CN107868816B - 确定未处理的样品中感兴趣的核酸的量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过用数字聚合酶链式反应(dPCR)分析处理样品和参考样品来确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法。

Description

确定未处理的样品中感兴趣的核酸的量的方法
本发明涉及通过用数字聚合酶链式反应(dPCR)分析经处理的样品和参考样品来确定未处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法。
为了许多生物、生物化学、诊断或治疗目的，有必要准确地确定样品中核酸的量或浓度。为此，通常使用外部标准品和/或内部标准品。标准品被推定为具有精密已知的“真实浓度”。
然而，如果使用了相对不准确的方法，如UV吸收或实时PCR，情况就可能不是这样，并且通常不容易验证。标准品的浓度通常依赖于一系列校准标准品，标准品最终来源于例如WHO标准品，因此常常积累了定量误差。定量标准品通常是不精密的，因为它们以由公司生产和储存的一个或几个二级标准品为参考，而这些二级标准品又参考另一个标准品，例如WHO标准品。即使该参考链条得到适当的处理而且是准确的，最终标准品也可能已经降解或经历过生产误差，除非使用非常严格的质量控制，否则这很难验证。
即使利用有可能准确定量测试样品中核酸的方法，通常也只可能精密测定经纯化的核酸的浓度，而无法精密测定用作定量反应输入的反应混合物中的未处理核酸。然而，人们真正感兴趣的，尤其是在医学诊断应用如初步诊断或疾病或治疗监测(例如，微小残留疾病监测中的医疗决策点)中，是原始样品或未处理的样品中的靶浓度。由于移液误差和样品制备过程的效率未知，对于得以从原始样品(例如来自人血液的血浆)进入到定量反应的核酸的量所知甚少。
因此，一种常见的做法是在原始样品中添加定量标准品，以跟踪制备过程中的所有损失。然而，当前技术是依赖于定量标准品的准确性，即，忽视上述误差。此外，提供具有确切已知的浓度的适当外部标准品(例如市售的标准品)是困难和昂贵的。而且，它需要通过二级和三级标准品链进行常规验证，而这些标准品又需要定期检查。
因此，对于可避免上述缺点，特别是不需要已知浓度的标准品的定量感兴趣的核酸的方法存在需求。
本发明的目的是提供这些方法。
该目的通过基于数字聚合酶链式反应(dPCR)的方法与以双功能方式使用的参考样品的结合得以解决。首先，将参考样品添加到dPCR运行中作为外部标准品。其次，将同一参考样品用作内部标准品，优选通过将其添加到原始样品(primary sample)中。它以与感兴趣的核酸(靶核酸)相同的方式贯穿整个样品制备过程。内部参考和外部参考这两者均使用dPCR定量。内部参考对外部参考定量的比率给出了在dPCR之前的样品制备的产率。知道了这个产率，可以计算出原始样品中的初始靶浓度。与dPCR一起使用的参考使得能够全面了解在dPCR中使用的标准品，并有助于防止由于移液和稀释误差导致的计算错误。即使使用非精密的标准品，dPCR的绝对准确度进一步得以提高，并且可以重新校准标准品作为额外的收益。
总之，本发明不仅提供了高度精密的定量未处理样品中核酸的方法，而且还建立了自制的定量标准品。
在实施例中，可以证明，通过现有技术的方法，无法精密且准确地定量感兴趣的核酸(参见表1和实施例2)。而且可以证明，当定量样品中的核酸时，本发明的方法将提供更可靠的结果(实施例3)。
因此，在第一方面，本发明涉及用于确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供
-疑似含有感兴趣的核酸的未处理样品；和
-已知含有与感兴趣的核酸不同的参考核酸的参考样品；
b)将未处理样品与限定(defined)量的参考样品合并，从而获得合并的样品；
c)处理该合并的样品，从而获得适合于数字聚合酶链式反应(dPCR)的经处理的样品；
d)用经处理的样品进行dPCR，从而确定处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度以及参考核酸的量或浓度；
e)用限定量的参考样品进行dPCR，从而确定在该限定量的参考样品中的参考核酸的量或浓度；
f)将步骤d)中确定的参考核酸的量或浓度与步骤e)中确定的参考核酸的量或浓度进行比较，从而确定步骤c)中核酸的产率；和
g)基于在步骤d)中确定的经处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度和步骤f)中确定的产率，确定所述未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度。
在第二方面，本发明涉及用于确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供疑似含有感兴趣的核酸的未处理样品；
b)提供已知含有与感兴趣的核酸不同的参考核酸的参考样品；
c)处理该参考样品，从而获得适合于dPCR的经处理的参考样品；
d)用该经处理的参考样品进行dPCR，从而确定在该经处理的参考样品中的参考核酸的量或浓度；
e)用限定量的未处理参考样品进行dPCR，从而确定在该限定量的未处理参考样品中的参考核酸的量或浓度；
f)将步骤d)中确定的参考核酸的量或浓度与步骤e)中确定的参考核酸的量或浓度进行比较，从而确定步骤c)中核酸的产率；
g)处理该未处理样品，从而获得适合于dPCR的经处理的样品，其中处理步骤c)和g)是相同的；
h)用该经处理的样品进行dPCR，从而确定感兴趣的核酸的量或浓度；和
i)基于在步骤i)中确定的处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度和步骤f)中确定的产率，确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度。
如上面详述的，可靠地确定核酸的量或浓度的方法在若干行业应用中(例如，在医疗领域中)具有特别意义。在若干方面，可能不仅需要弄清样品中是否存在核酸，而且可能需要尽可能精密和准确地确定未处理样品，例如从患者或产品获得的样品中的核酸的量或浓度。这在诊断疾病的严重性或环境技术或产品的质量控制方面可能是有意义的，例如，为了限定污染物或杂质。
在样品多时，需要对采集的样品进行处理以便进行检测所述核酸的方法。通常，在处理过程中会损失未知量的核酸。而且，在检测核酸的方法(即dPCR)的准备中，通常需要稀释或浓缩样品。例如，由于移液误差或不准确，实际稀释度或浓度可能与预期的不同。
dPCR(数字聚合酶链式反应，数字PCR，或称DigitalPCR)是常规的聚合酶链式反应方法的一种生物技术优化，可用于直接定量且任选地克隆扩增核酸，包括DNA、cDNA、RNA或其混合物。dPCR和传统PCR(例如qPCR或RT-PCR)的关键区别在于测量核酸量的方法，前者是比PCR更精密的方法，但没有经验的使用者也更容易犯错，尤其是由于必需的稀释所致。dPCR同样在一个样品内进行单一反应，但将样品分割成很多分区(partitions)或反应区(reaction areas)，并且在每份或每个反应区中单独进行反应。这种分割使得更可靠的收集和更灵敏的核酸量测量成为可能。而且，该方法使得精密定量成为可能。
如上详述，将dPCR样品分区，使得样品中的各个核酸分子在多个分隔的区域(反应区)内定位和浓缩。样品的分区使得能够通过假定分子群体遵循泊松分布来估计核酸的数目。结果，每个部分将包括阴性或阳性反应(分别为“0”或“1”)。在PCR扩增后，可通过计数含有PCR终产物阳性反应的区域来定量核酸。在常规的PCR中，PCR扩增循环数与起始拷贝数成比例。然而，dPCR不依赖于扩增循环的数量来确定初始样品量，无需依赖不确定的指数数据来定量靶核酸，因此可提供绝对定量。通常，样品需要处理后用于dPCR，例如通过稀释样品(以获得允许dPCR的核酸浓度)，去除干扰成分，加入dPCR所需的试剂等等进行处理。
根据本发明，“未处理样品”涉及尚未准备好或尚不适于dPCR，在用于dPCR之前需要进一步处理的样品。经过处理并准备好用于dPCR的样品称为经处理的样品。优选地，未处理样品是现采(as obtained样品)(例如自受试者采集的)。由于技术或后勤方面的原因，例如当必须运送样品(例如运送到实验室)或者需要首先破碎运送时，可以考虑不向现采样品添加参考核酸，而是在之后的某个阶段添加。例如，在本发明第一方面的方法中，本发明第一方面的方法的步骤c)涉及合并样品的处理。根据这一点，将步骤c)之前的样品称为未处理样品或合并样品(当已经添加参考核酸时)，并且将步骤c)中获得的样品称为经处理的样品。上述评述类似地适用于本发明第二方面的方法的步骤g)。
该样品可以是任何疑似含有所述核酸的样品，包括来自受试者的样品。样品是有限量的某种材料，其预期其与更大量的此种材料相同并且代表此种材料。获得样品的行动可以由人完成或自动完成。可以为了进行测试、分析、检验、调查、演示或试用而采集或提供样品。有时，采样可以持续进行。样品可以包含固体、液体或气体或由其组成；样品可以是具有一些中间特征的材料，例如凝胶或痰(sputum)、组织、生物或它们的组合。优选地，样品是便于分配的液体或悬浮液。
即使材料样品无法以个体(individual items)计数，但样品的量仍可以根据其体积、质量、大小或其他类似单位加以描述。固体样品可以是一个或几个离散的碎片，或者可以是片段化的、颗粒状的或粉末状的。
在本上下文中的样品是一定量的疑似含有待检测或测量和定量的一种或多种核酸的材料。如本文中使用的，该术语包括但不限于：标本(例如活组织检查或医学标本)、培养物(例如微生物培养物)或诸如水或土壤的环境样品。样品可以来自受试者，例如动物或人，它们可以是流体、固体(例如粪便)、悬浮液或组织。术语“来自受试者的样品”包括从任何给定受试者分离的所有生物流体、排泄物和组织。优选地，受试者是动物，更优选哺乳动物，或进一步更优选人。样品可以从所有不同类群的家畜、以及野化(feral)或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等的动物。
样品的实例包括但不限于细胞或组织培养物、血液、血清、血浆、针吸活组织、尿液、精液、精液、精浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活组织检查、腹水、脑脊液、胸膜液、羊水、腹膜液、间质液、痰、乳汁、淋巴、支气管灌洗样品和其他灌洗样品、或组织提取物样品。样品来源可以是来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物的固体组织；或来自受试者妊娠或发育中的任何时间的细胞。
样品可含有与样品的来源天然不混在的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养剂、抗生素等等。
如上文详述的，未处理样品含有感兴趣的核酸，所述核酸的量或浓度将在本发明的方法中确定。核酸可以是任何核酸，其量可指示例如病症、生物体环境或事件，因此可以用于检测它们。
核酸可以指示微生物(比如病原体)，并且可用于诊断疾病，比如感染。感染可能是由细菌、病毒、真菌、和寄生虫或其他含有核酸的物体引起的。病原体可以是外源性的(从环境或动物来源或从其他人获得)或内源性的(来自正常菌群)。可以基于体征和症状选择样品，样品应该代表疾病过程，并且应该在给予抗微生物剂之前采集。未处理样品中核酸的量可以指示疾病的严重程度。
或者，核酸可以指示遗传障碍。遗传障碍是由基因组中一种或多种异常引起的遗传问题，特别是从出生(先天性)就存在的病症。大多数遗传障碍是非常罕见的，每数千或数百万人中累及一人。遗传障碍可以是可遗传的，也可以是不可遗传的，可遗传的即为从父母的基因传下来。在可遗传的遗传障碍中，缺陷可能由DNA的新突变或变化引起。在这些情况下，缺陷只有发生在生殖细胞系中才是可遗传的。同样的疾病，如某些形式的癌症，在一些人中由遗传来的遗传状况引起，在另一些人中由新的突变引起，在又另一些人中主要由环境原因引起。显然，具有突变的核酸的量可以指示疾病状态。
在本发明的方法中，确定核酸的量或浓度。物质的量是标准规定的量。国际单位制(SI)规定物质的量与存在的基本单元数成正比，其中比例常数为阿伏伽德罗常数的倒数(以mol为单位)。物质的量的SI单位是摩尔。摩尔定义为含有与12克同位素碳12中的原子数相同的数量的基本单元的物质的量。因此，样品的物质的量以样品质量除以物质的摩尔质量来计算。
物质的浓度为组分的丰度除以混合物的总体积。可以区分几种类型的数学描述：质量浓度、摩尔浓度、数量浓度和体积浓度。术语“浓度”可以应用于任何种类的化学混合物，但它最常见地是指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度具有标准浓度和渗透浓度等变体。优选地，浓度是以数字给出的成分的量除以混合物的总体积。
根据本发明的感兴趣的核酸是任何要确定量或浓度的核酸。核酸是所有已知生命形式必需的生物聚合物。因此，核酸可以用作特定生物的指示物，而且，例如在突变或天然存在的变体的情况下，还可以用作疾病的指示物。核酸，包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)，是由被称为核苷酸的单体组成的。每个核苷酸有三个组成部分：5-碳糖、磷酸基和含氮碱基。如果所述糖为脱氧核糖，则该聚合物为DNA。如果所述糖为核糖，则该聚合物为RNA。核酸是最重要的生物大分子之一。它们在所有活生物体中都大量存在，在活生物体中发挥编码、传递和表达遗传信息的功能——换言之，通过核酸序列，或DNA或RNA分子中核苷酸的顺序，传递信息。核酸的实验研究是现代生物和医学研究的一个重要部分，并且构成基因组和法医学以及生物技术和制药行业的一个支柱。因此，本发明的方法可以用于任何这些领域。
在本发明的方法中，使用了参考样品。参考样品可以是任何已知含有参考核酸的样品。在本发明的第一方面，参考核酸与感兴趣的核酸不同。在本发明的第二方面，参考核酸可以与感兴趣的核酸相同或不同。如上文详述的，参考样品允许监测样品的处理，并且可以用于控制dPCR。
参考核酸可以是任何核酸，只要其可以通过dPCR检测到，并且——在本发明的第一方面中——可以与dPCR中感兴趣的核酸区分即可。显然，在本发明的第一方面中，参考核酸应当与感兴趣的核酸不同，以便可以一方面确定感兴趣的核酸的量，另一方面确定参考核酸的量。在本发明的第二方面，参考核酸和感兴趣的核酸可以是相同的。另外，应当选择可以与样品中存在的其他核酸区分开的参考核酸。该参考核酸可以是市售的；它可以是公认的标准品，如根据WHO指南的质量控制样品或由NIST(美国国家标准与技术研究所)提供的DNA标准品。它也可以是自制的标准品。该标准品可以通过从培养物中分离核酸而产生，或者可以通过生物技术或化学手段产生。具体地说，参考核酸可以是通过化学合成和/或遗传工程产生的人工序列。应当理解，在监测样品的处理和任选地在dPCR的控制中，与相关核酸相似但不同的参考样品通常是有利的。
作为本发明方法的最先步骤，提供疑似含有感兴趣的核酸的未处理样品和已知含有参考核酸的参考样品(参见步骤a)(第一和第二方面)和步骤b)(第二方面))。优选地，所提供的样品是液态(in a liquid)，这让进一步的方法步骤变得容易。优选地，任一个或两个样品的体积是已知的。在第一方面的方法中，虽然通过将参考样品添加到未处理样品中(或反之)将未处理样品与参考样品合并(参见步骤b))。
作为下一个步骤，处理相关样品(在第一方面的方法中，是合并样品；在第二方面的方法中，为未处理样品和参考样品)(参见步骤c)(第一和第二方面)和步骤g)(第二方面))。该处理可以包括众多不同的步骤和技术，取决于各个方面，包括样品的性质、感兴趣的核酸的类型和所用的dPCR方法。通常，处理包括纯化步骤和/或稀释或浓缩步骤。在本发明的第二方面，步骤g)的处理与步骤b)的处理相同，除了使用不同的样品(未处理样品对参考样品)之外。
纯化核酸的方法是本领域熟知的，包括但不限于均质化、洗涤、离心、提取等。
在获得样品之后，可能需要保存样品，例如，通过破碎样品、通过加入防腐剂、通过冷冻或干燥样品来保存样品。为了破碎获得的样品，可以使用物理力(例如，polytron组织均质机、研磨或冷冻)或化学方法(例如，裂解细胞)。洗涤剂或离液剂可用于均质化。可以通过使用酸性苯酚/氯仿、过滤器、玻璃颗粒或色谱(例如，用适当的核酸作为结合配偶体)提取核酸。在处理的任何时间(开始时，在处理期间和/或结束时)可能需要储存样品。为此，添加适当的介质，比如缓冲盐水，可能是必须的或适合的。可能需要除去不感兴趣或可能产生干扰的污染物和/或核酸。可以使用酶除去污染物(比如使用DNA酶、RNA酶和/或蛋白酶)或保护感兴趣的核酸(比如使用DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂)。为了使酶失活，加热步骤可能是适当的。可以使用去除剂，以便除去不期望的组分，比如二价阳离子(Ca2+和Mg2+)。可能需要洗涤步骤来更换介质。
如上文详述的，对于dPCR，相关核酸在dPCR全过程中必须以适当的量或浓度存在。因此，可能需要适当的稀释或浓缩步骤。核酸的稀释通常通过加入溶剂(例如对后续步骤而言适当的介质，例如dPCR介质或dPCR缓冲液)来进行。可以伴随有洗涤步骤，例如，如果意图或者需要去除不需要的成分或浓缩以获得一定的终浓度的话。浓缩可以通过任何富集程序实现，例如免疫捕获、离心、醇沉淀和使用结合基质。
以下详细说明了处理的典型步骤：在所述流体样品中，待分析的核酸不是游离在溶液中，而是位于封闭结构比如细胞或病毒之内。在诊断测定中，目的经常是特别鉴定在流体样品(比如临床样品)中的致病性细胞或病毒。这样的病原体可以例如包括RNA病毒，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒(WNV)、人乳头瘤病毒(HPV)、日本脑炎病毒(JEV)、圣路易脑炎病毒(SLEV)等，或DNA病毒，例如乙型肝炎病毒(HBC)、巨细胞病毒(CMV)等，或细菌，例如沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟球菌(NG)等。因此，处理包括通过裂解可能存在于样品中的细胞和/或病毒衣壳将核酸从其细胞和/或病毒环境释放出来。为了释放细胞或病毒颗粒的内容物，可以用酶或化学物质处理它们使得细胞壁或病毒颗粒溶解、降解或变性。适合于裂解细胞和/或病毒衣壳或类似结构的药剂通常在裂解缓冲液内提供，并且可以包含一种或多种选自下组的组分：离液剂(例如胍盐，如硫氰酸胍或盐酸胍或氯化胍或异硫氰酸胍、尿素；高氯酸盐，如高氯酸钾；其他硫氰酸盐或碘化钾)、缓冲物质(例如柠檬酸盐缓冲液，如柠檬酸钠)，还有Tris(三(羟甲基)-氨基甲烷)缓冲剂诸如Tris HCl、磷酸盐、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、乙酸盐缓冲液)、醇(例如聚多卡醇)和还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇)。可以存在这些核酸降解酶。相应地，可以存在可迅速降解酶类或不想要的蛋白质的蛋白酶。
典型的下一个步骤是从复合裂解混合物中提取核酸。有几种纯化核酸的方法。为纯化目的，尤其令人感兴趣的是将核酸吸附到玻璃表面上，不过其他表面也是可能的。近年来，已经提出了许多通过利用核酸与玻璃表面的结合行为来从核酸的天然环境中分离核酸的程序。如果未修饰的核酸是靶标，则核酸与具有二氧化硅表面的材料的直接结合是优选的，因为除了其他原因之外，核酸不必被修饰，甚至天然核酸也可以结合。各种文献详细描述了这些过程。该程序涉及使核酸与离液盐溶液中的玻璃表面选择性结合，并将核酸从诸如琼脂糖、蛋白质或细胞残留物的污染物分离。为了将玻璃颗粒与污染物分离，可以将颗粒离心或通过玻璃纤维过滤器抽吸流体。最优选的磁性玻璃颗粒及其用途描述于WO 01/37291中。一种高度优选的处理方法如WO 2012/013733的图1所示。
最后，通过将核酸浓度调整到dPCR所需的浓度来完成处理。
在处理之后，样品已准备好用于dPCR，dPCR分别按照本发明方法的步骤d)和e)(根据第一方面)或步骤e)和h)(根据第二方面)进行。
在dPCR中，扩增并检测相关核酸，其中若干单独的分子各自被隔离在分别的反应区中。每个反应区(孔、室、珠子、乳液等)如果不存在起始分子，将产生阴性结果，或者如果存在目标起始分子，则扩增和检测为阳性结果。dPCR是这样一种技术，其中在多个分别的PCR反应中进行样品的有限稀释(limiting dilution)，使得部分反应没有模板分子并产生阴性扩增结果。在反应终点计数阳性PCR反应数时，对原始样品中存在的单独的模板分子进行逐一计数。基于PCR的技术具有的额外优点是，仅计数能够被扩增的分子，例如，与测序工作流程中的大规模平行PCR步骤相关的分子。在基于数字PCR的方法中，将待分析的核酸分配到多个不同的反应区(例如孔、珠子、乳液、凝胶点、微流体装置中的室等)中。重要的是，一些反应区，但不是全部反应区，含有至少一个分子。通常，每个反应区将含有一个或零个分子。在实践中，分子将会随机分配到反应区(诸如孔)中。在一定百分比(例如，80％)的反应区为阳性的情况下，若干个区将含有一个或多个分子(例如，平均每孔2.2个分子)。可以使用统计方法根据不同反应区的数量和阳性数量来计算预期的样品中的总分子数。这将得出施加到不同反应区的部分中的核酸的计算量或浓度。可以使用多种基于抽样和概率的统计方法来得到该浓度。在Dube等人，arXiv：0809.1460v2“Computation of MaximalResolution of Copy Number Variation on a Nanofluidic Device using Digital PCR(2008)”中给出了这种分析的例子，这篇文章出处在Arxiv.org，引证arXiv：0809.1460v2[q-bio.GN]，首次于2008年9月8日上传。该文献提供了一系列等式，可用于根据数字PCR阵列中使用的反应区数目和阳性结果数来估计分子浓度和统计置信区间。这种类型的计算的另一个例子可以在美国专利申请US 2009/0239308 A1中找到。
通常，使用泊松分布来预测这样的数字限制条件(digital regime)，其中，在一个随机离散化的体积反应器中仅存在单个DNA扩增子，从而有利于每反应体积仅一个感兴趣的DNA扩增子。以这种方式，由每个反应器体积发出的PCR扩增信号(例如，荧光)是仅仅一个扩增子的产物，并且与所有其他离散的反应器体积隔离。然后通过计数有多少个数字反应器发射对应于嵌入染料或特定DNA聚合酶探针序列的扩增荧光信号来实现定量。由于在数字限制条件中每个反应器体积被限制为不超过单独一条DNA链，可以正确地假定其100％的扩增荧光信号仅来自这一条DNA链和相应的引物和探针组。
dPCR方法学有多种。例如，已经使用乳液PCR来制备含有克隆扩增的DNA的小珠-实质上，每个珠子含有一种类型的dPCR扩增子。基于荧光探针的技术可以在“原位”(即在同一孔中)对PCR产物实施，特别适用于本申请。美国专利No.6,440,705包含更详细的对该扩增程序的描述。这些扩增可以在乳液或凝胶中、在珠子上或在多孔板中进行。
dPCR还包括基于微流体的技术，其中使用通道和泵将分子递送到多个反应区。适合的微流体装置是本领域已知的。
dPCR基本上作为常规PCR来进行。使合适的培养基中的核酸(参考核酸或感兴趣的核酸)与引物、探针和热稳定聚合酶(例如Taq聚合酶)接触，进行热循环(反复的加热和冷却反应的循环，用于链分离和酶促复制)。培养基通常含有脱氧核苷酸、缓冲溶液和离子(例如Mg2+)。PCR的选择性是使用可在特定热循环条件下与靶向扩增区域互补的引物的结果。通过使用合适的探针来检测生成的扩增产物，探针通常是标记的，例如荧光标记的。对于基于mRNA的PCR，首先用逆转录酶将RNA样品逆转录成互补DNA(cDNA)。
通常，PCR过程由重复25至50次的一系列温度变化组成。这些循环通常由三个阶段组成：第一阶段，在约95℃，允许核酸的双链分离；第二阶段，在约50至60℃的温度下，允许引物与DNA模板结合；第三阶段，在68至72℃之间，促进由DNA聚合酶进行的聚合作用。由于片段的尺寸小，在这种类型的PCR中通常省略最后一步，因为在对准阶段和变性阶段之间的变化过程中，酶能够增加它们的数目。另外，在例如80℃的温度下测量信号(例如，荧光)，以便减少在使用非特异性染料时由引物二聚体的存在引起的信号。使用的温度和时限取决于多种多样的参数，例如：用于合成DNA的酶、在反应中的二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度以及引物的结合温度。
在一个实施方案中，提供了一种dPCR方法，它具有独特的能力，即通过使用多种颜色、时间和强度的组合来编码每一个独特探针序列，能够识别更多数量的荧光探针序列(例如，TaqMan探针序列)。此外，可以使用较便宜的非TaqMan探针实时PCR扩增指示剂如SYBR-或PicoGreen，实现基于单独的时间线索、单独的强度线索、或强度与时间线索的组合的多重dPCR，从而以更高的程度区分引物对，显著降低成本。如果需要，这些也可以用于增强控制和将结果标准化，以提高准确性。使用具有有限谱带的荧光报告基因，可以将典型的5重qPCR的典型多重化限制提升到多达100重的dPCR。
在步骤f)中，将步骤d)中确定的参考核酸的量或浓度与步骤e)中确定的参考核酸的量或浓度进行比较，从而确定步骤c)中核酸的产率。
在本发明的上下文中，产率是相对于在未处理情况下通过dPCR检测到的核酸的量/浓度，在处理后通过dPCR检测到的核酸的量/浓度。因此，产率是百分比产率或分数产率或相对产率，其用于量度处理的有效性。用处理后通过dPCR检测到的核酸的量/浓度除以在未处理情况下通过dPCR检测到的核酸的量/浓度来计算产率。如果使用浓度，则必须考虑体积(如果不同的话)。计算是建立在这样的认识基础之上的，即核酸通常在样品处理过程中损失，并且在确定样品中核酸的量或浓度时必须考虑该损失。损失可能是由于上面所述的事件引起。然而，损失通常在从混合物分离和纯化期望的产物时发生。
作为本发明方法的最后一个步骤，基于在步骤d)(第一方面)或h)(第二方面)中确定的经处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度和步骤f)中确定的产率，确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度。为此，用经处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度除以步骤f)中确定的产率。当确定原始获得的样品中感兴趣的核酸的量或浓度时，可以考虑进一步的方法步骤。
在本发明第二方面的方法的一个优选实施方案中，步骤a)和g)至i)的实施在位置上和/或时间上，特别是在时间上，与步骤b)至f)的实施分开。
据此，步骤a)和g)至i)可以例如在不同于步骤b)至f)的位置、装置和/或时间实施。在本发明的一个优选实施方案中，可以使用该方法的步骤b)至f)来确定处理和dPCR的效率。
在一个实例中，可以在明确且可重复地定义的方法中实施步骤b)至f)，从而确定处理和dPCR的产率。获得的产率的值可以用于确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度，其中步骤a)和g)至i)在相同的设置中实施，也就是说，使用相同的处理和dPCR方法，但在不同的时间进行。产率的值可以在包括步骤a)和g)至i)的多种后续方法中使用。因此，步骤b)至f)可用于表征处理和dPCR。步骤b)的核酸与步骤f)的核酸之间的关系(即产率)可以体现在一种或多种感兴趣的核酸的量或浓度的后续测定中。在该方法设计中，重要的是每个步骤，特别是处理(步骤c)和g))和dPCR(步骤d)、e)和h))以基本上相同的方式实施。这意味着使用相同或至少相似的装置、设备、化学品等，以消除产率偏差或至少将其降到最低限度。在一个实施方案中，预先实施方法步骤b)至f)，所得到的产率被报告并用于后续的方法步骤a)和g)至i)中，所述后续的方法步骤可以由另一个人或团队和/或在另一个位置进行。
在根据第一和第二方面的本发明方法的一个实施方案中，将参考样品中的参考核酸的量或浓度与参考值进行比较，从而控制该参考样品或该参考值。或者，参考样品中的参考核酸的量或浓度是未知的或非预设的。据此，可以使用定量标准品(例如市售的定量标准品)或任何其他适合的样品作为参考核酸。该方法可用于验证标准品，提供新的标准品或定量参考核酸。
在根据第一和第二方面的本发明方法的一个优选实施方案中，步骤e)中参考样品的量与步骤b)中参考样品的量相同。步骤b)和e)分别对在处理途径和非处理途径中最初采用的参考核酸进行定量，将两者比较以确定处理的产率。显然，有利的是在两条路径中使用相同的量是，以最小化两个路径的差异，这种差异例如由稀释或测定设计的差异引起，可能影响比较。
如上文详述的，核酸(靶标或参考)可以是任何适用于dPCR的核酸。核酸必须具有适当的长度。它可以含有非核酸组分。它可以是天然存在的、化学合成的或生物技术改造的。优选地，核酸选自DNA、cDNA、RNA及其混合物，或者是任何其他类型的核酸。在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，参考核酸是选自DNA、cDNA、RNA及其混合物的组的核酸。另外地或替代地，感兴趣的核酸是选自DNA、cDNA、RNA及其混合物的核酸。
为了将感兴趣的核酸和参考核酸之间可能造成干扰的处理效率差异降低到最低限度，两种核酸优选具有一些相似性。因此，参考核酸可以与感兴趣的核酸具有共同的结构特征。
参考核酸可以优选地与感兴趣的核酸具有相同的引物结合位点。引物结合位点对于引物结合是必需的，以允许在dPCR过程中的扩增。相同的结合位点可以减少在扩增效率上的变异。
而且，参考核酸可以优选地具有一定长度的核酸(a length in nucleic acids)，其与感兴趣的核酸的一定长度的核酸至多50％、至多25％、至多10％、或至多5％不同。“一定长度的核酸”可以定义为通过PCR被扩增的序列，例如，在正向引物和反向引物之间且包括所述引物的序列。
另外地或替代地，参考核酸可以优选地具有与感兴趣的核酸的序列至少50％相同、至少60％、至少70％或至少80％相同的序列。序列同一性是在两个不同序列之间精密匹配的核酸的量。因此，通常不将空位计数在内，并且测量通常与两个序列中的较短序列相关。用于确定序列同一性的方法和计算机程序是本领域熟知的。
此外，参考核酸的G和C含量可以优选地与感兴趣的核酸的G和C含量至多50％、至多25％、至多10％或至多5％不同。GC含量是在核酸分子上的含氮碱基鸟嘌呤或胞嘧啶的百分比(可能来自四种不同的碱基，也包括腺嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶)。GC对经由三个氢键结合，而ATU对经由两个氢键结合。具有高GC含量的DNA比具有低GC含量的DNA更稳定，这在PCR过程中可能是有意义的。而且，引物的GC含量用于预测其与模板DNA的退火温度。较高的GC含量水平指示较高的解链温度。
然而，可能的测定设计是，参考核酸的一部分必须或优选不是感兴趣的核酸的一部分并且用于检测该参考核酸。另外地或替代地，感兴趣的核酸包含这样的部分，该部分不是参考核酸的一部分并且被用于检测该感兴趣的核酸。这对于本发明的第一方面的方法特别有意义，第一方面的方法中的两种核酸需要不同，因为两者都存在于合并的样品中并且将在同一dPCR中予以测定。或者，参考核酸可以包含与感兴趣的核酸的引物结合位点不同的引物结合位点。这在，例如，(将要)使用商业标准品或法定标准品的情况下可能是有意义的。
为了使参考核酸类似于感兴趣的核酸或保护参考核酸，参考核酸可以是装甲(armored)核酸。
由于RNA比DNA更易于受诸如碱性pH、核糖核酸酶等的影响而降解，因此优选将由RNA组成的参考核酸作为装甲颗粒提供。装甲颗粒，特别是装甲RNA，在例如EP910643中有描述。简言之，RNA——其可以化学产生或优选地异源产生，例如通过细菌(例如大肠杆菌)异源产生——被至少部分地包封在病毒外壳蛋白中。后者赋予RNA对外部影响、特别是对核糖核酸酶的抗性。必须理解，DNA也可以作为装甲颗粒提供。装甲RNA和DNA两者都可用作本发明语境中的参考核酸。在一个优选的实施方案中，RNA对照核酸用大肠杆菌中的MS2外壳蛋白装甲。在一个进一步优选的实施方案中，使用λ噬菌体GT11对DNA核酸进行装甲。
装甲核酸可更好地忍受对核糖核酸酶的暴露和在血清或血浆中的长期储存。包装也可模仿天然存在的病毒，允许在纯化和检测之前在样品中掺入装甲核酸，从而允许在整个测定程序过程中监测核酸分离和检测中的变量。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，感兴趣的核酸指示微生物、病毒、细菌、真菌、细胞、哺乳动物物种、遗传状态或疾病。
本发明的方法在诸如诊断或治疗监测中的医学领域是特别感兴趣的，并且可以用于检测和/或定量指示特定微生物、细胞、病毒、细菌、真菌、哺乳动物物种、遗传状态或疾病的感兴趣的核酸。据此，所述方法可用于检测病原体。病原体具有引起疾病的潜力。病原体通常用于描述传染原，比如病毒、细菌、朊病毒、真菌或甚至其他微生物。当然，本发明的方法也可用于检测非病原微生物。
示例性病原体包括但不限于：
-细菌：链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、分枝杆菌属、衣原体属、埃里希体属、立克次体属、沙门菌属、奈瑟球菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、诺卡菌属、利斯特菌属、弗朗西斯菌属、军团菌属和耶尔森菌属
-病毒：腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、TBE病毒、HIV、流感病毒、拉沙病毒、轮状病毒和埃博拉病毒
-真菌：念珠菌属、曲霉菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺囊虫属和葡萄穗霉属
-寄生虫：原生动物寄生虫、蠕虫寄生虫和节肢动物寄生虫
很显然，病原体的可靠检测和任选定量可能在诊断疾病的存在和严重性方面具有高度相关性。
可以使用本发明的方法来检测和定量特定细胞，例如，细胞亚群。这样的细胞的实例包括：癌细胞，如循环肿瘤细胞或循环肿瘤微栓子，特定的血细胞，如B细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞等。细胞可能是稀有细胞，特别是其中在群体中稀有细胞与总细胞的比率至多为5％，优选至多1％，特别地至多0.1％，比如至多0.01％。稀有细胞可能特别地是患者血液中的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤微栓子(CTM)。发现和定量“稀有的”肿瘤细胞(只有少数CTC，与1毫升血液中的大约1000万个白细胞和50亿个红细胞混合)，并能够使它们区别于其他细胞，特别是上皮性非肿瘤细胞和白细胞，在早期发现癌症方面具有特别意义。这些细胞可以在肿瘤本身可检测之前的很长时间被检出，这在治疗癌性疾病方面显然是非常有利的。
癌细胞以特定标志物为表征，其核酸可用于癌细胞的检测和定量。可以提及的实例是：特别是癌基因和肿瘤抑制基因，比如p53；ras家族基因erb-B2、c-myc、mdm2、c-fos、DPC4、FAP、nm23、RET、WT1等的；LOH，例如关于p53、DCC、APC、Rb等，以及遗传性肿瘤中的BRCA1和BRCA2，MSH2、MLH1、WT1等的微卫星不稳定性；还有肿瘤性RNA，比如CEA、细胞角蛋白，例如CK20、BCL-2、MUCl，特别是其肿瘤特异性剪接变体，MAGE3、Muc18、酪氨酸酶、PSA、PSM、BA46、Mage-1等，或形态发生RNA，比如如乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(maspin)、hCG、GIP、胃动素、hTG、SCCA-1、AR、ER、PR、各种激素等；--此外，特别是影响转移特征即涉及血管生成、运动性、粘附和基质降解的分子的表达的RNA和蛋白质，例如bFGF、bFGF-R、VEGF、VEGF-R如VEGF-R1或VEGF-R2、上皮-钙粘蛋白、整合素、选择素、MMP、TIMP、SF、SF-R等，影响细胞周期分布或增殖谱的RNA和蛋白质，例如细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白D、E和B的表达率)、Ki67、p120、p21、PCNA等，或影响细胞凋亡谱的RNA和蛋白质，比如FAS(L+R)、TNF(L+R)、穿孔素、颗粒酶B、BAX、bcl-2、半胱天冬酶3等。
可通过本发明的方法确定的替代细胞包括由炎症过程释放的心血管细胞或血管细胞或脉管细胞、或胎儿细胞(例如，母体血液中的胎儿细胞)、干细胞(例如癌性干细胞)、指示微小残留病灶的细胞、癌细胞(例如白血病细胞)。在本语境中，所述方法可用于基因分型、诊断、预后、监测治疗等。
所述方法还可以用于检测和定量哺乳动物物种的细胞含量[例如在食物控制(food control)中]、遗传状态(例如当检测或监测遗传障碍时)或疾病(参见上文和下文)。
在根据第一和第二方面的本发明方法的又另一个优选实施方案中，未处理样品
-获自细胞培养物、疑似被污染的来源或受试者，特别是其中所述受试者选自人、动物或植物的组，特别是人；和/或
-选自体液、血液、血浆、血清、尿液、胆汁、脑脊液、拭子、临床标本、器官样品和组织样品。
如上文详述的，“样品”是指一定量的疑似含有待定量的感兴趣的核酸的材料。如本文中使用的，该术语包括标本(例如活组织检查或医学标本)或培养物(例如微生物培养物)。样品可以来自植物或动物，包括人，可以是流体、固体(例如粪便)或组织。样品可以包括从患者获取的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、针吸出物等。样品可以从所有不同类群的家畜、以及野化动物或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等的动物。关于人样品或“组织样品”或“患者样品”或“患者细胞或组织样品”或“标本”，都是指从受试者或患者的组织获得的类似细胞或生物化合物或生物化学化合物的集合。组织样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物的固体组织；血液或任何血液成分；体液如脑脊髓液、羊水、腹膜液、或间质液；或来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。组织样品可含有在自然界中与该组织天然不混在的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等等。
然而，在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，处理包括稀释、裂解、离心、提取、沉淀、过滤和/或纯化。关于这些处理方法的更多细节如上所述。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，dPCR在液体中、在凝胶中、在乳液中、在液滴中、在微型化室的微阵列中、在微流体装置的室中、在微孔板中、在芯片上、在毛细管中、在核酸结合表面上或珠子上，特别是在微阵列中或芯片上进行。有多种可得的dPCR系统可以用于本发明。商业化的数字PCR平台包括来自Fluidigm的基于微孔芯片的dPCR、基于通孔的QuantStudio12k flex dPCR和来自LifeTechnologies的3D dPCR、以及来自的基于液滴的ddPCR(ddPCR)QX100和QX200和来自的RainDrop。基于微流控芯片的dPCR每个面板可以有多达几百个分区。基于液滴的dPCR通常具有约20,000个分区的液滴，并且每反应可以具有多达10,000,000个液滴。QuantStudio 12k dPCR在板上执行数字PCR分析，每子阵列包含64个分区，总共有48个子阵列，相当于每阵列总共3072个分区。
液滴dPCR(ddPCR)建立在水-油乳液液滴技术的基础上。将样品分成大量液滴(例如约20,000个)，并且模板分子的PCR扩增在每个单独的液滴中发生。ddPCR技术使用的试剂和工作流程与用于大多数标准的基于TaqMan探针的测定法相似，包括液滴形成化学。同样，可以使用嵌入染料，比如Evagreen。大量样品分区是ddPCR技术的一个关键方面。
显然，通过使用更多数量的反应区可以提高dPCR的测定准确度。可以使用约100至200个、200至300个、300至400个、700个或更多个反应区，用于通过PCR确定相关的量或浓度。在根据第一和第二方面的本发明方法的优选实施方案中，dPCR在至少100个反应区，特别是至少1,000个反应区，特别是至少5,000个反应区中相同地进行。在根据第一和第二方面的本发明方法的优选实施方案中，dPCR在至少10,000个反应区，特别是至少50,000个反应区，特别是至少100,000个反应区中相同地进行。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，步骤d)和e)以相同的dPCR运行和/或在相同dPCR装置上实施，特别是在相同的微阵列中或在相同的芯片上实施。显然，如果感兴趣的核酸和参考核酸之间的差异数量减少，则定量误差可以被最小化。因此，在相同的反应区同时测定(既不在位置上也不在时间上分开)感兴趣的核酸和参考核酸是高度优选的。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，感兴趣的核酸的量或浓度和/或参考核酸的量或浓度的确定是借助于荧光进行的。
在PCR应用(如实时PCR)中，经常使用荧光来检测扩增产物。这通常在热循环仪中进行，热循环仪能够用具有至少一个规定波长的光束照射每个样品并检测由激发的荧光团发出的荧光。热循环仪还能够迅速加热和冷却样品，从而利用核酸和DNA聚合酶的物理化学性质。
dPCR可能涉及使用一种或多种荧光探针，以便检测感兴趣的核酸和/或参考核酸，特别是与淬灭剂组合或用作分子信标或用作水解探针。
通常在RT-PCR中检测荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种用于测量两种分子(在本案中为两种探针)之间的相互作用的技术。在这种技术中，两种不同的荧光分子(荧光团或标记)与适合于检测核酸的一对探针遗传融合。FRET的原理建立在两种标记的组合特征的基础之上。如果标记被特定波长(吸收频率)的光激发，它会以不同的波长(发射频率)重新发射该能量。在FRET中，第一标记被激发，其进而发射出具有发射频率的光。如果第一标记(供体)的发射峰与第二标记(受体)的激发峰重叠，则可以确定两种标记的接近度，因为第一标记将能量传递给第二标记，并且第二标记以其自身的发射频率发射出光。净结果是，供体发射的能量会比其通常情况下发射的少(因为随着光转而转移到受体，一些能量会被辐射掉)，而受体在其激发频率下发射的光能更多(因为它正在获得来自供体荧光团的额外能量输入)。也可以使用荧光染料与淬灭剂的组合。如果淬灭剂在荧光染料附近，则荧光发射被省略(omitted)。如果荧光部分与淬灭剂分开，则可以在用适当波长的光激发后检测第一荧光部分的发射。分子信标是发夹形探针，具有被内部淬灭的(internally quenched)荧光团，当它们结合靶核酸序列时，其荧光被恢复。如果待检测的核酸与环中的链互补，则在核酸和环之间形成的双链体比茎的双链体更稳定，因为前一种双链体包括更多的碱基对。这导致荧光团和淬灭剂分离。一旦荧光团离开淬灭剂，则光照射该杂合体会导致荧光发射。发射的存在表明，杂交事件已经发生，且因此靶核酸序列在测试样品中是存在的。水解探针由共价连接到寡核苷酸探针的5’端的荧光团和3’端的淬灭剂组成。只要荧光团和淬灭剂接近，淬灭就会抑制任何荧光信号。探针被设计成使得它们在被特定的引物组扩增的DNA区域内退火。当聚合酶延伸引物并合成新生链时，聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性会降解已退火到模板的探针。探针的降解使荧光团从其中释放出，并破坏了与淬灭剂的紧密靠近，从而减轻了淬灭效应并允许荧光团发出荧光。因此，检测到的荧光指示相关核酸的存在。
可用于FRET技术中各种受体荧光部分的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄(Lucifer Yellow)、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS(Lucifer Yellow VS)、4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸酯苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(succinimdyl 1-pyrenebutyrate)和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC-Red 610、LC-640、LC-Red 670、LC-705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异氰酸酯、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯或镧系离子(如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City，OR)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，荧光探针包含荧光素、罗丹明和/或花菁。例如，供体荧光部分可以是荧光素和/或受体荧光部分可以选自LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5的组，优选LC-Red 610或LC-Red 640。更优选地，供体荧光部分是荧光素，受体荧光部分是LC-Red 640或LC-Red610。
有几种不同的荧光团(例如6-羧基荧光素，首字母缩写词：FAM或四氯荧光素，首字母缩写词：TET)和淬灭剂(例如四甲基罗丹明，首字母缩写词：TAMRA)可用。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，该方法进一步包括使用外部对照，比如阴性对照和/或阳性对照。即使数字PCR不要求qPCR所需的校准和内部对照，也可能意图或有必要与本发明的方法一起使用它们，例如，以便遵守GLP或法律要求或确认测定的责任(liability)。阴性对照可包括无模板对照(no template controls)或无酶对照(no enzyme controls)。为了验证阴性结果，可能需要阳性对照，阳性对照反应包含这样的模板：如果反应按计划进行，则其必然会被扩增；除此之外，阳性对照应包含与样品相同的组分。这可以是外部阳性对照；外部阳性对照是别的包含对照模板的样品。当由于循环仪或反应组分问题导致反应失败或当抑制剂正在抑制反应时，这样的外部对照反应可有助于检测。或者，可以使用内部阳性对照(IPC)。为了运行具有IPC的反应，用于对照靶标的模板和引物与用于感兴趣的靶标的模板和引物一道包含在反应中。对照靶标当然应该易于与感兴趣的靶标区分开来。除了具有不需要单独的反应的优点之外，IPC是有用的，因为它们能够指示样品反应固有的问题。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，所述方法用于诊断，特别是用于检测疾病、病原体、稀有基因序列、稀有突变、拷贝数变异或相对基因表达。
一般而言，利用PCR可以通过患者的样品对疾病进行早期诊断。因此，可以直接在基因组DNA样品上进行dPCR测定，以检出疾病或病原体。众所周知，PCR能够快速和高度特异性地诊断感染性疾病，包括由细菌或病毒引起的疾病。PCR还允许从组织培养测定和动物模型中鉴定不可培养或缓慢生长的微生物，如分枝杆菌、厌氧细菌或病毒。微生物学中PCR诊断应用的基础在于借助于特定的基因检测传染原以及区分非致病菌株与致病菌株。同样，可以通过PCR检测病毒DNA。所使用的引物对于病毒DNA中的靶向序列而言必须是特异性的，并且PCR可用于病毒基因组的诊断分析或DNA测序。PCR的高敏感性允许在感染之后不久、甚至在疾病开始之前进行病毒检测。这样的早期检测可以在治疗上给医师带来显著的领先时间。也可以通过基于PCR的DNA定量技术对患者中的病毒量(“病毒载量”)进行定量。而且，本发明方法可用于诊断涉及稀有基因序列、稀有突变、拷贝数变异或相对基因表达的疾病，例如，癌症。稀有遗传变体的发现正在加速。这些序列变体中的一些是致病性的，可用于临床诊断。拷贝数变异是人类遗传多样性的来源。正在通过各种基因组分析鉴定众多的拷贝数变异。拷贝数变异形成可能是通过基于重组的机制和基于复制的机制而发生，相对于SNP而言，其从头位点特异性突变率看起来高得多。通过各种分子机制，包括基因剂量、基因破坏、基因融合、位置效应等，拷贝数变异可能与复杂疾病相关，或可能代表良性多态性变体。同样，一个或多个基因的表达谱可提供可用于诊断疾病的信息。具体而言，可以通过分析相对基因表达来确定疾病的存在或严重性。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，所述方法用于监测，具体地是监测患者，特别是治疗监测或确定治疗效率。根据上述细节，所述方法可用于监测，以便检测从某一来源在不同时间或条件下获得的样品中的核酸的变化。监测疾病和病原体为辨别疾病状态的变化提供可能性。它可以用于评估治疗是否有效或其效力如何。这可能包括慢性疾病的常规随访，以检查疾病的进展或消退以及并发症的发展。调整治疗可能是需要的。
除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语以及任何首字母缩写词具有与本发明领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下文献中找到分子生物学中常见术语的定义：Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia of MolecularBiology，由Blackwell Science Ltd.出版.1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
本发明不限于本文中描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管可以在本发明的实践中使用类似于或等同于本文中所描述的那些的任何方法和材料，但本文中描述了优选的方法和材料。此外，本文中使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围。
如本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确地指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。类似地，词语“包含”(″comprise″)、“含有”(″contain″)、以及“包括”(″encompass″)将被解释为开放式的含义，而不是封闭式的含义。类似地，除非上下文另外清楚指出，词语“或/或者”意图包括“和/及/以及”。术语“多个”是指两个或更多个。
以下实施例旨在说明本发明的各种实施方案。正因为如此，所论述的具体修改不应被解释为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明范围的情况下产生各种等效物、改变和修改，并且因此应当理解，这样的等效实施方案将被本文涵盖。
附图说明
图1说明了根据本发明第一方面的用于确定未处理样品中的感兴趣的核酸的量或浓度的方法。
图2说明了根据本发明第二方面的用于确定未处理样品中的感兴趣的核酸的量或浓度的方法。
图3A、3B和3C说明了用于确定相对提取产率(A)的测定设计，并显示了在(B)提取平台1的十二个位置上和(C)提取平台2的十二个位置上测量的靶核酸(合并样品)的产率。白色条和灰色条分别表示在完全相同条件下进行的第一次和第二次提取运行的数据。100％产率是通过使用dPCR直接定量干净(clean)靶标并考虑各自的稀释因子而确定的。
图4A和4B说明了原始样品浓度(A)的绝对定量的测定设计，并显示了原始样品(B)中的靶标浓度，是在平台2的12个位置上确定的，并使用属于该测定的定量标准品。靶标浓度是相对于使用dPCR直接确定(没有提取)的浓度表示的。
图5显示了在该过程的不同阶段指示参考样品以及含有未处理样品和参考样品的样品的拷贝数的图解。
N0(s)：未处理样品的拷贝数
N0(r)：参考样品的拷贝数
η：样品制备过程的产率
k：引入到PCR反应混合物中的洗脱物的分数
实施例
实施例1不同方法的总分析误差的比较
基于现有技术文献分析以及新的实验，进行定量方法的定性比较。为此，考虑到以下定义和等式，估计核酸分析的典型误差值：
不准确度：不准确度是指一大组测量值的平均值相对于参考值的偏差。不准确度通常相对于参考值来表示并以百分比的形式给出。对于定量核酸测试，样品c0的参考浓度由相应的WHO标准给出。因此，不准确度表示为：(cavg-c0)/c0*100(％)。
不精密度：不精密度是指重复测量的标准偏差，以从一大组重复确定的平均值的百分比表示。在浓度测量的情况下：STDEV(c)/cavg*100(％)。
总(分析)误差：总误差TE表示单个测量值离开参考值的、在所有测量95％的中不被超过的偏差。它表示为：TE＝不准确度+2*不精密度。
在本实施例中，将由两种代表当前技术发展水平的(state-of-the-art)核酸定量测试方法(表1a和b)的不精密度和不准确度组成的总分析误差与本发明描述的方法(表1d)进行比较。
此外，下表中估计的典型误差是指在“医疗决策点”范围内的样品浓度，从应用角度来看被视为最相关的。
涉及了以下方面：
-在两套NAT系统上，用经FDA批准的CMV监测测定法确定的HCV参考样品浓度的比较(Caliendo等人，2006，J Clin Microbiol 44：1726-32，称为参考文献1)
参考文献1的图5显示了在Bayer bDNA和Roche RT-PCR测定法(目前最广泛使用的用于HCV病毒载量测试的产品)之间的一致性。虚线表示样品的平均差。可以看出，样品与样品之间的变异大，暗示不精密度在+/-0.5log10(例如，对于基因型2)到+/-1.0log10(例如，对于基因型3)之间。此外，不准确度(所有样品的平均偏倚)在-0.1log10和+0.8log1之间变化。
-使用不同测试测定法在不同平台上的CMV和EMV参考样品的病毒载量的比较(Hayden等人，2012，J.Clin.Microbiol.50：337-345，作为参考文献2援引)
参考文献2的图2和图3说明了在不同平台上CMV和EMV的参考样品的病毒载量的比较。在不同平台上确定的中值滴定度的差异大约为十倍(1个log10的差异)。取决于测定法和平台，平台内的不精密度从1.2倍到10倍不等。
-在不同平台上确定的市售定量标准品相对于其标称值的不准确度(或偏倚)(J.Clin.Microbiol.May 2015 53：5 1500-1505，作为参考文献3援引)
参考文献3的图1显示了来自不同供应商的用于CMV测试的常用定量标准品在5个核酸测试平台上评估的浓度的不准确度。如该文中论述的，两个dPCR平台(BioRad和Raindance)提供了最一致和准确的结果。
-罗氏(Roche)产的定量标准品的典型不精密度和不准确度的值，为每批放行(lotrelease)收集的
下表(罗氏数据，作为参考文献4援引)说明了在罗氏核酸测试系统上测得的观察滴度值与指派滴度值之间的典型偏差。在本实验中，将测量的二级标准品的8个重复的定量结果与指派滴度值4.26log10比较。这对应于1.7*1E4个拷贝/ml的浓度。平均差异等于不准确度，而差异的标准偏差等于滴度值的不精密度。这些数据是使用特定的仪器和来自特定批次的试剂收集的。因此，这里显示的不精密度和不准确度的值不包括仪器与仪器之间的变异和试剂批次间的变异。
-来自两个平台的dPCR定量结果的比较(罗氏数据，作为参考文献5援引)
使用罗氏PCR装置在罗氏测量的定量结果的比较，并与BioRadQX100系统比较。重复实验的不精密度的范围在3.5％到5％之间，而在两个平台上对两个靶标确定的平均值有2.5％和5％的偏差。该分析建立在以下结果的基础之上：
-比较来自四个平台的dPCR定量结果(比较四种数字PCR平台准确定量经认证的质粒DNA参考材料的DNA拷贝数的情况，Dong等人，2015年，Scientific Reports 5：文章编号：13174，doi：10.1038/srep13174，作为参考文献6援引)
参考文献6的表1总结了四种dPCR平台的定量结果的比较。关于线性化质粒的结果指示2-6％的平台内不精密度，以及和0-6％的不准确度。
上述数据分析的结果总结在下表1a-d中：
实施例2相对提取产率的确定
为了证明现有技术方法的准确度，将靶DNA转移到血浆中并提取(平台1：Rochesample Prep MP24，或平台2：6800)。用dPCR定量洗脱物。在平台1的十二个位置和平台2的十二个位置上测量的靶核酸(合并样品)的产率。用dPCR直接定量的靶DNA设为100％。测定设计展示在图3A中。
实验设置-平台1：
Roche sample Prep MP24#000503，靶标：HBV EuroHep质粒(4.33E+05cp/mL或8.23E+4IU/mL)；人EDTA血浆(HIV/HBV/HCV阴性)，样品输入体积：500μL，洗脱体积：105μL
实验设置-平台2：
6800，仪器：1200，试剂：HBV试剂盒，靶标：HBV EuroHep质粒(4.33E+05cp/mL或8.23E+4IU/mL)，人EDTA血浆(HIV/HBV/HCV阴性)，样品输入体积：500μL，洗脱体积：50μL
实验设置-dPCR：
试剂：PLS MMx(RC09)，包含100nM TEXR作为填充控制(fill control)，来自6800的洗脱物，每泳道2μL靶标，分离流体：PMX 200 50cs无添加剂，填充站FM/分离V1.4，输入体积：10μL，检测FM：Config.F/1000ms积分，dPCR循环仪FM 105/104，型式(profilie)：NG调适
结果示于图3B(平台2)和3C(平台1)中。白色条和灰色条分别表示在完全相同条件下进行的第一次和第二次提取运行的数据。100％产率通过使用dPCR直接定量干净(clean)靶标并考虑各自的稀释因子来确定。产率在不同平台之间可以有相当大变化(这里：约2倍)，在相同平台上的位置之间也可以有相当大变化(这里：最高达2倍)。因此，在绝对定量中，未知产率可引入误差，因为定量校准品必须知晓产率，而校准品又被用于校准定量标准品。
实施例3原始样品浓度的绝对定量
为了证明本发明方法相对于现有技术方法在准确度方面的提高，将靶DNA转移到血浆中并提取(平台2：6800)。将洗脱物定量，或是通过使用定量标准品QS的qPCR(6800)(代表现有技术水平)，或是通过包含参考核酸的dPCR(罗氏dPCR系统)。将用dPCR直接定量的靶DNA设为100％。测定设计展示在图4A中。关于实验细节，参考上述实施例2。
结果显示在图4B中。在平台2的12个位置使用属于该测定的定量标准品确定了原始样品中靶标的浓度。靶标浓度作为相对于使用dPCR直接确定(w/o提取)的浓度的相对值给出。应注意的是，本实验中使用的靶核酸与用于校准针对该特定测定的系统的标准校准品靶标完全相同。
使用定量标准品和qPCR的绝对定量可能显著偏离真实浓度，在这里，定量偏低了大约40％(参见图4B的第1至12柱)。其原因可能是例如(二级)校准标准品的错误定量或定量标准品的批间变异。与此相反，利用本发明的方法，正确确定了浓度(参见图4B的第13柱)。

Claims (51)

1.一种用于确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法，所述方法为非诊断方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供
-疑似含有感兴趣的核酸的未处理样品，和
-已知含有与感兴趣的核酸不同的参考核酸的参考样品；
b)将未处理样品与限定量的参考样品合并，从而获得合并的样品；
c)处理该合并的样品，从而获得适合于数字聚合酶链式反应(dPCR)的经处理的样品；
d)用该经处理的样品进行dPCR，从而确定该经处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度以及参考核酸的量或浓度；
e)用限定量的参考样品进行dPCR，从而确定该限定量的参考样品中的参考核酸的量或浓度；
f)将步骤d)中确定的参考核酸的量或浓度与步骤e)中确定的参考核酸的量或浓度进行比较，从而确定步骤c)中核酸的产率；和
g)基于在步骤d)中确定的经处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度和步骤f)中确定的产率，确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度。
2.一种用于确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法，所述方法为非诊断方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供疑似含有感兴趣的核酸的未处理样品；
b)提供已知含有与感兴趣的核酸不同的参考核酸的参考样品；
c)处理该参考样品，从而获得适合于dPCR的经处理的参考样品；
d)用该经处理的参考样品进行dPCR，从而确定该经处理的参考样品中的参考核酸的量或浓度；
e)用限定量的未处理参考样品进行dPCR，从而确定在该限定量的未处理参考样品中的参考核酸的量或浓度；
f)将步骤d)中确定的参考核酸的量或浓度与步骤e)中确定的参考核酸的量或浓度进行比较，从而确定步骤c)中核酸的产率；
g)处理步骤a)中未处理样品，从而获得适合于dPCR的经处理的样品，其中处理步骤c)和g)是相同的；
h)用步骤g)中经处理的样品进行dPCR，从而确定感兴趣的核酸的量或浓度；和
i)基于在步骤h)中确定的经处理的样品中感兴趣的核酸的量或浓度和步骤f)中确定的产率，确定未处理样品中感兴趣的核酸的量或浓度。
3.权利要求2的方法，其中步骤a)及g)至i)的实施与步骤b)至f)的实施在位置上和/或时间上是分开的。
4.权利要求2的方法，其中步骤a)及g)至i)的实施与步骤b)至f)的实施在时间上是分开的。
5.权利要求1至4中任一项的方法，
-其中将参考样品中的参考核酸的量或浓度与参考值进行比较，从而控制所述参考样品，或其中参考样品中参考核酸的量或浓度是未知的或未预先确定；和/或
-其中步骤e)中参考样品的量或浓度与步骤b)中的完全相同。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述参考核酸
-是选自DNA、RNA及其混合物的核酸；
-与感兴趣的核酸具有相同的引物结合位点；
-与感兴趣的核酸具有不同的引物结合位点；
-具有与感兴趣的核酸的一定长度的核酸至多50％不同的一定长度的核酸；
-具有与感兴趣的核酸的序列至少50％相同的序列；
-具有与感兴趣的核酸的G和C含量至多50％不同的G和C含量；和/或
-包含这样的部分：其不是感兴趣的核酸的一部分并且被用于检测该参考核酸。
7.权利要求6的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的一定长度的核酸至多25％不同的一定长度的核酸。
8.权利要求7的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的一定长度的核酸至多10％不同的一定长度的核酸。
9.权利要求8的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的一定长度的核酸至多5％不同的一定长度的核酸。
10.权利要求6的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的序列至少60％相同的序列。
11.权利要求10的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的序列至少70％相同的序列。
12.权利要求11的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的序列至少80％相同的序列。
13.权利要求6的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的G和C含量至多25％不同的G和C含量。
14.权利要求13的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的G和C含量至多10％不同的G和C含量。
15.权利要求14的方法，其中所述参考核酸具有与感兴趣的核酸的G和C含量至多5％不同的G和C含量。
16.权利要求6的方法，其中所述DNA是cDNA。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述感兴趣的核酸
-是选自DNA、RNA及其混合物的核酸；
-包含这样的部分：其不是参考核酸的一部分，并且被用于检测该感兴趣的核酸；和/或
-指示微生物、细胞、哺乳动物物种或遗传状态。
18.权利要求17的方法，其中所述DNA是cDNA。
19.权利要求17的方法，其中所述微生物是病毒、细菌或真菌。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述未处理样品
-获自细胞培养物、疑似被污染的来源或受试者；和/或
-选自体液、临床标本、器官样品和组织样品。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者选自动物和植物。
22.权利要求20的方法，其中所述受试者是人。
23.权利要求20的方法，其中所述体液是血液、血浆、血清、尿液、胆汁或脑脊液。
24.权利要求20的方法，其中所述临床标本是拭子。
25.权利要求1至24中任一项的方法，其中所述处理包括稀释、裂解、离心、提取、沉淀、过滤和/或纯化。
26.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在液体中进行。
27.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在凝胶中进行。
28.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在乳液中进行。
29.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在液滴中进行。
30.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在微型化室的微阵列中进行。
31.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在微流体装置的室中进行。
32.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在微孔板中进行。
33.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在芯片上进行。
34.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在毛细管中进行。
35.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在核酸结合表面上进行。
36.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述dPCR在珠子上进行。
37.权利要求1至36中任一项的方法，其中所述dPCR在至少100个反应区中同样地进行。
38.权利要求37的方法，其中所述dPCR在至少1,000个反应区中同样地进行。
39.权利要求38的方法，其中所述dPCR在至少5,000个反应区中同样地进行。
40.权利要求39的方法，其中所述dPCR在至少10,000个反应区中同样地进行。
41.权利要求40的方法，其中所述dPCR在至少50,000个反应区中同样地进行。
42.权利要求41的方法，其中所述dPCR在至少100,000个反应区中同样地进行。
43.权利要求1至42中任一项的方法，其中步骤d)和e)以相同的dPCR运行和/或在相同的dPCR装置上进行。
44.权利要求43的方法，其中所述dPCR装置是微阵列或芯片。
45.权利要求1至44中任一项的方法，其中dPCR涉及使用一种或多种荧光探针以便检测感兴趣的核酸和/或参考核酸。
46.权利要求45的方法，其中一种或多种荧光探针与淬灭剂组合或用作分子信标或用作水解探针。
47.权利要求45或46的方法，其中所述荧光探针包含荧光素、罗丹明和/或花菁。
48.权利要求1至47中任一项的方法，其中感兴趣的核酸的量或浓度和/或参考核酸的量或浓度的确定是借助于荧光进行的。
49.权利要求1至48中任一项的方法，其中该方法进一步包括使用外部对照。
50.权利要求49的方法，其中所述外部对照是阴性对照和/或阳性对照。
51.权利要求1至50中任一项的方法，其中所述方法用于检测稀有基因序列、稀有突变、拷贝数变异或相对基因表达。
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