JP2013542712A - 微生物核酸の定性的および定量的検出 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
i)それはその反応の有効性を監視する。
その定性的内部対照核酸および/または内部定量標準核酸は、競合的、非競合的または部分的に競合的であることができる。競合的な定性的内部対照核酸および/または内部定量標準核酸は本質的にその標的と同じプライマー結合部位を有し、従って同じプライマーに関して標的として競合する。競合的構成の利点の中には、例えばそのアッセイに導入しなければならない異なるプライマーのセットがより少なく、従ってそれの費用および全体的な複雑さが低減されることがある。さらに、そのプライマーの機能性は、標的プライマー特異的である阻害作用として監視される。非競合的な定性的内部対照核酸および/または内部定量標準核酸はその標的と異なるプライマー結合部位を有し、従って異なるプライマーに結合する。そのような構成の利点には、とりわけ、その反応混合物中の異なる核酸の1回の増幅事象があらゆる競合作用なしに互いに独立して起こることができるという事実が含まれる。部分的に競合的な内部定量標準核酸を用いるPCRでは、そのそれぞれの対照核酸および標的核酸の少なくとも1つが同じプライマーに関して競合するが、少なくとも1つの他の標的核酸は異なるプライマーに結合する。
生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、前記の方法は以下のことを含む:
a)前記の微生物核酸を単離および精製し;
b)少なくとも第1対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸および前記の対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;
c)前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;
d)1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することおよび前記の対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;
e)前記の増幅産物により生成する、前記の対照核酸および前記の微生物核酸の濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、ここで前記の対照核酸の増幅産物の存在は前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。
生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、前記の方法は以下のことを含む:
a)前記の微生物核酸を単離および精製し;
b)異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸ならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;
c)前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;
d)1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;
e)前記の第1対照核酸および前記の微生物核酸の増幅産物により生成する、それらの濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、および/または同時に前記の第2対照核酸の前記の増幅産物により生成された蛍光シグナルを検出し、ここで前記の第2対照核酸の増幅産物の存在は前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。
“競合的”は、プライマーを含む増幅反応において、それぞれの対照核酸および標的核酸(単数または複数)が少なくとも本質的に同じプライマー結合部位を有し、従って同じプライマーに関して競合することを意味する。競合的構成の利点の中には、例えばそのアッセイに導入しなければならない異なるプライマーのセットがより少なく、従ってそれの費用および全体的な複雑さが低減されることがある。さらに、そのプライマーの機能性は、標的プライマー特異的である阻害作用として監視される。
当業者は、同じ実験から信頼できる定性的情報だけでなく場合により同等に信頼できる定量的情報も引き出すことができる。従って、別の観点において本発明は以下のものに関する:
さらに以下のことを含む、上記で記述した方法:
工程e)において、前記の微生物核酸および前記の第1対照核酸により生成されたシグナルの比較により、前記の生物学的試料中の前記の微生物核酸の量を決定する。
“反応混合物”は、本発明において用いられる場合、少なくとも生物学的反応または化学反応を促進するための全ての構成要素を含む。それはあらゆる分離した区画なしの単一の体積であり、すなわち、前記の“反応混合物”中に存在する全ての構成要素は、互いに直接接触している。
“微生物の”は、“微生物”に由来する、または属することを意味する。
“定量化する”は、特定の対象、例えば標的またはシグナルの量を決定することを意味する。
第1および第2対照核酸を用いる本発明の特定の態様の意味において、その第1対照核酸は“内部定量標準核酸”としての役目を果たす。“内部定量標準核酸”は“核酸”であり、従って当業者に既知であるような“ヌクレオチド”のポリマー化合物である。“内部定量標準核酸”の場合では、その核酸は同時に“その反応の有効性に関する対照として、および定量する”ための、すなわちその“標的核酸”または“微生物核酸”の量を決定するための基準として用いるのに適切であり、そのように用いられる。この目的に関して、その“内部定量標準核酸”はその“標的核酸”または“微生物核酸”と一緒に全ての可能性のある試料調製工程を経る。さらに、それはその方法全体を通してその同じ反応混合物内で処理される。その“内部定量標準核酸”は、直接または間接的に、その標的核酸の存在下または非存在下の両方において検出可能なシグナルを生成しなければならない。この目的に関して、その“内部定量標準核酸”の濃度は、それぞれの試験において、感度を損なわないように、しかし例えば非常に高い標的濃度においても検出可能なシグナルを生成するように、注意深く最適化されなければならない。好ましくは、その“内部定量標準核酸”、すなわちその第1対照核酸に関する濃度範囲は、反応あたり100コピー〜反応あたり100000コピーの範囲を含むであろう。その“内部定量標準核酸”の可能性のある濃度は、例えばHIVに関して:1000コピー/反応、HCVに関して:7500コピー/反応であってよいが、これらの濃度は当業者に既知であるようにその特定のアッセイに適合されてよい。そのそれぞれのアッセイの検出限界(LOD)の点では、その“内部定量標準核酸”に関する濃度範囲は好ましくは20〜5000×LOD、より好ましくは20〜1000×LOD、最も好ましくは20〜500×LODである。反応混合物中のその“内部定量標準核酸”の終濃度は、成し遂げられる定量的測定範囲に依存する。その“内部定量標準核酸”は、例えばDNA、RNAまたはPNA、armored DNAまたはarmored RNA、およびそれらの修飾された形態であることができる。
−例えば以下のような、配列依存性の、または生体分子特異的な(biospecific)方法:
・親和性クロマトグラフィー
・固定された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダーゼーション
−例えば以下のような、配列非依存性の、または物理化学的な方法:
・例えばフェノール−クロロホルムによる液体−液体抽出
・例えば純粋なエタノールによる沈殿
・濾紙による抽出
・セチル−トリメチル−アンモニウム−ブロミドのようなミセル形成剤による抽出
・固定されたインターカレートする色素、例えばアクリジン誘導体への結合
・シリカゲルまたは珪藻土(diatomic earths)への吸着
・カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子(MGP)またはオルガノシラン粒子への吸着。
1態様において、本発明の方法には夾雑を避けるための工程が含まれる。例えば、1回のサーマルサイクラーの運転と次の運転の間で夾雑を低減または排除するための、ウラシル−DNAグリコシラーゼを利用する酵素的方法が、米国特許第5,035,996号、第5,683,896号および第5,945,313号において記述されている。加えて、本発明の方法を実施する際には、標準的な実験室封じ込めの実施および手順が望ましい。封じ込めの実施および手順には、方法の異なる工程に関する別々の作業領域、封じ込めフード、バリアーフイルターピペットティップ、および専用の空気置換(air displacement)ピペットが含まれるが、それらに限定されない。人員による一貫した封じ込めの実施および手順が、臨床試料を取り扱う診断実験室における正確さのために必要である。
FRETの代替法として、増幅産物を蛍光DNA結合色素(例えばSYBRGREEN I(登録商標)またはSYBRGOLD(登録商標)(Molecular Probes))のような二本鎖DNA結合色素を用いて検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際に、そのような蛍光DNA結合色素は適当な波長の光により励起された後に蛍光シグナルを放射する。核酸にインターカレートする色素のような二本鎖DNA結合色素を用いることもできる。二本鎖DNA結合色素を用いる場合、通常、増幅産物の存在の確認のために融解曲線分析が実施される。
さらに好ましい態様において、前記のアクセプター蛍光部分はクエンチャーである。
本発明に従う方法は、ウイルス核酸に好都合に適用することができる。従って、本発明の好ましい態様において、その微生物核酸はウイルス核酸である。
T’=10(a(CTQS−CT標的)2+b(CTQS−CT標的)+c)
におけるような多項較正式を用いることにより、その力価Tを計算することができる。
どのようにしてTaqManにおける定性的結果の計算を行うかの例を以下で記述する:全PCR運転からの機器補正蛍光値の入力データを分析する。おそらく標的核酸、例えば微生物核酸、および定性的内部対照核酸の役目を果たす対照核酸を含有する試料のセットに対して、指定されたような温度プロフィールを用いるサーマルサイクラー上でPCRを行う。そのPCRプロフィールの間の選択された温度および時間において、試料に濾波された光を照射し、それぞれの試料に関してその標的核酸およびその定性的内部対照核酸に関する濾波された蛍光データを収集する。PCR運転が完了した後、その蛍光読み取り値を処理して、その定性的内部対照核酸に関する1セットの色素濃度データおよびその標的核酸に関する1セットの色素濃度データを得る。色素濃度データのそれぞれのセットを同じ様式で処理する。その定性的内部対照核酸および存在するならばその標的核酸に関してエルボー値(CT)を計算する。エルボー値は、その標的核酸またはその内部定量標準核酸の蛍光が予め定められた閾値(蛍光濃度)と交差する点として定義される。その定性的内部対照は、指定された範囲内のCTが得られ、かつその蛍光が予め定められた最小蛍光強度を上回る場合、有効である。標的CTが得られない場合、その定性的内部対照は有効でなければならない。標的CTが得られた場合、それはその試料中の標的核酸の存在を示し、その定性的内部対照は有効または無効どちらであってもよい。
信頼できる定性的検出のために、および同時に信頼できる定量のために、異なる濃度の第1および第2対照核酸を含む対照試薬の概念は、微生物核酸を標的とするあらゆるそれぞれのアッセイに好都合に用いることができる。
別の好ましい態様において、そのキットは5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性および逆転写活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。
生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための分析システムであって、システムは以下のものを含むシステム:
−前記の微生物核酸を単離および精製するための溶解緩衝液および容器を含む、試料調製モジュール
−その中で上記で記述した方法を実施する反応容器を含む、増幅および検出モジュール
−上記のようなキット。
前記の保管モジュールはさらに、本発明の方法に有用な他の構成要素、例えば使い捨て用品、例えばピペットティップまたは増幅および検出モジュール内で反応容器として用いるための容器さえも含むことができる。
たとえ前記の移動を手作業で行うことが可能であるとしても、その移動が例えばロボット装置、例えば電動の移動ラックまたはロボットピボットアームにより行われる自動化されたシステムを用いるのが好ましい。
そのような制御ユニットは、前記の分析システムの種々の構成要素が正確に、そして正確なタイミングで、働き、相互作用すること、例えば試料などの構成要素を協調した様式で反応モジュールに移動させることを確実にするためのソフトウェアを含むことができる。その制御ユニットは、リアルタイムオペレーティングシステム(RTOS)を動かす処理装置も含むことができ、それはリアルタイムアプリケーションを意図するマルチタスクオペレーティングシステムである。言い換えれば、そのシステム処理装置は、リアルタイムな制約、すなわちシステム負荷に関係のない、事象からシステム応答までの操作上の期限を管理することができる。それは、そのシステム内の種々のユニットが与えられた命令に従って正確に作動および応答することをリアルタイムに制御する。
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV、HCVおよびHIV−1検査は商業的に入手可能なリアルタイムPCR検査であり、それらはウイルス標的HBV、HCVおよびHIV−1の正確な定量化に最適化されてきた。それらのアッセイは、PCR反応混合物の試料調製ユニットから増幅/検出ユニットへの自動化された移動のためのドッキングステーションを含む完全に自動化されたCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqManシステム上、または手作業での移動を含むCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqManシステム上、またはCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48システム上のいずれかで用いられる。
有効なQSであるため有効な結果をもたらした阻害されたPCR反応、および“標的が検出されなかった”結果を、図4aにおいて示す。そのQSは、0.8相対蛍光単位に相当する蛍光閾値設定を超えたため、有効であった。
従って、一切の変更のない定量的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV検査は、定性検査として用いることはできない。
9.0の定性的RFIminの設定は、上記でHCVに関して示した例における阻害されたPCR反応を無効とするであろう。
その目標は、同じ試験試薬のセットを用いて信頼できる定性的結果の出力および信頼できる定量検査結果の両方を提供することである。この目標に取り組むためのこのアプローチにおいて、内部対照核酸を含有する試薬は、2種類の異なるarmored RNA粒子を有する配合物を含む。以下の試薬をこの実験のために用いることができる:
a)COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV検査の試料調製試薬類(磁性粒子懸濁液;プロテアーゼ溶液、溶解緩衝液;溶離緩衝液);
b)約1000コピー/反応の濃度レベルのQS armored粒子、および約100コピー/反応の濃度レベルのIC armored粒子。armored RNA粒子の生成を下記の図2において示す。そのarmored粒子により封入される転写産物は、異なるプライマー結合部位および異なるプローブ結合部位を有する。それらのプローブは、black hole quencher BHQと一緒に蛍光標識HEXおよびCY5で標識されている;
c)マグネシウム試薬;
d)以下を含むマスターミックス試薬:
−Z05DNAポリメラーゼおよびUNG
−3種類の異なるプライマーペア:標的HCVに対するもの、第1対照核酸に対するもの、および第2対照核酸に対するもの
−3種類の異なるプローブ:FAMおよびBHQで標識された標的に対するもの、HEXおよびBHQで標識された第1対照核酸に対するもの、ならびにCY5およびBHQで標識された第2対照核酸に対するもの、
−アプタマー
−dNTP(dUTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
−マスターミックス緩衝剤成分(酢酸カリウム、グリセロール、トリシン、DMSO、ベタイン、IGEPAL、水)。
T’=10(a(CTQS−CT標的)2+b(CTQS−CT標的)+c)
におけるような多項較正式を用いることにより、その力価Tを計算することができ、ここでその式の中の唯一の変数は差(CTQS−CT標的)である。
Claims (15)
- 生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、以下のことを含む方法:
a)前記の微生物核酸を単離および精製し;
b)少なくとも第1対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸および前記の対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;
c)前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;
d)1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することおよび前記の対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;
e)前記の増幅産物により生成する、前記の対照核酸および前記の微生物核酸の濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、ここで前記の対照核酸の増幅産物の存在は、前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。 - その第1対照核酸が、定量標準核酸として、または定性的内部対照核酸としての役目を果たすために、異なる基準に従って分析される、請求項1に記載の方法。
- 生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、以下のことを含む方法:
a)前記の微生物核酸を単離および精製し;
b)異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸ならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;
c)前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;
d)1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;
e)前記の第1対照核酸および前記の微生物核酸の増幅産物により生成する、それらの濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、および/または同時に前記の第2対照核酸の前記の増幅産物により生成された蛍光シグナルを検出し、ここで前記の第2対照核酸の増幅産物の存在は前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。 - その第1対照核酸が定量標準核酸であり、その第2対照核酸が定性的内部対照核酸である、請求項3に記載の方法。
- さらに
工程e)において、前記の微生物核酸および前記の第1対照核酸により生成されたシグナルの比較により、前記の生物学的試料中の前記の微生物核酸の量を決定する
ことを含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。 - 増幅が5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記の第1対照核酸が前記の微生物核酸の検出限界の20〜5000倍の濃度で存在し、前記の第2対照核酸が前記の微生物核酸の検出限界の1〜25倍の濃度で存在する、請求項3に記載の方法。
- 前記の第1および前記の第2対照核酸が1つの対照試薬内で提供される、請求項3に記載の方法。
- 微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための、異なる濃度の第1および第2対照核酸の使用。
- 前記の第1および第2対照核酸が同じプライマーペアまたは異なるプライマーペアにより増幅されるが、異なるプローブにハイブリダイズする、請求項9に記載の使用。
- 生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するためのキットであって、異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、ならびに前記の第1および第2対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含み、前記の第1および第2対照核酸が1つの対照試薬内で提供される、前記キット。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法に従って生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するためのキットであって、異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、ならびに前記の第1および第2対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む、前記キット。
- 前記の第1および第2対照核酸が同じプライマーペアにより増幅されるが異なるプローブにハイブリダイズする、請求項11または12のいずれかに記載のキット。
- 生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための分析システムであって、以下を含む分析システム:
−前記の微生物核酸を単離および精製するための溶解緩衝液および容器を含む、試料調製モジュール
−その中で請求項1〜8のいずれかに記載の方法を実施する反応容器を含む、増幅および検出モジュール
−請求項11〜13のいずれかに記載のキット。 - 加えて、その生物学的試料をその試料調製モジュールからその反応容器に移すための移動モジュールを含む、請求項14に記載の分析システム。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2019044126A1 (ja) * | 2017-08-30 | 2020-08-13 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 微生物密度の推定方法、及び微生物密度推定用マイクロアレイ |
JPWO2021145140A1 (ja) * | 2020-01-16 | 2021-07-22 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8877464B2 (en) | 2010-07-29 | 2014-11-04 | Roche Molecular Systems, Inc. | Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids |
ES2899739T3 (es) * | 2014-08-27 | 2022-03-14 | Hoffmann La Roche | Un procedimiento de análisis y sistema para analizar una reacción de amplificación de ácido nucleico |
EP4137583A1 (en) | 2016-03-24 | 2023-02-22 | BioFire Diagnostics, LLC | Methods for quantitative amplification |
ES2702432B2 (es) * | 2017-08-31 | 2019-08-05 | Venegas Pedro Manuel Medina | Método y dispositivo para el análisis de ácidos nucleicos |
CN107603981A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-01-19 | 中国科学院生态环境研究中心 | 检测黄曲霉毒素b1的凝血酶联核酸适配体及检测方法 |
US20200347437A1 (en) * | 2018-03-23 | 2020-11-05 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Nucleic acid tests with temporal fluorescent signals |
WO2020089756A1 (en) | 2018-10-30 | 2020-05-07 | Tubitak | Detection method for halal food and halal food additives |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08107798A (ja) * | 1994-09-26 | 1996-04-30 | Immuno Ag | 核酸の定量法 |
JP2002514905A (ja) * | 1996-07-03 | 2002-05-21 | アンビオン,インコーポレイテッド | リボヌクレアーゼ耐性rnaの調製および利用 |
WO2002052043A1 (fr) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | Takara Bio Inc. | Procede de detection d'un micro-organisme pathogene |
US20070148646A1 (en) * | 2003-04-11 | 2007-06-28 | Dna Landmarks Inc. | Methods for relatvie quantification of specific nucleic acid sequences |
US20100041040A1 (en) * | 2008-06-06 | 2010-02-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internally Controlled Multiplex Detection and Quantification of Microbial Nucleic Acids |
US20100129902A1 (en) * | 2008-11-24 | 2010-05-27 | Erhard Ralf Schoenbrunner | Replication Stable and RNase Resistant Chimeras of Pestivirus with Insertion in 3' Nontranslated Region (3'NTR) |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE373444C (de) | 1923-04-12 | Otto Ulrich | Handstaubsauger | |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
WO1990001069A1 (en) | 1988-07-20 | 1990-02-08 | Segev Diagnostics, Inc. | Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
US5035996A (en) | 1989-06-01 | 1991-07-30 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
US5683896A (en) | 1989-06-01 | 1997-11-04 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
EP0439182B1 (en) | 1990-01-26 | 1996-04-24 | Abbott Laboratories | Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions |
EP0557456A4 (en) | 1990-11-14 | 1995-11-15 | Siska Diagnostics Inc | Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor |
US5386024A (en) | 1993-02-10 | 1995-01-31 | Gen-Probe Incorporated | Method to prepare nucleic acids from a biological sample using low pH and acid protease |
ATE295427T1 (de) | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
NZ333137A (en) | 1996-06-04 | 2000-03-27 | Univ Utah Res Found | System and method for carrying out thermal cycling for biological processes such as the polymerase chain reaction |
US5981235A (en) | 1996-07-29 | 1999-11-09 | Promega Corporation | Methods for isolating nucleic acids using alkaline protease |
PL202358B1 (pl) | 1999-11-17 | 2009-06-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego |
CA2416631C (en) | 2000-08-03 | 2011-11-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses |
ES2305023T3 (es) | 2000-10-31 | 2008-11-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Metodos para el analisis de componentes no proteinaceos usando una proteasa de una cepa de bacilo. |
US6312929B1 (en) * | 2000-12-22 | 2001-11-06 | Cepheid | Compositions and methods enabling a totally internally controlled amplification reaction |
US7981606B2 (en) * | 2005-12-21 | 2011-07-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Control for nucleic acid testing |
GB0703996D0 (en) * | 2007-03-01 | 2007-04-11 | Oxitec Ltd | Nucleic acid detection |
-
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08107798A (ja) * | 1994-09-26 | 1996-04-30 | Immuno Ag | 核酸の定量法 |
JP2002514905A (ja) * | 1996-07-03 | 2002-05-21 | アンビオン,インコーポレイテッド | リボヌクレアーゼ耐性rnaの調製および利用 |
WO2002052043A1 (fr) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | Takara Bio Inc. | Procede de detection d'un micro-organisme pathogene |
US20070148646A1 (en) * | 2003-04-11 | 2007-06-28 | Dna Landmarks Inc. | Methods for relatvie quantification of specific nucleic acid sequences |
US20100041040A1 (en) * | 2008-06-06 | 2010-02-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internally Controlled Multiplex Detection and Quantification of Microbial Nucleic Acids |
US20100129902A1 (en) * | 2008-11-24 | 2010-05-27 | Erhard Ralf Schoenbrunner | Replication Stable and RNase Resistant Chimeras of Pestivirus with Insertion in 3' Nontranslated Region (3'NTR) |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6015018327; Mol. Cell. Probes, 1995, Vol. 9, No. 5, pp. 347-356 * |
JPN6015018328; Intervirology, 2008, Vol. 51, No. 1, pp. 42-49 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2019044126A1 (ja) * | 2017-08-30 | 2020-08-13 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 微生物密度の推定方法、及び微生物密度推定用マイクロアレイ |
JP7296043B2 (ja) | 2017-08-30 | 2023-06-22 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 微生物密度の推定方法、及び微生物密度推定用マイクロアレイ |
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WO2021145140A1 (ja) * | 2020-01-16 | 2021-07-22 | 株式会社リコー | 遺伝子検査装置の性能評価用試料及びその調製方法、並びに、遺伝子検査装置の性能評価用デバイス、性能評価方法、性能評価プログラム及び性能評価装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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