KR20150031229A - 시료 내 핵산 서열을 정량화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

시료 내 핵산 서열을 정량화하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시료 내 표적 올리고뉴클레오티드를 실시간으로 정량화하는 검출을 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법들은 NEAR 반응을 사용하여 증폭된 표적 올리고뉴클레오티드들에 적합하다.

Description

시료 내 핵산 서열을 정량화하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR QUANTIFYING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IN A SAMPLE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2012년 4월 9일에 출원되고 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 미국 가출원 제61/621,975호의 이점을 주장한다.
본 발명은 시료 내 핵산 서열을 정량화하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
핵산 증폭 기술은 복잡한 생물학적 과정의 이해, 병원성 및 비 병원성 유기체들의 검출, 동정 및 정량화, 법의학적 분석, 질병 연관 연구들 및 유전적으로 변형된 유기체 내 사건들의 검출 등을 위한 수단을 제공해왔다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 DNA를 증폭하기 위해 사용되는 통상적인 열 사이클 의존 핵산 증폭 기술로 DNA 융해 및 DNA 중합효소를 사용하는 DNA의 효소적 복제를 위해 반복되는 가열 및 냉각 반응의 사이클로 이루어진다. 실시간 정량 PCR(qPCR)은 생물학적 시료 내 주어진 핵산 서열의 카피의 수를 정량화하기 위해 사용되는 기술이다. 현재, qPCR은 반응 전체에 걸친 실시간 반응 생성물의 검출을 이용하고, 증폭 프로파일을 각 반응의 시작 시 알려진 양의 핵산을 함유하는 대조군의 증폭 프로파일(또는 미공지 시험 핵산에 대한 핵산의 공지된 상대적인 비)에 비교한다. 대조군의 결과는 통상적으로 표준 반응 증폭 곡선의 로그 부분을 기준으로 표준 곡선을 제작하기 위해 사용된다. 이러한 값들은 표준 대조군 양과 비교하여 그들의 증폭 곡선의 어디에 있는지에 기반하여 미지의 양을 삽입하기 위해 사용된다.
PCR에 더하여, 제한 없이, 다음을 포함하는 열 사이클 의존적이 아닌 증폭 시스템 또는 등온 핵산 증폭 기술이 존재한다: 절단(nicking) 및 연장 증폭 반응(NEAR), 회전환 증폭(RCA), 헬리카제 의존형 증폭(HDA), 루프 매개 증폭(LAMP), 가닥 치환 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 단일 프라이머 등온 증폭(SPIA), Q-β복제효소 시스템 및 재조합효소 중합효소 증폭(RPA).
NEAR 증폭은 PCR 열사이클과 유사성을 가진다. PCR과 마찬가지로, NEAR 증폭은 표적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 채용하며, PCR에서는 프라이머로 그리고 NEAR에서는 주형으로 지칭된다. 또한, 표적 서열의 NEAR 증폭은, 표준 PCR에서와 바로 마찬가지로, 표적 서열의 로그 증가를 초래한다. 표준 PCR과는 달리, NEAR 반응은 등온선상으로 진행된다. 표준 PCR에서는, 온도가 증가하여 두 가닥의 DNA가 분리될 수 있다. NEAR 반응에서, 표적 핵산 서열은 시험 시료 내 존재하는 특이적인 절단 자리에서 절단된다. 중합효소가 닉(nick) 자리에 침입하여 존재하는 상보적인 DNA 가닥의 이동을 따라 절단된 표적 뉴클레오티드 서열(첨가된 외인성 DNA)의 상보적인 가닥 합성을 시작한다. 가닥 교체 복제 과정은 증가된 온도의 필요성을 제거한다. 이 시점에서, 주형/프라이머 분자는 첨가된 외인성 DNA로부터 교체된 상보적인 서열에 어닐링된다. 중합효소는 이제 이전에 교체된 가닥에 상보적인 가닥을 생성하면서 주형의 3' 말단으로부터 연장된다. 제2 주형/프라이머 올리고뉴클레오티드가, 다음으로, 새롭게 합성된 상보적인 가닥에 어닐링되고, 연장되어서 절단 효소 인식 서열을 포함하는 이중의 DNA를 제조한다. 그런 다음, 이러한 가닥은 원래의 표적 DNA의 양 측에 닉 자리를 가지는 이중의 DNA의 생성을 야기하는 후속된 중합효소에 의한 가닥 교체 연장으로 절단되기가 쉽다. 일단 이러한 가닥이 합성되면, 분자는 새로운 주형 분자로 교체된 가닥의 복제를 통해 기하급수적으로 계속 증폭된다. 게다가, 증폭은, 또한, 닉 자리가 도입된 주형에서의 닉 번역 합성의 반복 작용을 통해 각 생성물 분자로부터 선형으로 진행된다. 그 결과는 표적 신호 증폭에서의 매우 급격한 증가이다; 10분 미만의 증폭 결과로 PCR 열사이클보다 훨씬 더 빠르다.
그러나, 정량화는 어려울 수 있다. 실시간 NEAR 시스템 최적 성능은 특이적인 생성물의 생성 및 증폭에 의존한다. NEAR 시스템은 반응 효소에 의한 특이적인 생성물에 더하여 상당한 수준의 비특이적 배경 생성물을 생성하는 것으로 알려져 있다. 배경 생성물은 증폭가능한 독립체로서 쓰일 수 있고 그들의 생성은 특이적 생성물의 생성을 능가할 수 있다. 원하는 표적에 특이적인 검출 프로브를 설계하는 것(따라서 특이적 생성물이 복합 배경에서 검출가능한 것)이 가능하지만, 상당한 수준의 비특이적 배경 생성물이 그렇지 않으면 특이적 생성물의 증폭에 활용될 수 있었던 반응 구성요소들을 격리시킨다. 따라서, 비특이적 배경 생성물 생성으로 인한 반응 구성요소의 격리는 차선인 반응을 초래한다. 이것은 특히 표적 핵산이 초기에 매우 낮은 풍부도를 가지고 표적의 신뢰할만한 검출을 위해 고도로 최적화된 반응이 요구될 때 문제이다. 또한, 차선 반응은 비록 검출가능하더라도 표적 핵산의 실제 양을 대표할 수 없다. 비특이적 배경 생성물의 증폭을 제거한 최적화된 NEAR 반응을 생성하는 것이 유리할 수 있다. 그러기 위해 표준 곡선 기반 시스템 또는 상대적인 정량화 중 하나에 의한 정량화에 적합한 반응이 제공될 수 있다.
또한, 질량 분석을 이용하여 NEAR 반응을 평가하는 것이 통상적인 실행이다. 높은 수준의 배경 생성물은 질량 분석 데이터의 해석을 모호하게 할 수 있다. 만약, 예를 들어, 반응이 배경 생성물, 비특이적 증폭으로부터 유래된 하나 이상의 생성물들(관련은 있지만 다른 표적), 및 특이적 생성물을 함유한다면, 배경 생성물로부터 이러한 매트릭스 유래 생성물들을 식별하는 것이 도전적일 수 있다. 배경 생성물의 제거는 특정 검정법의 성능/특이성의 명확한 결정을 야기한다.
추가적으로, 높은 수준의 배경 생성물은 의도적 이중 또는 다중 반응의 최적 증폭을 방해할 수 있다. 다중에서, 상이하게 표지된 검출 프로브들이 실시간 검출에 적합하지만, 비특이적 생성물 형성으로 인한 반응물 제한의 문제가 여전히 존재한다. 이는 특히 이러한 반응들이 배경 생성물들의 복합체 군집을 잠재적으로 형성할 수 있는 2개 초과의 주형/프라이머들을 함유하는 이중 또는 다중 반응에 적용된다. 배경 생성물의 증폭을 제거하는 NEAR 반응 시스템은 또한 의도적 이중 또는 다중 반응의 실시간 검출을 위한 조건을 제공한다. NEAR 반응에서 증폭가능한 배경 생성물을 제거함으로써 특이적 생성물의 잠재적인 생성을 최대화하는 수단을 제공하는 것이 매우 유리할 수 있다. 정량적인 결과가 반응의 진행을 실시간으로 정확히 모니터링함으로써 제공될 수 있는 것이 바람직할 것이다.
아래에 기술된 바와 같이, 본 발명은 배경 생성물의 생성을 낮추거나 제거하여 시료 표적 올리고뉴클레오티드를 정량화할 수 있게 하는, 시료 내 표적 올리고뉴클레오티드의 실시간 검출을 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법들은 NEAR 반응을 사용하여 증폭된 표적 올리고뉴클레오티드들에 적합하다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 단일 NEAR 반응에서의 특이적 생성물이 배경 생성물 없이 생성될 수 있다는 발견에 기반한다. 반응 조성물 및 방법은 미지의 시험 시료, 이중 반응, 및 다중 반응의 상대적인 정량화 및 미지의 시험 시료의 절대적인 정량화를 위한 표준 곡선의 생성을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 절단(nicking) 및 연장 증폭 반응에서 특정 생성물을 정량화하는 방법을 제공한다: 실질적으로 등온 조건하에 표적 핵산 분자를 엑소뉴클라제가 결핍된 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 포함하는 것인, 단계; 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘(amplicon)을 생성하는 단계; 및 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 혼성화에 특이적인 신호를 검출하는 단계로서, 신호가 시료 내 존재하는 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 양을 나타내는 것인, 단계.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 단일 반응의 과정 중에 생성된 복수의 별개의 반응 생성물들을 검출하기 위한 방법을 제공한다: 실질적으로 등온 조건하에 표적 핵산 분자를 엑소뉴클라제가 결핍된 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 포함하는 것인, 단계; 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 혼성화에 특이적인 신호를 검출하는 단계로서, 신호가 시료 내 존재하는 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 양을 나타내는 것인, 단계.
특정한 일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 절단 및 연장 증폭 반응에서 특정 생성물을 정량화하는 방법을 제공한다: 실질적으로 등온 조건하에 표적 핵산 분자를 엑소뉴클라제가 결핍된 중합효소, 2종의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 적어도 약 5개의 연속적인 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드들을 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단(예컨대, 올리고뉴클레오티드의 3' 종단)에 또는 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단에 인접하게 위치시키는 것인, 단계; 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 가지는 암플리콘을 생성하는 단계; 및 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 혼성화에 특이적인 신호를 검출하는 단계로서, 신호가 시료 내 존재하는 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 양을 나타내는 것인, 단계.
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 절단 및 연장 증폭 반응을 실시간으로 모니터링하기 위한 방법을 제공한다: 실질적으로 등온 조건 하에 시험 시료를 엑소뉴클라제가 결핍된 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 것인, 단계; 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 가지는 암플리콘을 생성하는 단계; 및 신호를 실시간으로 검출함으로써 표적 핵산 분자(들)를 정량하는 단계.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 NEAR 반응에서 표적 핵산 분자를 실시간으로 모니터링하기 위한 방법을 제공한다: 실질적으로 등온 조건 하에 표적 핵산 분자를 엑소뉴클라제 결핍 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 이형이중가닥 특이적인 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 가지는 것인, 단계; 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 표적 서열을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및 신호를 실시간으로 검출함으로써 표적 핵산 분자를 정량하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 시험 시료 내 표적 핵산 분자를 실시간으로 모니터링하기 위한 방법을 제공한다: 실질적으로 등온 조건 하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 복구 효소 또는 교정 효소 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 가지는 것인, 단계; 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 표적 서열을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및 신호를 실시간으로 검출함으로써 표적 핵산 분자를 정량하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 NEAR 반응에서 표적 서열을 검출하기 위한 키트로서, 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하고 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 하나 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들 및 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들을 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 지침을 함유하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은, 5'으로부터 3'으로, 제1 영역, 및 제2 영역을 가지는 단리된 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 제1 영역은 절단 효소 인식 서열을 가지고, 제2 영역은 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 적어도 9개 이상의 뉴클레오티드(예컨대, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드)들을 포함하고, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함한다. 다른 구현예에서, 단리된 올리고뉴클레오티드는 도 1에 기재된 올리고뉴클레오티드이다.
본원에 설명된 양태들의 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드(예컨대, 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드, 단리된 올리고뉴클레오티드)는 2' 변형 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 2' 변형은 2' O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-플루오로, 2' 하이드록실, 2'-알릴, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 4'-티오, 4'-CH2-O-2'-가교, 4'-(CH2)2-O-2'-가교, 2'-LNA, 2' 알킬, 및 2'-O-(N-메틸카바메이트) 또는 염기 유사체들을 함유하는 변형된 뉴클레오티드 중 하나 이상이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단(예컨대, 올리고뉴클레오티드의 3' 종단)에 위치하거나 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단에 인접하여 위치한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다른 구현예에서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치하는 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드는 닉(nick) 자리로부터 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 미변형 뉴클레오티드들만큼 떨어져 있다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 2개 이상의 2' 변형 뉴클레오티드(2, 3, 4, 5 이상)는 연속적이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 2개 이상의 2' 변형 뉴클레오티드는 미변형 뉴클레오티드와 교번한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 절단 효소 인식 서열은 5' -GAGTC-3'이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 5개의 연속적인 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단(예컨대, 올리고뉴클레오티드의 3' 종단)에 위치하거나 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3'말단에 인접하여 위치한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다른 구현예에서, 5개의 연속적인 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다른 구현예에서, 미치환 뉴클레오티드와 교번하는 2개 이상의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열(즉, 표적 특이적 영역)의 5' 말단에 위치한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 검출 단계는 표적이 아닌 분자의 암플리콘을 검출하지 않는다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 실시간으로 수행된다. 본원에 설명된 임의의 양태의 일정한 구현예에서, (예컨대, 반응 내 존재하는 표적의 양을 결정하기 위해) 암플리콘을 생성하는 단계는 실시간으로 수행된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 증폭 전에 생물학적 시료 내 존재하는 핵산 분자의 양을 결정하는 반(semi) 정량적 및/또는 양 임계 방법을 제공한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 더 가깝게 위치시키는 단계는 증폭의 검출 시간을 증가시킨다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 시작 표적 물질의 상이한 양으로부터 기인한 반응 생성물의 증가된 분석을 제공하기 위한 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들의 비의 사용을 더 포함한다. 인식 서열의 5' 말단에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 가지는 프라이머/주형 올리고에 대한 인식 서열의 3' 말단에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 가지는 프라이머/주형 올리고의 비를 증가시키는 것은 신호 곡선을 수축시키고 곡선의 기울기를 전이시키는 것으로 밝혀졌다.
본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 시작 표적 물질의 상이한 양으로부터 기인한 반응 생성물의 증가된 분석을 제공하기 위해 증폭 속도 조절제의 사용을 더 포함한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 표적 핵산 분자는 DNA 또는 RNA 핵산 분자이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 검출가능한 프로브는 SYBR 그린 또는 분자 비콘(Molecular Beacon)이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 검출가능한 프로브는 표적 서열에 상보적인 적어도 약 10개의 뉴클레오티드, 검출가능한 모이어티, 및 중합효소-정지 분자를 가지는 증폭가능하지 않은 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브로서, 중합효소 정지 분자는 그렇지 않으면 중합효소 활성을 지지하는 조건 하에서 중합효소가 프로브를 증폭하는 것을 방지하는 것이다.
본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 시험 시료는 병원균을 함유한다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 병원균은 바이러스, 박테리아, 효모 또는 진균류이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 시험 시료는 생물학적 시료이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 생물학적 시료는 세포, 조직 시료, 또는 생물학적 유체(예컨대, 소변, 정액, 질 분비물, 또는 대변)이다. 본원에 설명된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 시험 시료는 환경적 시료이다.
본 발명은 NEAR 반응을 사용하여 증폭된 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 정의되는 조성물들 및 제품들은 하기에 제공되는 실시예들과 관련되어 단리되거나 아니면 제조된다. 본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
정의
본 개시에서, "구성되다(comprises)", "구성되는(comprising)", "함유하는(containing)" 및 "가지는having)" 등은 그들이 미국 특허법에서 주어진 의미를 가질 수 있고, "포함하다(includes)" "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있으며; "필수적으로 이루어진(consisting essentially)” 또는 "필수적으로 이루어지다(consist essentially of)”도 마찬가지로 미국 특허법에서 주어진 의미를 가지고, 이러한 용어는 개방형으로 인용된 것의 기본적이거나 고유한 특성이 인용된 것을 넘어서 존재하는 것으로 인해 변경되지 않는 한 인용된 것을 넘어 존재할 수 있지만, 종래 기술의 구현예는 배제한다.
"중합효소 정지 분자”는 폴리뉴클레오티드 주형/프라이머와 결합하는 모이어티를 의미하며 폴리뉴클레오티드 주형 상에서 중합효소의 진행을 방지하거나 현저하게 감소시킨다. 바람직하게, 모이어티는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입된다. 바람직한 일 구현예에서, 모이어티는 중합효소가 주형 상에서 진행하는 것을 방지한다.
"중합효소 연장”은 접근가능한 3' 하이드록실기로부터의 중합효소의 정?항 진행을 의미하며 주형 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 그들의 대향하는 뉴클레오티드에 상보적인 인입 단량체를 삽입한다.
"엑소뉴클라제가 결핍된 중합효소" 는 5'-3' 엑소뉴클라제 활성이 없거나 사실상 검출 불가능한 수준으로 이러한 활성을 가지는 DNA-의존성 DNA 중합효소 및/또는 RNA 의존성 RNA 중합효소를 의미한다.
"뉴클레오티드 부가체"는 표준 뉴클레오티드 염기에 공유 결합하거나 아니면 고정된 모이어티를 의미한다.
본원에서 사용된 "검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브”라는 용어는, 임의의, 적어도 부분적으로 단일 가닥인, 표적 서열의 적어도 하나의 가닥에 상보적인 서열 영역을 가지는 검출가능한 모이어티로 표지된 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 표적 서열에 결합하면 검출가능한 모이어티로부터 검출가능한 신호를 방출하되 검출가능한 모이어티에 의한 신호 생성은 비특이적 5'-3' 엑소뉴클라제 활성에 의한 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브의 절개에 의존한다. 본원에 사용된 "검출가능한?폴리뉴클레오티드 프로브”의 일 예는, 이에 제한되지는 않지만, 종래 기술에 기술된 바와 같은 형광 분자 비콘 프로브이다.
본원에서 사용된 "핵산"이라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 변형된 뉴클레오티드 및 이의 단일 또는 이중 가닥 형태의 중합체를 지칭한다. 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 가지고 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 합성, 자연적으로 발생, 및 비자연적으로 발생하는 공지된 핵산 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는, 제한 없이, 2' 변형 리보뉴클레오티드(예컨대, 2' O-메틸 리보뉴클레오티드, 2' -F 뉴클레오티드)를 포함한다.
본원에서 사용된 "변형된 뉴클레오티드”는 뉴클레오시드, 핵염기, 펜토오스 고리, 또는 인산기에 하나 이상의 변형을 가지는 뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 우리딘 모노포스페이트, 및 시티딘 모노포스페이트를 함유하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 및 데옥시시티딘 모노포스페이트를 함유하는 데옥시리보뉴클레오티드를 배제한다. 변형은 메틸트랜스퍼라제와 같은 뉴클레오티드를 변형하는 효소에 의한 변형으로부터 기인한 자연적으로 발생한 변형을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 또한 합성 또는 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 내 합성 또는 비자연적으로 발생하는 변형은, 2' 변형, 예컨대, 2' 알킬(예를 들면, 2' O-메틸, 및 2'-메톡시에톡시), 2'-플루오로, 2' 하이드록실(RNA), 2'-알릴, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 4'-티오, 4'-CH2-O-2'-가교, 4'-(CH2)2-O-2'-가교, 2'-LNA, 및 2'-O-(N-메틸카바메이트) 또는 염기 유사체들을 포함하는 것들을 포함한다.
"염기 치환”은 상보적인 뉴클레오티드 가닥 사이의 혼성화의 현저한 파괴를 유발하지 않는 핵염기 중합체의 치환을 의미한다.
"특이적 생성물”은 주형 올리고뉴클레오티드의 상보적인 표적 서열로의 혼성화 및 이어지는 표적 서열의 중합효소 매개 연장으로부터 기인한 폴리뉴클레오티드 생성물을 의미한다.
"절단(nicking) 및 연장 증폭 반응”은 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 야기하는 절단 및 연장의 교번 사이클을 의미한다.
"실질적으로 증등온인 조건”은 단일 온도 또는 유의하게 변하지 않는 좁은 범위의 온도를 의미한다. 일 구현예에서, 실질적으로 등온인 조건 하에서 수행되는 반응은 단지 약 1 내지 5℃만큼만 변화하는 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5도만큼 변하는) 온도에서 수행된다. 다른 구현예에서, 반응은 사용되는 기기의 작동 파라미터 내의 단일 온도에서 수행된다.
"절단 효소”는 이중 가닥 핵산 분자 내 특이적 구조를 인식하고 결합하여, 인식된 특이적 구조에 결합하면 단일 가닥 상의 서로 접한 뉴클레오티드 사이의 인산이에스테르 결합을 끊음으로써 닉 자리의 상류의 말단 뉴클레오티드 상에 엑소뉴클라제가 결핍된 중합효소에 의해 연장될 수 있는 자유 3' 하이드록실기를 생성할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다.
"닉 자리”는 절단 효소에 의해 가수분해된 이중 가닥 핵산 분자의 하나의 가닥 상의 "끊어진" 산이에스테르 결합의 위치를 의미한다.
"암플리콘(amplicon)"은 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 증폭 중에 생성된 폴리뉴클레오티드 또는 다수의 폴리뉴클레오티드들을 의미한다. 일 실시예에서, 암플리콘은 중합효소 연쇄 반응 중에 생성된다.
"반 정량적인(semi-quantitative)"은 내부 대조군을 기준으로 상대적인 양의 추산을 제공하는 것을 의미한다.
"양 임계 방법"은 양이 비교 표준을 초과하거나 초과하지 않는 것을 기준으로 양의 추산을 제공하는 것을 의미한다.
"증폭 속도 조절제”는 중합효소 연장의 속도 또는 절단 효소에 의한 단일 가닥 절단의 속도 중 하나 또는 둘 다에 영향을 미칠 수 있는 제제를 의미한다.
"반응을 모니터링하는”은 반응의 진행을 검출하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 반응 진행의 모니터링은 중합효소 연장을 검출하는 단계 및/또는 완전한 NEAR 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
“검출하다”는 검출될 분석물의 양, 존재, 또는 부재를 식별하는 것을 의미한다.
“검출가능한 모이어티”는 관심 있는 분자에 연결될 때, 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 통해 후자를 검출가능하게 하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염색제, 고전자밀도 시약, (예를 들어, ELISA에서 흔히 사용되는 것과 같은) 효소, 비오틴, 디곡시제닌, 또는 합텐을 포함한다.
“단편”은 핵산 분자의 일 부분을 의미한다. 이러한 부분은, 바람직하게, 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%을 함유한다. 단편은 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
“혼성화”는 상보적인 핵염기 사이의 왓슨-크릭, 호그스틴(Hoogsteen) 또는 역 호그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌과 티미딘은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이룰 수 있는 상보적인 핵염기이다.
“단리된 폴리뉴클레오티드”는 본 발명의 핵산 분자가 유래된 유기체의 자연적으로 발생하는 게놈 내 유전자의 측면에 위치한 유전자가 없는 핵산(예컨대, DNA)을 의미한다. 따라서, 용어는, 예를 들어, 벡터 내; 자체적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 삽입된 재조합 DNA 또는 다른 서열들과 독립적으로 별개의 분자로서 존재하는 재조합 DNA(예를 들어, cDNA 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클라제 분해에 의해 생성된 게놈 또는 cDNA 단편)를 포함한다. 추가로, 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자뿐 아니라 추가적인 폴리펩티드 서열을 암호화하는 혼성화 유전자의 부분인 재조합 DNA를 포함한다.
“단리된”, "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한”이라는 용어는 보통 원형 상태에서 발견되는 바와 같이 동반되는 다양한 정도의 구성요소가 결여된 물질을 지칭한다. "단리하다"는 원래의 공급원 또는 주위로부터의 분리의 정도를 나타낸다. "정제하다"는 단리보다 더 높은 분리의 정도를 나타낸다. "정제된 "또는 "생물학적으로 순수한” 단백질은 다른 물질들이 충분히 결여되어서, 임의의 불순물들이 단백질의 생물학적 성질에 실질적으로 영향을 미치거나 다른 해로운 결과를 유발하지 않는다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 때 세포성 물질, 바이러스성 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 결여되거나 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물들이 실질적으로 결여된다면 정제된 것이다. 순도 및 균일도는 통상적으로 분석 화학 기술, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 야기한다는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화의 대상이 될 수 있는 단백질에 대해, 상이한 변형들은 개별적으로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 야기할 수 있다.
"제제를 수득하는”에서와 같은 본원에서 사용된 "수득하는"은 제제의 합성, 구매 또는 아니면 획득을 포함한다.
“참조”는 표준 또는 대조군 조건을 의미한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 적절한 참조는 요소의 효과를 결정하기 위해 요소가 변경된 것이다.
“혼성화하다”는 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 본원에 기술된 유전자), 또는 이의 부분들 사이에서 다양한 조건의 엄격도(stringency)하에 이중 가닥 분자를 형성하는 쌍을 의미한다(예컨대, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507를 참조한다).
“대상체"는, 이에 제한되지는 않으나, 인간 또는 소, 말, 개, 양, 또는 고양이와 같은 인간이 아닌 포유동물을 포함하는 포유동물을 의미한다.
“표적 핵산 분자”는 분석될 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 센스 또는 안티센스 가닥일 수 있다. "표적 핵산 분자”라는 용어는 또한 원래의 표적 서열의 암플리콘도 지칭한다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값들의 약기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다.
명확하게 진술되거나 문맥으로부터 자명하지 않다면, 본원에서 사용된 "또는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 명확하게 진술되거나 문맥으로부터 자명하지 않다면, 본원에서 사용된 "하나의(a, an, the)"라는 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
명확하게 진술되거나 문맥으로부터 자명하지 않다면, 본원에서 사용된 "약"이라는 용어는 당해 분야의 보통의 허용 오차의 범위 내, 예를 들어 평균의 2개의 표준 편자 이내인 것으로 이해된다. 약은 진술된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 명확하지 않다면, 본원에 제공된 모든 수치값들은 약이라는 용어에 의해 변형될 수 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서의 화학기들의 목록에 대한 설명은 임의의 단일기 또는 나열된 기들의 조합으로서 그러한 변수의 정의들을 포함한다. 본원에서 변수 또는 양태에 대한 일 구현예의 설명은 그러한 구현예를 임의의 단일 구현예로서 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합하여 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물들 또는 방법들은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물들 및 방법들 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
도 1은 예시적인 중합효소 정지 독립체(entity) 구조를 도시한 것이다. 흑색 = 안정화 서열, 청색 = 절단(nicking) 효소 인식 서열, 녹색 = 절단 효소 간격 서열, 적색 = 표적 특이적 인식 서열, A = 아데닌, T = 티민, G = 구아닌, C = 시토신, U = 우라실, mX = 2' O-메틸 RNA 염기. 밑줄 친 염기(들)은 변형된 서열 세그먼트를 설명한다.
도 2a 내지 2c는 클라비박터 미치가넨시스 세피도니쿠스(Clavibacter michiganensis sepidonicus, Cms) 표적 DNA에 대한 동적 범위 합성 긴 단위체(long-mer)의 평가를 도시한 것이다. Cms 합성 "긴-단위체" 표적의 역가 측정(titration) 및 형광비콘(fluorobeacon)을 통한 검출로부터의 예시적인 결과가 나타나 있다. 투입 표적 핵산 없이 수행된 Cms에 대한 NEAR 검정은 무표적 대조군(No Target Control, NTC)으로 표시된다. 도 2a는 무표적 대조군(NTC)들 내 신호가 2'-O-메틸 변형 프라이머/주형 함유 반응에서 억제되었다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 2b는 2'-O-메틸 주형 반응을 사용하여 표준 곡선이 넓은 동적 범위를 나타내었다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 2c는 미변형 프라이머/주형(왼쪽 패널)과 비교하여 2'-O-메틸 변형 프라이머/주형(오른쪽 패널)을 이용한 Cms 검정 시스템의 무표적 대조군(NTC) 내 비특이적 증폭 생성물의 제거를 보여주는 예시적인 질량 스펙트럼 데이터의 비교이다. 배경 생성물의 생성에 대한 2'-O-메틸 변형 프라이머/주형의 효과를 결정하기 위해, 도 2a에 도시된 무표적 대조군 반응의 시료(10 μl)을 HPLC/질량 분석을 통해 분석하였다. 질량 스펙트럼 데이터는 2'-O-메틸 변형 프라이머/주형의 존재 시 예상되는 분자 종들만의 존재가 검출되었고, 미변형 프라이머/주형의 존재 시 생성된 복합 배경 생성물들이 제거되었다는 것을 명확하게 보여준다.
도 3은 주형/프라이머의 2' O-메틸 변형이 SYBR 그린 검출을 사용한 NEAR 검정에서 배경 신호를 제거하였다는 것을 도시한다. 2' O-메틸 변형 프라이머/주형을 사용한 예시적인 증폭 데이터 및 비특이적 증폭 생성물의 제거가 나타나 있다. 도 3a는 무표적 대조군(NTC)들 내에서 유의한 신호(표적 DNA의 부재 하에 배경 생성물의 생성을 나타냄)가 관찰되었다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 3b는 무표적 대조군(NTC)들 내 신호가 2'-O-메틸 변형 주형 함유 반응에서 억제되었다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4는 주형/프라이머의 2' O-메틸 변형이 분자 비콘(Molecular Beacon) 검출을 사용한 NEAR 검정에서 배경 신호를 제거하였다는 것을 도시한다. 2' O-메틸 변형 프라이머/주형을 사용한 예시적인 증폭 데이터 및 비특이적 증폭 생성물의 제거가 나타나 있다. 도 4a는 무표적 대조군(NTC)들 내에서 유의한 신호(표적 DNA의 부재 하에 배경 생성물의 생성을 나타냄)가 관찰되었다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 4b는 2'-O-메틸 변형 주형 함유 반응에서 무표적 대조군(NTC)들 내 신호가 억제되었다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5는 2' O-메틸 변형 프라이머/주형 또는 2' O-메틸 변형 프라이머/주형의 비를 사용하는 예시적인 중합효소 정지 독립체가 시간-대-검출 및 반응의 효율을 조작하기 위해 사용되어 반응을 "조정"할 수 있음을 도시한 것이다. 3' 말단("종단" 주형; 왼쪽)에 5개의 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록을 가지는 프라이머/주형 및 닉(nick) 자리 이후의 3번째 뉴클레오티드("닉+2" 주형; 오른쪽)부터 시작하여 5개의 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록을 가지는 프라이머/주형을 포함하는 특이적 반응의 조정을 위한 예시적인 2' O-메틸 변형 주형/프라이머의 모식도가 나타나 있다. 각각의 조정 조건은 정방향 및 역방향 주형의 특이적 비를 포함하고 주형의 각각의 세트는 다양한 구조를 가진다.
도 6은 특이적 반응의 "조정"을 위한 주형/프라이머의 2' O-메틸 변형의 유용성을 나타내는 증폭 도표를 도시한 것이다. 2' O-메틸 변형 프라이머/주형을 사용한 예시적인 증폭 데이터가 나타나있다. 모든 반응(이중)에는 Cms DNA의 10,000 게놈 등가체가 함유되었다. 각각의 조정 조건은 정방향 및 역방향 주형의 특이적 비를 포함하고 주형의 각각의 세트는 다양한 구조를 가진다. 적색원은 각각의 조정 조건에 대한 시간-대-검출에서의 전이를 보여준다. 추가적으로, 각각의 조건의 로그기가 줄어들었고, 곡선의 기울기가 전이되었다.
도 7은 옥수수 ADH1 유전자의 단편을 증폭하기 위한 NEAR 검정에 사용되는 2종의 프라이머/주형 세트(TS3 및 TS6)의 설계를 도시한 것이다. TS3 및 TS6 프라이머/주형 세트의 서열 내 표적 특이적인 영역은 종래 기술의 통상적인 NEAR 검정의 프라이머/주형 세트(9 내지 12개의 염기)보다 현저하게 길다(15 내지 17개의 염기). TS3 프라이머/주형 세트에서, 닉 자리로부터, 각각, 5 또는 4개의 뉴클레오티드 하류의 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드로 시작하는 미치환 뉴클레오티드와 교번하는 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드들의 상류 영역이 3'-종단에 인접한 5개의 연속적인 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드들의 블록에 앞선다. TS3과는 반대로, TS6 세트의 프라이머/주형 각각에는 5개의 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드들만이 존재하고, 미변형 3'-종단 뉴클레오티드에 인접한 연속 뉴클레오티드들의 블록을 형성한다.
도 8은 SYBR 그린 염색 검출 채널에 기록된 2 세트의 프라이머/주형(TS3 및 TS6)을 사용한 ADH1 검정의 증폭 도표를 나타낸다.
도 9는 ROX 채널에 기록된 동일한 검정 반응의 증폭 도표를 나타낸다.
도 10은 기록된 NTC ADH1 검정 반응의 증폭 도표를 도시한 것이다. 도 8 및 9에 나타난 결과를 비교하면, 프라이머/주형 세트 TS3만이 ADH1-특이적 암플리콘(amplicon)을 생성하고, 반면 세트 TS6에 의해 생성된 신호는 대개 SYBR 그린에 의해서만 검출되는 배경 생성물의 비특이적 증폭에 기반한다는 것이 분명해진다.
본 발명은 등온 반응에서 표적 핵산 분자의 정량화에 유용한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 NEAR 반응에서 (예컨대, 실시간으로) 표적 핵산 분자의 정량화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 2' 변형(예컨대, 2' O-메틸, 2' 플루오로) 뉴클레오티드를 포함하는 프라미어-주형 올리고뉴클레오티드가 Bst DNA 중합효소 I의 5'-3' 엑소뉴클라제 결핍 유도체에 의한 원치않는 증폭을 감소시키거나 제거한다는 놀라운 발견에 기반한다.
NEAR 반응
NEAR 반응은 표적 올리고뉴클레오티드의 비정량적인 검출을 제공하는 종점 반응으로 사용되어 왔다. 통상적인 NEAR 검정은 (1) 표적 핵산 분자; (2) PCR의 프라이머 분자의 유사체인 두개의 올리고뉴클레오티드 분자("주형-프라이머”로 명명되고, 표적 핵산 분자에 상보적인 몇몇 개의 올리고뉴클레오티드 및 절단(nicking) 효소에 의해 잘려질 수 있는 자리를 포함함); (3) dNTP; (4) 5'-3' 엑소뉴클라제 결핍 중합효소가 이동하는 하나의 가닥; 및 (5) 절단 효소를 포함한다. 특히, 실시간으로 NEAR 반응을 정량화하기 위한 현재의 방법은, 부분적으로는, 통상적인 NEAR 반응 내에서 표적 서열의 검출을 모호하게 할 수 있는 시료 내 존재하는 비표적 분자의 원치 않는 증폭으로 인하여 부적당하다. 예를 들어, NEAR 반응에서 일관된 원치 않는 증폭이 존재하여 표적 분자의 부재 하에 검출가능한 신호를 초래하거나 반응물 내 존재하는 표적 핵산 분자의 양을 정확하게 반영할 수 없게 하는 신호를 가진다. 비록 이것이 종점 생성물의 검출을 제공하더라도, 반응의 실시간 모니터링을 제공하는 것에는 실패한다.
본 발명은 NEAR 반응에서 표적 핵산 분자의 정확한 정량의 문제를 극복한 변형된 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이는 NEAR 반응에서 실시간으로 표적 핵산 분자를 정량하는 데 특히 유용하다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 2' 변형(예컨대, 2' O-메틸, 2' 플루오로)을 포함하는 프라미어-주형 올리고뉴클레오티드가 특이적 생성물을 증폭하기 위한 이러한 변형된 프라이머-주형의 연장을 방지하지 않으면서 원치 않는 증폭을 감소시키거나 제거한다는 발견에 기반한다. 본 발명의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드는 전술된 NEAR 구성요소 중 하나 이상을 포함하는 NEAR 반응에 유용하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 프라이머-주형의 3' 종단에 위치하거나 프라이머-주형의 3' 종단에 인접하여 위치하는 2' 변형(예컨대, 2' O-메틸, 2' 플루오로)을 포함하는 프라이머-주형 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 놀랍게도, 프라이머-주형의 3' 종단 영역에 위치하는 2' O-메틸 뉴클레오티드는 등온 DNA 증폭 반응에서 Bst DNA 중합효소 I의 5'-3' 엑소뉴클라제가 결핍된 유도체에 대한 효과적인 개시 기질을 포함할 뿐 아니라 이러한 변형된 프라이머-주형의 사용은 비특이적 프라이머-이량체 증폭을 완전히 억제한다. 이것은, 등온 DNA 증폭에 대한 당해 분야의 통상적인 사고가 2' O-메토일 및 프라이머의 3' 종단으로부터 6개의 뉴클레오티드 이내의 리보뉴클레오티드의 배치가 DNA 중합효소에 의한 프라이머의 연장을 저해하는 것으로 나타났으므로, 변형된 뉴클레오티드(예컨대, 2' O-메틸 리보뉴클레오티드, 미변형 리보뉴클레오티드)가 3' 종단으로부터는 떨어져서 프라이머/주형의 5 -종단 영역에만 도입될 수 있다는 것을 교시하기 때문에 특히 놀랍다(Amersham으로부터의 특허 출원 및 Qiagen으로부터의 특허를 참조로서 포함함). NEAR 및 다른 등온 증폭 기술(LAMP)에서 사용되는 Bst DNA 중합효소 I의 5'-3' 엑소뉴클라제가 결핍된 유도체는 낮은 합성 정확도 DNA 복구 과정에 관련된 polA-형 박테리아 DNA 중합효소에 속한다. 반대로, 박테리아에서 높은 정확도 게놈 복제는 DNA 복제를 개시하기 위해 오로지 RNA 프라이머만을 사용하는 DNAE- 및 POLC형 DNA 중합효소 III 전효소에 의해 촉진된다. 간행된 종래 기술에서, RNA 및 DNA 프라이머 사이의 구분은 높은 오차율의 DNA 중합효소 I 효소가 높은 정확도 게놈 복제를 방해하는 것을 방지하기 위한 하나의 기전으로 생각된다. 이러한 맥락에서, Bst DNA 중합효소 I의 유도체가 DNA 합성을 위한 프라이머로서 2' 변형 리보뉴클레오티드를 효율적으로 사용할 수 있다는 놀라운 발견은 주목할 만하고 반직관적이다.
프라이머-주형 설계
예시적인 중합효소 정지 독립체(entity) 구조는 5'으로부터 3'으로 안정화 서열, 절단 효소 인식 서열, 절단 효소 간격 서열, 및 표적 특이적 인식 서열을 포함하되, 표적 특이적 인식 서열은 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드(예컨대, 2' O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-플루오로, 2'-알릴, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'하이드록실(RNA), 4'-티오, 4'-CH2-O-2'-가교, 4'-(CH2) 2-O-2'-가교, 2'-LNA, 및 2'-O-(N-메틸카바메이트)를 포함한다. 이론에 얽매이지 않으면서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 인식 영역에 삽입하는 것은 이러한 변형된 영역이 프라이머/주형의 상호작용(예컨대, 프라이머-이량체 형성)으로 형성된 비특이적 분자 내 및/또는 분자 간 복합체에서 중합효소 연장을 위한 주형으로서 작용하는데 적합하지 않도록 함으로써 등온 증폭에서 배경 신호를 감소시키거나 제거하는 것으로 가정된다. 2' 변형 뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 서열과 염기쌍을 이루는 염기를 가진다. 특정 구현예에서, 표적 특이적 인식 영역 내 2종 이상의 2' 변형 뉴클레오티드(예컨대, 2, 3, 4, 5개 이상의 2' 변형 뉴클레오티드)는 연속적(예컨대, 변형된 뉴클레오티드들의 블록)이다. 일부 구현예에서, 2' 변형 뉴클레오티드들의 블록은 표적 특이적 인식 영역의 3' 말단에 위치한다. 다른 구현예에서, 2' 변형 뉴클레오티드들의 블록은 표적 특이적 인식 영역의 5' 말단에 위치한다. 2' 변형 뉴클레오티드의 블록이 표적 특이적 인식 영역의 5' 말단에 위치할 때, 2' 변형 뉴클레오티드들은 닉(nick) 자리로부터 하나 이상의 미변형 뉴클레오티드(예컨대, 2, 3, 4, 5 이상의 2' 미변형 뉴클레오티드)만큼 떨어져 있을 수 있다. 출원인들은 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들 또는 2' 변형 뉴클레오티드들의 블록을 위치시키는 것이 증폭의 동역학을 변경한다는 것을 밝혔다. 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들 또는 2' 변형 뉴클레오티드들의 블록이 인식 영역의 5' 말단에 위치하거나 인식 영역의 5' 말단에 가깝게 위치하거나 닉 자리에 근접하게 위치할 때, 실시간 증폭 반응은 검출 시간의 감소를 나타내었다. 추가적으로, 신호 곡선이 수축되었고, 곡선의 기울기가 전이되었다. 본 출원인들은 또한 길이가 12 뉴클레오티드를 초과하는 인식 영역에서는, 5개의 연속적인 2' 변형 뉴클레오티드의 단일 블록이 비특이적 증폭을 억제하기에 충분하지 않고, 따라서 닉 자리로부터 최대 4 또는 5개의 뉴클레오티드 하류의 전체 인식 영역이 미변형 뉴클레오티드와 교번하는 2' 변형 뉴클레오티드로 치환되어야 한다는 것을 밝혔다.
관련된 일 구현예에서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 가지는 프라이머/주형 올리고의 비는 반응을 "조정"하기 위해 시간-대-검출 및/또는 반응의 효율을 변경하기 위해 사용할 수 있고, 증폭 동역학에 대한 예측가능한 제어가 얻어진다. 인식 서열의 5' 말단에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 가지는 프라이머/주형 올리고에 대한 인식 서열의 3' 말단에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 가지는 프라이머/주형 올리고의 비를 증가시키는 것이 신호 곡선을 수축시켰고 곡선의 기울기를 전이시켰다. 반응을 "조정"할 수 있어서 시간-대-검출뿐 아니라 반응의 효율을 조작하기 위한 수단을 제공하는 것이 유리하다. 내부 대조군을 이용한 상대적인 정량화는 2가지의 중요한 조건이 충족되는 것을 요구한다. 첫번째로, 반응의 시간-대-검출을 변형하여 비경쟁적인 반응 조건을 생성하는 것이 이롭다. 따라서, (관심 있는 표적에 비하여) 후기 시점에서 검출될 수 있는 대조 반응에 영향을 미침으로써, 관심 있는 표적이 낮은 초기 풍부도로 존재할 때조차도 대조 반응이 관심 있는 특이적 표적에 우세하지 않게 한다. 두번째로, 실제 상대적 풍부도 계산을 보장하기 위해, 대조군 및 특이적 표적 반응이 매칭되는 효율을 가지는 것이 요구된다. "조정"조건을 사용하여 각 반응의 효율을 제어함으로써, 반응이 매칭되게 할 수 있고 만족스런 상대적 정량화 계산을 허용한다. 반응을 조정하는 것은 정량적 PCR(qPCR)에서 표적 핵산 증폭 및 참조 핵산 증폭(예컨대, 내부 표준)의 효율을 매칭하기 위해 사용될 수 있다. 추가적으로, 표적 핵산 및 내부 표준의 증폭 곡선이 변경되어 표적 핵산 증폭 및 내부 표준 증폭에 대한 동일한 효율을 제공하면서 그들의 증폭 생성물을 검출하는 시간이 분리될 수 있다. 반응 내에서 올리고뉴클레오티드 구조들의 특정 조합 및 비를 사용함으로써, 반응 성능 조정을 가능하게 하는 조건을 생성할 수 있다.
다양한 구현예에서, 프라이머/주형 쌍은 줄기 및 고리(stem and loop) 형태로 제작된다. 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 줄기의 적어도 일부를 형성하는 자기 상보적 영역을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 줄기는 절단 효소 인식 서열의 적어도 일 부분 또는 전체를 더 포함한다. 본 발명의 다른 다양한 구현예에서, 프라이머-주형 내 절단 효소 인식 서열은 이중 가닥 줄기 구조의 일부가 아니며, 대부분 단일 가닥인 루프 내의 잔기이다. 절단 효소 인식 자리는 3' 말단에서 절단 자리(3' 말단에서 표적 서열에 상보적인 서열에 연결됨)를 포함하는 2'차 구조 자유 자리에 연결된다. 원한다면, 표적 서열에 상보적인 서열은 2차 구조를 포함하거나 2차 구조가 결여될 수 있다. 자기 상보적 영역을 포함할 수 있는 2차 구조의 존재 여부는 특정 NEAR 검정을 최적화하기 위해 결정될 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 NEAR 반응을 제공하는데, NEAR 반응은 표준 NEAR 구성요소들을 포함하지만, 상보적인 DNA 가닥과 이종이중가닥으로 존재할 때 RNA 뉴클레오티드를 절단할 수 있는 효소도 포함한다. 일 구현예에서, 잘라진 RNA 뉴클레오티드는 PTO의 표적 상보적 영역의 5' 말단을 향하는 4 내지 15개의 잘라질 수 없는 RNA 뉴클레오티드(즉, O-2-Me-RNA)의 열로 존재할 것이고 주형 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 3' 종단 ‘캡(cap)'을 가질 것이다. 주형 올리고뉴클레오티드의 적절한 혼성화의 완료시에만, 이종이중가닥 절개(cleaving) 분자(즉, RNase H)가 RNA 염기를 잘라서 닉 번역 효소를 위한 3' 말단(여기서부터 연장됨)을 생성할 수 있어서; NEAR 반응이 진행되어 완료된다. 이상 주형 결합(프라이머 이량체, 부분적인 비 표적 혼성화 등)은 RNA-DNA 이종이중가닥의 형성을 야기하지 않기 때문에 NEAR 반응의 진행을 방지한다. 이러한 주형들은 오직 3'중합효소 연장
'캡'의 제거를 통해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 결합한 후에만 증폭될 수 있다. 이는 NEAR 반응의 특이성 및 민감성의 수준의 증가를 야기할 것이다.
본 발명의 주형 올리고뉴클레오티드는 NEAR 반응물에 포함되고, NEAR 반응물은 (1) 표적 핵산 분자; (2) 표적 핵산 분자에 상보적인 몇몇 개의 올리고뉴클레오티드 및 절단 효소에 의해 잘라질 수 있는 자리를 포함하고 4 내지 15개의 RNA 뉴클레오티드(그 중 하나는 RNase 감수성)로 구성된 2종의 주형 올리고뉴클레오티드 분자; (3) dNTP; (4) 중합효소가 이동하는 가닥; (5) 절단 효소; 및 (6) DNA-RNA 이종이중가닥 RNA 절단 효소 및 3' 종단 중합효소 연장 캡을 포함한다. 따라서, 본 발명은 표적 핵산 분자를 정량하기 위해 이러한 구성요소들을 사용하는 방법을 제공한다.
방법은 실직적으로 등온 조건 하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종의 주형 올리고뉴클레오티드(각각이 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소 및 3' 말단 중합효소 연장 캡을 가지는 DNA-RNA 이종이중가닥 절단 효소(예컨대, RNase H)에 접촉시키는 단계; 표적 서열에 결합하는 주형 올리고뉴클레오티드의 적어도 일 부분을 포함하는 검출가능한 암플리콘을 생성하는 단계를 포함한다.
표적 핵산 분자
본 발명의 방법 및 조성물은 시험 시료 내 표적 핵산 분자의 식별에 유용하다. 표적 서열은 사실상 표적 핵산 분자를 포함하는 임의의 시료(이에 제한되지는 않으나, 진균류, 포자, 바이러스 또는 세포(예컨대, 원핵생물, 진핵생물)를 포함하는 시료)로부터 증폭된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 클라비박터 미치가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus), 슈도모나스 시린개 피브이. 토마토(Pseudomonas syringae pv Tomato), 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 베시카토리아(Xanthomonas campestris pv Vesicatoria), 알타나리아 속(Alternaria spp), 클라도스포리움 속(Cladosporium spp), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 버티실리움 달리에(Verticilium dahlia), 슈도모나스 커루가타(Pseudomonas currugata), 어위나 카로토보라(Erwina carotovora), 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)을 검출한다. 예시적인 시험 시료는 체액(예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 양수, 가래, 소변, 뇌척수액, 림프, 눈물 유체, 대변 또는 위장관 유체), 조직 추출물, 배양 배지(예컨대, 세포, 예를 들면 병원균 세포를 성장시킨 액체), 환경적 시료, 농업 생성물 또는 다른 식품류 및 그들의 추출물, DNA 식별 태그를 포함한다. 원한다면, NEAR 반응에 포함되기 이전에 생물학적 시료로부터 핵산 분자를 단리하기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 표준 방법을 이용하여 시료를 정제한다.
일 구현예에서, 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드는 시료 내 병원균의 존재를 검출하기 위해 병원균의 표적 핵산을 증폭한다. 예시적인 병원균은 진균류, 박테리아, 바이러스 및 효모를 포함한다. 이러한 병원균은 시험 시료 내 병원균 단백질(예를 들면, 독소)을 암호화하는 핵산 분자를 식별함으로써 검출될 수 있다. 예시적인 독소는, 이에 제한되지는 않으나, 아플라톡신, 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 살모넬라 독소, 시가(Shiga) 독소, 클로스트리디윰 보툴리늄(Clostridium botulinum) 독소, 내독소, 및 미코톡신(mycotoxin)을 포함한다. 환경적 적용에서, 시험 시료는 물, 공기 필터의 액체 추추물, 토양 시료, 건축재(예컨대, 건식벽체, 천정 타일, 벽판, 천, 벽지 및 바닥 깔개), 환경적 면봉 채취물 또는 임의의 다른 시료를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 식물의 가뭄에 대한 저항성, 식물의 제초제, 해충에 의한 포식에 대한 저항성의 개선에 맞추어진 분자 육종 실험에서 내부 대조군으로서 사용되는 식물의 표적 핵산을 증폭한다. 본원에서의 방식으로 된 이러한 내부 대조군 표적 뉴클레익의 일 예는 옥수수로부터의 알코올데하이드로게나제 1 유전자(alcoholdehydrogenase 1, ADH1)이다.
표적 핵산 분자는 이중 가닥 및 단일 가닥 핵산 분자(예컨대, DNA, RNA 및 본원에 기술된 핵산 분자와 혼성화될 수 있는 것으로 당해 분야에 공지된 다른 핵염기 중합체)를 포함한다. 본 발명의 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 검출가능한 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드로의 검출에 적합한 RNA 분자는, 이에 제한되지는 않으나, 표적 서열을 포함하는 이중가닥 및 단일가닥 RNA 분자(예컨대, 메신저 RNA, 바이러스 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 마이크로 RNA, 및 마이크로 RNA 전구체 및 siRNA 또는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 다른 RNA)를 포함한다. 본 발명의 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드로의 검출에 적합한 DNA 분자는, 이에 제한되지는 않으나, 이중가닥 DNA(예컨대, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, 및 합성 이중가닥 DNA)를 포함한다. 단일 가닥 DNA 표적 핵산 분자는, 예를 들어, 바이러스 DNA, cDNA 및 합성 단일 가닥 DNA 또는 당해 분야에 공지된 다른 유형의 DNA를 포함한다.
일반적으로, 검출을 위한 표적 서열은 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(예컨대, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 뉴클레오티드) 사이이다. 표적 핵산 분자의 GC 함량은 약 45, 50, 55, 또는 60% 미만이 되도록 선택된다. 바람직하게, 표적 서열 및 절단 효소는 표적 서열이 반응 혼합물에 포함될 임의의 절단 효소에 대한 절단 자리를 함유하지 않도록 선택된다.
검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브
본 발명은 적어도 하나의 중합효소 정지 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산 분자에 결합할 수는 있지만 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브를 표적으로서 사용하여 주형 연장을 지지할 수 없게 하는 뉴클레오티드 변형 또는 다른 모이어티)를 포함하는 증폭가능 하지 않은 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하는 NEAR 반응에서 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 정량적인 검출을 제공한다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 중합효소를 진행할 수 없게 하는 하나 이상의 모이어티의 존재는 올리고뉴클레오티드에 대한 비 핵산 골격 첨가에서 또는 복제형 중합효소의 지연(즉, C3-간격, 손상된 DNA 염기, 다른 간격 모이어티, O-2-Me 염기)을 통해 중합효소 정지를 유발하는 경향이 있다. 이러한 구성은 따라서 NEAR 반응의 과정 중에 프로브의 원치않는 증폭을 감소시키거나 방지한다. 이는 증폭을 방지하기 위해 NEAR 반응의 종료 시 첨가되어야만 하는 통상적인 검출 프로브로부터 이들을 차별화한다.
통상적인 검출 프로브는 실시간으로 NEAR 반응을 정량하기에 비실용적인 것으로 입증되었다. 만일 통상적인 검출 프로브가 NEAR 반응물 내에 포함된다면, 이러한 통상적인 검출 프로브는 표적과 동시에 증폭된다. 이러한 검출 분자의 증폭은 반응의 시작 시 검출 프로브의 검출 분자의 시작 분자의 수로 인해 진정한 표적 암플리콘의 검출을 감춘다.
본 발명은 최소 하나의 중합효소 정지 분자를 포함하는 증폭가능하지 않는 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공한다. 본 발명의 중합효소 정지 분자는, 이에 제한되지는 않으나, 뉴클레오티드 변형 또는 복제형 DNA 중합효소에 의한 프라이머-주형 연장을 차단함으로써 검출 분자의 증폭을 방지하지만 표적 분자 또는 표적 분자의 증폭된 카피에 대한 적절한 혼성화 또는 뉴클레오티드 간격 띄움을 허용할 수 있는 다른 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브는 검출 분자의 원치않는 증폭을 감소시키거나 방지하는 3 탄소 간격(C3-간격)을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 모이어티를 포함하는 헤어핀 형상의 올리고뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 증폭가능하지 않는 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브는 하나의 말단에 형광단 그리고 반대 말단에 ?칭 염색제를 포함하는 헤어 핀 형상의 올리고뉴클레오티드이다. 헤어핀의 루프는 표적 서열에 상보적이고 표적 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 헤어핀의 줄기는 루프의 양 측에 위치한 상보적인 암(arm) 서열을 어닐링함으로써 형성된다. 형광단 및 ?칭 분자는 각 암의 대향하는 말단에 공유 결합된다. 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브가 헤어핀 형태 내에 존재할 때, 형광 및 ?칭 분자는 서로 근접하고, 따라서, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 및 형광단의 형광의 ?칭을 야기한다. 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브가 표적 분자를 만나면, 혼성화가 일어난다; 루프 구조가 표적 분자와의 이중가닥 구조로 전환되어, 형광단과 ?칭 분자의 분리를 유발하여 형광이 발생한다(Tyagi et al. Nature Biotechnology 14: March 1996, 303-308).
검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 서열에 특이적이다. 일 구현예에서, 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브는 상보적인 뉴클레오티드에 대해 향상된 결합 친화도를 가지는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 염기를 가진다. 염기의 예는, 이에 제한되지는 않으나, 잠금 핵산(locked nucleic acids, LNA), 2' 플루오로 아미디티(amidite) 및 2?Me RNA 아미디티(중합효소 정지 분자로서도 기능함)를 포함한다. 본 발명의 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브는 상이한 색을 나타내는 형광단으로 합성될 수 있고 사실상 임의의 표적 서열에 혼성화되도록 설계될 수 있다. 그들의 주목할만한 특이성의 관점에서, 본 발명의 증폭가능하지 않은 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브는 시료 내 단일 표적 핵산 분자를 검출하기 위해 사용되거나 각각 상이한 표적 핵산 분자에 결합하는 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 증폭가능하지 않는 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브는 동일한 반응에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있어서, 이러한 표적들이 동시에 정량될 수 있게 한다. 본 발명은 본원에 기술된 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브와 조합된 이러한 형광단의 사용을 포함한다.
증폭가능하지 않은 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브의 사용
증폭가능하지 않은 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브는 절단 및 연장 증폭 반응(NEAR)에서 표적 핵산 분자를 정량하기 위한 방법에 유용하다. 본 방법은 실질적으로 등온 조건 하에 표적 핵산 분자를 적합한 완충액 및 dNTP의 존재 하에 중합효소, 2종의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계; 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및 반응 내 프로브 분자로부터의 형광 강도에 기반하여 표적 핵산 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 반응 중에 실시간으로 정량함으로써 반응물 내 존재하는 표적 핵산 분자의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 유리하게, 이러한 방법은 NEAR을 실시간으로 모니터링하는 데 유용하다.
일반적으로, 본 발명의 증폭가능하지 않는 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브는 NEAR 반응물에 포함되고, NEAR 반응물은 (1) 표적 핵산 분자; (2) 표적 핵산 분자에 상보적인 몇몇 개의 올리고뉴클레오티드 및 절단 효소에 의해 잘라질 수 있는 자리를 포함하는 2종의 주형 올리고뉴클레오티드 분자; (3) dNTP; (4) 중합효소가 이동하는 가닥; 및 (5) 절단 효소를 포함한다. 따라서, 본 발명은 표적 핵산 분자를 정량하기 위해 이러한 구성요소들을 사용하는 방법을 제공한다.
NEAR 검정
본 발명은 NEAR 검정에서 증폭되는 표적 핵산 분자의 검출을 제공한다. 이러한 검정법은 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 포함된 미국 특허 출원 공개 2009/0081670, PCT 출원 2009/012246, 및 미국 특허 제7,112,423호 및 제7,282,328호를 참조한다. 본원에 기술된 방법에 유용한 중합효소는 표적 핵산 분자에 결합된 올리고뉴클레오티드(예컨대, 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드 또는 다른 프라이머)의 3' 하이드록실 종단을 연장하기 위한 뉴클레오티드의 삽입을 촉진할 수 있다. 이러한 중합효소는 호열성인 것들 및/또는 가닥 교체가 가능한 것들을 포함한다. 본원에 기술된 방법에 유용한 중합효소는 5'-3' 엑소뉴클라제 활성이 결여되어 있는데, 그렇지 않다면, 교체된 단일 가닥 핵산 가닥이 분해된다. 올리머라제(olymerase)는 또한 역전사 효소 활성을 가진다(예컨대, Bst DNA 중합효소의 유도체(큰 단편), Therminator DNA 중합효소, Therminator II DNA 중합효소). 예시적인 중합효소는, 이에 제한되지는 않으나, Bst DNA 중합효소 I의 Bst 큰 단편, E. 콜라이 DNA 중합효소 I(클레나우(Klenow) 단편), 클레나우 단편(3'-5' 엑소-), T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Deep VentR.(엑소-) DNA 중합효소, Deep VentR DNA 중합효소, Therminator, Therminator II DNA 중합효소, AmpliTherm DNA 중합효소, SP6 DNA 중합효소를 포함한다. 다음의 역전사 효소(RT)의 비제한적인 예는 RNA 서열을 검출할 때 성능을 개선하기 위한 본 방법의 반응에 사용될 수 있다: OmniScript(Qiagen), SensiScript(Qiagen), MonsterScript(Epicentre), Transcriptor(Roche), HIV RT(Ambion), SuperScript III(Invitrogen), ThermoScript(Invitrogen), Thermo-X(Invitrogen), ImProm II(Promega).
절단 효소는 이중 가닥 DNA 내 인식 서열에 결합하고 이중 가닥 나선의 하나의 가닥을 자른다. 절단 효소는 그들의 인식 자리의 상류 또는 하류 또는 효소의 인식 자리 내를 자를 수 있다. 본원에 개시된 방법에서, 인식 자리의 하류의 상부 가닥을 절단하는 절단 효소만이 프라이머-주형 사이의 표적 핵산 단편의 기하급수적인 증폭을 유도하는 기질 DNA 절단 및 중합효소에 의한 닉 연장의 반복적인 사이클을 시작하기 위해 사용될 수 있다. 이상적으로, 절단 효소는 중합효소와 동일한 반응 조건 하에서 기능적이다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 절단 효소는 열안정적이고 50℃내지 60℃에서 활성이다. 본원에 개시된 방법에 유용한 예시적인 절단 효소는, 이에 제한되지는 않으나, Nt.BspQI(NEB), Nt.BspD6I, Nt.BsmAI(NEB), Nt.AlwI(NEB), Nt.BbvCI(NEB), N.Bst9I(Sibenzyme), 및 Nt.BstNBI(NEB)을 포함한다.
NEAR 반응은 통상적으로, 예를 들어, 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)와 같은 뉴클레오티드들을 포함한다. 반응은 또한 방사성표지(예컨대, 32P, 33P, 125I, 35S), 효소(예컨대, 알칼라인 포스파타제), 형광 표지(예컨대, 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)), 비오틴, 아비딘, 디옥시게닌, 항원, 합텐, 또는 형광색소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 모이어티를 포함하는 dNTP 존재 하에 수행될 수 있다. NEAR 반응은 절단 효소 및 중합효소의 활성을 제공하는 일정한 염 및 완충액을 더 포함한다.
유리하게, NEAR 반응은 증폭 반응의 과정 동안 반응의 온도가 거의 일정한 실질적으로 등온인 조건하에 수행된다. 온도가 높은 온도와 낮은 온도 사이에서 순환할 필요가 없기 때문에, NEAR 반응은 통상적인 PCR이 수행되기 어려울 수 있는 조건 하에 수행될 수 있다. 통상적으로, 반응은 약 35℃ 내지 90℃ (예컨대, 35, 37, 42, 60, 65, 70, 75, 80, 또는 85℃)에서 수행된다. 유리하게는, 높은 정확도로 온도가 유지되는 것이 필수적이지는 않다. 온도에서의 약간의 가변성은 허용가능하다.
(이에 제한되지는 않으나) 에틸렌 글리콜 및 글리세롤과 같은 융해 온도(Tm) 및 반응 속도 조절제가 또한 올리고뉴클레오티드의 융해 온도를 낮추기 위해 사용될 수 있다. 또한, (dNTP 및 농축 마그네슘과 같은) DNA 중합효소 반응 속도 조절제는 반응 속도를 변경하여 더 큰 정량화 정확도를 야기하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 전술되고 특허 US007112423B2 및 US20090017452A1에 기술된 바와 같은 NEAR 증폭 전략을 사용하여 NEAR 반응을 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 정량적인 NEAR은 공지된 양의 대조군 증폭과 함께 표적 핵산 증폭을 사용한다. 표적 핵산의 양은 대조군의 공급원(외인성 또는 내인성 대조군)에 기반하여 절대적인 정량화 또는 상대적인 정량화(반(semi)-정량적)으로 계산될 수 있다.
미지의 뉴클레오티드 서열의 정량은 별개의 세트의 반응에서 또는 동일한 반응에서 일련의 공지된 표적 서열에 미지의 로그 임계 증폭을 비교; 또는 (미지가 임계를 초과한다면) 양성 결과 또는 (미지가 임계를 초과하지 않는다면) 음성 결과를 나타내는 임계값을 생성하는 내부의 내인성 또는 외인성 공동 증폭 생성물 중 하나를 통해 달성될 수 있다.
적용
본 발명은 시작 표적 핵산의 양의 정량적인 측정을 제공할 수 있는 등온 증폭 NEAR 반응의 실시간 모니터링을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 빠른 정량적 답(예컨대, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5분 이하에 검출가능한 증폭)을 원하는 인간 진단에 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명은 임상적 설정에서 인간 진단에서의 NEAR 반응 검정의 사용을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 열사이클 장비로의 접근이 가능하지 않거나 터무니없이 비쌀 수 있는 진단 분야 작업에서의 NEAR 반응 검정의 사용을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 빠른 정량적인 답을 원하는 학문적 설정에서의 NEAR 반응 검정의 사용을 제공한다.
키트
본 발명은 또한 표적 핵산 분자의 증폭을 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 대상체로부터 수득된 생물학적 시료 내 표적 핵산의 검출 또는 정량에 유용하다. 본 발명의 키트는, 예를 들어, 본원에 기술된, 하나 이상의 중합효소, 정방향 및 역방향 프라이머-주형, 및 하나 이상의 절단 효소를 포함할 수 있다. 하나의 표적이 증폭될 경우, 하나 또는 두개의 절단 효소가 키트 내에 포함될 수 있다. 다수의 표적 서열이 증폭될 것이고, 이러한 표적 서열에 대해 설계된 프라이머-주형이 동일한 절단 효소를 위한 절단 효소 자리를 포함하는 경우, 하나 또는 두개의 절단 효소가 포함될 수 있다. 프라이머-주형이 상이한 절단 효소에 의해 인식되는 경우, 예를 들어, 3개 이상과 같이, 더 많은 절단 효소가 키트 내에 포함될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (예컨대, 증폭에 충분한 구성요소들을 함유하는 완충 용액 내에) DNA 중합효소; 1차 프라이머-주형, 2차 프라이머-주형, 프라이머-주형 내 절단 효소 인식 자리에 특이성을 가지는 절단 효소, 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)를 포함하는 핵산 증폭을 위한 키트를 제공한다. 다양한 구현예에서, 각각 표적 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 3' 말단 특이적 인식 영역 서열을 가지되, 말단 특이적 인식 영역이 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드를 포함하는 1차 프라이머-주형 및 2차 프라이머-주형; 3' 말단 특이적 인식 영역 서열의 상류에 절단 효소 인식 자리를 함유하는 5' 말단 꼬리 서열; 및 절단 효소 결합 자리의 상류(5' 의 안정화 서열을 가진다.
일 양태에서, 본 발명의 키트는 표적 핵산을 제외한, dNTP, 정방향 및 역방향 프라이머-주형, 절단 효소, 중합효소, 검출가능한 표적 특이적 폴리뉴클레오티드 프로브, 반응 완충액 및 안정화제를 포함하나 이로 제한되지는 않는 모든 NEAR 반응 구성요소들의 균일한 혼합물을 포함한다.
본 발명의 키트는 또한 하나 이상의 구성요소를 임의의 수의 별개의 용기, 패킷, 튜브(예컨대, <0.2 ml, 0.2 ml, 0.6 ml, 1.5 ml, 5.0 ml, >5.0 ml), 바이알, 마이크로 역가 플레이트(예컨대, <96-웰, 96-웰, 384-웰, 1536-웰, >1536-웰), ArrayTape 등 내에 포함할 수 있거나, 구성요소들이 이러한 용기들의 다양한 조합과 조합될 수 있다. 다양한 구현예에서, 키트는 참조 서열에 결합하고 참조 서열을 증폭할 수 있는 한 쌍의 프라이머-주형 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 프라이머-주형 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있는 멸균 용기를 포함하고; 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터 팩 또는 당해 분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층된 종이, 금속 호일, 또는 핵산을 고정하기에 적합한 임의의 다른 물질로 제조될 수 있다.
키트의 구성요소는, 예를 들어, 하나 이상의 용기 내에 존재할 수 있고, 예를 들어, 구성요소 전체가 하나의 용기 내에 존재할 수 있거나, 예를 들어, 효소가 주형으로부터 별개의 용기 내에 존재할 수 있다. 구성요소는, 예를 들어, 건조(예컨대, 건조 잔기)되거나, 동결건조(예컨대, 건조 케이크)되거나 또는 적합한 (예컨대, 화학적으로 안정화된, 열적으로 안정화된) 완충액 내에 존재할 수 있다. 건조 구성요소는, 예를 들어, 감압동결건조, 진공 및 원심분리 지원형 건조 및/또는 상압건조에 의해 제조될 수 있다. 다양한 구현예에서, 중합효소 및 절단 효소는 감압동결건조된 형태로 단일 용기 내에 존재하고, 주형은 상이한 용기 내에 감압동결건조되거나 동결건조되거나, 완충액 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 중합효소, 절단 효소, 및 주형은 감압동결건조된 형태로 단일 용기 내에 존재한다. 다른 구현예에서, 중합효소 및 절단 효소는 상이한 용기로 분리된다.
키트는, 예를 들어, 반응에서 사용되는 dNTP 또는 변형된 뉴클레오티드, 반응을 위해 사용되는 큐벳, 또는 다른 용기들, 또는 감압동결건조된 구성요소들의 재수화를 위한 물 또는 완충액의 바이알을 더 포함할 수 있다. 사용된 완충액은, 예를 들어, 중합효소 및 절단 효소 활성 모두에 적절할 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 본원에 기술된 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 지시서 및/또는 본원에 기술된 하나 이상의 조성물 또는 시약의 설명서를 포함할 수 있다. 지시서 및/또는 설명서는 인쇄된 형태일 수 있고, 키트 인서트 내에 포함될 수 있다. 키트는 또한 이러한 지시서 또는 설명서를 제공하는 인터넷 위치의 서면 설명서를 포함할 수 있다.
키트는 또한 (예컨대, 실시간 또는 종점) 검출 방법을 위해 사용되는 (예를 들면, 혼성화 프로브 또는 DNA 결합 염색제와 같은) 시약을 포함한다. 키트는 검출 방법에 사용되는 시약, 예를 들면, FRET를 위해 사용되는 시약, 측방 유동 디바이스, 딥스틱, 형광 염색제, 콜로이드성 골드 입자, 라텍스 입자, 분자 비콘(beacon), 또는 폴리스티렌 비드를 더 포함한다. 검출 구성요소는 측방 유동 디바이스에 포함될 수 있다. 측방 유동 디바이스는 현장 진단에 사용될 수 있다.
본 발명의 실행은, 다르게 지시되지 않는 한, 당업자의 이해 범위 이내인 분자 생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 채용한다. 이러한 기술들은 문헌("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology"(Coligan, 1991))에 완전히 설명되어 있다. 이러한 기술들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성에 적용될 수 있고, 이와 같이, 본 발명을 만들고 실시하는 것으로 간주될 수 있다. 특정 구현예들에 대한 특히 유용한 기술들이 하기의 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예들은 당업자에게 본 발명의 검정, 선별 및 치료적 방법을 어떻게 만들고 어떻게 사용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 작성되었고, 본 발명자가 그들의 발명에서 고려하고 있는 것의 범주를 제한하기 위한 의도가 아니다.
실시예
현재, NEAR 반응은 시료 내 표적 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 빠르게 그리고 등온으로 검출하기 위해 사용된다. 기술적인 제한으로 인해, 통상적인 NEAR 방법은 적어도 부분적으로 표적 암플리콘의 검출 및 정확한 정량화를 모호하게 하는 시료 내 비표적 분자의 원치 않는 증폭으로 인하여 실시간 표적 올리고뉴클레오티드의 정량화에 적합하지 않다. 본 발명은 원치 않는 증폭에 대해 감수성이 없는 검출가능한 프라이머/주형을 제공함으로써 이러한 제한을 극복하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 정량화가능한 NEAR 검정은 NEAR 반응 중에 비표적 분자의 원치 않는 증폭을 감소시키거나 방지하는 하나 이상의 2' O-Me 변형을 포함하는 프라이머를 채용한다. 현재, NEAR 증폭 검정의 설계는 표적 핵산 내에 적어도 하나의 자연적으로 발생하는 절단(nicking) 효소 인식 자리에 근접한 매우 짧은 영역으로 제한된다. 이러한 닉(nick) 자리로부터 개시되는 가닥 교체 합성은 짧은 표적 특이적 영역을 가지는 프라이머-주형이 결합하여 절단/중합효소 연장 표적 증폭 반응의 사이클을 시작할 수 있는 단일 가닥의 표적 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 더 긴 표적 특이적 영역을 가지는 프라이머-주형을 사용함으로써 이러한 제한을 극복하는 조성물 및 방법을 제공함으로써, 증폭 반응의 제1 단계 중에 가닥 교체 합성의 도움 없이 50℃ 내지 60℃에서 가닥 침투를 할 수 있다. 프라이머-주형 내 더 긴 표적 특이적 영역은 비특이적 증폭 생성물의 합성을 시작할 수 있는 연장가능한 3' 말단과의 비특이적 DNA 혼성화의 형성하기 위한 보다 현실적인 상태를 제공하는 단점을 가진다. 본 발명의 조성물은 표적 특이적 영역 전체를 포괄하기 위해 3' 종단의 5개의 연속적인 변형된 뉴클레오티드의 블록을 넘어서 2' 변형 및 미변형 뉴클레오티드의 교번 서열을 사용하여 2' 변형 뉴클레오티드의 배치를 연장함으로써 이러한 단점을 경감한다.
실시예 1: 2' O-메틸 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머-주형 올리고뉴클레오티드는 NEAR 증폭에서 배경 신호를 감소시키거나 제거한다.
NEAR 증폭이 투입 표적 핵산 없이 수행될 때(즉, 무표적 대조군; NTC), 주형의 부재에도 불구하고 신호가 생성된다. 따라서, 배경 신호의 생성은 NEAR 증폭을 사용한 표적 핵산 정량의 정확도를 낮출 가능성을 가진다. 배경 신호는, 부분적으로, 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드에 의한 프라이머-이량체의 형성에 의해 생성되는 것으로 가정되어왔다. 이론에 얽매이지 않으면서, 2' 변형 뉴클레오티드를 포함하는 중합효소 정지 구조는 프라이머/주형의 분자내 및/또는 분자간 상호작용(예컨대, 프라이머-이량체 형성)을 감소시키거나 제거하기 위해 사용될 수 있고, 따라서, NEAR 검정에서 배경 신호를 감소시키거나 제거한다.
예시적인 중합효소 정지 독립체 구조는 5' 으로부터 3'으로 안정화 서열, 절단 효소 인식 서열, 절단 효소 간격 서열 및 표적 특이적 인식 서열을 포함하되, 표적 특이적 인식 서열은 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드(예컨대, 2' O-메틸 리보뉴클레오티드)를 포함한다. 2개 이상의 2' 변형 뉴클레오티드가 표적 특이적 인식 서열 내에 존재할 때, 2' 변형 뉴클레오티드는 연속적(예컨대, 2, 3, 4, 5 이상의 2' 변형 뉴클레오티드)일 수 있다. 클라비박터 미치가넨시스 세피도니쿠스(Clavibacter michiganensis sepidonicus, Cms) 합성 이중 가닥 표적 DNA 분자의 역가측정은 형광비콘(fluorobecon)을 통한 검출을 사용하여 평가되었다. 표적 DNA는 표적 서열 및 단일 닉 자리를 가지도록 설계된 합성된 250개의 염기쌍 DNA " 긴단위체(longmer)"의 모액으로부터 계대희석되었다.
2'-O-메틸 변형된 주형 함유 반응에서 무표적 대조군(NTC)들 내 신호가 억제되었다(도 2a). 2'-O-메틸 주형 반응을 사용한 표준 곡선은 넓은 동적 범위를 나타내었다(도 2b). 무표적 대조군 반응의 시료(10 μl)는 HPLC/질량 분석을 사용하여 분석되었고 배경 증폭 생성물의 억제를 확인하였다(도 2c). 미변형 올리고를 사용한 반응으로부터 유래된 스펙트럼은 미반응 주형과 함께 비특이적 배경 생성물로부터 유래된 다중 증폭 생성물로 구성된 복합 스펙트럼을 보여주었다(도 2c, 왼쪽 패널). 2' O-메틸 변형 올리고를 사용한 반응으로부터 유래된 스펙트럼은 비특이적 배경 생성물 없이 미반응 주형으로 구성된 단순한 스펙트럼을 나타내었다(도 2c, 오른쪽 패널).
2' O-메틸 변형 주형 함유 반응의 생물학적 시료의 증폭에 대한 효과를 연구하기 위해, 게놈 클라비박터 미치가넨시스 세피도니쿠스(Cms)를 표적 DNA로 사용하였다. 증폭된 생성물은 이중 가닥 DNA를 검출하는 SYBR 그린(도 3a 및 3b) 또는 특이적 생성물을 검출하는 분자 비콘(도 4a 및 4b)에 의한 검출이었다. 표준 반응이 DNA 올리고뉴클레오티드 주형으로 수행되었고(도 3a 및 4a) 2' O-메틸 변형 주형을 함유하는 반응(DNAble) 반응이 표적 특이적 인식 서열 내 3' 말단에 5개의 연속적인 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록을 함유하는 올리고뉴클레오티드로 수행되었다(도 3b 및 4b). 무표적 대조군(NTC)내의 신호는 2' O-메틸 변형 주형 함유 반응에서 억제된 반면(도 3b 및 4b), 무표적 대조군(NTC)에서 표적 DNA 부재하에 배경 생성물의 생성을 나타내는 유의한 신호가 관찰되었다(도 4a 및 4b).
따라서, 이러한 결과는 2' O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머가 NEAR 증폭에서 배경 신호를 감소시키거나 제거한다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드에 2' O-메틸 뉴클레오티드를 위치시키는 것은 NEAR 반응의 효능 및 시간-대-검출을 변경한다.
특이성 영역 내의 상이한 위치에 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드를 가지는 예시적인 중합효소 정지 독립체가 NEAR 증폭 반응에 사용되었고, 그들의 반응 동역학을 연구하였다. 특히, 특이성 영역의 3' 말단 또는 특이성 영역의 5' 말단(닉 자리로부터 2개의 뉴클레오티드 하류)에 위치된 5개의 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록을 가지는 올리고뉴클레오티드 한 쌍을 포함하는 프라이머/주형이 연구되었다(도 5). 표준 반응은 3' 말단에 상 또는 닉 자리 이후의 3번째 뉴클레오티드부터 시작하고 5개의 염기에 대해 계속되는 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록 또는 이들 2개의 구조의 혼합으로 지시된 바와 같이 2회 수행되었다. 표적 DNA는 게놈 클라비박터 미치가넨시스 세피도니쿠스(Cms)였다. 검출은 100 nM의 최종 농도의 분자 비콘(beacon)을 기반으로 한다.
프라이머/주형 올리고뉴클레오티드의 특이성 영역 내 상이한 위치에 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드를 가지는 반응 속도 조절 독립체는 상이한 증폭 동역학을 나타내었다(도 6). 3' 말단에 5개의 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록을 가지는 프라이머/주형을 사용하는 반응은 닉 자리 이후 3번째 뉴클레오티드에서 시작하여 5개의 2' O-메틸 뉴클레오티드의 블록을 가지는 프라이머/주형("닉 + 2" 주형; 430초)에 비하여 검출하는 시간의 감소("종단"(terminal)" 주형; 170초)를 나타내었다. 따라서, 2종의 프라이머/주형 올리고의 비가 반응의 '조정' 을 위해 시간-대-검출 및/또는 반응의 효율을 조작하는데 사용될 수 있는 것으로 가정하였다. 다양한 비의 "종단" 주형": "닉 + 2" 주형주형의 반응은 2개의 주형의 시간-대-검출 사이인 중간의 시간-대-검출을 나타내었다(도 6). 추가적으로, "종단" 주형: "닉 + 2" 주형”의 비의 증가로, 곡선은 수축되었고 곡선의 기울기가 전이되었다. 따라서, 2' 변형 뉴클레오티드를 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드 내에 위치시키는 것 및 상이하게 위치한 2' 변형 뉴클레오티드를 가지는 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드의 비는 NEAR 반응의 효능 및 시간-대-검출 및 효능을 변경하였다. 본 발명은 적어도 부분적으로 이러한 발견에 기반한다.
실시예 3: NEAR 검정에서 비특이적 증폭의 긴 표적 특이적 영역을 가지는 프라이머-주형을 사용한 완전한 억제
옥수수 알코올 데하이드로게나제 1 유전자(ADH1)을 정량화하기 위한 NEAR 검정은 2종의 교번하는 정방향 및 역방향 프라이머-주형의 세트를 사용하여 설계되었다(TS3 및 TS3). 어떠한 적합한 절단 효소 인식 자리도 옥수수 gDNA의 표적 서열 영역으로부터 500 뉴클레오티드 상류 또는 하류 내에 위치할 수 없었다. 2종의 프라이머-주형 세트는 표적 DNA와 가닥 침입 매개 혼성화할 수 있는 더 긴 표적 상보성 영역(각각 16 및 19개의 뉴클레오티드)을 특징으로 한다. 제1 세트(TS3)에서, 정방향 및 역방향 프라이머-주형의 표적 상보성 영역은 3' 종단 데옥시뉴클레오티드의 바로 상류에 5개의 연속적인 2' O-메틸 변형 리보뉴클레오티드의 블록을 함유한다. 표적 서열 상보성 영역의 나머지는 교번하는 미변형 데옥시뉴클레오티드 및 닉 자리로부터 5개의 뉴클레오티드(정방향 프라이머-주형) 또는 4개의 뉴클레오티드(역방향 프라이머-주형) 하류에서부터 시작되는 2' O-메틸 리보뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 프라이머-주형의 제2 세트(TS6)는 오직 3'-종단 미변형 데옥시뉴클레오티드에 인접한 5개의 2' O-메틸 리보뉴클레오티드의 블록만을 특징으로 하며, 표적 상보성 영역의 나머지는 오직 미변형 데옥시뉴클레오티드만 포함한다.
10 마이크로리터 NEAR 반응은 3.84 U Warmstart 2.0 Bst DNA 중합효소1(NEB), 10K 합성 옥수수 ADH1 표적 DNA의 카피, 0.3 mM dNTP, 3 U Nt.BstNBI 절단 효소, 200 nM ROX/BHQ-표지된 ADH1 분자 비콘 프로브, 0.5X SYBR 그린 염색제(LifeTechnologies), 1000 nM TS3 또는 TS6 역방향 프라이머-주형 및 100 nM TS3 또는 TS6 정방향 프라이머-주형을 사용하여 50 mM Tris pH 8.0, 15 mM (NH4)2SO4, 15 mM Na2SO4, 및 15 mM MgSO4 내에 설정되었다. 한 세트의 무표적 DNA 대조군 반응(NTC)이 합성 옥수수 ADH1 표적 DNA 없이 동일한 구성요소로 제조되었다. 모든 반응물을 56℃에서 15분간 인큐베이션하였고, 형광 신호는 520 nm(SYBR그린) 및 610 nm(ROX)에서 기록하였다.
SYBR그린(도 8) 및 ROX(도 9) 검출 채널 내 반응을 포함하는 표적 DNA의 증폭 도표를 SYBR그린 검출 채널(도 10) 내 NTC 반응의 증폭 도표와 비교.
본원에 보고된 결과는 다르게 지시되지 않는 한 하기의 방법 및 물질을 사용하여 수득되었다.
NEAR 증폭 반응
반응물(50 μl)은 15 mM MgSO4, 0.3 mM dNTP, 19.2 단위 Bst 중합효소, 15 단위 n.BstNBI, 1000 nM 주형 1, 및 200 nM 주형 2를 함유하였다. 표적 DNA는 게놈 클라비박터 미치가넨시스 세피도니쿠스(Cms) 또는 Cms 서열에 기반한 ?芽騈㎴?였다. 주형 및 표적을 10 μl의 총 부피로 56℃에서 30초간 사전인큐베이션하였다. 남은 반응 구성요소의 마스터 혼합물을 40 μl 최종 부피로 56℃에서 30초간 사전인큐베이션하였다. 마스터 혼합물을 주형 및 표적과 조합하고, 형광 검출물(SYBR 그린 또는 분자 비콘)과 함께 56℃에서 10분간 인큐베이션하고, 인큐베이션 중 매 10초마다 수집하였다. 반응물을 2분의 95℃ 단계로 "열 사멸”하고 상온으로 복귀시켰다. 각 반응에 대한 사이클 임계(Ct) 등가체를 Biorad IQ5 소프트웨어에서 곡선 맞춤 식에 기반하여 결정하였고, 값은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 그래프로 도표화하였다. 선형 회귀를 수행하였고, 상관계수(R2)를 결정하였다.
다른 구현예들
전술된 설명으로부터, 다양한 용도들 및 조건들에 채택하기 위해 본원에 기술된 본 발명에 대한 다양한 변경들 및 변형들이 만들어질 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 이러한 구현예들도 또한 하기 청구범위의 범주 이내이다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서의 요소들의 목록의 설명은 임의의 단일요소 또는 나열된 요소들의 조합(또는 하위조합)으로서 그러한 변수의 정의들을 포함한다. 본원에서 일 구현예의 설명은 그러한 구현예를 임의의 단일 구현예로서 또는 임의의 다른 구현예들 또는 이의 일부와 조합하여 포함한다.
본 출원은, 미국 가출원 제61/373,695호(2010년 8월 13일 출원)의 이점을 주장하는 국제 특허 출원 PCT/US2011/047049(2011년 8월 9일 출원)과 관련될 수 있으며, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허들 및 간행물들은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 참조로서 포함되도록 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 같은 정도로 본원에 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SHAFFER, DANIEL JUDICE, STEPHEN A. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR QUANTIFYING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IN A SAMPLE <130> 049224.1004US1(00011) <140> <141> <150> PCT/US2013/035750 <151> 2013-04-09 <150> 61/621,975 <151> 2012-04-09 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-O-methyl modified RNA base <400> 1 tgactccata tggagtcaca tggttcattc gtg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-O-methyl modified RNA base <400> 2 tgactccata tggagtcaca tggttcattc gtg 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> 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Claims (49)

  1. 절단(nicking) 및 연장 증폭 반응에서 특정 생성물을 정량화하는 방법으로서,
    (a) 실질적으로 등온 조건하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 하나 이상의 2' 변형뉴클레오티드를 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 포함하는 것인, 단계;
    (b) 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘(amplicon)을 생성하는 단계; 및
    (c) 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 혼성화에 특이적인 신호를 검출하는 단계로서, 신호가 시료 내 존재하는 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 양을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 2' 변형은 2' O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-플루오로, 2' 하이드록실, 2'-알릴, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 4'-티오, 4'-CH2-O-2'-가교, 4'-(CH2)2-O-2'-가교, 2'-LNA, 및 2'-O-(N-메틸카바메이트) 또는 염기 유사체들을 포함하는 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단에 위치하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 종단에 위치하는 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 닉(nick) 자리로부터 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 미변형 뉴클레오티드들만큼 떨어져 있는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 연속된 것인, 방법.
  7. 제3항에 있어서, 5개의 연속적인 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들이 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단에 위치하는, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 5개의 연속적인 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들이 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계는 비표적 분자의 암플리콘을 검출하지 않는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 실시간으로 수행되는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 증폭 전에 생물학적 시료 내 존재하는 핵산 분자의 양을 결정하는 반(semi) 정량적 및/또는 양 임계 방법을 제공하는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 더 가깝게 위치시키는 단계는 증폭의 검출 시간을 증가시키는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 시작 표적 물질의 상이한 양으로부터 기인한 반응 생성물의 증가된 분석을 제공하기 위해 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들의 비의 사용을 더 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 시작 표적 물질의 상이한 양으로부터 기인한 반응 생성물의 증가된 분석을 제공하기 위해 증폭 속도 조절제의 사용을 더 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 분자는 DNA 또는 RNA 핵산 분자인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브는 SYBR 그린 또는 분자 비콘(Molecular beacon)인, 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브는 표적 서열에 상보적인 적어도 약 10개의 뉴클레오티드, 검출가능한 모이어티, 및 중합효소-정지 분자를 포함하는 증폭가능하지 않은 검출가능한 폴리뉴클레오티드 프로브로서, 중합효소 정지 분자는 그렇지 않으면 중합효소 활성을 지지하는 조건 하에서 중합효소가 프로브를 증폭하는 것을 방지하는 것인, 방법.
  18. 단일 반응의 과정 중에 생성된 복수의 별개의 반응 생성물들을 검출하기 위한 방법으로서,
    (a) 실질적으로 등온 조건하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 하나 이상의 2' 변형뉴클레오티드를 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 포함하는 것인, 단계;
    (b) 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및
    (c) 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 혼성화에 특이적인 신호를 검출하는 단계로서, 신호가 시료 내 존재하는 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 양을 나타내는 것인, 단계를 포함하는, 방법.
  19. 절단 및 연장 증폭 반응에서 특정 생성물을 정량화하는 방법으로서,
    (a) 실질적으로 등온 조건하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 말단에 위치한 5개의 연속적인 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드들을 포함하는, 단계;
    (b) 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및
    (c) 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 혼성화에 특이적인 신호를 검출하는 단계로서, 신호가 시료 내 존재하는 표적 핵산 분자 또는 이의 암플리콘의 양을 나타내는 것인, 단계를 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 단계 (c)는 실시간으로 수행되어 반응에 존재하는 표적의 양을 결정하는 것인, 방법.
  21. 절단 및 연장 증폭 반응을 실시간으로 모니터링 하기 위한 방법으로서,
    (a) 실질적으로 등온 조건 하에 시험 시료를 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 것인, 단계;
    (b) 상기 표적 핵산 분자의 적어도 일 부분을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및
    (c) 신호를 실시간으로 검출함으로써 표적 핵산 분자(들)를 정량하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 시험 시료는 병원균을 포함하는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 병원균이 바이러스, 박테리아, 효모 또는 진균류인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 시험 시료가 생물학적 시료인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 생물학적 시료가 생물학적 유체, 세포 또는 조직 시료인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 생물학적 유체는 소변, 정액, 질 분비물, 또는 대변인, 방법.
  27. 제21항에 있어서, 시험 시료가 환경적 시료인, 방법.
  28. 제21항에 있어서, 단계 (c)가 실시간으로 수행되는, 방법.
  29. NEAR 반응에서 표적 핵산 분자를 실시간으로 모니터링하기 위한 방법으로서,
    (a) 실질적으로 등온 조건 하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 이형이중가닥 특이적인 절단 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 것인, 단계;
    (b) 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 표적 서열을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및
    (c) 신호를 실시간으로 검출함으로써 표적 핵산 분자를 정량하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 시험 시료에서 표적 핵산 분자를 실시간으로 모니터링하기 위한 방법으로서,
    (a) 실질적으로 등온 조건 하에 표적 핵산 분자를 중합효소, 2종 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들(각각 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합함), 절단 효소, 복구 효소 또는 교정 효소, 및 검출 가능한 폴리뉴클레오티드 프로브에 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 것인, 단계;
    (b) 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 표적 서열을 포함하는 암플리콘을 생성하는 단계; 및
    (c) 신호를 실시간으로 검출함으로써 표적 핵산 분자를 정량하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 시험 시료가 병원균을 포함하는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 병원균은 바이러스, 박테리아, 효모 또는 진균류인, 방법.
  33. 제30항에 있어서, 시험 시료가 생물학적 시료인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 생물학적 시료가 생물학적 유체, 세포 또는 조직 시료인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 생물학적 유체는 소변, 정액, 질 분비물, 또는 대변인, 방법.
  36. 제30항에 있어서, 시험 시료가 환경적 시료인, 방법.
  37. 제30항에 있어서, 단계 (c)가 실시간으로 수행되는, 방법.
  38. NEAR 반응에서 표적 서열을 검출하기 위한 키트로서, 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하고 표적 핵산 분자에 상보적인 서열 내에 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 하나 이상의 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들 및 프라이머/주형 올리고뉴클레오티드들을 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 지침을 포함하는, 키트.
  39. i) 제1 영역; 및
    ii) 제2 영역을 5'으로부터 3'으로 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드로서, 제1 영역은 절단 효소 인식 서열을 포함하고, 제2 영역은 표적 핵산 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 적어도 9개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들을 포함하는 것인, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  40. 제36항에 있어서, 2' 변형은 2' O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-플루오로, 2'하이드록실, 2'-알릴, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 4'-티오, 4'-CH2-O-2'-가교, 4'-(CH2)2-O-2'-가교, 2'-LNA, 및 2'-O-(N-메틸카바메이트) 또는 염기 유사체들을 포함하는 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3' 종단에 위치하는, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치하는, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  43. 제42항에 있어서, 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치하는 하나 이상의 2' 변형 뉴클레오티드는 닉 자리로부터 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 미변형 뉴클레오티드들만큼 떨어져 있는 것인, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 2' 변형 뉴클레오티드들은 연속적인 것인, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  45. 제44항에 있어서, 연속적인 2'변형 뉴클레오티드들의 수는 2, 3, 4, 5개 이상인, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 효소 인식 서열은 5 -GAGT-3'인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 5개의 연속적인 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들이 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 3'말단에 위치하는, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  48. 제42항에 있어서, 5개의 연속적인 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드들이 표적 핵산 분자에 상보적인 서열의 5' 말단에 위치하는, 단리된 올리고뉴클레오티드.
  49. 올리고뉴클레오티드가 도 1에 기재된 올리고뉴클레오티드인, 단리된 올리고뉴클레오티드.
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