物に添加することによって、混入し ているRNAおよびDNAを除去し得る。 伝統的に、MS2バクテリオファージは、CsCl勾配によって精製する。それらは 、1.45g/ccの濃度できつくバンドを形成する（Pickett，1993）。Armored RNATM を、MS2バクテリオファージと同様のCsCl勾配手順を使用することによって精製 し得る。遠心分離後、Armored RNATMバンドを取り出し、次いで100mM NaCl:50mM Tr is(pH7.5)またはPBSのような塩緩衝液に対して透析する。Armored RNATMを、OD2 60 およびOD280（それぞれ、核酸およびタンパク質の濃度を測定するのために当 該分野で使用される）を得ることによって定量し得る。Armored RNATMのストッ クを作製した後、同じアンプリコンを含む裸のDNAに対してこれを較正し得る。 例えば、Armored RNATM標準を、裸のQS RNA標準に対して較正し得る。 Armored RNATMのヌクレアーゼ処理粗抽出物をまた、Sephacryl S-200（Pharma cia）（Heisenberg，1966）のような樹脂を使用して、ゲル排除クロマトグラフ ィーによって精製し得る。Armored RNATMのサイズが大きいことに帰因して、他 のタンパク質および核酸成分は遅延するが、それらはボイド容積中を流れる。ボ イド容積中のArmored RNATMを、上記のように較正し得る。Armored RNATMが完全 に均一であることを確実にするためにいくつかの精製手順を組み合わせることが 有利である。 Armored RNATMの大規模産生を、以下のように実施し得る。pAR構築物を有する E.coliの100mlの接種物を、対数増殖中期まで、Cb25-LB培地中で増殖させる。こ の接種物を使用して、1,000mlの１mM IPTG-Cb25-LB培地を接種する。細胞を、16 時間、200rpm、37℃にてインキュベートする。１mlのリゾチーム（50mg/ml）を 培養物に添加し、そして37℃にて１時間200rpmでインキュベートする。培養物を 、遠心分離によってペレット化する。上清は、Armored RNATM粒子ならびにE.col iのゲノムおよびプラスミドのDNAを含む。混入しているRNAおよびDNAは、CaCl2 を上清に添加することによって10mMに低下させ、次いで上清をMicrococcal Nucl ease（30unit/ml）とともに、37℃にて１時間、200rpmでインキュベートする。E DTAを25mMまで添加してCaCl2をキレート化し、そしてヌクレアーゼ活性を停止さ せる。AR粒子を、４℃にて２時間、50％硫酸アンモニウムで沈殿させる。沈殿物 を、遠心分離によってペレット化する。ペレットを、100mM NaCl：1mM EDTA：10 mM Tris（pH7.5）（TSE緩衝液）に再懸濁する。AR2溶液１グラムあたり0.6gのCs Clを、添加する。CsClを溶解させ、そして50.2Tiローター（Beckmann）用の加熱 封入した超遠心分離管に移す。CsCl勾配を、45,000rpmで、20時間、21℃にて遠 心分離する。AR粒子は、遠心分離管のほぼ真ん中にバンドを形成する。CsClバン ドを、針および注射器（約５ml）で取り出す。AR2粒子を、最終的に、T SE緩衝液中でSephacryl S-200樹脂を通過させる。粒子は、ボイド容積中に溶出 する。AR2粒子の数を、MS2バクテリオファージの10D260＝0.125mg/mlの吸光系数 および分子量が３×106であることを用いて決定し得る。この手順に基づいて、 約１×1015のAR粒子を、１リットルの培養物から精製し得る。 電子顕微鏡を用いて、Armored RNATMを直接計数し得る。この方法は、HIVを定 量するために使用されている(Lu，1993)。 精製後、Armored RNATMを、４℃または室温で保存し得る殺生物剤を添加して 、標準中の細菌または真菌の増殖を防止し得る。Armored RNATMを、定量に便利 な濃度まで希釈する。 実施例XI Armored RNATMを構築するための他のRNAバクテリオファージの使用 ３つの他の遺伝的に別個のグループのRNA大腸菌ファージならびに少なくとも ２つの他の非E.coli RNAバクテリオファージPP7およびPRR1（Dhaese，1979;Dhae se，1980）が存在する。これらのバクテリオファージは、MS2被覆タンパク質（G olmohammadi，1993）に対してタンパク質配列が相同である被覆タンパク質を有 する。MS2ファージについてのように、MaturaseのcDNAおよびこれらの任意のバ クテリオファージの被覆タンパク質を、pSE380のような発現ベクターにクローニ ングし得る。これらの組換えプラスミドは、非ファージDNA配列がクローニング し得るベクターとして作用され得る。非ファージ配列の転写物は、これらの他の バクテリオファージのためのOperator配列およびMaturase結合配列を含み、その 結尿、非ファージRNA配列は、適切な株特異的ファージの被覆タンパク質およびM aturaseでキャプシド化される。この様式において、Armored RNATMは、任意のRN Aバクテリオファージ種由来の被覆タンパク質およびMaturaseから構成され得る 。pAR-2構築と同様に、誘導は、これらの他のバクテリオファージのMaturase、 被覆タンパク質、Operator配列（単数または複数）、およびMaturase結合配列（ 単数または複数）をコードするreRNAを産生し、その結果、非バクテリオファー ジRNA配列は、適切な株特異的ファージの被覆タンパク質およびMaturaseでキャ プシド化される。 実施例XII 植物ウイルスArmored RNATM 植物ウイルスを使用して、Armored RNATMを調製し得る。例えば、TMVおよびPo tyvirusを、この目的のために使用し得る。 １．タバコモザイクウイルスパッケージング。 E.coli中のタバコモザイクウイルス（TMV）被覆タンパク質を用いて組換えRNA （reRNA）をパッケージングすることが可能である（Hwang 1994aおよびHwang 19 94b）。TMVは、2,100個の17kDa被覆タンパク質のから構成される繊維状ウイルス であり、このタンパク質は、6.4kbの一本鎖のポジティブセンスゲノムRNAをリボ ヌクレアーゼに対して保護する。TMVは、多量体生物構造物の自己会合を研究す るためのモデル系として使用されてきた。適正な条件下で、精製TMV被覆タンパ ク質およびgRNAは、自発的に会合して、インビトロで感染性のウイルスを形成す る。そのうえ、インビトロでTMV被覆タンパク質でパッケージングされたreRNAは 、リボヌクレアーゼ消化に対して保護される（Jupinら、1989）。 TMVg RNAは、被覆タンパク質によって認識されて会合を開始するためのオペレ ーター様配列（Origin-of-Assembly-Sequence(OAS)と称される）を有する。OAS は、野生型ウイルス中のヌクレオチド5112〜5443に位置し、432ヌクレオチド長 である。OASは、３つのステムループ構造として存在する。パッケージングに要 求されるOASの最小の長さは、75ヌクレオチド（ヌクレオチド5444〜5518）であ る。被覆タンパク質は、5'から3'の方向におけるよりもRNAに沿って3'から5'の 方向における方がより早く会合する。 TMV-E.coliパッケージング系において、TMV被覆タンパク質は、プラスミドに コードされ、そしてパッケージングされるreRNAに対してトランスで提供された 。（Hwang 1994a、Hwang 1994b、米国特許第5,443,969号）。5'オープンリーデ ィングフレームおよびOASを含む、1.6kbのreRNA（CAT-OASRNA）および2.8kbのre RNA（GUS-OAS RNA）は、E.coliにおいて第２のプラスミドから転写された。被覆 タンパク質およびreRNAの同時発現は、reRNAのパッケージングをもたらした。 パッケージングされたreRNAの完全性を、RT-PCRTMによりアッセイした。完全長C AT-OAS RNAはRT-PCRTMにより検出されたが、完全長GUS-OAS RNAは検出されなか った。 ２．Potyvirusパッケージング。 Potyvirusは、Armored RNATMを産生するために使用され得る植物ウイルスの別 の例である。その被覆タンパク質はE.coli中で発現され、そしてキャプシドに会 合されている（Zhoa、1995）。しかし、パッケージングされ得たRNAの言及はな かった。おそらく、MS2およびTMVに見出されたような、オペレーター様配列が存 在するに違いない。Potyvuirusについてこのような配列を見出した参考文献はな い。一旦そのオペレーター配列が発見されれば、reRNAはこの被覆タンパク質に よってパッケージングされ得る。 potyvirus中のオペレーター配列を明らかにするために、系統的なセットのパ ッケージング実験を、PickettおよびPeabody（1993）の実験と同様に、実施し得 る。potyvirus被覆タンパク質遺伝子は、E.coli中の１つのベクターから発現さ れ得る。別のベクターを使用して、約１kbの長さのpotyvirusゲノムRNAの異なる セグメントを転写し得る。これらの配列を、レポーター配列（すなわち、potyvi rusゲノムRNAの各セグメントに通常融合される公知の配列）に融合し得た。レポ ーター配列は、20塩基程の短さであり得る。potyvirus被覆タンパク質および試 験配列を、E.coli中で同時発現し得、そしてウイルス粒子を単離し得る。RNAを 粒子から単離し得、次いでRNAを、多数の異なる方法（例えば、RT-PCRTM、ノー ザンブロッティング、ドットブロッティング、またはRPA）の１つによってレポ ーター配列についてアッセイし得る。レポーター配列を含む粒子は、オペレータ ー配列を含む候補物である。オペレーター配列は、１kbの候補配列を250塩基の 配列にさらに分割し、同じ実験を反復して実施することによってさらに特徴付け られ得る。一旦オペレーター配列が同定されると、これをpotyvirus被覆タンパ ク質とともに使用して、異種RNA配列をパッケージングし得る。 バクテリオファージArmored RNATMを作製するために使用するような戦略を使 用することによって、組換えRNA、potyvirus被覆タンパク質配列、非potyvirus 配 列、およびpotyvirusオペレーター配列から構成されるE.coli中で転写し得る。 このreRNAは、potyvirus被覆タンパク質によって特異的にパッケージングされる 。なぜなら、このreRNAは3'末端にオペレーター配列を含むからである。この系 において、被覆タンパク質配列およびオペレーター配列は、シスにある。別の代 替法は、被覆タンパク質RNAおよび非potyvirus RNA/オペレーターRNAをトランス で転写することである。このようなトランス系を、MS2（PickettおよびPeabody ，1993）およびTMVの両方とともに使用した。 実施例XIII 動物ウイルスArmored RNATM 動物ウイルスを使用して、Armored RNATMを産生し得る。この１実施例は、ア ルファウイルスに関して見られる。 １．アルファウイルスパッケージング。 アルファウイルスは、哺乳動物、鳥類、および昆虫に感染する、エンベロープ に包まれた、ポジティブな、一本鎖RNAウイルスである。このウイルスファミリ ーからの例は、セムリキ森林ウイルス（SFV）、シンドビスウイルス、およびベ ネズエラウマ脳炎（Venezuelan Equine Encephalitis）（VEE)である。過去10年 間にわたって、これらのウイルスは、動物細胞における組換えRNAおよびタンパ ク質の発現に適応されてきた（Frolov 1996および米国特許第5,217,879）。 アルファウイルス粒子は、240個のE1E2エンベロープ糖タンパク質へテロダイ マーを含む脂質二重層によって囲まれた、240コピーの塩基性キャプシドタンパ ク質（Ｃ）によって保護された単一のゲノムRNAを有する。アルファウイルスは 、種々の細胞型に感染し得、そして１つ以上のレセプターを使用して細胞内へ侵 入得る。ウイルスは、正十二面体（icosehederal）対称を有する。ゲノムRNAを5 '末端でキャップ化し、そしてこれを、5'末端側の半分がRNA複製のための非構造 遺伝子をコードし、3'側の半分がRNAをパッケージングするための構造遺伝子を コードするように編成する。効率的なキャプシド化のために要求されるゲノムRN Aの非構造領域内にパッケージングシグナル配列が存在する。 いくつかの戦略が、アルファウイルス系を用いてreRNAをパッケージングする ために使用されている。１つの方法において、感染性組換えウイルスを産生する 。このウイルスの中では、完全な野生型ゲノムRNAが維持され、そして目的の外 来配列が構造遺伝子の5'または3'側に挿入される。２kbまでの外来RNA配列を、 パッケージングし得る。この方法を使用して、細菌性クロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（CAT）および短縮型のインフルエンザヘマグルチニン を含むいくつかの外来遺伝子をパッケージングした。これらの組換えアルファウ イルスに感染した細胞は、コードされたタンパク質を産生した。 reRNAのパッケージングのための別の戦略は、非感染性粒子の産生に関する。 この系において、構造RNAおよび非構造RNAは、パッケージングシグナルを含むレ プリカーゼ配列および外来RNA配列を有する別個のRNA中に別々にコードされる。 これらの２つのRNAを、細胞に同時トランスフェクトする。レプリカーゼは、非 構造RNAおよび構造RNAの両方を複製し、一方、構造RNAは、非構造／外来遺伝子R NAのみをパッケージするタンパク質を生成する。これらの粒子は非感染性である 。なぜなら、構造遺伝子は、非構造遺伝子とともにパッケージングされていない からである。この方法を使用することによって、少なくとも５kbの外来RNAをパ ッケージングし得ると推定される。 類似の型の戦略を含む、上記のパッケージング系の他の改変物が存在するが、 それらのほとんどが外来RNA配列のタンパク質発現を増加させるために設計され る。 アルファ粒子は、MS2粒子とほぼ同様の様式でリボヌクレアーゼからRNAを保護 する。reRNAはリボヌクレアーゼから保護されると予測される。なぜなら、それ らのゲソムRNAがリボヌクレアーゼに感受性であるなら、一旦それらがパッケー ジされ、そしてウイルスがそれらの宿主細胞から放出されると、アルファウイル スは再感染し得ないからである。 アルファ粒子は、バクテリオファージArmored RNATMほどの耐熱性ではないか もしれない。なぜなら、これらは、異なる被覆構造を有するからである。バクテ リオファージArmored RNAは、アルファウイルスが熱感受性である場合、輸送目 的のための好ましい選択であり得る。しかし、いずれの熱感受性も、粒子を単に ド ライアイスまたはウエットアイス上で輸送され得るので、克服できない問題では ない。 アルファウイルスは、物理的にHIVと非常に類似しているので、これらは超敏 感アッセイのためのよりよいペレット化標準であり得る。アルファウイルスは、 バクテリオファージよりも、構造的にHIVおよびHCVと、より共通性を有する。従 って、これらは、これらが模倣すると仮定されたようにHIVおよびHCVとより同様 に、遠心分離によってペレット化し得る。ウイルスをペレット化することは、超 敏感アッセイのための良い標準を開発するために重要であり得る。lmlの血漿中 のHIVを、遠心分離によって濃縮し得、次いでRNAをウイルスペレットから抽出す る。アルファウイルス粒子はまた、MS2系よりも長い外来配列を受け入れ得る。 なぜなら、アルファウイルス粒子は、バクテリオファージより長いゲノムを有す るからである。アルファウイルス粒子は、HIVと同様の時間、血清／血漿中で安 定であるべきである。これらのウイルスのほとんどは、蚊ベクターを介して伝染 する。それゆえ、ウイルスは、血漿に曝露しても生存しなければならない。 実施例XIV Armored DNAの構築 E.coliならびに多数の他の細菌を感染させる、多くのよく研究された一本鎖お よび二本鎖のDNAバクテリオファージが存在する。DNAフラグメントをM13のよう な一本鎖バクテリオファージまたは二本鎖バクテリオファージλにクローニング するのは簡単である。これらの組換えファージは、プラーク形成単位を決定する ことによって、容易に精製および定量される。それらは、DNAウイルスについて のPCRTMに基づくアッセイのための標準として作用し得る。例えば、ヒト病原体 である単純ヘルペスウイルスの保存されたDNA配列を含むλ組換えバクテリオフ ァージは、二本鎖DNA標準として作用し得る。これは、定量標準またはポジティ ブコントロールとして使用され得る。 実施例XV 全RNAからのrRNAの除去 Armored RNATMを使用して、18Sおよび28S rRNAのアンチセンス配列をコードす る大きな質量のRNAを合成し得る。一旦、RNAが単離および精製されていれば、こ れをフォトビオチンで標識し得る。ビオチン化RNAを、標的18Sおよび28S rRNAに 対してモル過剰で全RNAに添加する。混合物を、ハイブリダイゼーション緩衝液 中で加熱変性し、RNAハイブリッドの形成を促進し、次いで室温になるまで放冷 して、18Sおよび28S rRNAとビオチン化アンチセンスRNAとの間の二重鎖の形成を 促進する。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジンを溶液に添加し、そ してビオチン化RNAに結合させる。フェノール抽出は、すべての非結合ストレプ トアビジンおよびビオチン／ストレプトアビジン複合体を有機層に分配する。ア ンチセンスビオチン化RNAにハイブリダイズした18Sおよび28S rRNAもまた、有機 層に分配する。この戦略によって、18Sおよび28Sを、全RNAから除去する。18Sお よび28S rRNAのモル量は、全体で非常に豊富なので、この戦略のためには大量の アンチセンスRNAが必要とされる。Armored RNATM技術は、RNAの安価な供給源を 提供するための手段として提供し得る。 実施例XVI RNAサイズ標準の構築 非常に別々の長さのRNAの混合物は、ゲル電気泳動のためのRNAサイズ標準とし てしばしば使用する。これらのサイズ標準は、未知のmRNA種の長さを推測するた めにノーザンブロッティングにしばしば使用する。一般に、RNAサイズ標準は、0 .2〜10キロベースの範囲である。これらの標準中のRNAはリボヌクレアーゼに感 受性であり、そしてこれらは通常インビトロでの転写によって産生される。それ ゆえ、本明細書中に記載される任意の方法を使用して、リボヌクレアーゼ耐性RN Aサイズ標準を作製し得る。 例えば、各々異なる長さのRNAを含む一連のArmored RNATM標準を構築し得る。 異なるサイズのDNAフラグメントをpAR-1のクローニングして、この一連のサイズ 標準を構築する。標準のサイズ範囲は、パッケージング系のRNAサイズの限界に 依存する。産生後、Armored RNATMサイズ標準の各々を産生し、そして別々に定 量する。標準の各々のRNAが同じ質量濃度であるように標準を混合する。 好ましい実施態様において、RNA-タンパク質複合体を破壊するために、ゲル電 気泳動にそれらを使用する直前に、混合したArmored RNATMサイズ標準を変性溶 液に添加する。変性溶液は、酢酸のような酸、SDSのような界面活性剤、または 尿素のようなカオトロピック剤（chaotrope）からなり得る。標準を加熱し、次 いでゲルに流す。この実施態様の利点は、ゲル電気泳動の直前までRNA標準が分 解する機会がないことである。 別の実施態様において、Armored RNATM混合物を、そこからサイズ標準を単離 するためのストック溶液として使用する。RNAを、Chomczynski（1987）によるよ うな一般のRNA単離手順を用いて単離し得る。 もちろん、Armored RNATMサイズ標準の各々から別々にRNAを単離し、次いでRN Aを後で混合することもまた可能である。 あるいは、化学的に改変されたリボヌクレアーゼ耐性RNAサイズ標準を構築す ることが可能である。これは、単一標準として、または混合標準のセットにおい て使用され得る。 実施例XVII ファージRNAからの非ファージRNAの除去 いずれのファージ配列をもコードしないRNAを研究者が要求し得る応用が存在 する。すべてのArmored RNATM組成物は、若干量のMS2バクテリオファージ配列を コードするreRNAを含む。当業者は、RNA配列を構築し得、その結果目的のRNA配 6）。非ファージRNAは、リボザイム配列でキャプシド化され得る。なぜなら、こ れらの配列は、E.coli中であまり活性ではないからである。RNAをArmored RNATM から単離した後、RNAを最適なリボザイム活性を生じる緩衝液条件に供し得る。 リボザイム切断の後、目的のRNAフラグメントを、ゲル電気泳動またはHPLCによ って精製し得る。 他者によって以前に使用された別の方法は、RNA/DNA二重鎖でRNAを切断するリ ボヌクレアーゼHを使用することを含む（Lapham，1996）。所望のRNAフラグメン トに隣接する領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、それをArmored RNATM粒子 から精製した後には、裸のreRNAにハイブリダイズする。この基質を、オリゴヌ クレオチドがハイブリダイズした部位でreRNAを切断するRNase Hに供する。DNas eIを、すべてのオリゴヌクレオチドを消化するために後に使用し得る。 精製後、RNAフラグメントを、GTPおよびSAMを用いてRNAグアニルトランスフェ ラーゼでキャップし得る。次いで、これらは、翻訳に適切な基質であり得る。 実施例XVIII インビトロおよびインビボでRNAを送達するためのArmored RNATMの使用 Armored RNATM技術を使用して、インタクトな完全長のRNAを、インビトロおよ びインビボで細胞に送達し得る。RNAでの細胞のトランスフェクションを、リボ ヌクレアーゼに感受性である裸のRNAで実施した。一時的な遺伝子発現を、Armor ed RNATMとしてRNAメッセージを産生することによって最適化し、それが細胞に 侵入するまでRNAを保護し得る。細胞に侵入すると、保護性被覆タンパク質は、 細胞機構によって除去され得る。インタクトなRNAを送達するためのバクテリオ ファージ系の使用は、以前に使用されたTMV系を同様である。組換えRNAを、TMV 被覆タンパク質を用いてインビトロでパッケージングし、そして植物細胞および カエル細胞に首尾よく送達した（Gallieら、1987）。 RNAは、翻訳のために必ずしもキャップ化されるわけではない。脳心筋炎ウイ ルスまたはPolio翻訳リーダー配列を、コード配列の上流に融合して、内部の翻 訳開始をインビトロまたはインビボで促進し得る（Elroy-Stein，1989）。この 系は、翻訳がキャップ非依存性である。Armored RNATMを、DOTAP、Lipofectin、 Transfectam、またはLipofectamineと混合して、膜融合を最適化するために陽イ オン性リポソームを形成し得る。リポソームは、組織培養物由来の細胞でのRNA トランスフェクションの効率を増大させるために首尾よく使用されている（Lu， 1994；Dwarkl，1993）。その上、Maturaseまたは被覆タンパク質は遺伝的に操作 されて、その結果、いずれかまたは両方が、特定の細胞表面レセプターを認識す るペプチド配列を含み得る。これらのリガンドは、Armored RNATMの組織特異的 取り込みを促進する。24アミノ酸までのペプチド配列が、MS2被覆タンパク質に 挿入されて、その結果、組換え被覆タンパク質はキャプシドに会合するその能力 を 維持し得る（Masticoら、1993）。細胞特異的レセプターを認識するペプチド配 列は、被覆タンパク質に取り込まれ得る。組換え被覆タンパク質を使用して、re RNAをインビトロまたはインビボでArmored RNAにパッケージングし、特定の細胞 表面レセプターを認識する多価巨大分子を産生する。Armored RNAの多価特性は 、細胞表面レセプターへの強力な親和性を与える。ペプチドレセプター配列は、 ファージディスプレイ技術（Barry，1996；Pasqualini，1996）を用いて誘導さ れ得るか、または以前に特徴づけられたペプチド配列（Hart，1994）を用いるこ とによって誘導され得る。 CEA遺伝子（多くの異なる腫瘍と関連し、そして腫瘍拒絶抗原と考えられてい る）のような目的の遺伝子をpAR-1のようなベクターにクローニングすることに よって、mRNAをインビボでパッケージングし得る。遺伝子を、pAR-1中でOperato r配列のすぐ下流にクローニングする。その上、EMCV翻訳配列を、OperatorとCEA コード配列との間にクローニングする。このようにして、CEARNAを、mRNAの翻訳 を増強するための5’CAPを必要とせずに翻訳し得る。 インビトロでのトランスフェクションのために、CEA-Armored RNATMを、トラ ンスフェクションの前にリポソームを形成するかまたは形成せずに、組織培養し た細胞と混合する。リポソームは、細胞とのArmored RNATMの融合を増強し得る 。また、CEA-Armored RNATMを、卵母細胞にマイクロインジェクションし得る。A rmored RNATMの使用は、RNAの操作における通常の用心の必要性なしですませる 。これらの手順において、Armored RNATMは、標的細胞の侵入の際に解離し、そ してそれらのパッケージグされたRNAを放出し、その結果これは翻訳に利用可能 であると予測される。 インビボにおいて、Armored RNATMを、静脈内または筋肉内のような種々の経 路によって組織に注射し、防御免疫応答を生じ得る。Armored RNATMが適切な免 疫細胞によって取り込まれ、最強かつ最も防御的な免疫応答を生じ得ることが望 ましい。当業者は、Armored RNATMが最も強力な免疫モジュレーターと結合し、 そしてそれによって取り込まれるように、適切な対のレセプター（すなわちリガ ンド）をMaturaseまたは被覆タンパク質に導入し得る。この戦略は、これらを適 切に標的化するためにはこれらの免疫モジュレーターのいくつかの特定の細胞特 異的レ セプターについての以前の知見を必要とし得る。 一回のワクチン接種が保護的免疫応答を生成するのに十分でない場合、次いで 複数の免疫化が必要であり得る。この場合において、Armored RNATM自体が免疫 源であり得、そして個体がArmored RNATM自体に対する免疫を発生するので、ト ランスフェクション時により少ない有効性となる。複数のワクチン化はいくつか の異なる血清型に由来するRNAバクテリオファージから開発されたArmored RNATM を用いることを含み得る。Armored RNATMワクチン化の全ては、同様の保護的mRN Aを含むが、異なる血清型に由来するファージキャプシドによりパッケージング される。例えば、RNA大腸菌ファージは、血清学的グループＩ、II、III、および IVに分けられる。P．aeruginosa RNAバクテリオファージの２つの株もまた存在 する。従って、CEA mRNAは、６つ程度の異なるArmored RNATMでパッケージング され得、そして各々は、各々異なる免疫化のために使用される。 キャップ化mRNAは、転写と同時かまたは転写後にカプセル化され得る。5'キャ ップを有するmRNAは、インビトロ転写の間にキャップアナログヌクレオチドを使 用することにより合成され得るか、またはRNA転写物は、GTPおよびS-アデノシル メチオニンを基質として使用するRNAグアニルトランスフェラーゼを用いてキャ ップ化され得る。mRNA合成の後、このmRNAは、被覆タンパク質および／またはMa turaseと混合されArmored RNATMを生成し得る。mRNAは、１つ以上のOperator配 列および／または１つ以上のMaturase結合部位を含み得るが、それらは、長いRN A分子のパッケージングについては必須ではない。インビトロ方法論により完全 に合成されたこれらのArmored RNATMは、細胞内へのトランスフェクションのた めに使用され得る。再び、被覆タンパク質を操作してArmored RNATMの標的細胞 への結合を増強し、そしてその取り込みおよびプロセシングを促進するリガンド を発現し得る。 最近、インビトロ(Barry，1996)およびインビボ(Pasqualini，1996)で特定の 細胞型に対して選択的に結合するペプチドについて選択するために、ファージデ ィスプレー技術が使用された。繊維状DNAバクテリオファージディスプレーラン ダムペプチド配列のライブラリーは、培養において増殖したマウス線維芽細胞に よりパニングされるかまたはそれらはマウスへ静脈内注射されるかのいずれかで あり、そして結合したバクテリオファージは異なる器官から溶出された。マウス 線維芽細胞によるパニングは、線維芽細胞、肝ガン細胞、および肥満細胞腫細胞 によく結合するが、筋芽細胞およびマクロファージ細胞には結合しないバクテリ オファージクローンを生じた。マウスへの静脈内注射は、脳組織および腎臓に選 択的に結合するバクテリオファージを生じた。ペプチドを、脳に選択的に結合す るバクテリオファージに由来する配列に基づいて合成した。これらのペプチドは 、脳の毛細血管に対するバクテリオファージの接着をブロックし得た。これらの データは、Armored RNATMが特定の器官を標的化する遺伝子治療または薬物処置 のための送達系となり得ることを示唆する。実際に、ペプチド配列RGD（これは 、細胞表面レセプターインテグリンに対する結合を促進する）を表す繊維状バク テリオファージは、ヒトHEp-2細胞において内部移行することが実証されている( Hart，1994)。 Armcred RNATMはまた、ウサギ網状赤血球抽出物のようなインビトロ翻訳系に 添加され得る。先に述べたように、キャップ化された、ポリＡ mRNAは、reRNAが インビトロパッケージング系を使用して転写後にパッケージングされる場合に使 用され用る。 被覆タンパク質またはMaturaseは、E coli内でビオチン化されるようにこのペ プチドを導くビオチン化ペプチド配列を含むように改変され得る。このストラテ ジーにおいて、Armored RNATMは、ストレプトアビジンにアクセス可能であるビ オチン分子を有する表面上にコートされる。ストレプトアビジンは、特定の細胞 表面レセプターを認識するリガンドに結合され得る。リガンド-ストレプトアビ ジン結合体は、Armored RNATMとともにインキュベートされてArmored RNATMをス トレプトアビジン−リガンド結合体でコートする。リガンド-ストレプトアビジ ン-Armorcid RNATM複合体は、パッケージされたRNAを送達するために使用され得 る。 Armored RNATMに対する抗体は、以前に実施されたように(Douglasら，1996)レ セプター分子へ結合され得る。Armored RNATM粒子は抗体-レセプター結合体で予 めコートされ、そのようにしてArmored RNATMにレセプター特異性を与える。Arm ored RNATM Antibody Receptor複合体は特定の細胞に結合し、次いでその細胞内 へ取り込まれる。 Armored RNATMは、一旦Armored RNATMが細胞内へ侵入すると容易に分解される 場合に送達ベクターとしてより効率的に作製され得る。Armored RNATMで被覆タ ンパク質の変異形態を使用することにより、リボヌクレアーゼからカプセル化re RNAを保護し得るが、細胞内へ侵入する際に直ちに分解するより小さい安定性の 構造を生成することが可能であり得る。キャプシドの会合でより効率的でない(L eCuyer，1995)、そして野生型被覆タンパク質と比べてより低い熱安定性を有す る(Stonehouse，1993)被覆タンパク質の変異形態が研究されている。高濃度の被 覆タンパク質は、野生型配列についてよりキャプシド会合を誘導する必要がある 。しかし、これらの変異被覆タンパク質の存在においてインビボで会合されるAr mored RNATMは、RNA送達により効率的であり得る 実施例XIX アフィニティカラムを構築するためのRNAの生成 RNAについての必要性は、特異的RNA配列に結合するタンパク質のアフィニティ ー精製のためのカラムを生成することへ拡張する。このようなタンパク質は、翻 訳の調節およびRNA代謝回転に関与する。Armored RNATM技術を使用して、大量の 特異的RNA配列を産生し得る。reRNAは、Armored RNATM粒子から精製される。reR NAを、固層樹脂へ共有結合し得た。あるいは、CoatProteinが樹脂に共有結合さ れたより一般的な樹脂が開発され得る。reRNAを、Operator配列を介する被覆タ ンパク質へのその結合により、樹脂に固定化し得た。次いで、reRNA中の非ファ ージ配列を使用して、それを特異的に認識するタンパク質を引き出した。 別の形式において、タンパク質-reRNA結合を、実際の相互作用をより良好に模 倣して溶液中で生じ得、次いで遊離reRNAおよびタンパク質-reRNA複合体を、被 覆タンパク質カラムを使用して濃縮した。カラムを、reRNAに結合したタンパク を放出するためにリボヌクレアーゼに供し得る。次いで、これらのタンパク質を ゲル電気泳動により特徴づけ得るか、またはカラムから溶出された物質を、抗体 を生成するためにマウスおよびウサギのような動物内へ注入し得る。一旦抗体が 産生されれば、次いで、cDNA発現ライブラリーをそのRNAに結合するタンパク質 を担う遺伝子についてスクリーニングし得る。 実施例XX インビボでのキャップ化mRNAのパッケージング Armored RNATM技術を用いて、E.coli中でmRNAをキャップ化およびパッケージ ングし得る。酵素RNAグアニルトランスフェラーゼはGTPおよびS-アデノシルメチ オニン(SAM)を基質として使用してmRNAの5'末端のキャップ化を担う。RNAグアニ ルトランスフェラーゼはクローン化されて、そしてE.coli中で活性形態で発現さ れた(Cong，1995)。RNAグアニルトランスフェラーゼを、キャップ化しそしてArm ored RNATM粒子としてパッケージングされるべきRNAと同時発現し得る。好まし い実施態様において、非ファージRNAは、reRNAの5'末端で配置される。 実施例XXI ヌクレアーゼ耐性RANを生成するための方法としてのカプセル化 RNAの「ケージ化(caging)」またはカプセル化は、RNAをRNase含有溶液へアク セスし得なくする。ウイルスタンパク質によるRNAのキャプシド化は、微小カプ セル化の例である。微小カプセル化は、それによって分子（この場合は、RNA） が内部移行した分子へのアクセスを否定する構造によって囲まれるプロセスであ る。微小カプセル化は、ヌクレアーゼが混入した環境からRNAを隔絶することに よりRNAにヌクレアーゼ耐性を与える。ウイルスタンパク質のキャプシド化に加 えて、微小カプセル化の最も通常の方法は、リポソーム中への内部移行および高 分子マトリックス中への封入である。ウイルスタンパク質キャプシド化は、ヌク レアーゼ耐性RNAを提供し得ることが判明している(上記Armored RNAを参照のこ と)。リポソームおよびポリマーマトリックスは、タンパク質キャプシド化と類 似する様式で分子を分配し、従って、それらは内部移行したRNA標準を保護する ことにおいて等しく良好に行うことが予想される。 １．リポソーム リポソームの形成は、脂質が水性溶液に分散される場合に自然に生じる。水性 溶液中に存在する試薬は、リポソーム形成の間にカプセル化され、これは薬剤、 細胞、タンパク質、および核酸を微小カプセル化するための比較的簡単な方法を 提供する。リポソームを生成するためのいくつかの方法が存在する(Vemuri 1995 )。これらの最も特徴づけられた方法は、過剰量の試薬含有水性緩衝液を、脂質 溶液を凍結乾燥した丸底フラスコへ添加する工程を包含する。水性溶媒の添加は 、最初に脂質を溶解し、次いで結果的に水性溶液の一部を包み込むリポソームを 形成させる。これは、精製され、定量化され、保存され、そして最終的には診断 的アッセイにおいて使用され得るリポソームカプセル化試薬を効率的に生成する 。 ２．ポリマーマトリックス 種々のモノマーは、重合化を助長する溶液中への滴下拡散によりポリマー性ミ クロスフェアへ変換され得る。モノマー溶液または重合化が生じている溶液のい ずれかにおいて溶解させた分子は、ミクロスフェア中にトラップされる。ミクロ スフェアの精製は、周囲の溶液において巨大分子にアクセスし得ないトラップさ れた試薬を提供する。 試薬含有ミクロスフェアの生成方法の説明は、アルギン酸塩／スペルミンマト リックス中のロタウイルスの微小カプセル化についての研究に由来する(Offit 1 994)。アルギン酸ナトリウム(0.68mM)と混台されたロタウイルス懸濁液を、５μ mの滴として0.55mMスペルミン塩酸塩中へ分散させた。混合物を600×gで遠心分 離し、そして数回洗浄してロタウイルス含有ミクロスフェアを精製した。ミクロ スフェアの分析は、ロタウイルスがポリマーマトリックス内に含まれ、そして放 出の際にそれらはまだ感染性であったことを明らかにした。ミクロスフェアが周 囲の溶液から分子を隔絶し、そして内部移行分子がその天然な状態で維持される ことが明らかになっているので、これらの２つのポイントは重要である。RNA標 準のマイクロカプセル化は、ロタウイルス懸濁液をRNA溶液へ置換することによ って行った。 単一の、一般的な方法を、マイクロカプセル化RNAを診断的アッセイに組み入 れるために使用し得る。検出に十分なRNAプロセシングドメイン（プライマー結 合部位およびハイブリダイゼーション部位）を、上記の方法の１つによりカプセ ル化した。カプセル化RNAを精製し、定量化し、そして将来の使用のために保存 した。診断のために、マイクロカプセル化標準を希釈し、そしてサンプルを適切 な工程でアリコートした。診断プロトコルにおける標準RNA単離手順が、標準を 適切に放出しない場合、または標準を単離工程の後で添加する場合、次いでサン プルを90℃で２〜５分間加熱することは、ほとんどのマイクロカプセルからの放 出に十分である。次いで、アッセイのRNA検出部分を実行し得る。 実施例XXII ヌクレアーゼ耐性標準としての非共有結合RNA RNAを、種々の分子により比較的高親和性で結合する。多くの場合において、R NAは、相互作用分子により、完全にコートされ得る。結合分子の存在が、RNAに ヌクレアーゼ分解に耐性を与える例が存在する。この一般的な仕組みは、ヌクレ アーゼ耐性RNA標準を作製するためのさらなる方法を提供する。 RNAを結合する種々のタンパク質、核酸および小分子が存在する。HIV-1ヌクレ オキャプシドタンパク質(Allen 1996)およびT4のregAタンパク質(Winterら1987) を用いるフットプリント実験は、結合分子はRNAをヌクレアーゼの耐性にし得る ことを示す。RNAを協同的に結合するタンパク質および小分子は、しばしばポリ マーの大きな領域を被覆する。例としては、T4遺伝子32タンパク質(von Hippel 1982)、MS2/R17被覆タンパク質(Witherall 1990)、ならびに小分子スペルミンお よびスペルミジン(McMahon 1982)が挙げられる。協同的結合およびヌクレアーゼ 閉塞の組合せはRNAの大きなドメインを分解から効率的に保護し得(Allen 1996) 、このことは、これらを理想的なヌクレアーゼ耐性標準にする。ポリＬ-リジン は、天然の２本鎖RNAインターフェロン誘導物質、ラリファン(larifan)およびリ ドスチン(ridostin)をヒト血清中のリボヌクレアーゼから保護し得る。血清中の 遊離インターフェロン誘導物質は、血清中の４時間のインキュベーション後にそ れらの活性を完全に消失した。ポリＬ-リジンの保護活性は、その分子量の増加 と供に平行して増加した。保護活性は、物質の12,300+/-1,000Daltonの物質で最 大になった(Surzhikら1993)。 臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)は、陽イオン性界面活性剤であり、 それは、タンパク質ではなく核酸へ結合し、そして沈殿させるその能力による核 酸の単離のために長らく使用されている(Jones，1953;Jones，1963)。正に荷電 した頭部の基は、RNAの負に荷電した骨格へ結合し得、それによってRNAをリボヌ クレアーゼから保護する。WinklerおよびKesslerによる実験（非公表）は、20mM CTABが、５μg程度のRNAをRNase AおよびRNase T1による分解から保護すること を実証する。0.5％のTriton X-100をCTAB/RNA溶液へ添加する場合、CTABはTrito n X-100により可溶化され、そして保護的作用は保存される。 同様に、核酸は、RNAとの直接的な相互作用によりヌクレアーゼ保護を与える( Weigand 1975)。短い(10ヌクレオチド)ランダム配列核酸は、RNAへハイブリダイ ズされ得、それによって分子を効率的にコートする。RNaseを含むサンプル中で のインキュベーションは、RNAがランダマーにより結合され、従って保護される ので、有害ではない。増幅スキームが、検出のために用いられる場合、短いラン ダマーは、逆転写酵素のプライマーとして作用し得る。 一般的なスキームは、任意の非共有結合RNAを標準として使用するための技術 の１つにより考案され得る。プライマー結合(RT-PCR、NASBA、または3SRのため の)またはプローブハイブリダイゼーション(分枝DNAアッセイまたはDiGene's抗 体に基づくアッセイ)のための配列を有するRNAは、上記の段落において述べた任 意のRNA結合分子により予め結合し得る。この結合RNAを正確に定量化し、そして 将来の使用のために保存する。結合RNAを希釈し、そしてRNA精製の前または後の いすれかにサンプル中へアリコートする。（検出プロコトルに依存して）増幅ま たはハイブリダイズの前に、サンプルを90℃まで加熱してRNA標準を放出する。 次いで、増幅またはハイブリダイズを実施し得、これは検出のためのシグナルを 生成する。 実施例XXIII gp32によって結合されたRNAはヌクレアーゼ耐性である バクテリオファージT4の遺伝子32によりコードされるタンパク質(gp32)により 結合されるRNAを使用して、RNA標準の作製のための非共有結合の方法論の有効性 を実証した。gp32は、RNAおよびssDNAを協同的に結合することが公知である(von Hippel 1982)。精製タンパク質(約１μM)を、放射標識RNA標的（約100nM）と５ 分間、室温で、50mM HEPES pH7.4，200mM NaCl、および2.5mM MgCl2からなる緩 衝液中で混合した。ゲルシフトアッセイにより、RNA分子の約50％を、タンパク 質により結合させた。10分の１量のヤギ血清をコートされたRNAへ添加し、そし で混合物を25℃で10分間インキュベートした。RNAをPAGEを介して分離し、オー トラジオグラフィーにより検出した。インタクトなRNAの量は、タンパク質を欠 く同じRNAサンプルより多かった。これは、gp32の存在が血清に媒介される分解 からRNAを保護することおよび協同的結合分子により生成されるヌクレアーゼ保 護の概念が妥当であることを示す。 上記で用いた同じRNAのサンプルを、記載された手順を用いてgp32により結合 させた。このサンプルを95℃で２分間加熱し、次いでRNAの3'末端に特異的なプ ライマーを使用して、AMV逆転写酵素によって逆転写した。得られたcDNAを連続 的に希釈し、そして種々の希釈を使用して、RNA標準に対し特異的なプライマー を用いる標準的なPCR反応を開始した。PCR産物を、ゲル電気泳動により分析した 。産物が最初に観察される希釈で、同じ手順に供した非結合RNAについてとgp32 結合RNAについて同じであった。これは、T4タンパク質が、テンプレートとしてR NAを使用するためのRTの能力に影響せず、続いてPCR反応にも影響しないことを 示す。タンパク質コートRNAはまた、10％血清溶液中へ15分間希釈し、次いでRT- PCR実験へ適用されている。適切なサイズの産物を生成し、このことはRNAの協同 的結合が、安定なRT-PCRコントロールを作製するための方法として有用である証 拠を提供する。 実施例XXIV 化学的改変を介したRNAの保護 酵素を介した分解に対してRNAを耐性にするための１つの方法は分解の機構を ブロックするようにかまたはRNaseがもはやRNAとして分子を認識しないようにRN Aを化学的に改変することである。このような改変は、RNA中にこの改変が取り込 まれる前にヌクレオチドになされるか、またはそれが形成された後にRNAになさ れ得る。リボース(Piecken 1991)およびリン酸(Black 1972)改変は、ヌクレアー ゼの存在下でRNAの安定性を増強することが示されている。2'ヒドロキシルおよ びヌクレオチド内リン酸の改変は、リボヌクレアーゼによって用いられる分解機 構に必要な化学基の改変によりヌクレアーゼ耐性を与える(Heidenreich 1993)。 別の力法は、分子（例えば、炭水化物）をRNA標準へ化学的に添加することによ り達成し得る。これらの化学基は検出プロトコルの間逆転写を可能にするために 酵素的かまたは化学的に除去し得る。これらが核酸検出スキームにおいて使用さ れる逆転写またはハイブリダイゼーションプロトコルのためのテンプレートであ る場合、化学的に改変されたRNAは、それらが非改変RNAよりかなり安定であるの でRNA標準として理想的に適している。 化学的改変RNAの診断的アッセイにおける標準として使用するための一般的な スキームは、現在のRNA標準を同じ配列を有する改変RNAで単に置換することであ る。RNA標準をコードするDNAテンプレートをT7 RNAポリメラーセを用いて転写し 、これは標準的なNTPをリボースまたはリン酸改変NTPと置換する。得られた全長 RNAを精製し、定量化し、そして将来の使用のために保存し得る。アッセイの時 点で、改変RNA標準を、RNA精製の前または後のいすれかでサンプルを適切に希釈 し、アリコートし、次いでサンプルRNAを用いて同時検出した。 実施例XXV 2'フッ化CTPおよびUTPを用いたRNAの保護 改変RNAの標準としての有用性を試験するために、ヌクレオチドアナログを転 写物中に取り込ませ、そして非改変RNAと比較した。2'フッ化CTPおよびUTPを、 転写緩衝液(40mM Tris pH8.0，20mM NaCl，6mM MgCl2，6mM MnCl2，2mMスペルミ ジン，10mM DTT)中の0.5ユニット/μlのT7 RNAポリメラーゼにより転写物中に取 り込ませた。10pmolの改変RNAおよび非改変RNAを、AMV逆転写酵素により逆転 写した。得られたcDNAの一連の希釈物をPCRにより増幅した。産物をPAGEを介し て分離し、そしてエチジウムブロマイド染色により分析した。改変RNAおよび非 改変RNAのサンプルの両方が同じ結果を生じ、そのことは改変が、RT-PCRによるR NAの定量化には影響しないことを示す。改変RNAを、血清中で１時間インキュベ ートし、産物をPAGEによりサイズで分離した。改変RNAの非分解は明らかである が、同じ配列を有する非改変RNAは完全に分解された。従って、改変RNAは、それ らが（より良い内部標準を提供する）診断的プロトコルにおいてより早く添加さ れ得るので、非改変RNAよりはるかに優れ、そして改変RNAは保存の間より安定で ある。 改変RNAの究極の試験は、現存の診断的アッセイを用いてその適合性を示すこ とである。Amplicor HIV MonitorTMアッセイのための標準の配列をコードするテ ンプレートを、2'F CTPおよびUTPを用いて-L記のように転写した。2'F改変RNAの 一連の希釈を、Amplicor HIV MonitorTM試験に適用した。改変標準は、濃度に依 存した様式でシグナルを生成し、このことは改変RNAが逆転写され、そして得ら れたcDNAをPCR増幅された証拠を提供する。次いで、改変RNA標準を、非改変RNA と比較した。検出プロトコルの溶解工程の後に導入された場合、両標準は、ほぼ 等しいシグナルを生成したが、２つのRNAを検出プロトコル中に組み込む前に血 漿中で15分間インキュベートした場合、非改変RNAにより生成されたシグナルは 、バックグラウンドから識別不能である一方、改変RNAは、RNAが血漿中でプレイ ンキュベーションされない場合に観察されるシグナルとほとんど同等であるシグ ナルを生成した。この後者の観察は、改変RNA標準の明白な利点を指摘する、す なわちRNAが、実験全体についてのよりよいコントロールを提供する場合、プロ トコルにおけるより早い時（サンプルの溶解の前）に添加され得る。さらに、ア ッセイの前の分解の可能性を非常に減少させるので、ヌクレアーゼ耐性は貯蔵の 間に有利である。 CTPおよびUTPのαチオールの形態によるリン酸改変ヌクレオチドを、上記の2' FのようにT7 RNAポリメラーゼにより転写物へ取り込ませた。得られたRNAは、逆 転写酵素のためのテンプレートであった。PCR分析は改変RNAが、非改変RNAを同 じくらい効率的にcDNAに変換されることを明らかにした。 記載された研究は改変のみを使用したが、改変されたプリンもまたRNAに取り 込まれ得る[Aurupら(1994)]。これは、高濃度のプリン特異的ヌクレアーゼがあ る群のサンプルにおいて存在するような場合において重要であり得る。取り込ま れ得る種々のヌクレオチドアナログが存在するので、RNAは、至適の安定性およ びアッセイ効率を保証するために異なる保存および反応条件について調製され得 る。 実施例XXVI リボヌクレアーゼ保護についてのアッセイ リポヌクレアーゼ耐性に対して潜在的なリボヌクレアーゼ耐性構築物を試験す るために、保護RNA構築物を、リボヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ１ またはリボヌクレアーゼA）とともに、37℃でいくつかの異なる時間（15分間、3 0分間、１時間、２時間）でインキュベートする。同じ実験の間に、同じArmored RNA構築物から単離された裸のRNAもまた、リボヌクレアーゼとともにインキュ ベートする。各時間の後、リボヌクレアーゼをフェノール抽出により不活性化す る。フェノールはまたArmored RNA構築物中のRNAから被覆タンパク質をはぎ取る 。フェノール抽出の後、RNAをエタノール沈殿する。単離されたRNAを変性ホルム アルデヒドアガロースゲルにより分別し、エチジウムブロマイドで染色し、そし て分解について評価した。分解を、リボヌクレアーゼ処理したサンプルをリボヌ クレアーゼ処理していないRNAと比較することにより評価する。 あるいは、ゲル電気泳動によるRNAの分析の代わりに、サンプルを、より正確 で、より定量的な結果を得るために、競合的RT-PCRに供し得る。PCRの使用はま た、少量の材料を検出する利点を有する。 実施例XXVII 任意のRNase耐性標準を使用における標準的工程 RNA耐性標準を使用する多くのアッセイは、上記のAmplicor HIV MonitorTMア ッセイと同じ基本的形式を有する。このようなキットにおいて、既知の量のRNas e耐性標準をRNAサンプルに添加する。サンプルRNAおよびRNA標準(例えば、Armor ed RNATM、化学的改変RNA、または任意の他のリボヌクレアーゼ保護RNA)を、血 漿および細胞から同時に精製する。いくつかのアッセイについて、サンプルRNA はすでに精製されている。このような場合、RNase耐性標準を、直接サンプルRNA に添加し得る。次いで、混合物を５分間70℃で加熱して、タンパク質被覆、もし くはリポヌクレアーゼ耐性を与える任意の他の分子をはぎ取り得るか、または任 意の他の必要な方法で処置し得る。 RNAを精製または加熱した後、サンプルRNAおよび標準RNAを逆転写し、次いでP CRにより同時増幅した。標準RNAが欠失または挿入を有する場合、次いでPCR産物 をゲル上で分離し得る。RNA標準から生成されたPCR産物は、サンプルRNA由来のP CR産物とは異なる移動度を有する。検量線を、RNA標準の濃度および標準から生 成されたPCR産物の量をプロットして作製し得る。サンプルRNAの濃度を、曲線の 直線範囲内の内挿により得る。 HIV MonitorTMアッセイにおいて、RNA標準は、サンプルRNA配列と比較して26 ヌクレオチドの置換を有する。PCR産物の定量化は、試験PCR産物または標準PCR 産物へのハイブリダイズによりPCR産物を特異的に捕捉するための固定化オリゴ ヌクレオチドを使用することにより得られる。PCR産物を、5'ビオチン化する。 捕捉PCR産物を、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して比 色的に検出する。今一度、未知のRNAサンプルの濃度を、既知の標準RNAの濃度に より生成されたシグナルを使用して計算する。 本発明の組成物および方法が好ましい実施態様の点から記載されているが、改 変が、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記 載の組成物、方法、および方法の工程または一連の工程に適用され得ることが当 業者には明らかである。より詳細には、化学的および物理的の両方に関連する特 定の薬剤が、本明細書中に記載の薬剤で置換され得るが、同等または類似の結果 が達成されることが明らかである。当業者には明らかであるこのような類似の置 換および改変の全てが、添付の請求の範囲に規定されるように本発明の精神、範 囲、および概念の中にあると判断される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／８８１，５７１ (32)優先日 平成９年６月24日(1997．6．24) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ウィンクラー，マシュー エム. アメリカ合衆国 テキサス 78746，オー スティン，ライブ オーク サークル 960 (72)発明者 パスロスケ，ブリッタン エル. アメリカ合衆国 テキサス 78704，オー スティン，ケイター ドライブ 501 (72)発明者 ブラウン，デイビッド アメリカ合衆国 テキサス 78704，オー スティン，ドレイク 1705

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントを含む核 酸標準であって、該核酸セグメントは、正常ヒト血清における室温での５分間以 上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ分解から保護されている、核酸標準 。 ２．前記核酸標準が、標準RNAをコードする配列を含むリボヌクレアーゼ耐性RNA セグメントを含むRNA標準としてさらに規定される、請求項１に記載の核酸標準 。 ３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、リボヌクレアーゼ耐性構造に ケージ化されている、請求項２に記載のRNA標準。 ４．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、ウイルス被覆タンパク質から構成される 、請求項３に記載のRNA標準。 ５．前記ウイルス被覆タンパク質が改変されたウイルス被覆タンパク質である、 請求項４に記載のRNA標準。 ６．前記ウイルス被覆タンパク質がバクテリオファージウイルス被覆タンパク質 である、請求項４に記載のRNA標準。 ７．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、遺伝的サブクラスＡま たはＢのE.coliバクテリオファージ由来である、請求項６に記載のRNA標準。 ８．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、遺伝的サブクラスＡの E.coliバクテリオファージ由来である、請求項７に記載のRNA標準。 ９．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、血清学的群Ｉ、II、II I、またはIVのE.coliバクテリオファージ由来である、請求項７に記載のRNA標準 。 １０．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、血清学的群ＩのE.co liバクテリオファージ由来である、請求項９に記載のRNA標準。 １１．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、MS2/R17バクテリオ ファージ由来である、請求項４に記載のRNA標準。 １２．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、Pseudomonas aerugi nosa RNAバクテリオファージ由来である、請求項４に記載のRNA標準。 １３．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、Pseudomonas aerugi nosa PRRlまたはPP7バクテリオファージ由来である、請求項１２に記載のRNA標 準。 １４．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、繊維状バクテリオフ ァージ由来である、請求項４に記載のRNA標準。 １５．前記ウイルス被覆タンパク質が、植物または動物ウイルスのウイルス被覆 タンパク質である、請求項４に記載のRNA標準。 １６．前記ウイルス被覆タンパク質が、タバコモザイクウイルス、ネコ免疫不全 ウイルス、またはαウイルスの被覆タンパク質である、請求項１５に記載のRNA 標準。 １７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルスMaturaseタンパク 質に結合している、請求項４に記載のRNA標準。 １８．前記ウイルスMaturaseタンパク質が、改変されたウイルスMaturaseタンパ ク質である、請求項１７に記載のRNA標準。 １９．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、脂質から構成される、請求項３に記載 のRNA標準。 ２０．前記リボヌクレアーゼ耐性構造がリポソームである、請求項１９に記載の RNA標準。 ２１．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が合成マイクロカプセルである、請求項３ に記載のRNA標準。 ２２．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、ポリマーマトリックスである、請求項 ２１に記載のRNA標準。 ２３．前記ポリマーマトリックスがアガロースまたはアクリルアミドである、請 求項２２に記載のRNA標準。 ２４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operatorコード配列および ウイルスMaturaseタンパク質結合部位を含む、請求項２に記載のRNA標準。 ２５．前記Operatorコード配列が改変されたOperatorコード配列である、請求項 ２４に記載のRNA標準。 ２６．前記ウイルスMaturaseタンパク質結合部位が、改変されたウイルスMatura seタンパク質結合部位である、請求項２４に記載のRNA標準。 ２７．前記Maturaseタンパク質結合部位がウイルスMaturaseタンパク質コード配 列中に含まれる、請求項２４に記載のRNA標準。 ２８．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルスMaturaseタンパク 質コード配列をさらに含む、請求項２４に記載のRNA標準。 ２９．前記Maturaseタンパク質コード配列が、改変されたウイルスMaturaseタン パク質をコードする、請求項２８に記載のRNA標準。 ３０．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、化学的に改変されたリボヌ クレアーゼ耐性RNAである、請求項２に記載のRNA標準。 ３１．前記化学的に改変されたリボヌクレアーゼ耐性RNAが、化学的に改変され たヌクレオチドから構成される、請求項３０に記載のRNA標準。 ３２．前記化学的に改変されたリボヌクレアーゼ耐性RNAが、予め転写されたRNA 転写物の化学的改変によって調製される、請求項３０に記載のRNA標準。 ３３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、リボヌクレアーゼ耐性被覆 で被覆されている、請求項２に記載のRNA標準。 ３４．前記リボヌクレアーゼ耐性被覆が、タンパク質から構成される、請求項３ ３に記載のRNA標準。 ３５．前記タンパク質が、配列に独立な様式で前記リボヌクレアーゼ耐性RNAに 結合している、請求項３４に記載のRNA標準。 ３６．前記タンパク質が、MS2/R17被覆タンパク質、HIV-1ヌクレオキャプシドタ ンパク質、T4バクテリオファージのgp32、またはT4のregAタンパク質である、請 求項３５に記載のRNA標準。 ３７．前記タンパク質が、前記リボヌクレアーゼ耐性RNAに協同的に結合してい る、請求項３５に記載のRNA標準。 ３８．前記タンパク質が、T4バクテリオファージのgp32である、請求項３５に記 載のRNA標準。 ３９．前記リボヌクレアーゼ耐性被覆が、ポリアミンから構成される、請求項３ ３に記載のRNA標準。 ４０．前記ポリアミンが、スペルミンまたはスペルミジンである、請求項３９に 記載のRNA標準。 ４１．前記リボヌクレアーゼ耐性被覆が核酸から構成される、請求項３３に記載 のRNA標準。 ４２．前記核酸が、前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントにハイブリダイズ する、請求項４１に記載のRNA標準。 ４３．前記ハイブリダイズした核酸が、逆転写酵素のプライマーである、請求項 ４２に記載のRNA標準。 ４４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルス被覆タンパク質コ ード配列をさらに含む、請求項２に記載のRNA標準。 ４５．前記ウイルス被覆タンパク質コード配列が、バクテリオファージウイルス 被覆タンパク質をコードする、請求項４４に記載のRNA標準。 ４６．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、改変されたバクテリ オファージウイルス被覆タンパク質である、請求項４５に記載のRNA標準。 ４７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、非バクテリオファージ配列 を含む、請求項２に記載のRNA標準。 ４８．前記非バクテリオファージ配列が、ウイルス配列である、請求項４７に記 載のRNA標準。 ４９．前記非バクテリオファージ配列が、RNAの検出および/または定量における 標準としての使用に適合した配列である、請求項４７に記載のRNA標準。 ５０．前記非バクテリオファージ配列が、診断的価値のあるRNAの検出および/ま たは定量における使用に適合した配列である、請求項４９に記載のRNA標準。 ５１．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体の検出および/または 定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項４９に記載のRNA 標準。 ５２．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、またはＧ型肝炎の検出および/または定量における標準としての使用に適合し た配列である、請求項５１に記載のRNA標準。 ５３．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1．HIV-2、またはHCVの検出およ び/または定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項５２に 記載のRNA標準。 ５４．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1またはHIV-2の検出および/また は定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項５３に記載のRN A標準。 ５５．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1の検出および/または定量におけ る標準としての使用に適合した配列である、請求項５４に記載のRNA標準。 ５６．前記HIV-1の検出および/または定量における標準としての使用に適合した 非バクテリオファージ配列が、改変されたHIV-1配列を含む、請求項５５に記載 のRNA標準。 ５７．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-2の検出および/または定量におけ る標準としての使用に適合した配列である、請求項５４に記載のRNA標準。 ５８．前記HIV-2の検出および/または定量のおける標準としての使用に適合した 非バクテリオファージ配列が、改変されたHIV-2配列を含む、請求項５７に記載 のRNA標準。 ５９．前記非バクテリオファージ配列が、HCVの検出および/または定量における 標準としての使用に適合した配列である、請求項５３に記載のRNA標準。 ６０．前記HCVの検出および/または定量における標準としての使用に適合した非 バクテリオファージ配列が、改変されたHCV配列を含む、請求項５９に記載のRNA 標準。 ６１．前記非バクテリオファージ配列が、HTLV-1の検出および/または定量にお ける標準としての使用に適合した配列である、請求項５２に記載のRNA標準。 ６２．前記HTLV-1の検出および/または定量における標準としての使用に適合し た非バクテリオファージ配列が、改変されたHTLV-1配列を含む、請求項６１に記 載のRNA標準。 ６３．前記非バクテリオファージ配列が、HTLV-2の検出および/または定量にお ける標準としての使用に適合した配列である、請求項５２に記載のRNA標準。 ６４．前記HTLV-2の検出および/または定量における標準としての使用に適合し た非バクテリオファージ配列が、改変されたHTLV-2配列を含む、請求項６３に記 載のRNA標準。 ６５．前記非バクテリオファージ配列が、血液媒介性病原体の検出および/また は定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項５１に記載のRN A標準。 ６６．前記非バクテリオファージ配列が、プラスモディウム、トリパノソーマ、 Francisella tularensis、またはWucheria bancroftiの検出および/または定量 における標準としての使用に適合した配列である、請求項４９に記載のRNA標準 。 ６７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、バクテリオファージ配列を 含む、請求項２に記載のRNA標準。 ６８．前記バクテリオファージ配列が、血清学的群Ｉ、II、III、またはIVのE.c oliバクテリオファージ由来の配列である、請求項６７に記載のRNA標準。 ６９．前記バクテリオファージ配列が、遺伝的サブクラスＡのE.coliバクテリオ ファージ由来の配列である、請求項６７に記載のRNA標準。 ７０．前記バクテリオファージ配列が、MS2/R17バクテリオファージ由来の配列 である、請求項６７に記載のRNA標準。 ７１．前記バクテリオファージ配列が、Pseudomonas aeruginosa RNAバクテリオ ファージ由来の配列である、請求項６７に記載のRNA標準。 ７２．前記バクテリオファージ配列が、Pseudomonas aeruginosa PRR1またはPP7 バクテリオファージ由来の配列である、請求項７１に記載のRNA標準。 ７３．前記バクテリオファージ配列が、繊維状バクテリオファージ由来の配列で ある、請求項６７に記載のRNA標準。 ７４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、少なくとも２つのウイルスM utarase結合部位を含む、請求項２に記載のRNA標準。 ７５．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Repllcaseタンパク質をコー ドする配列を含む、請求項２に記載のRNA標準。 ７６．前記Replicaseタンパク質をコードする配列が、活性ではない改変されたR eplicaseタンパク質をコードする、請求項７５に記載のRNA標準。 ７７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、少なくとも２つのOperator 配列および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２に記載のRNA標準。 ７８．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列およびウイル ス被覆タンパク質配列を含む、請求項２に記載のRNA標準。 ７９．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、ウイルスMat uraseタンパク質、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２に記載のR NA標準。 ８０．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、ウイルスMat uraseタンパク質をコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列 、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項７９に記載のRNA標準。 ８１．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくとも ２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配 列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ配 列を含む、請求項８０に記載のRNA標準。 ８２．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくとも ２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配 列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、非バクテリオファージ配列、お よびReplicaseタンパク質をコードする配列を含む、請求項８１に記載のRNA標準 。 ８３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、pAR-1の配列においてコード されている、請求項２に記載のRNA標準。 ８４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがpAR-2の配列においてコードさ れている、請求項２に記載のRNA標準。 ８５．サンプル中の試験される核酸配列の存在についてアッセイする方法であっ て、以下の工程： サンプルを得る工程； 正常ヒト血清における室温での５分間以上のインキュベーションの際のヌクレ アーゼ分解から保護されている標準RNAをコードする配列を含む組換えRNAを含む 、リボヌクレアーゼ耐性の内部または外部RNA標準を得る工程； 該サンプルと該リボヌクレアーゼ耐性の内部または外部RNA標準とを混合する 工程； 任意のリボヌクレアーゼ耐性被覆またはリボヌクレアーゼ耐性構造を、該組換 えRNAから、該混合する工程の前かまたは後のいずれかに、除去する工程； 試験される核酸配列の存在について該サンプルをアッセイする工程；および 該組換えRNAを、該アッセイにおける内部または外部標準として利用する工程 、を包含する、方法。 ８６．前記サンプルから核酸組成物を単離する工程をさらに包含する、請求項８ ５に記載の方法。 ８７．前記サンプルが生物学的組織である、請求項８５に記載の方法。 ８８．前記サンプルが、血液成分である、請求項８５に記載の方法。 ８９．標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントをヌク レアーゼ耐性にする分子由来の標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐 性核酸セグメントを単離して標準核酸をコードする配列を含む核酸セグメントを 得る工程をさらに包含する、請求項８５に記載の方法。 ９０．前記試験される核酸配列の存在をアッセイする工程の前に、前記サンプル と、標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントを含む前 記核酸標準とを混合する工程をさらに包含する、核酸標準を請求項８５に記載の 方法。 ９１．標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐性核酸セグメントをヌク レアーゼ耐性にする分子由来の標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ耐 性核酸セグメントを単離して標準核酸をコードする配列を含む核酸セグメントを 得る工程をさらに包含する、請求項９０に記載の方法。 ９２．前記サンプルおよび標準核酸をコードする配列を含む前記核酸セグメント からの核酸組成物の単離が同一の単離手順において行われるように、前記混合す る工程が、該サンプルから該核酸組成物を単離する前、および標準核酸をコード する配列を含む該核酸セグメントを単離する前に、該サンプルと前記核酸標準と を混合することを包含する、請求項９１に記載の方法。 ９３．前記核酸標準が、内部核酸標準として利用される、請求項８５に記載の方 法。 ９４．前記核酸標準が、外部核酸標準として利用される、請求項８５に記載の方 法。 ９５．前記核酸標準が、陽性コントロール核酸標準として利用される、請求項８ ５に記載の方法。 ９６．前記アッセイが定量的アッセイである、請求項８５に記載の方法。 ９７．前記ヌクレアーゼ耐性核酸セグメントが、標準RNAをコードする配列を含 むリボヌクレアーゼ耐性RNAである、請求項８５に記載の方法。 ９８．前記試験される核酸がRNAである、請求項８５に記載の方法。 ９９．前記アッセイ工程が、PCRTM分析を含む、請求項８５に記載の方法。 １００．前記アッセイ工程が、以下： 逆転写手順を利用すること； PCRTM産物を生成するためにDNAを増幅すること；および 該PCRTM産物を検出すること、 を含むPCRTM分析を含む、請求項９９に記載の方法。 １０１．前記増幅する工程が、試験されるRNA PCRTM産物の標準RNA PCRTM産物と の共増幅を包含する、請求項１００に記載の方法。 １０２．前記共増幅が、RT-PCRTM手順からの試験されるRNA PCRTM産物および標 準RNA PCRTM産物の両方の増幅に適合した単一のプライマーセットの使用を包含 する、請求項１０１に記載の方法。 １０３．前記アッセイが、試験されるRNA PCRTM産物の量をRNA PCRTM産物の量と 比較する工程を包含する、請求項９９に記載の方法。 １０４．前記核酸標準が、標準RNAをコードする配列を含むリボヌクレアーゼ耐 性RNAセグメントを含むRNA標準としてさらに規定される、請求項８５に記載の方 法。 １０５．前記リボヌクレアーゼRNAセグメントが、化学的に改変されたリボヌク レアーゼ耐性RNAである、請求項１０４に記載の方法。 １０６．前記化学的に改変されたリボヌクレアーゼ耐性RNAが、化学的に改変さ れたヌクレオチドから構成される、請求項１０５に記載の方法。 １０７．前記化学的に改変されたRNAが、予め転写されたRNA転写物の化学的改変 によって調製される、請求項１０５に記載の方法。 １０８．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、リボヌクレアーゼ耐性被 覆で被覆されている、請求項１０４に記載の方法。 １０９．前記リボヌクレアーゼ耐性被覆がタンパク質から構成される、請求項１ ０８に記載の方法。 １１０．前記タンパク質が、前記リボヌクレアーゼ耐性RNAに配列に独立な様式 で結合している、請求項１０９に記載の方法。 １１１．前記タンパク質が、MS2/R17被覆タンパク質、HIV-1ヌクレオキャプシド タンパク質、バクテリオファージT4のgp32、またはT4のregAタンパク質である、 請求項１１０に記載の方法。 １１２．前記タンパク質が、リボヌクレアーゼ耐性RNAに結合している、請求項 １１１に記載の方法。 １１３．前記タンパク質がバクテリオファージT4のgp32である、請求項１１１に 記載の方法。 １１４．前記リボヌクレアーゼ耐性被覆がポリアミンから構成される、請求項１ ０８に記載の方法。 １１５．前記ポリアミンがスペルミンまたはスペルミジンである、請求項１１４ に記載の方法。 １１６．前記リボヌクレアーゼ耐性被覆が核酸から構成される、請求項１０８に 記載の方法。 １１７．前記核酸が、リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントにハイブリダイズす る、請求項１１６に記載の方法。 １１８．前記ハイブリダイズされた核酸が、逆転写酵素のプライマーである、請 求項１１７に記載の方法。 １１９．前記組換えRNAセグメントが、リボヌクレアーゼ耐性構造にケージ化さ れている、請求項１０４に記載の方法。 １２０．前記リボヌクレアーゼRNAセグメントがリボヌクレアーゼ耐性構造であ る、請求項１０４に記載の方法。 １２１．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、脂質から構成されている、請求項１ ２０に記載の方法。 １２２．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、リポソームである、請求項１２１に 記載の方法。 １２３．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、合成マイクロカプセルである、請求 項１２０に記載の方法。 １２４．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、ポリマーマトリックスである、請求 項１２３に記載の方法。 １２５．前記ポリマーマトリックスが、アガロースまたはアクリルアミドである 、請求項１２４に記載の方法。 １２６．前記リボヌクレアーゼ耐性構造が、ウイルス被覆タンパク質から構成さ れる、請求項１２０に記載の方法。 １２７．前記ウイルス被覆タンパク質が、改変されたウイルス被覆タンパク質で ある、請求項１２６に記載の方法。 １２８．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルス被覆タンパク質 中にキャプシド化されている場合、リボヌクレアーゼに耐性である、請求項１２ ６に記載の方法。 １２９．前記ウイルス被覆タンパク質が、バクテリオファージウイルス被覆タン パク質である、請求項１２６に記載の方法。 １３０．前記ウイルス被覆タンパク質が、植物ウイルスまたは動物ウイルスのウ イルス被覆タンパク質である、請求項１２６に記載の方法。 １３１．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、タバコモザイクウ イルスのウイルス被覆タンパク質である、請求項１３０に記載の方法。 １３２．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルスMaturaseタンパ ク質に結合している、請求項１２６に記載の方法。 １３３．前記ウイルスMaturaseタンパク質が、改変されたウイルスMaturaseタン パク質である、請求項１３２に記載の方法。 １３４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operatorコード配列およ びウイルスMaturaseタンパク質結合部位を含む、請求項９７に記載の方法。 １３５．前記ウイルスMaturaseタンパク質結合部位が、改変されたウイルスMatu raseタンパク質結合部位である、請求項１３４に記載の方法。 １３６．前記Maturaseタンパク質結合部位が、ウイルスMaturaseタンパク質コー ド配列中に含まれる、請求項１３４に記載の方法。 １３７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルスMaturaseタンパ ク質コード配列をさらに含む、請求項１３４に記載の方法。 １３８．前記Maturaseタンパク質コード配列が、改変されたウイルスMaturaseタ ンパク質をコードする、請求項１３７に記載の方法。 １３９．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、ウイルス被覆タンパク質 をコードする配列を含む、請求項９７に記載の方法。 １４０．前記ウイルス被覆タンパク質コード配列が、バクテリオファージウイル ス被覆タンパク質をコードする、請求項１３９に記載の方法。 １４１．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、改変されたバクテ リオファージウイルス被覆タンパク質である、請求項１３９に記載の方法。 １４２．前記標準RNAをコードする配列が、非バクテリオファージ配列を含む、 請求項９７に記載の方法。 １４３．前記非バクテリオファージ配列が、ウイルス配列である、請求項１４２ に記載の方法。 １４４．前記非バクテリオファージ配列が、RNAの検出および/または定量におけ る標準としての使用に適合した配列である、請求項１４２に記載の方法。 １４５．前記非バクテリオファージ配列が、診断的価値のあるRNAの検出および/ または定量における使用に適合した配列である、請求項１４４に記載の方法。 １４６．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV- 2、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体の検出および/または 定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項１４４に記載の方 法。 １４７．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1、HIV-2、またはHCVの検出お よび/または定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項１４ ６に記載の方法。 １４８．前記HIV-1、HIV-2、またはHCVの検出および/または定量における標準と しての使用に適合した非バクテリオファージ配列が、改変されたHIV-1、HIV-2、 またはHCV配列を含む、請求項１４７に記載の方法。 １４９．前記非バクテリオファージ配列が、HIV-1の検出および/または定量にお ける標準としての使用に適合した配列である、請求項１４７に記載の方法。 １５０．前記HIV-1の検出および/または定量における標準としての使用に適合し た非バクテリオファージ配列が、改変されたHIV-1配列を含む、請求項１４６に 記載の方法。 １５１．前記非バクテリオファージ配列が、血液媒介性病原体の検出および/ま たは定量における標準としての使用に適合した配列である、請求項１４６に記載 の方法。 １５２．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、ウイルスM aturaseタンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ配列を含む 、請求項９７に記載の方法。 １５３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、ウイルスM aturaseタンパク質をコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配 列、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項９７に記載の方法。 １５４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくと も２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ 配列を含む、請求項９７に記載の方法。 １５５．前記組換えRNAセグメントが、Replicaseタンパク質をコードする配列を 含む、請求項９７に記載の方法。 １５６．前記組換えRNAセグメントが、pAR-1またはpAR-2の配列においてコード される、請求項９７に記載の方法。 １５７．サンプル中で試験される核酸の存在についてのアッセイ方法における内 部標準または外部標準としての使用のために、室温での正常ヒト血清における５ 分以上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ分解から保護される組換えRNA を含む、リボヌクレアーゼ耐性RNA内部標準または外部標準。 １５８．Maturaseタンパク質結合部位がウイルスMaturaseタンパク質コード配列 中に含有される、請求項１５７に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １５９．Maturaseタンパク質結合部位が改変されたMaturaseタンパク質結合部位 である、請求項１５７に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １６０．ウイルスMaturaseタンパク質コード配列をさらに含む、請求項１５８に 記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １６１．前記Maturaseタンパク質コード配列が改変されたウイルスMaturaseタン パク質をコードする、請求項１６０に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメン ト。 １６２．ウイルス被覆タンパク質コード配列をさらに含む、請求項１５７に記載 のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １６３．前記ウイルス被覆タンパク質コード配列がバクテリオファージウイルス 被覆タンパク質の配列コードをコードする、請求項１６２に記載のリボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメント。 １６４．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、改変されたバクテ リオファージウイルス被覆タンパク質である、請求項１６３に記載のリボヌクレ アーゼ耐性RNAセグメント。 １６５．非バクテリオファージ配列をさらに含む、請求項１５７に記載のリボヌ クレアーゼ耐性RNAセグメント。 １６６．前記非バクテリオファージ配列がウイルス配列である、請求項１６５に 記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １６７．前記非バクテリオファージ配列が疾患の検出のための標準としての使用 に適した配列である、請求項１６５に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメン ト。 １６８．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体の検出および／または 定量における標準としての使用に適した配列である、請求項１６５に記載のリボ ヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １６９．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、またはＧ型肝炎の検出および／または定量における標準としての使用に適した 配列である、請求項１６８に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １７０．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1、HIV-2、またはHCVの検出およ び／または定量における標準としての使用に適した配列である、請求項１６９に 記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １７１．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1またはHIV-2の検出および／また は定量における標準としての使用に適した配列である、請求項１７０に記載のリ ボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １７２．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1の検出および／または定量にお ける標準としての使用に適した配列である、請求項１７１に記載のリボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメント。 １７３．前記HIV-1の検出および／または定量における標準としての使用に適し た非バクテリオファージ配列が改変されたHIV-1配列を含む、請求項１７２に記 載のリボヌタレアーゼ耐性RNAセグメント。 １７４．前記非バクテリオファージ配列がHIV-2の検出および／または定量にお ける標準としての使用に適した配列である、請求項１７１に記載のリボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメント。 １７５．前記HIV-2の検出および／または定量における標準としての使用に適し た非バクテリオファージ配列が改変されたHIV-2配列を含む、請求項１７４に記 載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １７６．前記非バクテリオファージ配列がHCVの検出および／または定量におけ る標準としての使用に適した配列である、請求項１７０に記載のリボヌクレアー ゼ耐性RNAセグメント。 １７７．前記HCVの検出および／または定量における標準としての使用に適した 非バクテリオファージ配列が改変されたHCV配列を含む、請求項１７６に記載の リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １７８．前記非バクテリオファージ配列がHTLV-1の検出および／または定量にお ける標準としての使用に適した配列である、請求項１６９に記載のリボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメント。 １７９．前記HTLV-1の検出および／または定量における標準としての使用に適し た非バクテリオファージ配列が改変されたHTLV-1配列を含む、請求項１７８に記 載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８０．前記非バクテリオファージ配列がHTLV-2の検出および／または定量にお ける標準としての使用に適した配列である、請求項１６９に記載のリボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメント。 １８１．前記HTLV-2の検出および／または定量における標準としての使用に適し た非バクテリオファージ配列が改変されたHTLV-2配列を含む、請求項１８０に記 載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８２．前記非バクテリオファージ配列が血液媒介性病原体の検出および／また は定量における標準としての使用に適した配列である、請求項１６８に記載のリ ボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８３．前記非バクテリオファージ配列が、プラスモディウム、トリパノソーマ 、Francisella tularensis、またはWucheria bancroftiの検出および／または定 量における標準としての使用に適した配列である、請求項１８２に記載のリボヌ クレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８４．ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配列、および非バクテリオフ ァージ配列をさらに含む、請求項１５７に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグ メント。 １８５．ウイルスMaturaseをコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコード する配列、および非バクテリオファージ配列をさらに含む、請求項１８４に記載 のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８６．少なくとも２つのウイルスMaturase結合部位をさらに含む、請求項１５ ７に記載のリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８７．Operator配列をコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする 配列、および非バクテリオファージ配列をさらに含む、請求項１５７に記載のリ ボヌクレアーゼ耐性RNAセグメント。 １８８．リボヌクレアーゼ耐性のセグメントが室温での正常ヒト血清における５ 分以上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ分解から保護される、ウイルス 被覆タンパク質においてキャプシド化された標準RNAをコードする配列を含むリ ボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントを含む、RNA標準の合成における使用に適した DNAベクター。 １８９．前記ベクターがOperator配列をコードする配列およびウイルスMaturase 結合部位をコードする配列を含む、請求項１８８に記載のベクター。 １９０．前記多重クローニング部位がウイルスMaturase結合部位をコードする配 列の下流に存在する、請求項１８９に記載のベクター。 １９１．ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項１ ８９に記載のベクター。 １９２．前記ウイルスMaturase結合部位をコードする配列がウイルスMaturaseタ ンパク質をコードする配列内に含まれる、請求項１９１に記載のベクター。 １９３．ウイルス被覆タンパク質遺伝子をコードする配列をさらに含む、請求項 １８９に記載のベクター。 １９４．ウイルス被覆タンパク質遺伝子をコードする配列、Operator配列、およ び多重クローニング部位をさらに含む、請求項１９３に記載ののベクター。 １９５．非バクテリオファージ配列をコードするDNA配列をさらに含む、請求項 １８８に記載のベクター。 １９６．前記非バクテリオファージ配列が、ウイルス非バクテリオファージ配列 である、請求項１９５に記載のベクター。 １９７．前記非バクテリオファージ配列が診断のための価値があるRNAの検出お よび／または定量のための標準としての使用に適している、請求項１９６に記載 のベクター。 １９８．標準核酸をコードする配列を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸標準を含む収 集管であって、該ヌクレアーゼ耐性核酸標準は、室温での正常ヒト血清における ５分間以上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ分解から保護される、収集 管。 １９９．前記管が体液の収集における使用に適した、請求項１９８に記載の収集 管。 ２００．前記体液が、血液、尿、または脳脊髄液である、請求項１９９に記載の 収集管。 ２０１．ウイルス被覆タンパク質においてキャプシド化された標準的なRNAをコ ードする配列を含む、室温での正常ヒト血清における５分間以上のインキュベー ションの際のヌクレアーゼ分解から保護される、リボヌクレアーゼ耐性RNAセグ メントを含むRNA標準を作製する方法であって、以下： Operator配列をコードする配列、ウイルスMaturase結合部位をコードす る配列、および非バクテリオファージ配列を含む標準的なRNAをコードする配列 を含むリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクター を得る工程； 該ベクターを細胞にトランスフェクトする工程； ウイルス被覆タンパク質を提供する工程； ウイルスMaturaseタンパク質を提供する工程；および 該リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントの転写および該リボヌクレアー ゼ耐性RNAセグメントのウイルス被覆タンパク質内へのキャプシド化を可能にさ せる条件下で該細胞を培養する工程、 を包含する方法。 ２０２．前記ウイルス被覆タンパク質を提供する工程が以下： ウイルス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントを得ること； 該ウイルス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントを細胞内にトラ ンスフェクトすること；および 該ウイルス被覆タンパク質の発現を可能にする条件下で該細胞を培養す ること、 を包含する、請求項２０１に記載の方法。 ２０３．前記ウイルス被覆タンパタ質をコードする核酸セグメントがリボヌクレ アーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクターに含まれるDNA配 列である、請求項２０２に記載の方法。 ２０４．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してシスに配置されている、請 求項２０３に記載の方法。 ２０５．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列内に配置されている、請求項２０３ に記載の方法。 ２０６．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してトランスに配置されている 、請求項２０３に記載の方法。 ２０７．前記ウイルスMaturaseタンパク質を提供する工程が以下： ウイルスMaturaseタンパク質をコードする核酸セグメントを得ること； 該Maturaseタンパク質をコードする核酸セグメントを前記細胞内にトラ ンスフェクトすること；および 該ウイルスMaturaseタンパク質の発現を可能にする条件下で該細胞を培 養すること、 を包含する方法。 ２０８．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードする核酸セグメントがリボヌ クレアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクターに含まれるDN A配列である、請求項２０７に記載の方法。 ２０９．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌク レアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してシスに配置されている 、請求項２０７に記載の方法。 ２１０．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌク レアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列内に配置されている、請求項２ ０７に記載の方法。 ２１１．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌク レアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してトランスに配置されて いる、請求項２０７に記載の方法。 ２１２．前記非バクテリオファージ配列が前記ウイルスMaturase結合部位をコー ドする配列の下流に存在する、請求項２０１に記載の方法。 ２１３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがウイルスMaturaseタンパク 質をコードする配列をさらに含む、請求項２０１に記載の方法。 ２１４．前記ウイルスMaturase結合部位をコードする配列がウイルスMaturaseタ ンパク質をコードする配列内に含まれる、請求項２１３に記載の方法。 ２１５．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがウイルス被覆タンパク質遺 伝子をコードする配列をさらに含む、請求項２０１に記載の方法。 ２１６．前記非バクテリオファージ配列がウイルス非バクテリオファージ配列で ある、請求項２０１に記載の方法。 ２１７．前記非バクテリオファージ配列が標準RNAとしての使用に適している、 請求項２１６に記載の方法。 ２１８．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体の検出および／または 定量における標準RNAとしての使用に適している、請求項２１７に記載の方法。 ２１９．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1由来の病原体の検出および／ま たは定量における標準RNAとしての使用に適した配列である、請求項２１８に記 載の方法。 ２２０．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが少なくとも２つのウイルスM aturase結合部位を含む、請求項２０１に記載の方法。 ２２１．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがReplicaseタンパク質コード する配列を含む、請求項２０１に記載の方法。 ２２２．前記Replicaseタンパク質コードする配列が改変されたReplicaseタンパ ク質をコードする、請求項２２１に記載の方法。 ２２３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、実質的に、Operator配列 、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ 配列からなる、請求項２０１に記載の方法。 ２２４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、少なくとも２つのOperato r配列、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２０１に記載の方法。 ２２５．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、少なくとも２つのOperato r配列、およびウイルス被覆タンパク質をコードする配列を含む、請求項２０１ に記載の方法。 ２２６．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、ウイルスM aturaseタンパク質をコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配 列、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２０１に記載の方法。 ２２７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくと も２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ 配列を含む、請求項２０１に記載の方法。 ２２８．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくと も２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、非バクテリオファージ配列、 およびReplicaseタンパク質をコードする配列を含む、請求項２０１に記載の方 法。 ２２９．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがpAR-1の配列中にコードされ る、請求項２０１に記載の方法。 ２３０．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがpAR-2の配列中にコードされ る、請求項２０１に記載の方法。 ２３１．前記細胞がE.coli細胞である、請求項２０１に記載の方法。 ２３２．室温での正常ヒト血清における５分間以上のインキュベーションの際の ヌクレアーゼ分解から保護されるヌクレアーゼ耐性核酸セグメントを含み、ウイ ルス被覆タンパク質にキャプシド化された標準核酸をコードする配列を含む、核 酸標準を作製する方法であって、以下： Operator配列をコードする配列、ウイルスMaturase結合部位をコードす る配列、および非バクテリオファージ配列を含む標準的な核酸をコードする配列 を含むリボヌクレアーゼ耐性核酸セグメントをコードする核酸配列を含むベクタ ーを得る工程； 該ベクターを細胞にトランスフェクトする工程； ウイルス被覆タンパク質を提供する工程； ウイルスMaturaseタンパク質を提供する工程；および 組換え核酸セグメントの転写および組換え核酸セグメントのウイルス被 覆タンパク質内へのキャプシド化を可能にさせる条件下で該細胞を培養する工程 、を包含する方法。 ２３３．前記ヌクレアーゼ耐性核酸セグメントがRNAである、請求項２３２に記 載の方法。 ２３４．前記ヌクレアーゼ耐性核酸セグメントがDNAである、請求項２３２に記 載の方法。 ２３５．室温での正常ヒト血清における５分間以上のインキュベーションの際の でのヌクレアーゼ分解から保護される、ウイルス被覆タンパク質にキャプシド化 されたリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントを含み、RNA標準を作製する方法であ って、以下： Operator配列をコードする配列、ウイルスMaturase結合部位をコードす る配列、および非バクテリオファージ配列を含む組換えRNAセグメントをコード するDNA配列を含むベクターを得る工程； 該ベクターを細胞にトランスフェクトする工程； ウイルス被覆タンパク質をコードするDNAセグメントを得、そして該細 胞内に該ウイルス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントをトランスフェク トする工程； ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNAセグメントを得、そして 該ウイルスMaturaseタンパク質コードする核酸セグメントを該細胞内にトランス フェクトする工程；および 組換えRNAセグメントの転写、該ウイルス被覆タンパク質および該ウイ ルスMaturaseタンパク質の発現、ならびに組換えRNAセグメントのウイルス被覆 タンパク質内へのキャプシド化を可能にさせる条件下で該細胞を培養して、標準 RNAをコードする配列を含むリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントを得る工程、を 包含する方法。 ２３６．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNAセグメントが、前記組換 えRNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクター中に含まれる、請求項２３ ５に記載の方法。 ２３７．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記組換えRNAセグ メントをコードするDNA配列に対してシスに配置されている、請求項２３６に記 載の方法。 ２３８．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記組換えRNAセグ メントをコードするDNA配列内に配置されている、請求項２３６に記載の方法。 ２３９．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記組換えRNAセグ メントをコードするDNA配列に対してトランスに配置されている、請求項２３６ に記載の方法。 ２４０．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNAセグメントが前記組 換えRNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクターに含まれる、請求項２３ ５に記載の方法。 ２４１．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記組換えRNA セグメントをコードするDNA配列に対してシスに配置されている、請求項２４０ に記載の方法。 ２４２．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記組換えRNA セグメントをコードするDNA配列内に配置されている、請求項２４０に記載の方 法。 ２４３．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記組換えRNA セグメントをコードするDNA配列に対してトランスに配置されている、請求項２ ４０に記載の方法。 ２４４．前記非バクテリオファージ配列が前記ウイルスMaturase結合部位をコー ドする配列の下流に存在する、請求項２３５に記載の方法。 ２４５．前記組換えRNAセグメントがウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列をさらに含む、請求項２３５に記載の方法。 ２４６．前記ウイルスMaturase結合部位をコードする配列がウイルスMaturaseタ ンパク質をコードする配列内に含まれる、請求項２４５に記載の方法。 ２４７．前記組換えRNAセグメントがウイルス被覆タンパク質遺伝子をコードす る配列をさらに含む、請求項２３５に記載の方法。 ２４８．前記非バクテリオファージ配列がウイルス非バクテリオファージ配列で ある、請求項２３５に記載の方法。 ２４９．前記非バクテリオファージ配列が標準RNAとしての使用に適している、 請求項２３５に記載の方法。 ２５０．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体の検出および/または 定量における標準RNAとしての使用に適している、請求項２４９に記載の方法。 ２５１．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1の検出および/または定量におけ る標準RNAとしての使用に適した配列である、請求項２５０に記載の方法。 ２５２．前記組換えRNAセグメントが少なくとも２つのウイルスMaturase結合部 位を含む、請求項２３５に記載の方法。 ２５３．前記組換えRNAセグメントがReplicaseタンパク質をコードする配列を含 む、請求項２３５に記載の方法。 ２５４．前記Replicaseタンパク質をコードする配列が改変されたReplicaseタン パク質をコードする、請求項２５３に記載の方法。 ２５５．前記組換えRNAセグメントが、本質的に、Operator配列、ウイルスMatur aseタンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ配列からなる、 請求項２３５に記載の方法。 ２５６．前記組換えRNAセグメントが、Operator配列、およびウイルス被覆タン パク質をコードする配列を含む、請求項２３５に記載の方法。 ２５７．前記組換えRNAセグメントが、少なくとも２つのOperator配列、および 非バクテリオファージ配列を含む、請求項２３５に記載の方法。 ２５８．前記組換えRNAセグメントが、Operator配列、ウイルスMaturaseタンパ ク質をコードする配列、ウイルス被覆タンパタ質をコードする配列、および非バ クテリオファージ配列を含む、請求項２３５に記載の方法。 ２５９．前記組換えRNAセグメントが、Operator配列、少なくとも２つのウイル スMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配列、ウイルス 被覆タンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ配列を含む、請 求項２３５に記載の方法。 ２６０．前記組換えRNAセグメントが、Operator配列、少なくとも２つのウイル スMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配列、ウイルス 被覆タンパク質をコードする配列、非バクテリオファージ配列、およびReplicas eタンパク質をコードする配列を含む、請求項２５９に記載の方法。 ２６１．前記組換えRNAセグメントがpAR-1の配列中にコードされる、請求項２３ ５に記載の方法。 ２６２．前記組換えRNAセグメントがpAR-2の配列中にコードされる、請求項２３ ５に記載の方法。 ２６３．前記細胞がE.coli細胞である、請求項２３５に記載の方法。 ２６４．インビボでRNAを作製する方法であって、以下： Operator配列をコードする配列、ウイルスMaturase結合部位をコードす る配列、および非バクテリオファージ配列を含む標準RNAをコードする配列を含 むリボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクターを得 る工程； 該ベクターを細胞にトランスフェクトする工程； ウイルス被覆タンパク質をコードするDNAセグメントを得、そして該細 胞内に該ウイルス被覆タンパク質をコードする核酸セグメントをトランスフェク トする工程； ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNAセグメントを得、そして 該ウイルスMaturaseタンパク質コードする核酸セグメントを該細胞内にトランス フェクトする工程；および 該リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントの転写、該ウイルス被覆タンパ ク質および該ウイルスMaturaseタンパク質の発現、ならびにリボヌクレアーゼ耐 性RNAセグメントのウイルス被覆タンパク質内へのキャプシド化を可能にさせる 条件下で該細胞を培養する工程であって、ここで該RNAセグメントが室温での正 常ヒト血清における５分以上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ分解から 保護される、工程、を包含する方法。 ２６５．前記被覆タンパク質から前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントを単 離する工程をさらに包含する、請求項２６４に記載の方法。 ２６６．前記単離されたRNAセグメントを処理して前記非バクテリオファージ配 列を含むRNAセグメントを得る工程をさらに包含する、請求項２６４に記載の方 法。 ２６７．前記単離されたRNAセグメントを処理して本質的に前記非バクテリオフ ァージ配列からなるRNAセグメントを得る工程をさらに包含する、請求項２６４ に記載の方法。 ２６８．前記単離されたRNAセグメントを処理して前記非バクテリオファージ配 列からなるRNAセグメントを得る工程をさらに包含する、請求項２６４に記載の 方法。 ２６９．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNAセグメントが前記リボヌ クレアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクター中に含まれる 、請求項２６４に記載の方法。 ２７０．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してシスに配置されている、請 求項２６９に記載の方法。 ２７１．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列内に配置されている、請求項２６９ に記載の方法。 ２７２．前記ウイルス被覆タンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌクレア ーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してトランスに配置されている 、請求項２６９に記載の方法。 ２７３．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNAセグメントが前記リ ボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列を含むベクター中に含ま れる、請求項２６４に記載の方法。 ２７４．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌク レアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してシスに配置されている 、請求項２７３に記載の方法。 ２７５．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌク レアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列内に配置されている、請求項２ ７３に記載の方法。 ２７６．前記ウイルスMaturaseタンパク質をコードするDNA配列が前記リボヌク レアーゼ耐性RNAセグメントをコードするDNA配列に対してトランスに配置されて いる、請求項２７３に記載の方法。 ２７７．前記非バクテリオファージ配列が前記ウイルスMaturase結合部位をコー ドする配列の下流に存在する、請求項２７６に記載の方法。 ２７８．前記組換えRNAセグメントがウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列をさらに含む、請求項２６４に記載の方法。 ２７９．前記ウイルスMaturase結合部位をコードする配列が前記ウイルスMatura seタンパク質をコードする配列内に含まれる、請求項２７８に記載の方法。 ２８０．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがウイルス被覆タンパク質遺 伝子をコードする配列をさらに含む、請求項２６４に記載の方法。 ２８１．前記非バクテリオファージ配列がウイルス非バクテリオファージ配列で ある、請求項２６４に記載の方法。 ２８２．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、本質的に、Operator配列 、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ 配列からなる、請求項２６４に記載の方法。 ２８３．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、ウイルスM aturaseタンパク質をコードする配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配 列、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２６４に記載の方法。 ２８４．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくと も２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、および非バクテリオファージ 配列を含む、請求項２６４に記載の方法。 ２８５．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが、Operator配列、少なくと も２つのウイルスMaturase結合部位、ウイルスMaturaseタンパク質をコードする 配列、ウイルス被覆タンパク質をコードする配列、非バクテリオファージ配列、 およびReplicaseタンパク質をコードする配列を含む、請求項２６４に記載の方 法。 ２８６．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントが少なくとも２つのウイルスM aturase結合部位を含む、請求項２６４に記載の方法。 ２８７．前記リボヌクレアーゼ耐性RNAセグメントがReplicaseタンパク質コード する配列を含む、請求項２６４に記載の方法。 ２８８．前記Replicaseタンパク質をコードする配列が改変されたReplicaseタン パク質をコードする、請求項２８７に記載の方法。 ２８９．インビトロでウイルス被覆タンパク質に組換えRNAセグメントをキャプ シド化する方法であって、以下： 組換えRNAセグメントを得る工程； ウイルス被覆タンパク質を得る工程；および 該組換えRNAセグメントおよび該ウイルス被覆タンパク質を、組換えRNA セグメントが該ウイルス被覆タンパク質内へキャプシド化されるような条件下で 、一緒に配置する工程であって、ここで該組換えRNAが室温での正常ヒト血清に おける５分以上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ分解から保護される、 工程、 を包含する方法。 ２９０．前記ウイルス被覆タンパク質がバクテリオファージウイルス被覆タンパ ク質である、請求項２８９に記載の方法。 ２９１．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、遺伝サブクラスＡ またはＢのE.coliバクテリオファージのタンパク質である、請求項２９０に記載 の方法。 ２９２．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、遺伝サブクラスＡ のE.coliバクテリオファージのタンパク質である、請求項２９１に記載の方法。 ２９３．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、血清学的グループ Ｉ、II、III、またはIV中のE.coliバクテリオファージのタンパク質である、請 求項２９０に記載の方法。 ２９４．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、血清学的グループ Ｉ中のE.coliバクテリオファージのタンパク質である、請求項２９３に記載の方 法。 ２９５．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、MS2/R17バクテリ オファージのタンパク質である、請求項２９０に記載の方法。 ２９６．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、Pseudomonas aeru ginosa RNAバクテリオファージのタンパク質である、請求項２９０に記載の方法 。 ２９７．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、Pseudomonas aeru ginosa PRR1またはPP7バクテリオファージのタンパク質である、請求項２９６に 記載の方法。 ２９８．前記バクテリオファージウイルス被覆タンパク質が、繊維状バクテリオ ファージのタンパク質である、請求項２９０に記載の方法。 ２９９．前記ウイルス被覆タンパク質が、植物または動物のウイルスのウイルス 被覆タンパク質である、請求項２８９に記載の方法。 ３００．前記ウイルス被覆タンパク質がタバコモザイクウイルス、ネコ免疫不全 ウイルス、またはRous肉腫ウイルスのウイルス被覆タンパク質である、請求項２ ９９に記載の方法。 ３０１．ウイルスMaturaseタンパク質の調製をさらに包含する、請求項２８９に 記載の方法。 ３０２．前記ウイルスMaturaseタンパク質が改変されたウイルスMaturaseタンパ ク質である、請求項３０１に記栽の方法。 ３０３．前記組換えKNAセグメントが、Operatorコード配列およびウイルスMatur aseタンパク質結合部位を含む、請求項２８９に記載の方法。 ３０４．前記組換えRNAセグメントがウイルスMaturaseタンパク質コード配列を さらに含む、請求項３０３に記載の方法。 ３０５．前記組換えRNAセグメントが、ウイルス被覆タンパク質をコードする配 列をさらに含む、請求項３０３に記載の方法。 ３０６．前記組換えRNAセグメントが、RNAバクテリオファージ由来のバクテリオ ファージ配列および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２９０に記載の方 法。 ３０７．前記非バクテリオファージ配列がウイルス配列である、請求項３０６に 記載の配列。 ３０８．前記非バクテリオファージ配列が、RNAの検出および／または定量にお ける標準としての使用に適している配列である、請求項３０６に記載の方法。 ３０９．前記非バクテリオファージ配列が、診断的価値のあるRNAの検出および ／または定量における使用に適した配列である、請求項３０８に記載の方法。 ３１０．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1、HIV-2、HCV、HTLV-1、HTLV-2 、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、または血液媒介性病原体の検出および／または 定量における標準としての使用に適した配列である、請求項３０８に記載の方法 。 ３１１．前記非バクテリオファージ配列がHIV-1の検出および／または定量にお ける標準としての使用に適した配列である、請求項３１０に記載の方法。 ３１２．前記HIV-1の検出および／または定量における標準としての使用に適し た非バクテリオファージ配列が改変されたHIV-1配列を含む、請求項３１１に記 載の方法。 ３１３．前記バクテリオファージ配列が、遺伝サブクラスＡのE.coliバクテリオ ファージ由来の配列である、請求項３０６に記載の方法。 ３１４．前記組換えRNAセグメントが、少なくとも２つのMaturase結合部位を含 む、詰求項２９０に記載の方法。 ３１５．前記組換えRNAセグメントが、Replicaseタンパク質をコードする配列を 含む、請求項２９０に記載の方法。 ３１６．前記Replicaseタンパク質をコードする配列が活性でない改変されたRep licascタンパク質をコードする、請求項３１５に記載の方法。 ３１７．前記組換えRNAセグメントが、少なくとも２つのOperator配列および非 バクテリオファージ配列を含む、請求項２９０に記載の方法。 ３１８．前記組換えRNAセグメントが、Operator配列、ウイルスMaturaseタンパ ク質をコードする配列、および非バクテリオファージ配列を含む、請求項２９０ に記載の方法。 ３１９．インビトロまたはインビボで細胞にRNAを送達する方法であって、以下 ： ウイルス被覆タンパク質中にキャプシド化されたリボヌクレアーゼ耐性 RNAセグメントを含むArmored RNATMを得る工程であって、該RNAセグメントが室 温での止常ヒト血清における５分以上のインキュベーションの際のヌクレアーゼ 分解から保護される、工程； ArmoredTMRNA培養物を細胞とともに配置する工程；および 該細胞を、Armored RNATMが該細胞に取り込まれるような条件下で培養 する工程、を包含する方法。 ３２０．前記ArmoredRNATMがRNAの細胞への送達を促進するように改変されたバ クテリオファージタンパク質を含む、請求項３１９に記載の方法。 ３２１．前記改変されたバクテリオファージタンパク質がウイルス被覆タンパク 質またはMaturaseタンパク質である、請求項３２０に記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013542712A (ja) * 2010-07-29 2013-11-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 微生物核酸の定性的および定量的検出
JP2016187338A (ja) * 2010-07-29 2016-11-04 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 微生物核酸の定性的および定量的検出
JP2019506849A (ja) * 2015-12-28 2019-03-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 特異的ｒｎａの安定化のための汎用法
JP2019528777A (ja) * 2016-10-10 2019-10-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｐｈｉ６内部対照組成物、装置、および方法

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939262A (en) * 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
DE19737442C2 (de) * 1997-08-22 1999-06-24 Olfert Landt Tib Molbiol Synth Proteinumhüllte Polyribonukleinsäuren, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US20030083272A1 (en) * 1997-09-19 2003-05-01 Lahive & Cockfield, Llp Sense mrna therapy
EP1892299A3 (en) * 1997-09-19 2011-07-20 Life Technologies Corporation Sense mRNA therapy
WO2002018645A2 (en) * 2000-08-28 2002-03-07 Oncomedx, Inc. 5t4 rna in plasma and serum as a marker for neoplastic disease
US7767422B2 (en) * 1998-09-22 2010-08-03 Oncomedx, Inc. Detection of 5T4 RNA in plasma and serum
US6777210B1 (en) 1998-09-24 2004-08-17 Ambion, Inc. Method and reagents for inactivating ribonucleases RNase A, RNase I and RNase T1
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
KR20000065690A (ko) * 1999-04-08 2000-11-15 박종구 반응 특이성 및 안정성을 개선시킨 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, 안티센스 ｄｎａ 및 그 제조방법
US7829693B2 (en) * 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
ATE311444T1 (de) * 2000-03-31 2005-12-15 Cambridge Antibody Tech Verbesserungen in bezug auf ribosom-komplexe als selektionspartikel
GB0021303D0 (en) * 2000-08-30 2000-10-18 Medinnova Sf Use
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US20020172972A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-21 President And Fellows Of Harvard College Use of a selectively inactivatable enzyme to digest contaminating nucleic acid
CN1311084C (zh) * 2001-12-06 2007-04-18 阿隆戴蒙德艾滋病研究中心 利用嵌合噬菌体标准物的高灵敏基因组检测
US20030170617A1 (en) 2002-01-28 2003-09-11 Pasloske Brittan L. Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection
EP2221377B2 (en) 2002-02-01 2017-05-17 Life Technologies Corporation Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
AU2003237528A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Kentucky Bioprocessing, Llc Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
US7767788B2 (en) * 2003-03-21 2010-08-03 The Research Foundation Of State University Of New York Folding protein functioning as a molecular switch
AU2004265581B2 (en) * 2003-05-20 2008-06-05 Investigen, Inc System for detecting polynucleotides
US7173015B2 (en) 2003-07-03 2007-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of Syk kinase expression
US7115719B2 (en) * 2003-12-16 2006-10-03 Gentra Systems, Inc. Formulations and methods for denaturing proteins
US20050267300A1 (en) 2004-04-05 2005-12-01 Muthiah Manoharan Processes and reagents for oligonucleotide synthesis and purification
US7626014B2 (en) 2004-04-27 2009-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
US7674778B2 (en) * 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
AU2005327517B2 (en) * 2004-06-30 2011-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
WO2006093526A2 (en) * 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
EP1913011B1 (en) 2004-08-04 2016-11-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
US7309589B2 (en) 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
CA2579676A1 (en) 2004-09-08 2007-02-15 Hana Golding Compositions and methods for the detection of hiv-1/hiv-2 infection
US8772254B2 (en) * 2004-10-25 2014-07-08 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded RNA to pest organisms
US20060105372A1 (en) 2004-11-05 2006-05-18 Bair Robert J Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents
AU2006270063A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Applied Biosystems, Llc. Methods for RNA profiling
EP2010677A4 (en) * 2006-02-24 2010-04-14 Investigen Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF POLYNUCLEOTIDES
EP2066686A4 (en) 2006-10-06 2010-07-14 Dna Genotek Inc STABILIZING COMPOSITIONS AND METHODS FOR EXTRACTING A RIBONUCLEIC ACID
WO2008051817A1 (en) * 2006-10-20 2008-05-02 Novartis Ag Compositions and method for monitoring bcr-abl expression
US20080096193A1 (en) * 2006-10-24 2008-04-24 Charles Robert Bupp Methods and compositions for detecting polynucleotides
CN101173252B (zh) * 2006-10-31 2011-09-21 杭州市疾病预防控制中心 披甲rna及其制备方法
WO2008103702A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Investigen, Inc. Methods and compositions for rapid light-activated isolation and detection of analytes
US7964350B1 (en) 2007-05-18 2011-06-21 Applied Biosystems, Llc Sample preparation for in situ nucleic acid analysis
WO2009151697A2 (en) * 2008-03-14 2009-12-17 The Government Of United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and processes relating to human bocavirus
US8324149B2 (en) * 2008-11-18 2012-12-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Encapsidation of heterologous entities into virus-like particles
US20100129902A1 (en) 2008-11-24 2010-05-27 Erhard Ralf Schoenbrunner Replication Stable and RNase Resistant Chimeras of Pestivirus with Insertion in 3' Nontranslated Region (3'NTR)
EP2367954B1 (en) 2008-12-19 2015-02-18 Life Technologies Corporation Proteinase k inhibitors, methods and compositions therefor
ES2617258T5 (es) 2010-07-29 2023-11-15 Hoffmann La Roche Preparación de muestras genéricas
US8877464B2 (en) 2010-07-29 2014-11-04 Roche Molecular Systems, Inc. Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids
CA2802567C (en) 2010-07-29 2017-12-05 F. Hoffmann La-Roche Ag Control nucleic acids for multiple parameters
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2426222A1 (en) 2010-09-07 2012-03-07 F. Hoffmann-La Roche AG Generic buffer for amplification
CA3162352A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2465945A1 (en) 2010-12-17 2012-06-20 F. Hoffmann-La Roche AG Generic matrix for control nucleic acids
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012177656A2 (en) 2011-06-19 2012-12-27 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
SG10201504415YA (en) 2012-03-13 2015-07-30 Emd Millipore Corp Use of centrifugation-aided infection to increase virus titer
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013243946A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
SG11201507463WA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Geneweave Biosciences Inc Non-replicative transduction particles and transduction particle-based reporter systems
US9481903B2 (en) 2013-03-13 2016-11-01 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for detection of cells using engineered transduction particles
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US9540675B2 (en) 2013-10-29 2017-01-10 GeneWeave Biosciences, Inc. Reagent cartridge and methods for detection of cells
WO2015118183A1 (en) * 2014-02-10 2015-08-13 Amptec Gmbh Incoated rna
EP3981437A1 (en) 2014-04-23 2022-04-13 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
GB201412316D0 (en) * 2014-07-10 2014-08-27 Momentum Bioscience Ltd Detecting the absence of micro-organisms
US11015217B2 (en) 2015-05-29 2021-05-25 Roche Molecular Systems, Inc. Method of inactivating microbes by citraconic anhydride
US10351893B2 (en) 2015-10-05 2019-07-16 GeneWeave Biosciences, Inc. Reagent cartridge for detection of cells
WO2017072303A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Life Science Inkubator Gmbh Use of vlp for the detection of nucleic acids
US20170356025A1 (en) 2016-06-14 2017-12-14 Roche Molecular Systems, Inc. Internal control probes for improving pcr assay performance
EP3299471B1 (en) 2016-09-23 2019-10-23 Roche Diagniostics GmbH Methods for determining the amount of a nucleic acid of interest in an unprocessed sample
WO2019070731A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Abbott Molecular Inc. ASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV)
CA3068482A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting hepatitis c virus (hcv)
WO2019139792A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting chlamydia trachomatis, neisseria gonorrhoeae, trichomonas vaginalis, and mycoplasma genitalium

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4866167A (en) * 1985-03-01 1989-09-12 Biotechnica Diagnostics, Inc. Detection of human oral cells by nucleic acid hybridization
CA1288073C (en) * 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US5091309A (en) * 1986-01-16 1992-02-25 Washington University Sindbis virus vectors
GB8608850D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
ES2060646T3 (es) * 1987-02-09 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Virus rna hibrido.
US5316931A (en) * 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
SE9003978D0 (sv) * 1990-12-13 1990-12-13 Henrik Garoff Dna expressionssystem baserade paa ett virus replikon
EP0596979B1 (en) * 1991-08-01 2002-01-30 Large Scale Biology Corporation Recombinant plant viral nucleic acids
DE69233285T2 (de) * 1991-08-02 2004-11-25 bioMérieux B.V. Quantifikation von Nukleinsäuren
WO1993020217A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Kanebo Limited Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product
US5443969A (en) * 1992-10-29 1995-08-22 Rutgers University RNA packaging system
GB9311386D0 (en) * 1993-06-02 1993-07-21 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogue assay procedures
US5614413A (en) * 1993-07-01 1997-03-25 The Uab Research Foundation Encapsidated recombinant poliovirus nucleic acid and methods of making and using same
CA2125344A1 (en) * 1993-07-01 1995-01-02 Casey D. Morrow Encapsidated recombinant poliovirus nucleic acid and methods of making and using same
ES2131699T3 (es) * 1993-07-09 1999-08-01 Akzo Nobel Nv Procedimiento mejorado de cuantificacion del acido nucleico.
WO1995014109A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 U.S. Department Of The Army High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens
GB2285445A (en) * 1993-12-06 1995-07-12 Pna Diagnostics As Protecting nucleic acids and methods of analysis
US5824507A (en) * 1994-05-20 1998-10-20 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis G virus and molecular cloning thereof
WO1995034684A1 (en) * 1994-06-10 1995-12-21 Georgetown University Recombinant virus and related method of quantitating same
US6613749B1 (en) * 1994-07-26 2003-09-02 Imperial College Innovations Limited Papovavirus pseudocapsids and use thereof for exogenous material transfer
US5716821A (en) * 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
US5736388A (en) * 1994-12-30 1998-04-07 Chada; Sunil Bacteriophage-mediated gene transfer systems capable of transfecting eukaryotic cells
US5939262A (en) * 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
US5677124A (en) * 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
WO2000063440A2 (en) 1999-04-20 2000-10-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Diagnostic standards for virus detection and quantification

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013542712A (ja) * 2010-07-29 2013-11-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 微生物核酸の定性的および定量的検出
JP2016187338A (ja) * 2010-07-29 2016-11-04 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 微生物核酸の定性的および定量的検出
JP2019506849A (ja) * 2015-12-28 2019-03-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 特異的ｒｎａの安定化のための汎用法
JP2019528777A (ja) * 2016-10-10 2019-10-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｐｈｉ６内部対照組成物、装置、および方法
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