MX2014012214A - Composiciones y metodos para cuantificar una secuencia de acido nucleico en una muestra. - Google Patents

Composiciones y metodos para cuantificar una secuencia de acido nucleico en una muestra.

Info

Publication number
MX2014012214A
MX2014012214A MX2014012214A MX2014012214A MX2014012214A MX 2014012214 A MX2014012214 A MX 2014012214A MX 2014012214 A MX2014012214 A MX 2014012214A MX 2014012214 A MX2014012214 A MX 2014012214A MX 2014012214 A MX2014012214 A MX 2014012214A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
target nucleic
sequence
nucleotides
Prior art date
Application number
MX2014012214A
Other languages
English (en)
Other versions
MX338296B (es
Inventor
Daniel Shaffer
Stephen A Judice
Original Assignee
Envirologix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49328090&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2014012214(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Envirologix Inc filed Critical Envirologix Inc
Publication of MX2014012214A publication Critical patent/MX2014012214A/es
Publication of MX338296B publication Critical patent/MX338296B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención presenta composiciones y métodos para cuantificar la detección de un oligonucleótido objetivo en una muestra en tiempo real. Estos métodos son compatibles con los oligonucleótidos objetivo amplificados al utilizar una reacción NEAR.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA CUANTIFICAR UNA SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO EN UNA MUESTRA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y metodos para cuantificar la detección de un oligonucleótido objetivo en una muestra en tiempo real. Estos métodos son compatibles con los oligonucleótidos objetivo amplificados al utilizar una reacción NEAR.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las teenologías de amplificación de ácidos nucleicos han proporcionado un medio para comprender complejos procesos biológicos, detección, identificación y cuantificación de organismos patogénicos y no patogénicos, análisis de criminología forense, estudios de asociación de enfermedades y detección de eventos en organismos genéticamente modificados, etc. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una tecnología común de amplificación de ácidos nucleicos dependiente de ciclos térmicos utilizada para amplificar DNA, que consiste en ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reacción para la fusión de DNA y replicación enzimática del DNA al utilizar una DNA polimerasa. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) es una técnica utilizada para cuantificar el número de copias de una secuencia de ácido nucleico determinada en una muestra biológica. Actualmente, la qPCR utiliza la detección de productos de reacción en tiempo real a lo largo de la reacción y compara el perfil de amplificación con la amplificación de controles que contienen una cantidad conocida de ácidos nucleicos al comienzo de cada reacción (o una relación relativa conocida de ácidos nucleicos al ácido nucleico probado desconocido). Los resultados de los controles se utilizan para construir curvas estándar, típicamente con base en la porción logarítmica de las curvas de amplificación de reacción estándar. Estos valores se utilizan para interpolar la cantidad de las incógnitas con base en dónde se comparan sus curvas de amplificación con las cantidades de control estándar.
Además de la PCR, existen sistemas de amplificación dependientes de ciclos no termicos o teenologías de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicas, incluyendo, sin limitación: Reacción de amplificación por corte y extensión (NEAR), Amplificación por círculo rodante (RCA), Amplificación dependiente de hellcasa (HDA), Amplificación mediada por bucle (LAMP), Amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), Amplificación mediada pro transcripción (TMA), Replicación de secuencias autosostenida (3SR), Amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), Amplificación isotérmica de un solo cebador (SPIA), Sistema de Q-b replícasa y Amplificación por polimerasa recombinasa (RPA).
La amplificación NEAR tiene similitudes con los ciclos termicos de la PCR. Como la PCR, la amplificación NEAR emplea secuencias de oligonucleótidos que son complementarias con secuencias objetivo referidas como cebadores en la PCR y moldes en NEAR. Además, la amplificación NEAR de secuencias objetivo resulta en un incremento logarítmico en la secuencia objetivo, tal como en la PCR estándar. A diferencia de la PCR estándar, la reacción de NEAR progresa de manera isotérmica. En la PCR estándar, la temperatura se incrementa para permitir que las dos hebras de DNA se separen. En una reacción NEAR, la secuencia de ácido nucleico objetivo se corta en sitios de corte específicos presentes en una muestra de prueba. La polimerasa se infiltra en el sitio de corte y comienza la síntesis de hebras complementarias de la secuencia de nucleótidos objetivo cortada (el DNA exógeno agregado) en conjunto con el desplazamiento de la hebra de DNA complementaria existente. El proceso de replicación por desplazamiento de hebra obvia la necesidad de una temperatura incrementada. En este punto, las moléculas de molde/cebador se alinean por temperatura a la secuencia complementaria desplazada del DNA exógeno agregado. La polimerasa ahora se extiende del extremo 3’ del molde, lo que crea una hebra complementaria a la hebra desplazada previamente. El segundo oligonucleótido de molde/cebador entonces se alinea por temperatura a la hebra complementaria recién sintetizada y se extiende haciendo una doble hebra heteróloga de DNA que incluye la secuencia de reconocimiento de enzima de corte. Esta hebra entonces es susceptible de cortarse con la extensión por desplazamiento de hebra subsecuente por la polimerasa, lo que conduce a la producción de una doble hebra heteróloga de DNA que tiene sitios de corte a cada lado del DNA objetivo original. Una vez que esto se sintetiza, la molecula continúa amplificándose exponencialmente a través de la replicación de las hebras desplazadas con nuevas moléculas de molde. Además, la amplificación también procede linealmente desde cada molécula producto a través de la acción repetida de la síntesis por traslado de corte en los sitios de corte introducidos del molde. El resultado es un incremento muy rápido en la amplificación de señales objetivo, mucho más rápido que los ciclos térmicos de la PCR, con resultados de amplificación en menos de diez minutos.
Sin embargo, la cuantificación ha sido problemática. El rendimiento óptimo de un sistema NEAR en tiempo real depende de la generación y amplificación de un producto específico. Se sabe que los sistemas NEAR generan niveles significativos de productos de fondo inespecíficos además del producto específico por las enzimas de reacción. Estos productos de fondo pueden servir como entidades que pueden amplificarse y su generación puede superar competitivamente la generación del producto específico. Aunque es posible diseñar sondas de detección específicas para el objetivo deseado (y, de esta manera, el producto específico es detectable en un fondo complejo), niveles significativos de productos de fondo inespecíficos secuestran componentes de reacción que de otra manera pueden haberse utilizado para la amplificación del producto específico. De esta manera, el secuestro de componentes de reacción debido a la generación de productos de fondo inespecíficos resulta en una reacción que se encuentra por debajo de lo óptimo. Esto es particularmente problemático cuando el ácido nucleico objetivo inicialmente se encuentra en muy baja abundancia y donde se requiere una reacción altamente optimizada para la detección confiable del objetivo. Tambien, una reacción por debajo de lo óptimo no puede representar la verdadera cuantificación de un ácido nucleico objetivo aún cuando sea detectable. Sería favorable generar reacciones NEAR optimizadas que eliminen la amplificación de productos de fondo inespecíficos. Al hacerlo puede proporcionarse una reacción que es adecuada para la cuantificación por un sistema basado en curvas estándar o cuantificación relativa.
También, es una práctica común evaluar las reacciones NEAR al utilizar espectrometría de masas. Los altos niveles de productos de fondo pueden opacar la interpretación de los datos de espectrometría de masas. Si, por ejemplo, una reacción contiene productos de fondo, uno o más productos derivados de la amplificación inespecífica (a partir de objetivos relacionados pero aún diferentes), y el producto específico, sería desafiante identificar estos productos derivados de matriz a partir de los productos de fondo. La eliminación de los productos de fondo conduce a una clara determinación del rendimiento/especificidad del ensayo particular.
Adicionalmente, los altos niveles de productos de fondo pueden impedir la amplificación óptima de reacciones ¡ntencionalmente duplicadas o multiplicadas. Aunque múltiples sondas de detección etiquetadas de manera diferencial son compatibles con la detección en tiempo real, aún existe el problema de las limitaciones de reactantes debido a la formación de productos inespecíficos. Esto es particularmente cierto para las reacciones dobles o múltiples en cuanto a que estas reacciones contienen más de dos moldes/cebadores que pueden formar potencialmente poblaciones complejas de productos de fondo. Un sistema de reacción NEAR que elimina la amplificación de productos de fondo también proporciona las condiciones para la detección de reacciones duplicadas o multiplicadas intencionalmente en tiempo real. Sería altamente favorable proporcionar un medio para eliminar los productos de fondo que pueden amplificarse, lo que de esta manera maximiza el potencial de generar productos específicos en las reacciones NEAR. Sería deseable si un resultado cuantitativo pudiera proporcionarse al monitorear con precisión el progresan de la reacción en tiempo real.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Como se describe posteriormente, la presente invención presenta composiciones y metodos para la detección de un oligonucleótido objetivo en una muestra en tiempo real, que reduce o elimina la generación de productos de fondo, lo que hace posible la cuantificación del oligonucleótido objetivo de la muestra. Estos métodos son compatibles con los oligonucleótidos objetivo amplificados al utilizar una reacción NEAR. La invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que los productos específicos en las reacciones NEAR sencillas pueden generarse sin la generación de productos de fondo. Las composiciones y métodos de reacción hacen posible una cuantificación relativa de muestras de prueba desconocidas, reacciones duplicadas y reacciones multiplicadas, y la creación de curvas estándar para la cuantificación absoluta de muestras de prueba desconocidas.
En un aspecto, la invención proporciona un método para cuantificar un producto específico en una reacción de amplificación por corte y extensión, y el método implica: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, y una sonda de polinucleótidos detecta ble, donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo; generar amplicones que tienen por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y detectar una señal específica para la hibridación de sondas de oligonucleótidos con la molécula de ácido nucleico objetivo o amplicón de la misma, donde la señal indica la cantidad de la molécula de ácido nucleico objetivo presente en la muestra, o un amplicón de la misma.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar una pluralidad de productos de reacción distintos, producidos en el transcurso de una sola reacción, y el método implica: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, y una sonda de polinucleótidos detectable, donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo; generar amplicones que tienen por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y detectar una señal específica para la hibridación de sondas de oligonucleótidos con la molécula de ácido nucleico objetivo o amplicón de la misma, donde la señal indica la cantidad de la molécula de ácido nucleico objetivo presente en la muestra, o un amplicón de la misma.
En un aspecto particular, la invención proporciona un método para cuantificar un producto específico en una reacción de amplificación por corte y extensión, y el método implica: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa, dos oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, y una sonda de polinucleótidos detectable, donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde tiene por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos modificados con 2’-O-metilo contiguos, colocados en o adyacentes al extremo 3’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el extremo terminal 3’ del oligonucleótido); generar amplicones que tienen por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y detectar una señal específica para la hibridación de sondas de oligonucleótidos con la molécula de ácido nucleico objetivo o amplicón de la misma, donde la señal indica la cantidad de la molécula de ácido nucleico objetivo presente en la muestra, o un amplicón de la misma.
En un aspecto, la invención proporciona un método para monitorear, en tiempo real, una reacción de amplificación por corte y extensión, y el metodo implica: poner en contacto una muestra de prueba con una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, y una sonda de polinucleótidos detectable, donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde tiene uno o más nucleótldos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas; generar amplicones que tienen por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y detectar una señal en tiempo real, lo que en consecuencia cuantifica la o las moléculas de ácido nucleico objetivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para monitorear, en tiempo real, una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción NEAR, y el método implica: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, una enzima de corte específica de dobles hebras heterólogas, y una sonda de polinucleótidos detectable, donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo; generar amplicones que tienen una secuencia objetivo que se une a la sonda de oligonucleótidos detectable; y detectar una señal en tiempo real, lo que en consecuencia cuantifica la molécula de ácido nucleico objetivo.
Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un método para monitorear, en tiempo real, una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra de prueba, y el método implica: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, una enzima de reparación o enzima de revisión y corrección, y una sonda de polinucleótidos detectable, donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo; generar amplicones que tienen una secuencia objetivo que se une a la sonda de oligonucleótidos detectable; y detectar una señal en tiempo real, lo que en consecuencia cuantifica la molécula de ácido nucleico objetivo.
Aún en otro aspecto, la invención proporciona un equipo para detectar una secuencia objetivo en una reacción NEAR, el equipo contiene uno o más oligonucleótidos de cebador/molde, que se unen específicamente a una secuencia complementaria en la molecula de ácido nucleico objetivo y tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo, y direcciones para el uso del oligonucleótido de cebador/molde en los métodos de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido aislado que tiene, de 5’ a 3’, una primera región y una segunda región, donde la primera región tiene una secuencia de reconocimiento de enzima de corte, donde la segunda región tiene por lo menos 9 o más nucleótidos (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos contiguos) que se unen específicamente a una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico objetivo, y donde la segunda región tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’. En otras modalidades, el oligonucleótido aislado es uno expuesto en la Figura 1.
En diversas modalidades de los aspectos delineados en este documento, el oligonucleótido (por ejemplo, oligonucleótido de cebador/molde, oligonucleótido aislado) contiene un nucleótido modificado, incluyendo un nucleótido modificado en 2’. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la modificación 2’ es una o más de un 2’-O-met¡lo, 2’-metoxietoxi, 2’-fluoro, 2’-hidroxilo, 2’-alilo, 2’-0- [2-(metilamino)-2-oxoetilo], 4’-tio, 4’-CH2-O-2’-puente, 4’-(CH2)2-0-2’-puente, 2’-LNA, 2’-alquilo, y 2’-0-(N-metilcarbamato), o el nucleótido modificado contiene un análogo de base. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, uno o más nucleótidos modificados en 2’ se colocan en o adyacentes al extremo 3’ de la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el extremo terminal 3’ del oligonucleótido). En otras modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, uno o más nucleótidos modificados en 2’ se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, uno o más nucleótidos modificados en 2’, colocados en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo, se separan del sitio de corte en 1, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos sin modificar. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, dos o más nucleótidos modificados en 2’ son contiguos (2, 3, 4, 5 o más). En otras modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, dos o más nucleótidos modificados en 2’ se alternan con nucleótidos sin modificar. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, el secuencia de reconocimiento de enzima de corte es 5’-GAGTC-3’. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, 5 nucleótidos modificados con 2’-0-metilo contiguos se colocan en o adyacentes al extremo 3’ de la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el extremo terminal 3’ del oligonucleótido). En otras modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, 5 nucleótidos modificados con 2’-O-metilo contiguos se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo. En otras modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, 2 o más nucleótidos modificados con 2’-0-metilo, alternando con nucleótidos sin modificar, se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo (es decir, la región específica de objetivo).
En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la etapa de detección no detecta un amplicón de una molécula no objetivo. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, el método se lleva a cabo en tiempo real. En ciertas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la etapa de generar amplicones se lleva a cabo en tiempo real (por ejemplo, para determinar la cantidad de objetivo presente en la reacción).
En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, el método proporciona un método semicuantitativo y/o de cantidad umbral para determinar la cantidad de molécula de ácido nucleico presente en una muestra biológica antes de la amplificación. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, colocar uno o más nucleótidos modificados en 2’ más cerca del extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo, incrementa el tiempo de detección de la amplificación. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, el método además implica el uso de relaciones de oligonucleótidos de cebador/molde para proporcionar una resolución incrementada de los productos de reacción, que resulta de cantidades diferentes de material objetivo de inicio. Se ha encontrado que incrementar la relación de oligonucleótido de cebador/molde, que tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en el extremo 3’ de la secuencia de reconocimiento, a oligonucleótido de cebador/molde que tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en el extremo 5’ de la secuencia de reconocimiento, contrae la curva de señal y mueve la pendiente de la curva.
En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, el método además implica el uso de un modificador de tasa de amplificación para proporcionar una resolución incrementada de los productos de reacción, que resulta de cantidades diferentes de material objetivo de inicio. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la molécula de ácido nucleico objetivo es una molécula de ácido nucleico de DNA o RNA. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la sonda detectable es SYBRgreen o una Baliza molecular. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la sonda detectable es una sonda de polinucleótidos detectable que no puede amplificarse, que tiene por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos que son complementarios a una secuencia objetivo, una fracción detectable, y una molecula de arresto de polimerasa, donde la molécula de arresto de polimerasa previene que una polimerasa amplifique la sonda bajo condiciones que de otra manera soportan la actividad polimerasa.
En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la muestra de prueba contiene un patógeno. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, el patógeno es un virus, bacteria, levadura u hongo. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la muestra de prueba es una muestra biológica. En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la muestra biológica es una célula, muestra de tejido o fluido biológico (por ejemplo, orina, semen, secreción vaginal o heces). En diversas modalidades de cualquier aspecto delineado en este documento, la muestra de prueba es una muestra ambiental.
La invención proporciona composiciones y métodos para detectar una molécula de ácido nucleico objetivo amplificada al utilizar una reacción NEAR. Las composiciones y artículos definidos por la invención se aislaron, o de otra manera se elaboraron, en relación con los ejemplos proporcionados posteriormente. Otros atributos y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción detallada, y de las reivindicaciones.
Definiciones En esta descripción, “comprende”, “que comprende", “que contiene” y “que tiene” y similares, pueden tener el significado atribuido a los mismos en la lcy de patentes de E.U. y pueden significar “incluye”, “incluyendo” y similares; “que consiste esencialmente en” o “consiste esencialmente” asimismo tienen el significado atribuido en la ley de patentes de E.U. y el término es indefinido, lo que hace posible la presencia de más de lo que se indica con la condición de que las características básicas o novedosas de lo que se indica no se cambien por la presencia de más de lo que se indica, pero excluye las modalidades de la téenica anterior.
Por “molécula de arresto de polimerasa” se quiere hacer referencia a una fracción asociada con un molde/cebador de polinucleótido que previene o reduce significativamente la progresión de una polimerasa en el molde de polinucleótido. Preferiblemente, la fracción se incorpora en el polinucleótido. En una modalidad preferida, la fracción previene que la polimerasa progrese en el molde.
Por “extensión por polimerasa" se quiere hacer referencia a la progresión hacia delante de una polimerasa desde un grupo hidroxilo 3’ accesible que incorpora monómeros entrantes complementarios a sus nucleótidos opuestos en una hebra de polinucleótidos de molde.
Por “polimerasa deficiente en actividad exonucleasa” se quiere hacer referencia a una DNA polimerasa dependiente de DNA y/o DNA polimerasa dependiente de RNA que es carente de una actividad exonucleasa 5’-3\ o que tiene niveles virtualmente indetectables de tal actividad.
Por “aducto de nucleótido” se quiere hacer referencia a una fracción que se une de manera covalente o se fija de otra manera a una base nucleotídica estándar.
Como se utiliza en este documento, el termino “sonda de polinucleótidos detectable” se refiere a cualquier polinucleótido por lo menos parcialmente de hebra sencilla, etiquetado con una fracción detectable con una región de secuencia complementaria a por lo menos una hebra de la secuencia objetivo, que libera una señal detectable de la fracción detectable con la unión a la secuencia objetivo, mientras que la generación de señales por esa fracción detectable depende de la escisión de la sonda de polinucleótidos detectable por una actividad exonucleasa 5’-3’ inespecífica. Un ejemplo de una “sonda de polinucleótidos detectable” como se utiliza en este documento es, pero no se limita a, una sonda de baliza molecular fluorescente, como se describe en la téenica anterior.
Como se utiliza en este documento, el termino “ácido nucleico” se refiere a desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o nucleótidos modificados, y polímeros de los mismos en forma de una sola o de doble hebra. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos o residuos o enlaces cadena principal modificados conocidos, que son sintéticos, que se presentan en la naturaleza y que no se presenta en la naturaleza, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan en una forma similar a la de los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, ribonucleótidos modificados en 2’ (por ejemplo, 2’-O-metil ribonucleótidos, 2’-F nucleótidos).
Como se utiliza en este documento, “nucleótido modificado” se refiere a un nucleótido que tiene una o más modificaciones al nucleósido, la base nitrogenada, anillo de pentosa o grupo fosfato. Por ejemplo, los nucleótidos modificados excluyen ribonucleótidos que contienen monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina y monofosfato de citidina, y desoxirribonucleótidos que contienen monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de desoxitimidina y monofosfato de desoxicitidina. Las modificaciones incluyen las que se presentan en la naturaleza, que resultan de la modificación por enzimas que modifican nucleótidos, tales como metiltransferasas. Los nucleótidos modificados también incluyen nucleótidos sintéticos o que no se presentan en la naturaleza. Las modificaciones sintéticas o que se no presentan en la naturaleza en los nucleótidos incluyen aquellas con modificaciones 2’, por ejemplo, 2’-alquilo, tales como 2’-O-metilo y 2’-metoxietox¡, 2’-fluoro, 2’-hidroxilo (RNA), 2 -alilo, 2’-0-[2- (metilamino)-2-oxoetilo], 4’-tio, 4’-CH2-0-2’-puente, 4’-(CH2)2-0-2’-puente, 2’-LNA y 2’-0-(N-metilcarbamato) o los que comprenden análogos de bases.
Por “sustitución de base” se quiere hacer referencia a un sustituyente de un polímero de bases nitrogenadas que no da lugar a una perturbación significativa de la hibridación entre las hebras de nucleótidos complementarios.
Por “producto específico” se quiere hacer referencia a un producto de polinucleótidos que resulta de la hibridación de oligonucleótidos de molde a una secuencia objetivo complementaria y la subsecuente extensión mediada por polimerasa de la secuencia objetivo.
Por “reacción de amplificación por corte y extensión” se quiere hacer referencia a ciclos alternos de corte y extensión, lo que conduce a la amplificación de un polinucleótido de interés.
Por “condición sustancialmente isotérmica” se quiere hacer referencia a una sola temperatura o dentro de un intervalo estrecho de temperaturas que no varía significativamente. En una modalidad, una reacción llevada a cabo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas se lleva a cabo a una temperatura que varía en sólo aproximadamente 1-5 °C (por ejemplo, variable en 1, 2, 3, 4 o 5 grados). En otra modalidad, la reacción se lleva a cabo a una sola temperatura dentro de los parámetros operativos del instrumento utilizado.
Por “enzima de corte” se quiere hacer referencia a un polipeptido capaz de reconocer y unirse a una estructura específica en moléculas de ácido nucleico de doble hebra y romper un enlace fosfodiéster entre nucleótidos colindantes en una sola hebra con la unión a su estructura específica reconocida, lo que en consecuencia crea un grupo hidroxilo 3’ libre en el nucleótido terminal corriente arriba del sitio de corte, que puede extenderse por una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa.
Por “sitio de corte” se quiere hacer referencia a la posición de un enlace fosfodiéster “roto” en una hebra de una molécula de ácido nucleico de doble hebra, hidrolizada por una enzima de corte.
Por “amplicón” se quiere hacer referencia a un polinucleótido o una gran cantidad de polinucleótidos generados durante la amplificación de un polinucleótido de interés. En un ejemplo, un amplicón se genera durante una reacción en cadena de la polimerasa.
Por “semicuantitativo” se quiere hacer referencia a proporcionar una estimación de la cantidad relativa con base en un control interno.
Por “método de cantidad umbral” se quiere hacer referencia a proporcionar una estimación de la cantidad con base en exceder o no exceder en cantidad un estándar comparativo.
Por “modificadores de tasa de amplificación” se quiere hacer referencia a un agente capaz de afectar la tasa de extensión por polimerasa o la tasa de corte de hebra sencilla por la enzima de corte, o ambas.
Por “monitoreo a reacción” se quiere hacer referencia a detectar el progreso de una reacción. En una modalidad, el monitoreo de la progresión de reacción implica detectar la extensión por polimerasa y/o detectar una reacción NEAR completa.
“Detectar” se refiere a identificar la presencia, ausencia o cantidad del analito a detectarse.
Por “fracción detectable” se quiere hacer referencia a una composición que, cuando se enlaza a una molecula de interés, hace a la última detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen isótopos radioactivos, cuentas magnéticas, cuentas metálicas, partículas coloidales, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (por ejemplo, como se utiliza comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos.
Por “fragmento” se quiere hacer referencia a una porción de una molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferiblemente, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de toda la longitud de la molecula de ácido nucleico o polipéptido de referencia. Un fragmento puede contener 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos.
“Hibridación” significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido, entre bases nitrogenadas complementarias. Por ejemplo, adenina y timina son bases nitrogenadas complementarias que se ordenan en pares a través de la formación de enlaces de hidrógeno.
Por “polinucleótido aislado” se quiere hacer referencia a un ácido nucleico (por ejemplo, un DNA) que se encuentra libre de los genes que, en el genoma que se presenta en la naturaleza del organismo del cual se deriva la molécula de ácido nucleico de la invención, flanquean el gen. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un DNA recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el DNA genómico de un procariota o eucariota, o que existe como molécula separada (por ejemplo, un cDNA o un fragmento genómico o de cDNA producido por PCR o digestión por endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. Además, el término incluye una molécula de RNA que se transcribe a partir de una molécula de DNA, así como un DNA recombinante que es parte de una secuencia polipeptídica adicional que codifica genes híbridos.
Los términos “aislado”, “purificado” o “biológicamente puro” se refieren a material que se encuentra libre, en diversos grados, de componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado nativo. “Aislar” denota un grado de separación de la fuente o ambientes originales. “Purificar” denota un grado de separación que es superior al aislamiento. Una proteína “purificada” o “biológicamente pura” se encuentra suficientemente libre de otros materiales, de tal modo que cualquier impureza no afecte materialmente las propiedades biológicas de la proteína o de lugar a otras consecuencias adversas. Es decir, un ácido nucleico o péptido de esta invención está purificado si se encuentra sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce por téenicas de DNA recombinante, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. La pureza y homogeneidad típicamente se determinan al utilizar técnicas de química analítica, por ejemplo, electroforesis en geles de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. El término “purificado” puede denotar que un ácido nucleico o proteína da origen esencialmente a una banda en un gel electroforético. Para una proteína que puede someterse a modificaciones, por ejemplo, fosforilación o glicosilación, diferentes modificaciones pueden dar lugar a diferentes proteínas aisladas, que pueden purificarse por separado.
Como se utiliza en este documento, “obtener”, como en “obtener un agente”, incluye sintetizar, comprar o adquirir de otra manera el agente.
Por “referencia” se quiere hacer referencia a una condición estándar o control. Como es aparente para un experto en la teenica, una referencia apropiada es donde un elemento se cambia con el fin de determinar el efecto del elemento.
Por “hibridar” se quiere hacer referencia a ordenar en pares para formar una molécula de doble hebra entre secuencias de polinucleótidos complementarios (por ejemplo, un gen descrito en este documento), o porciones de las mismas, bajo diversas condiciones de astringencia. (Véase, por ejemplo, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).
Por “sujeto” se quiere hacer referencia a un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, un humano o mamífero no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino.
Por “molécula de ácido nucleico objetivo” se quiere hacer referencia a un polinucleótido a analizarse. Tal polinucleótido puede ser una hebra sentido o antisentido de la secuencia objetivo. El término “molécula de ácido nucleico objetivo” también se refiere a amplicones de la secuencia objetivo original.
Se entiende que los intervalos proporcionados en este documento se abrevian para todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números, o subintervalo del grupo que consiste en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.
A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, como se utiliza en este documento, se entiende que el término “o” es incluyente. A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, como se utiliza en este documento, se entiende que los términos “un”, “una” y “el/la/los/las” son singulares o plurales.
A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, como se utiliza en este documento, se entiende que el término “aproximadamente” se encuentra dentro de un intervalo de tolerancia normal en la téenica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente puede entenderse dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% del valor indicado. A menos que de otra manera se aclare a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en este documento se modifican por el término aproximadamente.
La relación de un listado de grupos químicos en cualquier definición de una variable en este documento incluye las definiciones de esa variable como cualquier grupo único o combinación de grupos listados. La relación de una modalidad para una variable o aspecto en este documento incluye esa modalidad como cualquier modalidad única o en combinación con cualquier otra modalidad o porciones de la misma.
Cualquier composición o metodo proporcionado en este documento puede combinarse con uno o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en este documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa estructuras ejemplares de entidades de arresto de polimerasa. Negro = Secuencia estabilizante, Azul = Secuencia de reconocimiento de enzima de corte, Verde = Secuencia espadadora de enzima de corte, Rojo = Secuencia de reconocimiento específica de objetivo, A = Adenina, T = Timina, G = Guanina, C = Citosina, U = Uracilo, mX = base de RNA 2’-O-metilo. Base o bases subrayadas delinean el segmento de secuencia modificada.
Las Figuras 2A-2C representan la evaluación de un largómero sintético de intervalo analítico para DNA objetivo de Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms). Se muestran resultados ejemplares de la titulación del largómero” sintético de Cms objetivo y detección mediante una baliza fluorescente. El ensayo NEAR para Cms realizado sin ácido nucleico objetivo de entrada se indica como Control sin objetivo (NTC). La Figura 2 A es una gráfica que muestra que la señal en los Controles sin objetivo (NTC) se suprimió en las reacciones que contenían cebador/molde modificado con 2’-0-metilo. La Figura 2B es una gráfica que muestra que la Curva estándar mostró un amplio intervalo analítico al utilizar las reacciones de molde 2’-O-metilo. La Figura 2C es una comparación de datos de espectros de masas ejemplares que muestra la eliminación de productos de amplificación inespecíficos en los Controles sin objetivo (NTC) del sistema de ensayo Cms al utilizar cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo (panel derecho), en comparación con cebadores/moldes sin modificar (panel izquierdo). Para determinar el efecto de los cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo sobre la generación de productos de fondo, las muestras (10 mI) de las reacciones de Control sin objetivo representadas en la Figura 2A se analizaron mediante HPLC/Espectrometría de masas. Los datos de espectros de masas claramente se demuestran en presencia de cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo, y la presencia sólo de las especies moleculares esperadas se detectó y los productos de fondo complejos generados en presencia de cebadores/moldes sin modificar se eliminaron.
Las Figuras 3A y 3B muestran que la modificación 2’-0-metilo de los moldes/cebadores eliminó la señal de fondo en el ensayo NEAR al utilizar detección por SYBRGreen. Se muestran datos de amplificación ejemplares al utilizar cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo y la eliminación de productos de amplificación inespecíficos. La Figura 3A es una gráfica que muestra que una señal significativa se observó en los Controles sin objetivo (NTC’s), lo que indica generación de productos de fondo en ausencia de DNA objetivo. La Figura 3B es una gráfica que muestra que, las reacciones que contenían molde modificado con 2’-O-metilo, la señal en los Controles sin objetivo (NTC) se suprimió.
Las Figuras 4A y 4B muestran que la modificación 2’-0-metilo de los moldes/cebadores eliminó la señal de fondo en el ensayo NEAR al utilizar detección de Balizas moleculares. Se muestran datos de amplificación ejemplares al utilizar cebadores/moldes modificados con 2’-O-metilo y la eliminación de productos de amplificación inespecíficos. La Figura 4A es una gráfica que muestra que una señal significativa se observó en los Controles sin objetivo (NTC's), lo que indica generación de productos de fondo en ausencia de DNA objetivo. La Figura 4B es una gráfica que muestra que, las reacciones que contenían molde modificado con 2’-0-metilo, la señal en los Controles sin objetivo (NTC) se suprimió.
La Figura 5 representa entidades ejemplares de arresto de polimerasa al utilizar cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo, o relaciones de cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo pueden utilizarse para manipular el tiempo de detección y la eficiencia de la reacción, lo que de esta manera ‘afina’ las reacciones. Se muestran representaciones esquemáticas de moldes/cebadores modificados con 2 -O-metilo ejemplares para la afinación de una reacción específica, incluyendo un cebador/molde que tiene un bloque de cinco 2’-0-metil nucleótidos en el extremo 3’ (molde “Terminal”, izquierda) y un cebador/molde que tiene un bloque de cinco 2'-O-metil nucleótidos iniciando en el 3er nucleótido despues del sitio de corte (molde “Corte + 2”, derecha). Cada condición de afinación comprende relaciones específicas de moldes de avance e inverso y cada conjunto de moldes tiene estructuras variables.
La Figura 6 representa gráficas de amplificación que demuestran la utilidad de la modificación 2’-0-metilo de los moldes/cebadores para la ‘afinación’ de una reacción específica. Se muestran datos de amplificación ejemplares al utilizar cebadores/moldes modificados con 2’-0-metilo. Todas las reacciones (por duplicado) contenían 10,000 equivalentes de genoma de DNA de Cms. Cada condición de afinación representa relaciones específicas de moldes de avance e inverso y cada conjunto de moldes tiene estructuras variables. Los círculos rojos demuestran un cambio en el tiempo de detección para cada condición de afinación. Adicionalmente, la fase logarítmica de cada condición se contrajo y la pendiente de la curva se movió.
La Figura 7 representa el diseño de dos conjuntos de cebador/molde (TS3 y TS6) utilizados en un ensayo NEAR para amplificar un fragmento del gen ADH1 de maíz. La región específica de objetivo en las secuencias de los conjuntos de cebador/molde TS3 y TS6 es significativamente más larga (15 - 17 bases) que en los conjuntos de cebador/molde de los ensayos NEAR típicos (9 a 12 bases) en la téenica anterior. En el conjunto de cebador/molde TS3, el bloque de 5 nucleótidos modificados con 2’-O-metilo consecutivos, adyacentes al extremo terminal 3’ se precede por una región corriente arriba de los nucleótidos modificados con 2-O-metilo que alterna con nucleótidos sin modificar iniciando con un nucleótido modificado con 2’-0-metilo, 5 o 4 nucleótidos corriente abajo del sitio de corte, respectivamente. En contraste con TS3, hay sólo cinco nucleótidos modificados con 2’-0-metilo en cada uno de los cebadores/moldes del conjunto TS6, que forman un bloque de nucleótidos consecutivos adyacentes al nucleótido terminal 3’ sin modificar.
La Figura 8 muestra gráficas de amplificación del ensayo ADH1 al utilizar dos conjuntos de cebadores/moldes (TS3 y TS6) registrados en el canal de detección de colorante SYBRGreen.
La Figura 9 muestra las gráficas de amplificación de las mismas reacciones de ensayo registradas en el canal ROX.
La Figura 10 representa las gráficas de amplificación de las reacciones de ensayo NTC ADH1 registradas. Al comparar los resultados mostrados en las Figuras 8 y 9 se hace evidente que sólo el conjunto de cebador/molde TS3 produce el amplicón específico de ADHI, en tanto que la señal generada por el conjunto TS6 se basa en su mayor parte en la amplificación inespecífica de productos de fondo detectados sólo por SYBRgreen.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención presenta composiciones y metodos que son útiles para la cuantificación de una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción isotérmica. En modalidades particulares, la invención proporciona composiciones y métodos para la cuantificación de una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción NEAR (por ejemplo, en tiempo real).
La invención se basa, por lo menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los oligonucleótidos de cebador-molde que comprenden un nucleótido modificado en 2’ (por ejemplo, 2’-O-metilo, 2’-Fluoro) reduce o elimina la amplificación ilegítima por derivados deficientes en actividad exonucleasa 5’-3’ de la DNA polimerasa I de Bst.
Reacción NEAR.
La reacción NEAR se ha utilizado como reacción terminal que hace posible la detección no cuantitativa de oligonucleótidos objetivo. El ensayo NEAR convencional comprende (1) una molécula de ácido nucleico objetivo; (2) dos moléculas de oligonucleótidos que son análogas a las moléculas de cebadores de PCR, denominadas “molde-cebador” que comprenden cierto número de oligonucleótidos que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo y un sitio que puede escindirse por una enzima de corte; (3) varios dNTP; (4) una polimerasa deficiente en actividad exonucleasa 5-3’ de desplazamiento de hebra, y (5) una enzima de corte. Los metodos actuales para cuantificar la reacción NEAR, particularmente en tiempo real, son inadecuados en parte debido a la amplificación ilegítima de moléculas no objetivo presentes en una muestra que pueden opacar la detección de secuencias objetivo en una reacción NEAR convencional. Por ejemplo, hay una amplificación indeseable consistente en las reacciones NEAR que resulta en una señal detectable en ausencia de una molécula objetivo o con señales que no reflejan con precisión la cantidad de molécula de ácido nucleico objetivo presente en la reacción. Aunque esto hace posible la detección de un producto terminal, no hace posible un monitoreo en tiempo real de la reacción.
La presente invención proporciona oligonucleótidos de cebador/molde modificados que superan el problema de cuantificar con precisión una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción NEAR. Esto es particularmente útil para cuantificar una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción NEAR en tiempo real. La invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que los oligonucleótidos de cebador-molde que comprenden un nucleótido modificado en 2’ (por ejemplo, 2’-O-metilo, 2'-Fluoro) reduce o elimina la amplificación ilegítima sin evitar la extensión de los cebadores-moldes modificados con el fin de amplificar el producto específico. Los oligonucleótidos de cebador/molde de la invención son útiles en las reacciones NEAR que comprenden uno o más de los componentes NEAR anteriormente mencionados.
En otras modalidades, la invención hace posible oligonucleótidos de primer-molde que comprenden un nucleótido modificado en 2’ (por ejemplo, 2’-O-metilo, 2’-Fluoro) que se coloca en o adyacente al extremo terminal 3’ del cebador-molde. De manera sorprendente, los 2’-0-metil nucleótidos colocados en la región terminal 3’ de un cebador-molde no sólo comprenden sustratos de cebadores efectivos para derivados deficientes en actividad exonucleasa 5’-3’ de DNA polimerasa I de Bst en reacciones de amplificación isotermica de DNA, pero el uso de tales cebadores-moldes modificados suprime completamente la amplificación inespecífica de cebadores-dímeros. Esto es particularmente sorprendente dado que el raciocinio convencional en el campo de la amplificación isotérmica de DNA enseña que los nucleótidos modificados (por ejemplo, 2’-0-metil ribonucleótidos, ribonucleótidos sin modificar) sólo puede introducirse en la región terminal 5’ del cebador/molde lejos del extremo terminal 3’, dado que la colocación de 2’-0-metoílo, así como ribonucleótidos dentro de los 6 nucleótidos a partir del extremo terminal 3’ de un cebador, había demostrado la inhibición de la extensión de cebadores por DNA polimerasas (incluyen como referencias la solicitud de patente de Amersham y la patente de Qiagen). Los derivados deficientes en actividad exonucleasa 5’-3’ de DNA polimerasa I de Bst utilizados en NEAR y otras teenologías de amplificación isotérmica (LAMP) pertenecen a las DNA polimerasas bacterianas tipo polA implicadas en procesos de reparación de DNA de baja fidelidad de síntesis. En contraste, la replicación genómica de alta fidelidad en bacterias se cataliza por holoenzimas de DNA polimerasa III tipo DNAE y POLC, las cuales utilizan exclusivamente cebadores de RNA para iniciar la replicación de DNA. En la teenica anterior publicada, la discriminación entre cebadores de RNA y DNA se consideraba un mecanismo para prevenir la interferencia de enzimas DNA polimerasa I de alta tasa de error con la replicación genómica de alta fidelidad. En este contexto, el sorprendente descubrimiento de que derivados de DNA polimerasa I de Bst pueden utilizar de manera eficiente los ribonucleótidos modificados en 2’ como cebadores para síntesis de DNA es notable y nada intuitivo.
Diseño de cebadores-moldes Las estructuras ejemplares de entidades de arresto de polimerasa de 5’ a 3’ comprenden una secuencia estabilizante, secuencia de reconocimiento de enzima de corte, secuencia espadadora de enzima de corte y secuencia de reconocimiento específica de objetivo, y la secuencia de reconocimiento específica de objetivo comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ (por ejemplo, 2’-O-metilo, 2’-metoxietoxi, 2-fluoro, 2’-alilo, 2’-0-[2-(metilam¡no)-2-oxoetilo], 2’-hidroxilo (RNA), 4’-tio, 4’- CH2-0-2’-puente, 4’-(CH2)2-0-2’-puente, 2’-LNA y 2’-0-(N-metilcarbamato)). Sin limitarse a la teoría, se formula la hipótesis de que incorporar uno o más nucleótidos modificados en 2’ en las regiones de reconocimiento hace a esas regiones modificadas inadecuadas para servir como molde para la extensión por polimerasa en complejos intermoleculares y/o intramoleculares inespecíficos formados por interacciones de cebadores/moldes (por ejemplo, formación de cebadores-dímeros) y, en consecuencia, reduce o elimina la señal de fondo en la amplificación isotermica. El nucleótido modificado en 2’ preferiblemente tiene una base que se ordena en pares de bases con la secuencia objetivo. En modalidades particulares, dos o más nucleótidos modificados en 2’ (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos modificados en 2’) en la región de reconocimiento específica de objetivo son contiguos (por ejemplo, un bloque de nucleótidos modificados). En algunas modalidades, el bloque de nucleótidos modificados en 2’ se coloca en el extremo 3’ de la región de reconocimiento específica de objetivo. En otras modalidades, el bloque de nucleótidos modificados en 2’ se coloca en el extremo 5’ de la región de reconocimiento específica de objetivo. Cuando el bloque de nucleótidos modificados en 2’ se coloca at el extremo 5’ de la región de reconocimiento específica de objetivo, los nucleótidos modificados en 2’ pueden separarse del sitio de corte por uno o más nucleótidos sin modificar (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos sin modificar en 2’). Los solicitantes han encontrado que la colocación de uno o más nucleótidos modificados en 2’, o de un bloque de nucleótidos modificados en 2’, altera la cinética de amplificación. Cuando el o los nucleótidos modificados en 2’ o el bloque de nucleótidos modificados en 2’ se colocan en o cerca del extremo 5’ de la región de reconocimiento o proximales al sitio de corte, las reacciones amplificación en tiempo real mostraron un tiempo de detección disminuido. Adicionalmente, la curva de señal se contrajo y la pendiente de la curva se movió. Los solicitantes tambien han encontrado que, en las regiones de reconocimiento, al exceder 12 nucleótidos de longitud, un solo bloque de 5 nucleótidos modificados en 2’ consecutivos no es suficiente para suprimir la amplificación inespecífica y, por lo tanto, toda la región de reconocimiento hasta 4 o 5 nucleótidos corriente abajo del sitio de corte deben sustituirse por nucleótidos modificados en 2’ alternando con nucleótidos sin modificar.
En una modalidad relacionada, relaciones de un oligonucleótido de cebador/molde que tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ pueden utilizarse para alterar el tiempo de detección y/o la eficiencia de la reacción para la‘afinación’ de las reacciones, lo que resulta en un control predecible sobre la cinética de amplificación. Incrementar la relación de oligonucleótido de cebador/molde, que tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en el extremo 3’ de la secuencia de reconocimiento, a oligonucleótido de cebador/molde que tiene uno o más nucleótidos modificados en 2’ en el extremo 5’ de la secuencia de reconocimiento, contrae la curva de señal y mueve la pendiente de la curva. Esto es favorable para ser capaz de “afinar” una reacción, lo que proporciona un medio para manipular tanto el tiempo de detección como la eficiencia de la reacción. La cuantificación relativa al utilizar un control interno requiere que se cumplan dos importantes condiciones. Primero, es propicio ser capaz de modificar el tiempo de detección de una reacción, lo que crea una condición de reacción no competitiva. De esta manera, al afectar la reacción de control para ser detectable en un punto en el tiempo posterior (con respecto al objetivo de interes) la reacción de control no supera competitivamente el objetivo específico de interés aún cuando el objetivo de interés se encuentra en baja abundancia inicial. Segundo, para asegurar un verdadero cálculo de abundancia relativa, se requiere que las reacciones control y objetivo específico tengan eficiencias coincidentes. Al controlar la eficiencia de cada reacción al utilizar una condición de “afinación” habilita que las reacciones se hagan coincidentes, lo que hace posible cálculos satisfactorios de cuantificación relativa. La afinación de las reacciones puede utilizarse para hacer coincidir las eficiencias de la amplificación de ácidos nucleicos objetivo y amplificación nucleica de referencia (por ejemplo, estándar interno) en la PCR cuantitativa (qPCR). Adicionalmente, las curvas de amplificación del ácido nucleico objetivo y el estándar interno puede alterarse de modo que el tiempo de detección de sus productos de amplificación se separe, en tanto que se proporciona la misma eficiencia para la amplificación de ácidos nucleicos objetivo y amplificación de estándar interno. A traves del uso de combinaciones y relaciones específicas de estructuras de oligonucleótidos dentro de una reacción, es posible crear condiciones que habiliten un rendimiento de reacción afinado.
En diversas modalidades, se construyen pares de cebadores/moldes con una configuración de tallo y bucle. El extremo 5’ del oligonucleótido de cebador/molde comprende una región autocomplementaria que forma por lo menos parte del tallo. En algunas modalidades de la invención, el tallo además abarca por lo menos una porción o toda la secuencia de reconocimiento de enzima de corte. En otras diversas modalidades de la invención, la secuencia de reconocimiento de enzima de corte en los cebadores-moldes no es parte de la estructura de tallo de doble hebra, sino reside dentro del bucle de hebra sencilla en su mayor parte. Este sitio de reconocimiento de enzima de corte se enlaza en el extremo 3’ a un sitio libre de estructura secundaria que comprende un sitio de corte que se enlaza en el extremo 3’ a una secuencia que es complementaria a una secuencia objetivo. Si se desea, la secuencia que es complementaria a la secuencia objetivo puede comprender una estructura secundaria o puede estar libre de estructura secundaria. La presencia de ausencia o estructura secundaria, que puede comprender una región autocomplementaria, se determinará para optimizar el ensayo NEAR particular.
En una modalidad, los metodos de la invención proporcionan una reacción NEAR que comprende los componentes NEAR estándar, pero también comprende una enzima capaz de cortar un nucleótido de RNA cuando se presenta en una doble hebra heteróloga con una hebra de DNA complementario. En un ejemplo, el nucleótido de RNA escindido se presentará en una cadena de 4-15 nucleótidos de RNA no escindióles (es decir, O-2-Me-RNA) hacia el extremo 5’ de la región complementaria objetivo del PTO, y el extremo 3’ del oligonucleótido de molde tendrá una ‘tapa’ terminal 3’. Sólo con la hibridación apropiada completa del oligonucleótido de molde, con la molécula de escisión de doble hebra heteróloga (es decir, RNasa H) será capaz de escindir la base de RNA, lo que crea un extremo 3’ para que la enzima de traslado de corte se extienda, y permite que la reacción NEAR progrese a la terminación. La unión aberrante de moldes (dímeros de cebadores, hibridación parcial sin objetivo, etc.) no conducirá a la formación de la doble hebra heteróloga RNA-DNA y, de esta manera, previene la progresión de la reacción NEAR. Estos moldes sólo se amplificarán después de la unión a una secuencia de nucleótidos complementarios a través de la remoción de la ‘tapa’ de extensión por polimerasa 3’. Esto conducirá a un nivel incrementado de especificidad y sensibilidad de la reacción NEAR.
Los oligonucleótidos de molde de la invención se incluyen en una reacción NEAR que comprende (1) una molécula de ácido nucleico objetivo; (2) dos moleculas de oligonucleótidos de molde que comprenden cierto número de oligonucleótidos que son complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo y un sitio que puede escindirse por una enzima de corte y comprenderse de 4-15 nucleótidos de RNA, uno de los cuales es susceptible a RNasa; (3) diversos dNTP; (4) una polimerasa de desplazamiento de hebra; (5) una enzima de corte; y (6) una enzima de corte de RNA de doble hebra heteróloga DNA-RNA y una tapa de extensión por polimerasa terminal 3’. Por consiguiente, la invención proporciona un método para utilizar estos componentes para cuantificar una molécula de ácido nucleico objetivo.
El método implica poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo, bajo condiciones sustancialmente isotérmicas, con una polimerasa, dos oligonucleótidos de molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de nucleótidos objetivo, una enzima de corte, y una enzima de corte de doble hebra heteróloga DNA-RNA (por ejemplo, RNasa H) con una tapa de extensión por polimerasa terminal 3’, lo que genera un amplicón detectadle que comprende por lo menos una porción de un oligonucleótido de molde que se une a una secuencia objetivo.
Moléculas de ácido nucleico objetivo Los métodos y composiciones de la invención son útiles para la identificación de una molecula de ácido nucleico objetivo en una muestra de prueba. Las secuencias objetivo se amplifica a partir de virtualmente cualquier muestra que comprenda una molécula de ácido nucleico objetivo, incluyendo, pero sin limitarse a, muestras que comprenden hongos, esporas, virus o células (por ejemplo, procariotas, eucariotas). En modalidades específicas, las composiciones y métodos de la invención detectan Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pseudomonas syríngae pv Tomato, Xanthomonas campestris pv Vesicatoria, Alternaría spp, Cladosporium spp, Fusarium oxysporum, Verticiiium dahlia, Pseudomonas currugata, Erwina carotovora y Ralstonia solanacearum. Muestras de prueba ejemplares incluyen fluidos corporales (por ejemplo, sangre, suero, plasma, líquido amniótico, esputo, orina, líquido cefalorraquídeo, linfa, fluido lagrimal, heces o fluido gástrico), extractos de tejidos, medios de cultivo (por ejemplo, un líquido en el cual una célula, tal como una célula patógena, se ha cultivado), muestras ambientales, productos agrícolas u otros comestibles, y sus extractos, etiquetas de identificación de DNA. Si se desea, la muestra se purifica antes de su inclusión en una reacción NEAR al utilizar cualquier método estándar típicamente utilizado para aislar una molécula de ácido nucleico a partir de una muestra biológica.
En una modalidad, los oligonucleótidos de cebador/molde amplifican un ácido nucleico objetivo de un patógeno para detectar la presencia de un patógeno en una muestra. Patógenos ejemplares incluyen hongos, bacterias, virus y levaduras. Tales patógenos pueden detectarse al identificar una molecula de ácido nucleico que codifica una proteína patógena, tal como una toxina, en una muestra de prueba. Las toxinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aflatoxina, toxina del cólera, toxina diftérica, toxina de Salmonella, toxina Shiga, toxina de Clostridium botulinum, endotoxina y micotoxina. Para aplicaciones ambientales, las muestras de prueba pueden incluir agua, extractos líquidos de filtros de aire, muestras de suelo, materiales de edificación (por ejemplo, lámina de yeso, placas de techo, placa de yeso, telas, papel tapiz y recubrimientos de pisos), hisopos ambientales, o cualquier otra muestra.
En una modalidad dada a conocer en este documento, los oligonucleótidos de cebador/molde amplifican un ácido nucleico objetivo de planta, utilizado como control interno en experimentos de mejoramiento molecular orientados hacia la mejora, por ejemplo, de la resistencia de la planta a la sequía, la resistencia de la planta a los herbicidas, a la depredación por insectos dañinos. Un ejemplo de tal ácido nucleico objetivo de control interno reducido a la práctica en este documento es el gen ADH1 (alcohol deshidrogenasa 1) del maíz.
Las moléculas de ácido nucleico objetivo incluyen moléculas de ácido nucleico de doble hebra y de hebra sencilla (por ejemplo, DNA, RIMA y otros polímeros de bases nitrogenadas conocidos en la téenica, capaces de hibridar con una molecula de ácido nucleico descrita en este documento). Las moléculas de RNA adecuadas para la detección con una sonda de oligonucleótidos detectable u oligonucleótido de cebador/molde detectable de la invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas de RNA de doble hebra y de hebra sencilla que comprenden una secuencia objetivo (por ejemplo, RNA mensajero, RNA viral, RNA ribosómico, RNA de transferencia, microRNA y precursores de microRNA, y siRNA u otros RNA descritos en este documento o conocidos en la téenica). Las moléculas de DNA adecuadas para la detección con una sonda de oligonucleótidos u oligonucleótido de cebador/molde detectable de la invención incluyen, pero no se limitan a, DNA de doble hebra (por ejemplo, DNA genómico, DNA de plásmido, DNA mitocondrial, DNA viral y DNA sintético de doble hebra). Las moléculas de ácido nucleico objetivo de DNA de hebra sencilla incluyen, por ejemplo, DNA viral, cDNA y DNA sintético de hebra sencilla, u otros tipos de DNA conocidos en la técnica.
En general, una secuencia objetivo para la detección se encuentra entre 10 y 100 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nucleótidos). El contenido de GC de la molécula de ácido nucleico objetivo se selecciona para que sea menor a aproximadamente 45, 50, 55 o 60%. De ser posible, la secuencia objetivo y enzimas de corte se seleccionan de tal modo que la secuencia objetivo no contenga sitios de corte para ninguna enzima de corte que se incluirá en la mezcla de reacción.
Sondas de oligonucleótidos detectables La presente invención hace posible la detección cuantitativa de moleculas de ácido nucleico objetivo o amplicones de las mismas en una reacción NEAR ai utilizar sondas de polinucleótidos detectables que no pueden amplificarse, que comprenden por lo menos una molécula de arresto de polimerasa (por ejemplo, modificación de nucleótido u otra fracción que hace al oligonucleótido capaz de unirse a una molécula de ácido nucleico objetivo, pero incapaz de soportar extensión de molde al utilizar la sonda de oligonucleótidos detectable como objetivo). Sin querer limitarse por la teoría, la presencia de una o más fracciones que no permiten la progresión de la polimerasa probablemente dan lugar al arresto de polimerasa en adiciones de cadena principal de ácidos no nucleicos al oligonucleótido o a través de la detención de una polimerasa duplicativa (es decir, espaciador C3, bases de DNA dañadas, otra fracción de espaciador, bases O-2-Me). Estas construcciones de esta manera previenen o reducen la amplificación ilegítima de la sonda durante el curso de una reacción NEAR. Esto las distingue de las sondas de detección convencionales, que deben agregarse al final de la reacción NEAR para prevenir su amplificación.
Se ha probado que las sondas de detección convencionales son ¡mprácticas para cuantificar una reacción NEAR en tiempo real. Si se incorporan sondas de detección convencionales en la reacción NEAR, estas sondas de detección convencionales se amplifican al mismo tiempo con el objetivo. La amplificación de estas moléculas de detección enmascara la detección de amplicones objetivo legítimos debido al número de moléculas de inicio de la sonda de detección al inicio de la reacción.
La invención proporciona sondas de polinucleótidos detectables que no pueden amplificarse, que comprenden por lo menos una molécula de arresto de polimerasa. Una molécula de arresto de polimerasa de la invención incluye, pero no se limita a, una modificación de nucleótido u otra fracción que bloquea la extensión de cebador-molde por DNA polimerasas duplicativas, lo que en consecuencia previene la amplificación de moléculas de detección, pero puede permitir la apropiada hibridación o espaciamiento de nucleótidos a la molécula objetivo, o copias amplificadas de la molécula objetivo. En una modalidad, una sonda de oligonucleótidos detectable de la invención comprende un espaciador de 3 carbonos (espadador C3) que previene o reduce la amplificación legítima de una molécula de detección.
En una modalidad, la sonda de oligonucleótidos detectable de la invención es un oligonucleótido conformado en horquilla que comprende una fracción detectable. En otra modalidad, la sonda de polinucleótidos detectable que no puede amplificarse es un oligonucleótido conformado en horquilla que comprende un fluoróforo en un extremo y un colorante de extinción en el extremo opuesto. El bucle de la horquilla comprende una secuencia que es complementaria y capaz de hibridar con una secuencia objetivo. El tallo de la horquilla se forma por la alineación por temperatura de secuencias de brazos complementarios localizadas a cada lado del bucle. Un fluoróforo y una molecula de extinción se enlazan de manera covalente en extremos opuestos de cada brazo. Cuando la sonda de oligonucleótidos detectable se encuentra en la configuración de horquilla, las moléculas fluorescente y de extinción se aproximan entre sí, lo que en consecuencia conduce a la transferencia de energía de resonancia con florescencia (FRET) y extinción de la fluorescencia del fluoróforo. Cuando la sonda de oligonucleótidos detectable encuentra una molécula objetivo, la hibridación se presenta, el estructura de bucle se convierte a una conformación de doble hebra con la molécula objetivo, lo que ocasiona la separación del fluoróforo y moléculas extintoras, lo que resulta en fluorescencia (Tyagi et al. Nature Biotechnology 14: March 1996, SOS-SOS).
Las sondas de oligonucleótidos detectables son específicas para la secuencia objetivo. En una modalidad, una sonda de oligonucleótidos detectable comprende uno o más bases nucleotídicas modificadas que tienen afinidad de unión potenciada a un nucleótido complementario. Ejemplos de bases incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), 2’ Fluoro amiditas, y 2’OMe RNA amiditas (que tambien funcionan como molécula de arresto de polimerasa). Las sondas de oligonucleótidos detectables de la invención pueden sintetizarse con diferentes fluoróforos de color y pueden diseñarse para hibridar virtualmente con cualquier secuencia objetivo. En vista de su notable especificidad, una sonda de polinucleótidos detectable que no puede amplificarse de la invención se utiliza para detectar una sola molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra, o se utiliza en combinación con sondas de oligonucleótidos detectables, cada una de las cuales se une a una molécula de ácido nucleico objetivo diferente. Por consiguiente, las sondas de polinucleótidos detectables que no pueden amplificarse de la invención pueden utilizarse para detectar una o más moléculas de ácido nucleico objetivo en la misma reacción, lo que permite que estos objetivos se cuantifiquen de manera simultánea. La presente invención abarca el uso de tales fluoróforos en relación con las sondas de oligonucleótidos detectables descritas en este documento.
Uso de sondas de polinucleótidos detectables que no pueden amplificarse Las sondas de polinucleótidos detectables que no pueden amplificarse son útiles en métodos para cuantificar una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción de amplificación por corte y extensión (NEAR). El metodo implica poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de nucleótidos objetivo, una enzima de corte, y la sonda de oligonucleótidos detectable en presencia de un regulador adecuado y diversos dNTP; generar amplicones que comprenden por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y determinar el nivel de molécula de ácido nucleico objetivo presente en la reacción al cuantificar la sonda de oligonucleótidos que híbrida con la molécula de ácido nucleico objetivo en tiempo real durante la reacción, con base en la intensidad de fluorescente de las moléculas de sonda en la reacción. De manera favorable, tales métodos son útiles para monitorear la NEAR en tiempo real.
En general, las sondas de polinucleótidos detectables que no pueden amplificarse de la invención se incluyen en una reacción NEAR que comprende (1) una molécula de ácido nucleico objetivo; (2) dos moléculas de oligonucleótidos de molde que comprenden cierto número de oligonucleótidos que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo y un sitio que puede escindirse por una enzima de corte; (3) diversos dNTP; (4) una polimerasa de desplazamiento de hebra; y (5) una enzima de corte. Por consiguiente, la invención proporciona un método para utilizar estos componentes para cuantificar una molecula de ácido nucleico objetivo.
Ensayos NEAR La invención hace posible la detección de moléculas de ácido nucleico objetivo amplificadas en un ensayo NEAR. Tales ensayos se conocen en la téenica y se describen en este documento. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2009/0081670, Solicitud de PCT 2009/012246, y Patentes de E.U. Nos. 7,112,423 y 7,282,328, cada una de los cuales se incorpora en este documento en su totalidad. Las polimerasas útiles en los métodos descritos en este documento son capaces de catalizar la incorporación de nucleótidos para extender un extremo terminal hidroxilo 3’ de un oligonucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido de cebador/molde u otro cebador) unido a una molécula de ácido nucleico objetivo. Tales polimerasas incluyen las que son termófilas y/o las capaces de desplazamiento de hebra. Las polimerasas útiles en los métodos descritos en este documento carecen de actividad exonucleasa 5’-3’, lo que de otra manera puede degradar la hebra de ácido nucleico de hebra sencilla desplazada. La polimerasa también tiene actividad transcriptasa inversa (por ejemplo, derivados de DNA polimerasa de Bst (fragmento grande), DNA polimerasa Therminator, DNA polimerasa Therminator II). Las polimerasas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos grandes de Bst de la DNA polimerasa I de Bst, DNA polimerasa I de E. coli (fragmento Klenow), fragmento Klenow (exonucleasa 3’-5’), DNA polimerasa T4, DNA polimerasa T7, (exo) DNA Polimerasa Deep VentR., DNA Polimerasa Deep VentR, Therminator, DNA Polimerasa Therminator II, DNA Polimerasa AmpliTherm, DNA polimerasa SP6. Los siguientes ejemplos no limitantes de Transcriptasas inversas (RT) pueden utilizarse en las reacciones del presente metodo para mejorar el rendimiento cuando se detecta una secuencia de RNA: OmniScript (Qiagen), SensiScript (Qiagen), MonsterScript (Epicentre), Transcriptor (Roche), HIV RT (Ambion), Superscript III (Invitrogen), ThermoScript (Invitrogen), Thermo-X (Invitrogen), ImProm II (Promega).
Una enzima de corte se une a una secuencia de reconocimiento en DNA de doble hebra y escinde una hebra de una hélice de doble hebra. Las enzimas de corte pueden escindir ya sea corriente arriba o corriente abajo de su sitio de reconocimiento o dentro del sitio de reconocimiento de la enzima. Para los métodos dados a conocer en este documento, sólo las enzimas de corte que escinden la hebra superior corriente abajo del sitio de reconocimiento pueden utilizarse para iniciar ciclos repetitivos de corte de DNA sustrato y extensión por corte por la polimerasa para impulsar la amplificación exponencial del fragmento nucleico objetivo entre los cebadores-moldes. Idealmente, la enzima de corte es funcional bajo las mismas condiciones de reacción que la polimerasa. En una modalidad preferida de la invención, la enzima de corte es termoestable y activa entre 50 °C y 60 °C. Las enzimas de corte ejemplares útiles para los métodos dados a conocer en este documento incluyen, pero no se limitan a, Nt.BspQI(NEB), Nt.BspD6l, Nt.BsmAI(NEB), Nt.Alwl(NEB), Nt.BbvCI(NEB), N.Bst9l(Sibenzyme) y Nt.BstNBI(NEB).
Una reacción NEAR típicamente comprende nucleótidos, tales como, por ejemplo, trifosfatos de didesoxirribonucleósidos (dNTPs). La reacción también puede llevarse a cabo en presencia de los dNTP que comprenden una fracción detectable incluyendo, pero sin limitarse a, una radioetiqueta (por ejemplo, 32P, 33P, 125l, 35S), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina), una etiqueta fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC)), biotina, avidina, digoxigenina, antígenos, haptenos o fluorocromos. La reacción NEAR además comprende ciertas sales y reguladores que hacen posible la actividad de la enzima de corte y polimerasa.
De manera favorable, la reacción NEAR se lleva a cabo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas donde la temperatura de la reacción es más o menos constante durante el curso de la reacción de amplificación. Dado que la temperatura no necesita cielarse entre una temperatura superior y una temperatura inferior, la reacción NEAR puede llevarse a cabo bajo condiciones donde puede ser difícil llevar a cabo la PCR convencional. Típicamente, la reacción se lleva a cabo a aproximadamente entre 35 °C y 90 °C (por ejemplo, 35, 37, 42, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 °C). De manera favorable, no es esencial que la temperatura se mantenga con un gran grado de precisión. Cierta variabilidad en la temperatura es aceptable.
Modificadores de temperatura de fusión (Tm) y velocidad de reacción tambien pueden utilizarse para reducir la temperatura de fusión de los oligonucleótidos, tales como (pero sin limitarse a) etilenglicol y glicerol. Además, pueden utilizarse modificadores de velocidad de reacción de DNA polimerasa (tal como la concentración de dNTP y magnesio) para alterar la velocidad de reacción para conducir a una mayor precisión de cuantificación.
Esta invención proporciona métodos para monitorear una reacción NEAR en tiempo real, al utilizar una estrategia de amplificación NEAR, como se describe anteriormente y en las patentes US007112423B2 y US20090017452A1. En una modalidad, la NEAR cuantitativa utiliza amplificación de ácidos nucleicos objetivo junto a una amplificación de control de cantidad conocida. La cantidad de ácido nucleico objetivo puede calcularse como cuantificación absoluta o cuantificación relativa (semicuantitativa) con base en la fuente del control (control exógeno o endógeno).
La cuantificación de la secuencia de nucleótidos desconocida puede lograrse a través de la comparación de amplificación de umbral logarítmico del desconocido con una serie de secuencias objetivo conocidas en un conjunto separado de reacciones o en la misma reacción, o como producto de coamplificación endógeno o exógeno interno que produce un valor de umbral, indicativo de un resultado positivo (si el desconocido excede el umbral) o resultado negativo (si el desconocido no excede el umbral).
Aplicaciones La presente invención hace posible el monitoreo en tiempo real de la reacción NEAR de amplificación isotermica que puede proporcionar una medida cuantitativa de la cantidad del ácido nucleico objetivo de inicio. Las composiciones y métodos de la invención son útiles en diagnóstico en humanos, donde se desea una rápida respuesta cuantitativa (por ejemplo, amplificación detectable por debajo de 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 min o menos). En modalidades particulares, la invención hace posible el uso de ensayos de reacciones NEAR en diagnóstico en humanos en entornos clínicos. En otras modalidades, la invención hace posible el uso de ensayos de reacciones NEAR en trabajo de campo diagnóstico, donde el acceso a equipo de ciclos térmicos no está disponible o puede ser extremadamente costoso. Aún en otras modalidades, la invención hace posible el uso de ensayos de reacciones NEAR en un entono académico donde se desean rápidas respuestas cuantitativas.
Equipos La invención tambien proporciona equipos para la amplificación de una molécula de ácido nucleico objetivo. Tales equipos son útiles para la detección o cuantificación de un ácido nucleico objetivo en una muestra biológica obtenida de un sujeto. Los equipos de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, una o más polimerasas, cebadores-moldes de avance e inversos, y una o más enzimas de corte, como se describe en este documento. En casos donde debe amplificarse un objetivo, una o dos enzimas de corte pueden incluirse en el equipo. En casos donde se amplificarán múltiples secuencias objetivo, y los cebadores-moldes diseñados para esas secuencias objetivo comprenden los sitios de enzima de corte para la misma enzima de corte, entonces puede incluirse una o dos enzimas de corte. En casos donde los cebadores-moldes se reconocen por diferentes enzimas de corte, más enzimas de corte pueden incluirse en el equipo, tales como, por ejemplo, 3 o más.
En un aspecto, la invención proporciona un equipo para amplificación de ácidos nucleicos, que comprende una DNA polimerasa, un cebador-molde principal, un cebador-molde secundario, una enzima de corte con especificidad para un sitio de reconocimiento de enzima de corte dentro de los cebadores-moldes, y trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP) (por ejemplo, en una solución regulada que contiene componentes suficientes para la amplificación). En diversas modalidades, el cebador-molde principal y cebador-molde secundario tienen, cada uno, una secuencia de región de reconocimiento específica de extremo 3’ complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia objetivo, donde la región de reconocimiento específica de extremo comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’, una secuencia de extremo 5’ que contiene un sitio de reconocimiento de enzima de corte corriente arriba de las secuencias de regiones de reconocimiento específicas de extremo 3’, y una secuencia estabilizante corriente arriba (5’) del sitio de unión de enzima de corte.
En un aspecto, los equipos de la presente invención comprenden una mezcla homogenea de todos los componentes de reacción NEAR, incluyendo, pero sin limitarse a, diversos dNTP, cebadores-moldes de avance e inversos, enzima de corte, polimerasa, una sonda de polinucleótidos detectadle específica de objetivo, regulador de reacción y estabilizantes, excepto el ácido nucleico objetivo.
Los equipos de la presente invención también pueden comprender uno o más de los componentes en cualquier número de recipientes separados, paquetes, tubos (por ejemplo, < 0.2 mi, 0.2 mi, 0.6 mi, 1.5 mi, 5.0 mi, > 5.0 mi), viales, placas de microtitulación (por ejemplo, < 96 pozos, 96 pozos, 384 pozos, 1536 pozos, > 1536 pozos), ArrayTape, y similares, o los componentes pueden combinarse en diversas combinaciones en tales recipientes. En diversas modalidades, el equipo además comprende un par de oligonucleótidos de cebador-molde capaces de unirse y amplificar una secuencia de referencia. Todavía en otras modalidades, el equipo comprende un recipiente esteril que contiene los oligonucleótidos de cebador-molde, y tales recipientes pueden ser cajas, ampolletas, botellas, viales, tubos, bolsas, sacos, blísteres, u otra forma de recipiente adecuado conocido en la téenica. Tales recipientes pueden elaborarse de plástico, vidrio, papel laminado, lámina metálica, u otros materiales adecuados para alojar ácidos nucleicos.
Los componentes del equipo, por ejemplo, pueden presentarse en uno o más recipientes, por ejemplo, todos los componentes pueden estar en un recipiente o, por ejemplo, las enzimas pueden estar en un recipiente separado de los moldes. Los componentes, por ejemplo, pueden secarse (por ejemplo, residuo seco), liofilizarse (por ejemplo, pasta seca) o en un regulador estable (por ejemplo, químicamente estabilizado, térmicamente estabilizado). Los componentes secos, por ejemplo, pueden prepararse por liofilización, vacío y secado ayudado por fuerza centrífuga y/o secado ambiental. En diversas modalidades, la polimerasa y enzimas de corte se encuentran en forma liofilizada en un solo recipiente, y los moldes se liofilizan, deshidratan por congelación, o están en regulador, en un recipiente diferente. En algunas modalidades, la polimerasa, enzimas de corte y los moldes se encuentran en forma liofilizada, en un solo recipiente. En otras modalidades, la polimerasa y la enzima de corte pueden separarse en diferentes recipientes.
Los equipos además pueden comprender, por ejemplo, diversos dNTP utilizados en la reacción, o nucleótidos modificados, cubetas u otros recipientes utilizados para la reacción, o un vial de agua o regulador para rehidratar componentes liofilizados. El regulador utilizado, por ejemplo, puede ser apropiado para la actividad polimerasa y de enzima de corte.
Los equipos de la presente invención tambien pueden comprender instrucciones para realizar uno o más métodos descritos en este documento y/o una descripción de una o más composiciones o reactivos descritos en este documento. Las instrucciones y/o descripciones pueden estar en forma impresa y pueden incluirse en un prospecto de equipo. Un equipo también puede incluir una descripción escrita de una ubicación de Internet que proporciona tales instrucciones o descripciones.
Los equipos además pueden comprender reactivos utilizados para los métodos de detección (por ejemplo, en tiempo real o terminal) tales como, por ejemplo, sondas de hibridación o colorantes de unión a DNA. Los equipos además pueden comprender reactivos utilizados para los métodos de detección, tales como, por ejemplo, reactivos utilizados para FRET, dispositivos de flujo lateral, varillas graduadas, colorante fluorescente, partículas de oro coloidal, partículas de látex, una baliza molecular o cuentas de poliestireno. Los componentes de detección pueden incorporarse en un dispositivo de flujo lateral. El dispositivo de flujo lateral puede utilizarse en un laboratorio móvil.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, téenicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales se encuentra de manera suficiente dentro del campo de acción del experto. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshncy, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, como tales, pueden considerarse en la elaboración y práctica de la invención. Las técnicas particularmente útiles para las modalidades particulares se discutirán en las secciones que aparecen a continuación.
Los siguientes ejemplos se proponen con el fin de ofrecer a los expertos en la técnica una descripción y descripción completas de cómo hacer y usar el ensayo, selección y métodos terapéuticos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención.
EJEMPLOS Actualmente, la reacción NEAR se utiliza para detectar rápidamente y de manera isotérmica la presencia o ausencia de un oligonucleótido objetivo en una muestra. Debido a limitaciones téenicas, los métodos NEAR convencionales son inadecuados para cuantificar oligonucleótidos objetivo en tiempo real debido, por lo menos en parte, a la amplificación ilegítima de moléculas no objetivo en la muestra, lo que opaca la detección y cuantificación precisa de amplicones objetivo. La presente invención proporciona composiciones y métodos que superan estas limitaciones al proporcionar cebadores/moldes detectables que no son susceptibles a una amplificación ilegítima. En una modalidad, un ensayo NEAR cuantificable emplea un cebador que comprende una o más modificaciones 2’-O-Me, que previene o reduce la amplificación ilegítima de moléculas no objetivo durante la reacción NEAR. Actualmente, el diseño de ensayos de amplificación NEAR se limita a regiones muy cortas dentro del ácido nucleico objetivo que tienen por lo menos un sitio de reconocimiento de enzima de corte que se presenta en la naturaleza en estrecha cercanía. La síntesis por desplazamiento de hebra iniciada a partir de este sitio de corte proporciona moléculas de DNA objetivo de hebra sencilla a las cuales los cebadores-moldes con regiones específicas de objetivo cortas pueden unirse e iniciar los ciclos de reacciones de amplificación de objetivos por corte/extensión por polimerasa. La presente invención proporciona composiciones y métodos que superan esta limitación al utilizar cebadores-moldes con regiones específicas de objetivo más largas que, por lo tanto, son capaces de invasión de hebra entre 50 °C a 60 °C durante la primera fase de la reacción de amplificación sin la asistencia de una síntesis por desplazamiento de hebra. Las regiones específicas de objetivo más largas en los cebadores-moldes provienen con la desventaja de proporcionar más bienes inmuebles para formar híbridos de DNA inespecíficos con extremos 3’ extensibles que pueden iniciar la síntesis de productos de amplificación inespecíficos. Las composiciones en la presente invención mitigan esa desventaja al extender la colocación de nucleótidos modificados en 2’ más allá de un bloque terminal 3’ de cinco nucleótidos modificados consecutivos para cubrir toda la región específica de objetivo al utilizar una secuencia alterna de nucleótidos modificados en 2’ y sin modificar.
Ejemplo 1: Los oligonucleótidos de cebador-molde que comprenden 2’-O-metil nucleótidos reducen o eliminan la señal de fondo en la amplificación NEAR.
Cuando la amplificación NEAR se realiza sin ácido nucleico objetivo de entrada (es decir, Controles sin objetivo; NTC), la señal se genera a pesar de la ausencia de molde. De esta manera, la generación de señal de fondo tiene el potencial de disminuir la exactitud de la cuantificación de ácidos nucleicos objetivo al utilizar la amplificación NEAR. Se formuló la hipótesis de que la señal de fondo se generó, en parte, por la formación de cebadores-dímeros por oligonucleótidos de cebador/molde.
Sin limitarse a la teoría, las estructuras de arresto de polimerasa que comprenden nucleótidos modificados 2’ puede utilizarse para reducir o eliminar interacciones intermoleculares y/o intramoleculares de cebadores/moldes (por ejemplo, formación de cebadores-dímeros) y, en consecuencia, reducir o eliminar la señal de fondo en el ensayo NEAR.
Las estructuras ejemplares de entidades de arresto de polimerasa de 5’ a 3’ comprenden una secuencia estabilizante, secuencia de reconocimiento de enzima de corte, secuencia espadadora de enzima de corte y secuencia de reconocimiento específica de objetivo, y la secuencia de reconocimiento específica de objetivo comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ (por ejemplo, 2’-0-metil ribonucleótidos). En casos donde dos o más nucleótidos modificados en 2’ se presentan en la secuencia de reconocimiento específica de objetivo, los nucleótidos modificados en 2’ pueden ser contiguos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos modificados en 2’). La titulación de la molécula de DNA objetivo de doble hebra sintética de Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms) se evaluó al utilizar detección mediante una baliza fluorescente. El DNA objetivo se diluyó de manera seriada a partir de una solución de reserva de un‘largómero’ de DNA de 250 pares de bases sintetizado DNA que se diseñó con la secuencia objetivo y un solo sitio de corte.
La señal en los Controles sin objetivo (NTC) se suprimió en las reacciones que contenían molde modificado con 2’-O-metilo (Figura 2A).
La Curva estándar mostró un amplio intervalo analítico al utilizar las reacciones de molde 2’-0-metilo (Figura 2B). Las muestras (10 mI) de las reacciones de Control sin objetivo se analizaron mediante HPLC/Espectrometría de masas y se confirmó la supresión de productos de amplificación de fondo (Figura 2C). Los espectros derivados de las reacciones al utilizar oligonucleótidos sin modificar mostraron un espectro complejo compuesto de múltiples productos de amplificación derivados de productos de fondo inespecíficos en conjunto con moldes sin reaccionar (Figura 2C, panel izquierdo). Los espectros derivados de reacciones al utilizar oligonucleótidos modificados con 2’-0-metilo mostraron un espectro simple compuesto de moldes sin reaccionar sin presencia de productos de fondo inespecíficos (Figura 2C, panel derecho).
Para estudiar el efecto de las reacciones que contienen moldes modificados con 2’-O-metilo en la amplificación de una muestra biológica, DNA genómico de Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms) se utilizó como DNA objetivo. Los productos amplificados se detectaron por SYBRgreen, que detecta DNA de doble hebra (Figuras 3A y 3B) o Balizas Moleculares, que detectaron un producto específico (Figuras 4A y 4B). Reacciones estándar se llevaron a cabo con moldes de oligonucleótidos de DNA (Figuras 3A y 4A) y reacciones que contienen moldes modificados con 2’-0-metilo (DNAble), y las reacciones se llevaron a cabo con oligonucleótidos que contenían un bloque de 5 2’-0-metil nucleótidos contiguos en el extremo 3’ en la secuencia de reconocimiento específica de objetivo (Figuras 3B y 4B). La señal en los Controles sin objetivo (NTC) se suprimió en las reacciones que contenían moldes modificados con 2’-0-metilo (Figuras 3B y 4B) mientras que una señal significativa se observa en los Controles sin objetivo (NTC) (Figuras 4A y 4B) lo que indica generación de producto de fondo en ausencia de DNA objetivo.
De esta manera, estos resultados indican que los cebadores que comprenden 2’-0-metil nucleótidos reducen o eliminan la señal de fondo en la amplificación NEAR.
Ejemplo 2: Colocación de 2’-O-metil nucleótidos en oligonucleótidos de cebador/molde y tiempo de detección y eficiencia alterados de reacciones NEAR.
Entidades de arresto de polimerasa ejemplares que tienen nucleótidos modificados con 2’-0-metilo en diferentes posiciones dentro de la región de especificidad se utilizaron en reacciones de amplificación NEAR y se estudió su cinetica de reacción. En particular, los cebadores/moldes estudiados incluyeron un par de oligonucleótidos que tenían un bloque de cinco 2’-0-metil nucleótidos colocados en el extremo 3’ de la región de especificidad o en el extremo 5’ de la región de especificidad (2 nucleótidos corriente abajo del sitio de corte) (Figura 5). Reacciones estándar se llevaron a cabo por duplicado con un bloque de 2’-O-metil nucleótidos en el extremo 3’ o al iniciar en el 3er nucleótido después del sitio de corte y continuando por 5 bases o una mezcla de estas dos estructuras como se indica. El DNA objetivo fue genómico de Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms). La detección se basó en Baliza molecular a una concentración final de 100 nM.
Las entidades modificadoras de velocidad de reacción que tienen nucleótidos modificados con 2’-0-metilo en diferentes posiciones dentro de la región de especificidad del oligonucleótido de cebador/molde mostraron diferente cinética de amplificación (Figura 6). Las reacciones, al utilizar cebadores/moldes que tienen un bloque de cinco 2’-0-metil nucleótidos en el extremo 3’, mostraron un tiempo de detección disminuido (molde “Terminal”; 170 s) en comparación con cebadores/moldes que tienen un bloque de cinco 2’-O-metil nucleótidos al iniciar en el 3er nucleótido después del sitio de corte (molde “Corte + 2”; 430 s). De esta manera, se formuló la hipótesis de que las relaciones de los dos oligonucleótidos de cebador/molde pueden utilizarse para manipular el tiempo de detección y/o la eficiencia de la reacción para la ‘afinación’ de reacciones. Las reacciones con relaciones variables de molde “Terminal”: molde “Corte+ 2” mostraron un tiempo de detección intermedio entre el de los dos moldes (Figura 6). Adicionalmente, con una relación creciente de molde “Terminal”:molde “Corte + 2”, la curva se contrajo y la pendiente de la curva se movió. De esta manera, se demostró que la colocación de nucleótidos modificados en 2’ en oligonucleótidos de cebadores/moldes y las relaciones de oligonucleótidos de cebadores/moldes con nucleótidos modificados en 2’, colocados de manera diferencial, alteró el tiempo de detección y eficiencia de las reacciones NEAR. La invención se basa, por lo menos en parte, en estos descubrimientos.
Ejemplo 3: Supresión completa de amplificación inespecífica en ensayos NEAR al utilizar cebadores-moldes con regiones específicas de objetivo largas Un ensayo NEAR para la cuantificación del gen de alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1) de maíz se diseñó al utilizar dos conjuntos alternativos de cebadores-moldes de avance e inversos (TS3 y TS3). No pudo localizarse un sitio de reconocimiento de enzima de corte adecuado dentro de 500 nucleótidos corriente arriba o corriente abajo a partir de la región de secuencia objetivo en gDNA de maíz. Ambos conjuntos de cebadores-moldes presentan regiones complementarias de objetivo más largas (16 y 19 nucleótidos, respectivamente) capaces de hibridación mediada por invasión de hebra con el DNA objetivo. En el primer conjunto (TS3) las regiones complementarias de objetivo de los cebadores-moldes de avance e inversos contienen un bloque de 5 ribonucleótidos modificados con 2’-O-metilo consecutivos inmediatamente corriente arriba a partir del desoxinucleótido terminal 3’. El resto de la región complementaria de secuencia objetivo comprende una secuencia de desoxinucleótidos sin modificar alternantes y 2’-0-metil ribonucleótidos iniciando cinco nucleótidos (cebador-molde de avance) o cuatro nucleótidos (cebador-molde inverso) corriente abajo del sitio de corte. El segundo conjunto (TS6) de cebadores-moldes presenta sólo un bloque de cinco 2’-0-metil ribonucleótidos adyacentes al desoxinucleótido sin modificar terminal 3’, en tanto que el resto de la región complementaria objetivo comprende sólo desoxinucleótidos sin modificar.
Reacciones NEAR de diez microlitros se constituyeron en Tris 50 mM pH 8.0, (NH4)2S04 15 mM, Na2S04 15 mM y MgSC>4 15 mM al utilizar 3.84 U de DNA polimerasa 1 de Bst Warmstart 2.0 (NEB), 10K copias de DNA objetivo de ADH1 de maíz sintetico, dNTP 0.3 mM, 3 U de enzima de corte Nt.BstNBI, sonda de baliza molecular ADH1 etiquetada con ROX/B HQ 200 nM, colorante SYBRgreen 0.5 X (LifeTechnologies), cebador-molde inverso TS3 o TS6 1000 nM y cebador-molde de avance TS3 o TS6 100 nM. Un conjunto de reacciones de control de DNA no objetivo (NTC) se constituyó de los mismos componentes sin el DNA objetivo de ADH1 de maíz sintético. Todas las reacciones se incubaron a 56 °C durante 15 minutos y las señales de fluorescencia se registraron a 520 nm (SYBRgreen) y 610 nm (ROX).
Se compararon las gráficas de amplificación de las reacciones que contenían DNA objetivo en los canales de detección de SYBRgreen (Figura 8) y ROX (Figura 9) con las gráficas de amplificación de las reacciones NTC en el canal de detección de SYBRgreen (Figura 10) Los resultados reportados en este documento se obtuvieron al utilizar los siguientes métodos y materiales, a menos que se indique de otra manera.
Reacciones de amplificación NEAR.
Las reacciones (50 mI) contenían MgSÜ4 15 mM, dNTP 0.3 mM, 19.2 unidades de Polimerasa Bst, 15 unidades de n.BstNBI, molde 1 1000 nM y molde 2 200 nM. El DNA objetivo fue genómico de Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms) o un “largómero” basado en secuencias de Cms. Los moldes y objetivo se preincubaron en conjunto a 56 °C durante 30 segundos en un volumen total de 10 pl. La mezcla principal de los componentes de reacción restantes se preincubó a 56 °C durante 30 segundos en un volumen total de 40 mI. La mezcla principal se combinó con los moldes y objetivo, y se incubó a 56 °C durante 10 minutos con detección fluorescente (SYBRGreen o Balizas moleculares) recolectada cada 10 segundos durante la incubación. Las reacciones se‘inactivaron por calor’ con una etapa de 2 minutos a 95 °C, seguido por un retorno a temperatura ambiente. Se determinaron equivalentes de umbral de ciclo (Ct) para cada reacción con base en una fórmula de ajuste de curva en el software Biorad IQ5 y los valores se representaron en una gráfica al utilizar Microsoft Excel. Una regresión lineal se llevó a cabo y se determinó un Coeficiente de correlación (R2).
Otras modalidades A partir de la descripción precedente, será obvio que pueden hacerse variaciones y modificaciones a la invención descrita en este documento para adaptarla a diversos usos y condiciones. Tales modalidades también se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
La relación de un listado de elementos, en cualquier definición de una variable en este documento, incluye las definiciones de esa variable como cualquier elemento o combinación (o subcombinacuión) únicos de los elementos listados. La relación de una modalidad en este documento incluye esa modalidad como cualquier modalidad única o en combinación con cualquier otra modalidad o porciones de la misma.
Esta solicitud puede relacionarse con la Solicitud de Patente International No. PCT/US2011/047049, presentada el 9 de agosto de 2011, que reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U. No. 61/373,695, presentada el 13 de agosto de 2010, cuyos contenidos completos se incorporan en este documento para referencia.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en este documento para referencia, en la misma magnitud como si cada patente y publicación independiente se indicara incorporada, específica e individualmente, para referencia.

Claims (49)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para cuantificar un producto específico en una reacción de amplificación por corte y extensión, el método comprende: (a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte y una sonda de polinucleótidos detectable, en donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo; (b) generar amplicones que comprenden por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y (c) detectar una señal específica para la hibridación de sondas de oligonucleótidos con la molécula de ácido nucleico objetivo o amplicón de la misma, en donde la señal indica la cantidad de la molécula de ácido nucleico objetivo presente en la muestra, o un amplicón de la misma.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la modificación 2’ se selecciona del grupo que consiste en 2’-O-metilo, 2 -metoxietoxi, 2’-fluoro, 2’-hidroxilo, 2’-alilo, 2’-0-[2-(metilam¡no)-2-oxoetilo], 4’-tio, 4’-CH2-O-2’-puente, 4’-(CH2)2-0-2’-puente, 2’-LNA y 2’-0-(N-metilcarbamato) o los que comprenden análogos de bases.
3. El metodo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el o los nucleótidos modificados en 2’ se colocan en el extremo 3’ de la secuencia complementaría a la molécula de ácido nucleico objetivo.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el o los nucleótidos modificados en 2’ se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el o los nucleótidos modificados en 2’, colocados en el extremo terminal 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo, se separan del sitio de corte en 1, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos sin modificar.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dos o más nucleótidos modificados en 2’ son contiguos.
7. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde 5 nucleótidos modificados con 2’-0-metilo se colocan en el extremo 3’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo.
8. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde 5 nucleótidos modificados con 2’-O-metilo se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa de detección no detecta un amplicón de una molécula no objetivo.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el método se lleva a cabo en tiempo real.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el método proporciona un método semicuantitativo y/o de cantidad umbral para determinar la cantidad de molécula de ácido nucleico presente en una muestra biológica antes de la amplificación.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde colocar el o los nucleótidos modificados en 2’ más cerca del extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo, incrementa el tiempo de detección de la amplificación.
13. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que además comprende el uso de relaciones de oligonucleótidos de cebador/molde para proporcionar una resolución incrementada de los productos de reacción, que resulta de cantidades diferentes de material objetivo de inicio.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que además comprende el uso de un modificador de tasa de amplificación para proporcionar una resolución incrementada de los productos de reacción, que resulta de cantidades diferentes de material objetivo de inicio.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la molécula de ácido nucleico objetivo es una molécula de ácido nucleico de DNA o RNA.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la sonda es SYBRgreen o una Baliza molecular.
17. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la sonda es una sonda de polinucleótidos detectadle que no puede amplificarse, que comprende por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos que son complementarios a una secuencia objetivo, una fracción detectable, y una molécula de arresto de polimerasa, en donde la molécula de arresto de polimerasa previene que una polimerasa amplifique la sonda bajo condiciones que de otra manera soportan la actividad polimerasa.
18. Un método para detectar una pluralidad de productos de reacción distintos, producidos en el transcurso de una sola reacción, el método comprende: (a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte y una sonda de polinucleótidos detectable, en donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo; (b) generar amplicones que comprenden por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y (c) detectar una señal específica para la hibridación de sondas de oligonucleótidos con la molecula de ácido nucleico objetivo o amplicón de la misma, en donde la señal indica la cantidad de la molécula de ácido nucleico objetivo presente en la muestra, o un amplicón de la misma.
19. Un método para cuantificar un producto específico en una reacción de amplificación por corte y extensión, el método comprende: (a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte y una sonda de polinucleótidos detectable, en donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde comprende 5 nucleótidos modificados con 2’-O-metilo contiguos se colocan en el extremo 3’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo; (b) generar amplicones que comprenden por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y (c) detectar una señal específica para la hibridación de sondas de oligonucleótidos con la molécula de ácido nucleico objetivo o amplicón de la misma, en donde la señal indica la cantidad de la molécula de ácido nucleico objetivo presente en la muestra, o un amplicón de la misma.
20. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la etapa (c) se lleva a cabo en tiempo real para determinar la cantidad de objetivo presente en la reacción.
21. Un método para monitorear, en tiempo real, una reacción de amplificación por corte y extensión, el método comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte y una sonda de polinucleótidos detectable, en donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas; (b) generar amplicones que comprenden por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo; y (c) detectar una señal en tiempo real, lo que en consecuencia cuantifica la o las moléculas de ácido nucleico objetivo.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21 , en donde la muestra de prueba comprende un patógeno.
23. El metodo de conformidad con la reivindicación 22, en donde el patógeno es un virus, bacteria, levadura u hongo.
24. El método de conformidad con la reivindicación 21, en donde la muestra de prueba es una muestra biológica.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde la muestra biológica es un fluido biológico, célula o muestra de tejido.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el fluido biológico es orina, semen, secreción vaginal o heces.
27. El método de conformidad con la reivindicación 21, en donde la muestra de prueba es una muestra ambiental.
28. El método de conformidad con la reivindicación 21, en donde la etapa (c) se lleva a cabo en tiempo real.
29. Un método para monitorear, en tiempo real, una molécula de ácido nucleico objetivo en una reacción NEAR, que comprende: (a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, una enzima de corte específica de doble hebra heteróloga y una sonda de polinucleótidos detectable, en donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo; (b) generar amplicones que comprenden una secuencia objetivo que se une a la sonda de oligonucleótidos detectable; y (c) detectar una señal en tiempo real, lo que en consecuencia cuantifica la molécula de ácido nucleico objetivo.
30. Un método para monitorear, en tiempo real, una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra de prueba, el método comprende: (a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones sustancialmente isotérmicas con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos de cebador/molde, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo, una enzima de corte, una enzima de reparación o enzima de revisión y corrección y una sonda de polinucleótidos detectable, en donde cada uno de los oligonucleótidos de cebador/molde comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo; (b) generar amplicones que comprenden una secuencia objetivo que se une a la sonda de oligonucleótidos detectable; y (c) detectar una señal en tiempo real, lo que en consecuencia cuantifica la molécula de ácido nucleico objetivo.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la muestra de prueba comprende un patógeno.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, en donde el patógeno es un virus, bacteria, levadura u hongo.
33. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la muestra de prueba es una muestra biológica.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde la muestra biológica es un fluido biológico, célula o muestra de tejido.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, en donde el fluido biológico es orina, semen, secreción vaginal o heces.
36. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la muestra de prueba es una muestra ambiental.
37. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la etapa (c) se lleva a cabo en tiempo real.
38. Un equipo para detectar una secuencia objetivo en una reacción NEAR, el equipo comprende uno o más oligonucleótidos de cebador/molde, que se unen específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de ácido nucleico objetivo y comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’ en la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo, y direcciones para el uso del oligonucleótido de cebador/molde en los métodos de la invención.
39. Un oligonucleótido aislado que comprende, de 5’ a 3’, i) una primera región, y ii) una segunda región, en donde la primera región comprende una secuencia de reconocimiento de enzima de corte; en donde la segunda región comprende por lo menos 9 nucleótidos que se unen específicamente a una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico objetivo; y en donde la segunda región comprende uno o más nucleótidos modificados en 2’.
40. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 36, en donde la modificación 2’ se selecciona del grupo que consiste en 2’-O-metilo, 2’-metoxietox¡, 2’-fluoro, 2’-hidroxilo, 2’-alilo, 2’-O-[2-(metilam¡no)-2-oxoetilo], 4’-tio, 4’-CH2-0-2’-puente, 4’-(CH2)2-0-2’-puente, 2’-LNA y 2’-0-(N-metilcarbamato) o los que comprenden análogos de bases.
41. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 39 o 40, en donde el o los nucleótidos modificados en 2’ se colocan en el extremo terminal 3’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo.
42. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 39 o 40, en donde el o los nucleótidos modificados en 2’ se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo.
43. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 42, en donde el o los nucleótidos modificados en 2’, colocados en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo, se separan del sitio de corte en 1 , 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos sin modificar.
44. El oligonucleótido asilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde dos o más nucleótidos modificados en 2’ son contiguos.
45. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 44, en donde el número de nucleótidos modificados en 2’ contiguos es 2, 3, 4, 5 o más.
46. El oligonucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 45, en donde la secuencia de reconocimiento de enzima de corte es 5’-GAGT-3’.
47. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 41, en donde 5 nucleótidos modificados con 2’-O-metilo se colocan en el extremo 3’ de la secuencia complementaria a la molecula de ácido nucleico objetivo.
48. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 42, en donde 5 nucleótidos modificados con 2’-0-metilo se colocan en el extremo 5’ de la secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo.
49. Un oligonucleótido aislado, en donde el oligonucleótido es uno expuesto en la Figura 1.
MX2014012214A 2012-04-09 2013-04-09 Composiciones y metodos para cuantificar una secuencia de acido nucleico en una muestra. MX338296B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261621975P 2012-04-09 2012-04-09
PCT/US2013/035750 WO2013155056A1 (en) 2012-04-09 2013-04-09 Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014012214A true MX2014012214A (es) 2015-05-08
MX338296B MX338296B (es) 2016-04-11

Family

ID=49328090

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2016004384A MX367666B (es) 2012-04-09 2013-04-09 Composiciones y métodos para cuantificar una secuencia de ácido nucleico en una muestra.
MX2014012214A MX338296B (es) 2012-04-09 2013-04-09 Composiciones y metodos para cuantificar una secuencia de acido nucleico en una muestra.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2016004384A MX367666B (es) 2012-04-09 2013-04-09 Composiciones y métodos para cuantificar una secuencia de ácido nucleico en una muestra.

Country Status (18)

Country Link
US (8) US9096897B2 (es)
EP (2) EP2836609B2 (es)
JP (4) JP5801513B2 (es)
KR (4) KR102362649B1 (es)
CN (2) CN104685066B (es)
AU (3) AU2013246080C1 (es)
BR (1) BR112014025262A8 (es)
CA (1) CA2869971C (es)
DK (1) DK2836609T4 (es)
ES (1) ES2743050T5 (es)
HK (1) HK1210228A1 (es)
IN (1) IN2014DN08831A (es)
MX (2) MX367666B (es)
NZ (2) NZ723570A (es)
RU (2) RU2601129C2 (es)
UA (2) UA116205C2 (es)
WO (1) WO2013155056A1 (es)
ZA (3) ZA201408116B (es)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2810856C (en) 2010-08-13 2022-05-17 Envirologix Inc. Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample
NZ723570A (en) 2012-04-09 2018-06-29 Envirologix Inc Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample
RU2723079C2 (ru) 2014-04-22 2020-06-08 Инвайролоджикс, Инк. Композиции и способы для увеличения и/или прогнозирования амплификации днк
BR112016025349A2 (pt) * 2014-04-30 2017-12-12 Envirologix Inc composições e métodos para a detecção de huanglongbing
JP6773651B2 (ja) * 2014-10-14 2020-10-21 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ポリｄｎａスペーサー配列を有する配列変換およびシグナル増幅ｄｎａならびにそれらを用いた検出方法
EP3209802B1 (en) * 2014-10-20 2022-09-07 Envirologix Inc. Compositions and methods for detecting an rna virus
WO2016122698A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 Envirologix, Inc. Compositions and methods for rapid detection of salmonella
MX2017009833A (es) * 2015-01-30 2017-11-02 Envirologix Inc Molecula de sustrato.
JP7166586B2 (ja) * 2015-06-25 2022-11-08 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 生体分子センサーおよび方法
EP3325495A1 (en) * 2015-07-20 2018-05-30 Envirologix Inc. Compositions and methods for rapid detection of salmonella serovar d1
EP3368654A4 (en) * 2015-10-30 2019-06-05 Alere Inc. DETERMINATION OF POLYMORPHISMS BY ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID
US10329601B2 (en) 2015-12-28 2019-06-25 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction (NEAR) of Streptococcus species
KR20180104127A (ko) 2016-01-28 2018-09-19 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 대량 병렬 ｄｎａ 시퀀싱 장치
US11624725B2 (en) 2016-01-28 2023-04-11 Roswell Blotechnologies, Inc. Methods and apparatus for measuring analytes using polymerase in large scale molecular electronics sensor arrays
EP3882616A1 (en) 2016-02-09 2021-09-22 Roswell Biotechnologies, Inc Electronic label-free dna and genome sequencing
US10597767B2 (en) 2016-02-22 2020-03-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Nanoparticle fabrication
GB201611469D0 (en) 2016-06-30 2016-08-17 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes
US9829456B1 (en) 2016-07-26 2017-11-28 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices
KR102622275B1 (ko) 2017-01-10 2024-01-05 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 Dna 데이터 저장을 위한 방법들 및 시스템들
WO2018136148A1 (en) 2017-01-19 2018-07-26 Roswell Biotechnologies, Inc. Solid state sequencing devices comprising two dimensional layer materials
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
CN110546276A (zh) 2017-04-25 2019-12-06 罗斯威尔生命技术公司 用于分子传感器的酶电路
WO2018208505A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Roswell Biotechnologies, Inc. Binding probe circuits for molecular sensors
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
TWI754652B (zh) * 2017-07-10 2022-02-11 英商盧米瑞德克斯英國有限公司 核酸擴增方法中或相關之改良
CN111373049A (zh) 2017-08-30 2020-07-03 罗斯威尔生命技术公司 用于dna数据存储的进行性酶分子电子传感器
EP3676394A4 (en) * 2017-08-31 2021-06-02 Ionian Technologies, LLC SYNCYTIAL SYNCHRONIZATION AND EXTENSION AMPLIFICATION REACTION (NEAR) OF RESPIRATORY VIRUS SPECIES
EP3694990A4 (en) 2017-10-10 2022-06-15 Roswell Biotechnologies, Inc. METHODS, APPARATUS AND SYSTEMS FOR NON-AMPLIFICATION DNA DATA STORAGE
GB2569965A (en) 2018-01-04 2019-07-10 Lumiradx Uk Ltd Improvements in or relating to amplification of nucleic acids
CN108588252A (zh) * 2018-03-29 2018-09-28 杭州泰熙生物技术有限公司 一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法
US20210207203A1 (en) * 2018-06-26 2021-07-08 The Broad Institute, Inc. Crispr double nickase based amplification compositions, systems, and methods
GB201812149D0 (en) * 2018-07-25 2018-09-05 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method
KR102154628B1 (ko) 2019-01-03 2020-09-10 베트올 (주) 반정량 수평류 면역진단 기술을 이용한 랄스토니아 솔라나세아룸과 푸사리움 옥시스포룸의 동시 진단 방법
KR102199394B1 (ko) * 2019-07-01 2021-01-06 한국화학연구원 이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법
KR102531590B1 (ko) * 2019-07-16 2023-05-11 고려대학교 산학협력단 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한 표적핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 조성물
CN110408678A (zh) * 2019-07-26 2019-11-05 宁儿医院股份有限公司 单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法
AU2022405094A1 (en) * 2021-12-08 2024-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Cold-temperature isothermal amplification of polynucleotides
WO2023221939A1 (en) * 2022-05-14 2023-11-23 Jiangsu Code Biomedical Technology Co., Ltd. Novel compositions and methods for cell-free dna detection
TW202421795A (zh) * 2022-07-01 2024-06-01 美商夏洛克生物科學公司 環境溫度核酸擴增及偵測
WO2024030985A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Abbott Laboratories Assays for detecting monkeypox virus

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
WO1994003635A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Institute Of Molecular Biology & Biotechnology Rapid amplification and detection of nucleic acids
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5629179A (en) 1995-03-17 1997-05-13 Novagen, Inc. Method and kit for making CDNA library
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
EP0914462A4 (en) * 1996-03-18 2002-05-22 Molecular Biology Resources Amplification of target nucleic acid sequences
WO1998002582A2 (en) * 1996-07-16 1998-01-22 Gen-Probe Incorporated Methods for detecting and amplifying nucleic acid sequences using modified oligonucleotides having increased target specific t¿m?
GB9716231D0 (en) 1997-07-31 1997-10-08 Amersham Int Ltd Base analogues
US6355421B1 (en) 1997-10-27 2002-03-12 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to PNA molecular beacons
US5952202A (en) 1998-03-26 1999-09-14 The Perkin Elmer Corporation Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification
WO2000028084A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Molecular Biology Resources, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods
US6436677B1 (en) 2000-03-02 2002-08-20 Promega Corporation Method of reverse transcription
EP1290225A4 (en) 2000-05-20 2004-09-15 Univ Michigan METHOD FOR PRODUCING A DNA BANK BY POSITIONAL REPRODUCTION
US6191267B1 (en) 2000-06-02 2001-02-20 New England Biolabs, Inc. Cloning and producing the N.BstNBI nicking endonuclease
ES2254306T3 (es) * 2000-10-25 2006-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Amplificacion usando cebadores modificados.
WO2002057479A2 (en) 2000-12-27 2002-07-25 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
CA2492220C (en) * 2001-07-15 2014-03-18 Keck Graduate Institute Nucleic acid amplification using nicking agents
WO2003066802A2 (en) 2001-07-15 2003-08-14 Keck Graduate Institute Gene expression analysis using nicking agents
EP1420069A4 (en) * 2001-08-20 2005-11-02 Takara Bio Inc nucleic acid amplification
US6977148B2 (en) 2001-10-15 2005-12-20 Qiagen Gmbh Multiple displacement amplification
US6617137B2 (en) 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US20030211483A1 (en) 2002-05-09 2003-11-13 Schroeder Benjamin G. Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
AU2003272438B2 (en) 2002-09-20 2009-04-02 New England Biolabs, Inc. Helicase dependent amplification of nucleic acids
US7662594B2 (en) 2002-09-20 2010-02-16 New England Biolabs, Inc. Helicase-dependent amplification of RNA
WO2004067726A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Keck Graduate Institute Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides
JP4380305B2 (ja) 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
US20090017452A1 (en) 2004-03-05 2009-01-15 University Of Chicago Methods and compositions relating to the pharmacogenetics of different gene variants
US20060115838A1 (en) 2004-10-19 2006-06-01 Trevigen Inc. Real-time detection of amplicons using nucleic acid repair enzymes
JP5068175B2 (ja) * 2005-01-04 2012-11-07 日立化成工業株式会社 プライマー生成ローリングサークル型増幅
JP4555136B2 (ja) * 2005-03-31 2010-09-29 本田技研工業株式会社 燃料電池の電気システム、燃料電池車両及び電力供給方法
CA2616241C (en) 2005-07-25 2012-02-07 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
DK1924704T3 (da) 2005-08-02 2011-09-05 Rubicon Genomics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US7947286B2 (en) 2005-10-07 2011-05-24 Panthera Biopharma Llc Drosophila cell lines producing recombinant secretable filovirus surface glycoproteins lacking the membrane spanning domain
US20090092967A1 (en) * 2006-06-26 2009-04-09 Epoch Biosciences, Inc. Method for generating target nucleic acid sequences
US20080096257A1 (en) 2006-08-15 2008-04-24 Zuxu Yao Methods for Rapid, Single-Step Strand Displacement Amplification of Nucleic Acids
DE102006039396A1 (de) 2006-08-22 2008-03-13 Robert Bosch Gmbh Laserlichtquelle
EP2071927A2 (en) 2006-09-28 2009-06-24 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
NZ576003A (en) 2006-10-06 2012-03-30 Dna Genotek Inc Stabilizing compositions and methods for extraction of ribonucleic acid
JP2008136451A (ja) 2006-12-05 2008-06-19 Hitachi Ltd 核酸増幅法
US8202972B2 (en) 2007-01-10 2012-06-19 General Electric Company Isothermal DNA amplification
US20090081760A1 (en) † 2007-01-12 2009-03-26 Monsanto Technology Llc Dmo methods and compositions
US20080254458A1 (en) 2007-04-10 2008-10-16 Asiagen Corporation Method of pre-treating in pleural effusion for detection of Mycobacterium tuberculosis
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
US20090048439A1 (en) 2007-08-06 2009-02-19 Weisburg William G Isolation of nucleic acids molecules using modified solid supports
US20090197254A1 (en) 2007-12-14 2009-08-06 Ming-Chou Lee Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection
AU2009242546B2 (en) 2008-04-30 2015-01-22 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers
WO2010026933A1 (ja) 2008-09-03 2010-03-11 タカラバイオ株式会社 Ｒｎａ検出用組成物
JP2012515528A (ja) 2009-01-21 2012-07-12 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 改良された等温鎖置換増幅
EP2408936A4 (en) 2009-03-18 2013-01-30 Sequenom Inc USE OF HEAT-STAINED ENDONUCLEASES FOR THE PREPARATION OF REPORTER MOLECULES
WO2010126913A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
CA2810856C (en) * 2010-08-13 2022-05-17 Envirologix Inc. Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample
EP2420579A1 (en) 2010-08-17 2012-02-22 QIAGEN GmbH Helicase dependent isothermal amplification using nicking enzymes
CN103946398B (zh) 2011-09-15 2019-08-13 健能泰格技术公司 探针：反义探针组合物对高特异性dna或rna的检测
EP2798089B1 (en) 2011-12-30 2018-05-23 Bio-rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for performing nucleic acid amplification reactions
NZ723570A (en) 2012-04-09 2018-06-29 Envirologix Inc Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample
CN104583413B (zh) 2012-06-29 2018-10-19 通用电气公司 用于自rna模板开始的等温dna扩增试剂盒
JP2014082936A (ja) 2012-10-19 2014-05-12 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素
RU2723079C2 (ru) 2014-04-22 2020-06-08 Инвайролоджикс, Инк. Композиции и способы для увеличения и/или прогнозирования амплификации днк
BR112016025349A2 (pt) 2014-04-30 2017-12-12 Envirologix Inc composições e métodos para a detecção de huanglongbing
EP3209802B1 (en) 2014-10-20 2022-09-07 Envirologix Inc. Compositions and methods for detecting an rna virus
BR112017008718A2 (pt) 2014-10-28 2017-12-19 Envirologix Inc ?recipientes de preparação de amostra, circuitos de microfluídos, e sistemas e métodos para preparação, extração e análise da amostra?
WO2016122698A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Envirologix, Inc. Compositions and methods for rapid detection of salmonella

Also Published As

Publication number Publication date
US9322053B2 (en) 2016-04-26
JP2018007658A (ja) 2018-01-18
US9096897B2 (en) 2015-08-04
AU2013246080B2 (en) 2015-07-23
ES2743050T3 (es) 2020-02-18
JP2017029154A (ja) 2017-02-09
KR20150031229A (ko) 2015-03-23
EP2836609B1 (en) 2019-05-22
AU2018201671A1 (en) 2018-04-05
US20180094310A1 (en) 2018-04-05
RU2732589C2 (ru) 2020-09-21
US10077467B2 (en) 2018-09-18
JP6480511B2 (ja) 2019-03-13
CA2869971C (en) 2022-10-25
EP2836609B2 (en) 2022-06-15
KR102159818B1 (ko) 2020-09-25
AU2013246080C1 (en) 2018-03-29
EP2836609A4 (en) 2015-11-11
HK1210228A1 (en) 2016-04-15
RU2014144722A (ru) 2016-06-10
JP2015512654A (ja) 2015-04-30
US11866773B2 (en) 2024-01-09
KR102048946B1 (ko) 2019-11-27
EP2836609A1 (en) 2015-02-18
NZ723570A (en) 2018-06-29
KR20200111287A (ko) 2020-09-28
ES2743050T5 (es) 2022-10-20
AU2013246080A1 (en) 2014-11-13
KR20190132570A (ko) 2019-11-27
KR101570951B1 (ko) 2015-11-23
ZA201408116B (en) 2016-02-24
JP2016073273A (ja) 2016-05-12
ZA201508197B (en) 2017-05-31
AU2015246059A1 (en) 2015-11-05
US20200239947A1 (en) 2020-07-30
JP5801513B2 (ja) 2015-10-28
ZA201607642B (en) 2018-05-30
BR112014025262A8 (pt) 2021-06-29
DK2836609T4 (da) 2022-09-05
NZ701145A (en) 2016-09-30
RU2016138585A (ru) 2018-12-13
US20180363046A1 (en) 2018-12-20
CA2869971A1 (en) 2013-10-17
JP6169660B2 (ja) 2017-07-26
US20160122811A1 (en) 2016-05-05
AU2015246059B2 (en) 2017-12-07
BR112014025262A2 (pt) 2017-06-20
US20150104788A1 (en) 2015-04-16
EP3587587A1 (en) 2020-01-01
WO2013155056A1 (en) 2013-10-17
IN2014DN08831A (es) 2015-05-22
MX367666B (es) 2019-08-30
WO2013155056A9 (en) 2014-01-09
MX338296B (es) 2016-04-11
CN114134207A (zh) 2022-03-04
CN104685066B (zh) 2021-09-21
KR20150080023A (ko) 2015-07-08
US20170166960A1 (en) 2017-06-15
US20150315635A1 (en) 2015-11-05
US10584376B2 (en) 2020-03-10
UA125112C2 (uk) 2022-01-12
US9631231B2 (en) 2017-04-25
AU2018201671B2 (en) 2019-11-14
CN104685066A (zh) 2015-06-03
JP6321738B2 (ja) 2018-05-09
KR102362649B1 (ko) 2022-02-14
RU2016138585A3 (es) 2020-03-19
US20220243262A1 (en) 2022-08-04
DK2836609T3 (da) 2019-08-26
RU2601129C2 (ru) 2016-10-27
UA116205C2 (uk) 2018-02-26
US11208687B2 (en) 2021-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11866773B2 (en) Isolated oligonucleotides containing modified nucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration