UA125112C2 - Спосіб ампліфікації полінуклеотиду - Google Patents

Спосіб ампліфікації полінуклеотиду Download PDF

Info

Publication number
UA125112C2
UA125112C2 UAA201709549A UAA201709549A UA125112C2 UA 125112 C2 UA125112 C2 UA 125112C2 UA A201709549 A UAA201709549 A UA A201709549A UA A201709549 A UAA201709549 A UA A201709549A UA 125112 C2 UA125112 C2 UA 125112C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
target
nucleic acid
primers
amplification
templates
Prior art date
Application number
UAA201709549A
Other languages
English (en)
Inventor
Даніел Шаффер
Даниэл Шаффер
Стефен А. Джудіс
Стэфэн А. Джудис
Original Assignee
Енвіролоджикс Інк.
Энвиролоджикс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49328090&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA125112(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Енвіролоджикс Інк., Энвиролоджикс Инк. filed Critical Енвіролоджикс Інк.
Publication of UA125112C2 publication Critical patent/UA125112C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

Винахід стосується композиції та способу виявлення та кількісного визначення цільового олігонуклеотиду в зразку в режимі реального часу. Ці способи сумісні з цільовими олігонуклеотидами, ампліфікованими за допомогою NEAR-реакції.

Description

Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 61/621975, поданою 9 квітня 2012 року, яку включено в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
Технології ампліфікації нуклеїнових кислот забезпечили засіб для розуміння складних біологічних процесів, виявлення, ідентифікації та кількісного визначення патогенних і непатогенних організмів, судово-криміналістичних аналізів, досліджень взаємозв'язку захворювань і виявлення трансгенних об'єктів - генетично модифікованих організмів тощо.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) являє собою загальновідому залежну від термоциклювання технологію ампліфікації нуклеїнових кислот, використовувану для ампліфікації ДНК, що складається з циклів повторюваного нагрівання та охолодження реакційної суміші для плавлення ДНК і ферментативної реплікації ДНК із використанням ДНК- полімерази. Кількісна ПЛР у режимі реального часу (4РСК) являє собою методику, використовувану для кількісного визначення числа копій даної послідовності нуклеїнової кислоти в біологічному зразку. У даний час у ЗФРСЕ. використовують виявлення продуктів реакції в режимі реального часу протягом реакції та порівнюють профіль ампліфікації з ампліфікацією контрольних зразків, які містять відому кількість нуклеїнових кислот на початку кожної реакції (або відоме відносне співвідношення нуклеїнових кислот стосовно невідомої тестової нуклеїнової кислоти). Результати контрольних зразків використовують для побудови калібрувальних кривих, як правило, на основі логарифмічної ділянки калібрувальних кривих реакції ампліфікації. Ці значення використовують для інтерполяції кількості невідомих нуклеїнових кислот на основі порівняння їхніх кривих ампліфікації з кількістю в стандартних контрольних зразках.
На додаток до ПЛР, існують системи ампліфікації, незалежні від термоциклювання, або технології ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот, зокрема, без обмеження: реакція ампліфікації із внесенням одноланцюгових розривів і добудовою (МЕАК), ампліфікація за типом "кільця, що котиться" (КСА), геліказа-залежна ампліфікація (НОА), ампліфікація з формуванням петель (ГАМР), ампліфікація із заміщенням ланцюгів (ЗОБА), транскрипційно-опосередкована ампліфікація (ТМА), самопідтримувана реплікація послідовностей (З35К), ампліфікація, яка базується на послідовності нуклеїнових кислот (МАЗВА), ізотермічна ампліфікація з одним
Зо праймером (5РІА), система Ор-реплікази та рекомбіназна полімеразна ампліфікація (КРА).
МЕАВ-ампліфікація подібна до термоциклювання під час ПЛР. Подібно до ПЛР, у МЕАК- ампліфікації використовуються олігонуклеотидні послідовності, комплементарні цільовим послідовностям, які мають назву праймерів у ПЛР та матриць у МЕАК. Крім того, МЕАК- ампліфікація цільових послідовностей зумовлює логарифмічне збільшення числа копій цільової послідовності так само, як це відбувається у стандартній ПЛР. На відміну від стандартної ПЛР,
МЕАВ-реакція розвивається ізотермічно. У стандартній ПЛР температуру підвищують, щоб відокремити два ланцюги ДНК. В МЕАК-реакції в цільову послідовність нуклеїнової кислоти вводять одноланцюгові розриви в певних сайтах одноланцюгових розривів, що є присутніми в тестовому зразку. Полімераза проникає в сайт одноланцюгового розриву та починає синтез ланцюга, комплементарного нуклеотидній цільовій послідовності, у яку було внесено одноланцюговий розрив (доданій екзогенній ДНК), разом із заміщенням наявного комплементарного ланцюга ДНК. Процес реплікації із заміщенням ланцюгів усуває необхідність у підвищеній температурі. На цій стадії молекули матриці/праймера відпалюють із заміщеною комплементарною послідовністю з доданої екзогенної ДНК. Тепер полімераза робить добудову від 3'-кінця матриці, створюючи ланцюг, комплементарний раніше заміщеному ланцюгу. Другу олігонуклеотидну матрицю/праймер потім відпалюють із щойно синтезованим комплементарним ланцюгом і добудовують, одержуючи ДНК-дуплекс, що містить послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив. Потім цей ланцюг підлягає внесенню одноланцюгового розриву з наступною добудовою із заміщенням ланцюга за допомогою полімерази, що зумовлює одержання ДНК-дуплекса, який має сайти одноланцюгового розриву по обидва боки від вихідної цільової ДНК. Відразу після його синтезу молекула продовжує ампліфікуватися експоненційно завдяки реплікації заміщених ланцюгів з новими молекулами матриць. Крім того, ампліфікація також відбувається лінійно від кожної молекули продукту завдяки повторним операціям синтезу шляхом нік-трансляції в сайтах одноланцюгового розриву, уведених за допомогою матриць. Результатом є дуже швидке збільшення інтенсивності ампліфікації цільового сигналу, набагато швидше, ніж у випадку термоциклювання під час ПЛР, при цьому результати ампліфікації з'являються протягом менш ніж десяти хвилин.
Однак, кількісне визначення є проблематичним. Оптимальна продуктивність системи МЕАК бо у режимі реального часу залежить від утворення та ампліфікації специфічного продукту. Відомо,
що в системах МЕАК у реакціях за допомогою ферментів утворюються неспецифічні фонові продукти на істотних рівнях на додаток до специфічного продукту. Ці фонові продукти можуть слугувати як ампліфіковані об'єкти, і їхнє утворення може перешкоджати утворенню специфічного продукту. Хоча можна сконструювати детекторні зонди, специфічні до бажаної цільової молекули (і, таким чином, специфічний продукт можна виявити в змішаному фоні), неспецифічні фонові продукти на істотних рівнях блокують компоненти реакції, які могли бути в іншому випадку використані для ампліфікації специфічного продукту. Таким чином, блокування компонентів реакції у зв'язку з утворенням неспецифічних фонових продуктів призводить до реакції, що є субоптимальною. Це особливо небажано, коли цільова нуклеїнова кислота від початку характеризується дуже низьким відносним вмістом і коли для надійного виявлення цільової молекули потрібна високооптимізована реакція. Крім того, субоптимальна реакція може не відображати дійсну кількість цільової нуклеїнової кислоти, навіть якщо її можна виявити.
Було б вигідно створювати оптимізовані МЕАК-реакції, у яких усувається ампліфікація неспецифічних фонових продуктів. Це могло б забезпечити реакцію, придатну для кількісного визначення за допомогою системи на основі калібрувальних кривих або за допомогою відносного кількісного визначення.
Крім того, звичайною практикою є оцінка МЕАК-реакцій за допомогою мас-спектрометрії.
Високі рівні фонових продуктів можуть заважати інтерпретації даних мас-спектрометрії. Якщо, наприклад, реакційна суміш містить фонові продукти, один або декілька продуктів, одержаних у результаті неспецифічної ампліфікації (від споріднених, але неоднакових цільових молекул), і специфічний продукт, було б складно виявити ці одержані з матриксу продукти серед фонових продуктів. Усунення фонових продуктів зумовлює чітке визначення продуктивності/ специфічності конкретного аналізу.
Додатково, високі рівні фонових продуктів можуть перешкоджати оптимальній ампліфікації у завідомо дуплексних або мультиплексних реакціях. У той час як численні диференційно мічені детекторні зонди сумісні з виявленням у режимі реального часу, дотепер існує проблема обмежень для реагентів через утворення неспецифічних продуктів. Це особливо справедливо для дуплексних або мультиплексних реакцій, оскільки в цих реакціях використовується більш ніж дві матриці/праймера, які потенційно можуть утворювати змішані групи фонових продуктів.
Зо Реакційна система МЕАК, у якій усувається ампліфікація фонових продуктів, також забезпечує умови для виявлення у завідомо дуплексних або мультиплексних реакціях у режимі реального часу. Було б дуже вигідним забезпечити засіб для усунення ампліфікованих фонових продуктів, максимізуючи, таким чином, потенціал утворення специфічних продуктів в МЕАК-реакціях. Було б бажано, якщо б кількісний результат можна було представити завдяки точному контролю ходу реакції в режимі реального часу.
Як описано нижче, в даному винаході представлено композиції та способи виявлення цільового олігонуклеотиду в зразку в режимі реального часу, які знижують або усувають утворення фонових продуктів, дозволяючи проводити кількісне визначення цільового олігонуклеотиду в зразку. Ці способи сумісні із цільовими олігонуклеотидами, ампліфікованими за допомогою МЕАЕК-реакції. Даний винахід щонайменше частково базується на виявленні того, що специфічні продукти в одноплексних МЕАК-реакціях можуть бути утворені без утворення фонових продуктів. Реакційні композиції та способи передбачають відносне кількісне визначення невідомих тестових зразках, дуплексні реакції та мультиплексні реакції та створення калібрувальних кривих для абсолютного кількісного визначення невідомих тестових зразків.
В одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб кількісного визначення специфічного продукту в реакції ампліфікації із внесенням одноланцюгових розривів і добудовою, при цьому спосіб включає приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою з недостатністю екзонуклеазної активності, двома або більше олігонуклеотидними праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і виявлюваним полінуклеотидним зондом, де кожний/кожна з олігонуклеотидних праймерів/матриць має один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів у послідовності, комплементарній цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; утворення ампліконів, які мають щонайменше частину зазначеної цільової молекули нуклеїнової кислоти; і виявлення сигналу, специфічного для гібридизації олігонуклеотидного зонда із цільовою молекулою нуклеїнової кислоти або її ампліконом, де сигнал указує на кількість цільової молекули нуклеїнової кислоти, присутньої у зразку, або її амплікону.
В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб виявлення багатьох різних продуктів реакції, одержуваних протягом однієї реакції, при цьому спосіб включає приведення цільової бо молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою з недостатністю екзонуклеазної активності, двома або більше олігонуклеотидними праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і виявлюваним полінуклеотидним зондом, де кожний/кожна з олігонуклеотидних праймерів/матриць має один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів у послідовності, комплементарній цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; утворення ампліконів, які мають щонайменше частину зазначеної цільової молекули нуклеїнової кислоти; і виявлення сигналу, специфічного для гібридизації олігонуклеотидного зонда із цільовою молекулою нуклеїнової кислоти або її ампліконом, де сигнал указує на кількість цільової молекули нуклеїнової кислоти, присутньої у зразку, або її амплікону.
У конкретному аспекті даний винахід забезпечує спосіб кількісного визначення специфічного продукту в реакції ампліфікації із внесенням одноланцюгових розривів і добудовою, при цьому спосіб включає приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою з недостатністю екзонуклеазної активності, двома або більше олігонуклеотидними праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і виявлюваним полінуклеотидним зондом, де кожний/кожна з олігонуклеотидних праймерів/матриць має щонайменше приблизно 5 суміжних нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, які розташовані на 3'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти (наприклад, на 3'-кінці олігонуклеотиду), або прилягають до нього; утворення ампліконів, які мають щонайменше частину зазначеної цільової молекули нуклеїнової кислоти; і виявлення сигналу, специфічного для гібридизації олігонуклеотидного зонда із цільовою молекулою нуклеїнової кислоти або її ампліконом, де сигнал указує на кількість цільової молекули нуклеїнової кислоти, присутньої у зразку, або її амплікону.
В одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб контролю реакції ампліфікації із внесенням одноланцюгових розривів і добудовою в режимі реального часу, при цьому спосіб включає приведення тестового зразка в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою з недостатністю екзонуклеазної активності двома або більше олігонуклеотидними
Зо праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і виявлюваним полінуклеотидним зондом, де кожний/кожна з олігонуклеотидних праймерів/матриць має один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів у послідовності, комплементарній цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; утворення ампліконів, які мають щонайменше частину зазначеної цільової молекули нуклеїнової кислоти; і виявлення сигналу в режимі реального часу з кількісним визначенням, таким чином, цільової(цільових) молекули(молекул) нуклеїнової кислоти.
В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб контролю в режимі реального часу цільової молекули нуклеїнової кислоти в МЕАРК-реакції, при цьому спосіб включає приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою з недостатністю екзонуклеазної активності, двома або більше олігонуклеотидними праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, специфічним для гетеродуплексів ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і виявлюваним полінуклеотидним зондом, де кожний/кожна з олігонуклеотидних праймерів/матриць має один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів у послідовності, комплементарній цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; утворення ампліконів, які мають цільову послідовність, що зв'язується із виявлюваним олігонуклеотидним зондом; і виявлення сигналу в режимі реального часу з кількісним визначенням, таким чином, цільової молекули нуклеїнової кислоти.
У ще одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб контролю в режимі реального часу цільової молекули нуклеїнової кислоти в тестовому зразку, при цьому спосіб включає приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою, двома або більше олігонуклеотидними праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, репаративним ферментом або ферментом для виправлення помилок і виявлюваним полінуклеотидним зондом, де кожний/кожна з олігонуклеотидних праймерів/матриць має один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів у послідовності, комплементарній цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; утворення бо ампліконів, які мають цільову послідовність, що зв'язується із виявлюваним олігонуклеотидним зондом, і виявлення сигналу в режимі реального часу з кількісним визначенням, таким чином, цільової молекули нуклеїнової кислоти.
У ще одному аспекті даний винахід забезпечує набір для виявлення цільової послідовності в
МЕАВ-реакції, при цьому набір містить один або декілька олігонуклеотидних праймерів/матриць, які специфічно зв'язуються з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти та мають один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів у послідовності, комплементарній цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, та інструкцію для застосування олігонуклеотидного праймера/матриці в способах за даним винаходом.
В одному аспекті даний винахід забезпечує виділений олігонуклеотид, що має в напрямку 5'-
З першу ділянку та другу ділянку, де перша ділянка має послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив; де друга ділянка має щонайменше 9 або більше нуклеотидів (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше суміжних нуклеотидів), що специфічно зв'язуються з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; і де друга ділянка має один або декілька г'-модифікованих нуклеотидів. В інших варіантах здійснення виділений олігонуклеотид є одним із наведених на фігурі 1.
У різних варіантах здійснення аспектів, визначених у даному документі, олігонуклеотид (наприклад, олігонуклеотидний праймер/матриця, виділений олігонуклеотид) містить модифікований нуклеотид, у тому числі 2'-модифікований нуклеотид. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, 2'-модифікація являє собою один або декілька з наступного: 2'-О-метил, 2'-метоксіетоксі, 2'-фтор, 2-гідроксил, 2'-аліл, 2'-О- (г-(метиламіно)-2-оксоетилі, 4-тіо, 4-СНг-О-2'"-місток, 4-(СНг)»2-О-2'-місток, 2-І МА, 2'-алкіл та 2-
О-(М-метилкарбамат), або модифікований нуклеотид містить аналог основи. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, один або декілька 2'- модифікованих нуклеотидів розташовані на 3'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти (наприклад, на 3'-кінці олігонуклеотиду), або прилягають до нього.
В інших варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, один або декілька 2'- модифікованих нуклеотидів розташовані на 5'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів, розташованих на 5'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, відокремлені від сайта одноланцюгового розриву за допомогою 1, 2, 3, 4, 5 або більше немодифікованих нуклеотидів. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, два або більше 2'-модифіковані нуклеотиди є суміжними (2, 3, 4, 5 або більше). В інших варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, два або більше 2'"-модифіковані нуклеотиди чергуються з немодифікованими нуклеотидами. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, являє собою 5'-(3А(СТ0-3. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, 5 суміжних нуклеотидів 3 2-О-метильною модифікацією розташовані она 3'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти (наприклад, на 3'-кінці олігонуклеотиду), або прилягають до нього. В інших варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, 5 суміжних нуклеотидів з 2-О-метильною модифікацією розташовані на 5'- кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти. В інших варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, 2 або більше нуклеотиди з 2'-
О-метильною модифікацією, які чергуються з немодифікованими нуклеотидами, розташовані на
Б-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти (тобто у ділянці, специфічній для цільової молекули).
У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, на етапі виявлення не виявляється амплікон нецільової молекули. У різних варіантах здійснення будь- якого аспекту, визначеного в даному документі, спосіб виконують у режимі реального часу. У певних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, етап утворення ампліконів виконують у режимі реального часу (наприклад, для визначення кількості цільової молекули, присутньої у реакційній суміші).
У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, спосіб являє собою напівкількісний та/або кількісний спосіб порогів для визначення кількості молекули нуклеїнової кислоти, присутньої у біологічному зразку до ампліфікації. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, розташування одного або декількох 2'- модифікованих нуклеотидів ближче до 5'-кінця послідовності, комплементарної бо цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, збільшує час виявлення в ампліфікації. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, спосіб додатково включає застосування олігонуклеотидних праймерів/матриць у певних співвідношеннях для забезпечення підвищеного ступеня виявлення продуктів реакції, одержуваних з різних кількостей вихідного цільового матеріалу. Було встановлено, що збільшення співвідношення олігонуклеотидних праймерів/матриць, що мають один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів на 3'-кінці послідовності розпізнавання, і олігонуклеотидних праймерів/матриць, що мають один або декілька 2'і-модифікованих нуклеотидів на 5'-кінці послідовності розпізнавання, звужує криву сигналу та змінює нахил кривої.
У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, спосіб додатково включає застосування модифікатора швидкості ампліфікації для забезпечення підвищеного ступеня виявлення продуктів реакції, одержуваних з різних кількостей вихідного цільового матеріалу. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, цільова молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти
ДНК або РНК. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, виявлюваний зонд являє собою ЗУВК Сгеєп або молекулярний маяк. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, виявлюваний зонд являє собою неампліфікований виявлюваний полінуклеотидний зонд, який має щонайменше приблизно 10 нуклеотидів, комплементарних цільовій послідовності, виявлюваний фрагмент і молекулу, що пригнічує активність полімерази, де молекула, що пригнічує активність полімерази, запобігає ампліфікації зонда за допомогою полімерази в умовах, що підтримують полімеразну активність в інших випадках.
У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, тестовий зразок містить патоген. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, патоген являє собою вірус, бактерію, дріжджі або гриб. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, тестовий зразок являє собою біологічний зразок. У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, біологічний зразок являє собою клітину, зразок тканини або біологічну рідину (наприклад, сечу, сперму, піхвовий секрет або кал). У різних варіантах здійснення будь-якого аспекту, визначеного в даному документі, тестовий зразок являє собою пробу з довкілля.
Зо Даний винахід забезпечує композиції та способи для виявлення цільової молекули нуклеїнової кислоти, ампліфікованої за допомогою МЕАК-реакції. Композиції та вироби, визначені даним винаходом, виділяли або виготовляли в інший спосіб із використанням прикладів, представлених нижче. Інші відмітні ознаки та переваги даного винаходу будуть очевидні з докладного опису та з формули винаходу.
Визначення
У даному розкритті "включає", "який включає", "який містить" та "який має" тощо можуть мати значення, визначене для них у патентному праві США, і можуть означати "включає в себе", "який включає в себе" тощо; "який складається по суті з" або "складається по суті з" також має значення, визначене в патентному праві США, і термін є необмежувальним, дозволяючи присутність більшого, ніж згадане, доти, доки основні або нові характеристики згаданого не зміняться завдяки присутності більшого, ніж згадане, але виключає варіанти здійснення з попереднього рівня техніки.
Під "молекулою, що пригнічує активність полімерази" мають на увазі фрагмент, пов'язаний з полінуклеотидною матрицею/праймером, який запобігає просуванню полімерази полінуклеотидною матрицею або істотно знижує його. Переважно фрагмент убудований у полінуклеотид. В одному переважному варіанті здійснення фрагмент запобігає просуванню полімерази матрицею.
Під "полімеразною добудовою" мають на увазі просування полімерази вперед від доступної
З3'-гідроксильної групи, під час якого відбувається вбудовування мономерів, що надходять, за принципом комплементарності стосовно протилежних їм нуклеотидам у полінуклеотидному ланцюгу матриці.
Під "полімеразою з недостатністю екзонуклеазної активності" мають на увазі ДНК-залежну
ДНК-полімеразу або РНК-залежну ДНК-полімеразу, яка не має 5'-3'-екзонуклеазної активності або яка має таку активність на практично невиявлюваних рівнях.
Під "аддуктом нуклеотиду" мають на увазі фрагмент, ковалентно зв'язаний або іншим способом приєднаний до стандартної нуклеотидної основи.
Застосовуваний у даному документі термін "виявлюваний полінуклеотидний зонд" стосується будь-якого щонайменше частково одноланцюгового полінуклеотиду, міченого виявлюваним фрагментом з ділянкою послідовності, комплементарною щонайменше одному бо ланцюгу цільової послідовності, який вивільняє виявлюваний сигнал з виявлюваного фрагмента під час зв'язування з цільовою послідовністю, тоді як утворення сигналу цим виявлюваним фрагментом залежить від розщеплення виявлюваного полінуклеотидного зонда за допомогою неспецифічної 5'-3'і-екзонуклеазної активності. Прикладом "виявлюваного полінуклеотидного зонда", застосовуваного в даному документі, є, без обмеження, флуоресцентний зонд типу молекулярного маяка, описаний у попередньому рівні техніки.
Застосовуваний у даному документі термін "нуклеїнова кислота" стосується дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів або модифікованих нуклеотидів та полімерів на їхній основі в одно- або дволанцюговій формі. Термін охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі аналоги нуклеотидів або модифіковані каркасні залишки або зв'язки, які є синтетичними, такими, що трапляються в природі, та такими, що не трапляються в природі, які мають такі ж властивості зв'язування, що й еталонна нуклеїнова кислота, і які перетворюються протягом метаболізму аналогічно до еталонних нуклеотидів. Приклади таких аналогів включають, без обмеження, 2'-модифіковані рибонуклеотиди (наприклад, 2'-О-метилрибонуклеотиди, 2'-БЕ- нуклеотиди).
Застосовуваний у даному документі "модифікований нуклеотид" стосується нуклеотиду, що має одну або декілька модифікацій нуклеозиду, нуклеїнової основи, пентозного кільця або фосфатної групи. Наприклад, модифіковані нуклеотиди виключають рибонуклеотиди, які містять аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, уридинмонофосфат і цитидинмонофосфат, і дезоксирибонуклеотиди, які містять дезоксіаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезокситимідинмонофосфат і дезоксицитидинмонофосфат.
Модифікації включають такі, що трапляються в природі, які є результатом модифікації ферментами, що модифікують нуклеотиди, такими як метилтрансферази. Модифіковані нуклеотиди також включають синтетичні або такі, що не трапляються в природі, нуклеотиди.
Нуклеотиди із синтетичними або такими, що не трапляються в природі, модифікаціями включають в себе такі з 2'-модифікаціями, наприклад, які містять 2'-алкіл, такий як 2'-О-метил та 2'-метоксіетоксі, 2'-фтор, 2"-гідроксил (РНК), 2'-аліл, 2'-О-(2-(метиламіно)-2-оксоетилі, 4"-тіо, 4-
СНе-О-2"-місток, 4-(СНег)2-О-2'-місток, 2-ІМА та 2'-0О-(М-метилкарбамат), або такі, що містять аналоги основ.
Під "заміною основи" мають на увазі введення замісника полімеру на основі нуклеїнових
Зо основ, яке не спричиняє істотного порушення гібридизації між комплементарними нуклеотидними ланцюгами.
Під "специфічним продуктом" мають на увазі полінуклеотидний продукт, одержаний у результаті гібридизації олігонуклеотидних матриць із комплементарною цільовою послідовністю та наступною добудовою цільової послідовності, опосередкованою полімеразою.
Під "реакцією ампліфікації із внесенням одноланцюгових розривів і добудовою" мають на увазі цикли внесення одноланцюгових розривів і добудови, що чергуються, які зумовлюють ампліфікацію полінуклеотиду, який становить інтерес.
Під "практично ізотермічними умовами" мають на увазі перебування при одній температурі або у вузькому діапазоні температур, істотні зміни в якому не відбуваються. В одному варіанті здійснення реакцію, виконувану в практично ізотермічних умовах, виконують при температурі, яка змінюється лише на приблизно 1-5 "С (наприклад, змінюється на 1, 2, 3, 4 або 5 градусів). В іншому варіанті здійснення реакцію виконують при одній температурі в межах робочих параметрів використовуваного приладу.
Під "ферментом, що вносить одноланцюговий розрив" мають на увазі поліпептид, здатний розпізнавати конкретну структуру в дволанцюгових молекулах нуклеїнової кислоти та зв'язуватися з нею, а також руйнувати фосфодіестерний зв'язок між сусідніми нуклеотидами в одному ланцюзі під час зв'язування з її розпізнаваною конкретною структурою з наданням, таким чином, вільної 3'-гідроксильної групи в кінцевому нуклеотиді вище за сайт одноланцюгового розриву, від якої може бути зроблена добудова за допомогою полімерази з недостатністю екзонуклеазної активності.
Під "сайтом одноланцюгового розриву" мають на увазі положення "зруйнованого" фосфодіестерного зв'язку в одному ланцюзі дволанцюгової молекули нуклеїнової кислоти, яку піддають гідролізу за допомогою ферменту, що вносить одноланцюговий розрив.
Під "ампліконом" мають на увазі полінуклеотид або багато полінуклеотидів, що утворюються протягом ампліфікації полінуклеотиду, який становить інтерес. В одному з прикладів амплікон утворюють протягом полімеразної ланцюгової реакції.
Під "напівкількісним" мають на увазі забезпечення оцінки відносної кількості на основі внутрішнього контролю.
Під "кількісним методом порогів" мають на увазі забезпечення оцінки кількості на основі бо перевищення або відсутності перевищення кількості порівняльного стандарту.
Під "модифікатором швидкості ампліфікації" мають на увазі засіб, здатний впливати або на швидкість полімеразної добудови, або на швидкість внесення одноланцюгових розривів за допомогою ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, або на те й інше.
Під "контролем реакції" мають на увазі виявлення ходу реакції. В одному варіанті здійснення контроль ходу реакції включає в себе виявлення полімеразної добудови та/або виявлення завершеної МЕАК-реакції. "Виявлення" стосується виявлення присутності, відсутності або кількості аналіту, який підлягає виявленню.
Під "виявлюваним фрагментом" мають на увазі композицію, яка під час зв'язування з молекулою, що становить інтерес, робить останню виявлюваною за допомогою спектроскопічних, фотохімічних, біохімічних, імунологічних або хімічних засобів. Наприклад, застосовні мітки включають радіоактивні ізотопи, магнітні гранули, металеві гранули, колоїдні частинки, флуоресцентні барвники, електронно-щільні реагенти, ферменти (наприклад, зазвичай використовувані в ЕГІ5А), біотин, дигоксигенін або гаптени.
Під "фрагментом" мають на увазі частину молекули нуклеїнової кислоти. Ця частина містить переважно щонайменше 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 або 90 95 від повної довжини еталонної молекули нуклеїнової кислоти або поліпептиду. Фрагмент може містити 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 6О, 70, 80, 90 або 100 нуклеотидів. "Гібридизація" означає утворення водневих зв'язків, що може являти собою вотсон- криківське, хугстинівське або зворотне хугстинівське утворення водневих зв'язків між комплементарними нуклеїновими основами. Наприклад, аденін і тимін є комплементарними нуклеїновими основами, які утворюють пари шляхом утворення водневих зв'язків.
Під "виділеним полінуклеотидом" мають на увазі нуклеїнову кислоту (наприклад, ДНК), що не містить генів, які в геномі, що трапляється в природі, організму, з якого одержана молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом, фланкують даний ген. Термін, отже, включає, наприклад, рекомбінантну ДНК, убудовану у вектор, в автономно реплікувальні плазміду або вірус або в геномну ДНК прокаріоту або еукаріоту або яка існує у формі окремої молекули (наприклад, у формі кДНК або фрагмента геномної ДНК або кКДНК, одержаних за допомогою
ПЛР або розщеплення рестрикційною ендонуклеазою) незалежно від інших послідовностей.
Зо Крім того, термін включає молекулу РНК, транскрибовану з молекули ДНК, а також рекомбінантну ДНК, яка є частиною гібридного гена, що кодує додаткову поліпептидну послідовність.
Терміни "виділений", "очищений" або "біологічно чистий" стосуються матеріалу, різною мірою вільного від компонентів, які звичайно супроводжують його, як виявляється в його нативному стані. "Виділяти" вказує на ступінь відокремлення від вихідного джерела або оточення. "Очищати" вказує на ступінь відокремлення, що перевищує такий для виділення. "Очищений" або "біологічно чистий" білок є достатньою мірою вільним від інших матеріалів, так що будь-які домішки не чинять істотний вплив на біологічні властивості білка або не спричиняють інші несприятливі наслідки. Тобто нуклеїнова кислота або пептид за даним винаходом є очищеними, якщо вони по суті є вільними від клітинного матеріалу, вірусного матеріалу або культурального середовища у разі їх одержання за допомогою методик рекомбінантної ДНК або хімічних попередників чи інших хімічних речовин у разі їх хімічного синтезу. Чистоту та однорідність, як правило, визначають із використанням методів аналітичної хімії, наприклад, електрофорезу в поліакриламідному гелі або високоефективної рідинної хроматографії. Термін "очищений" може позначати, що нуклеїнова кислота або білок дають по суті одну смугу в гелі для електрофорезу. Для білка, що може бути підданий модифікаціям, наприклад, фосфорилюванню або глікозилюванню, різні модифікації можуть давати різні виділені білки, які можна очищати окремо.
Як застосовується в даному документі, "одержання", як і "одержання засобу", включає синтезування, закупівлю або придбання засобу в інший спосіб.
Під "еталонним" мають на увазі стандартний або контрольний стан. Як очевидно для фахівця в даній галузі, придатним еталоном є той, де елемент змінюють для того, щоб визначити ефект елемента.
Під "гібридизацією" мають на увазі утворення пари між комплементарними полінуклеотидними послідовностями (наприклад, гена, описаного в даному документі) або їхніми частинами в умовах різної жорсткості з утворенням дволанцюгової молекули. (Див., наприклад, Ууап!і с.М. апа 5.Ї. Вегдег (1987) МеШшоа5 Еплутої. 152:399; Кіттеї! А.К. (1987)
Меїнодз5 Епгутої. 152:507).
Під "суб'єктом" мають на увазі ссавця, у тому числі, без обмеження, людину або ссавця, 60 який відрізняється від людини, такого як бик, кінь, собака, вівця або кіт.
Під "цільовою молекулою нуклеїнової кислоти" мають на увазі полінуклеотид, що підлягає аналізу. Такий полінуклеотид може являти собою смисловий або антисмисловий ланцюг цільової послідовності. Термін "цільова молекула нуклеїнової кислоти" також стосується ампліконів вихідної цільової послідовності.
Діапазони, представлені в даному документі, розуміються як такі, що припускають всі значення всередині діапазону. Наприклад, діапазон від 1 до 50 розуміють як такий, що включає будь-яке число, комбінацію чисел або піддіапазон із групи, що включає 1,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, З6, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, А7, 48, 49 або 50.
Якщо спеціально не зазначено або не очевидно з контексту, застосовуваний у даному документі термін "або" слід розуміти як такий, що включає. Якщо спеціально не зазначено або не очевидно з контексту, застосовувані в даному документі форми однини розуміють як такі, що означають однину або множину.
Якщо спеціально не зазначено або не очевидно з контексту, застосовуваний у даному документі термін "приблизно" слід розуміти як такий, що позначає величину в діапазоні нормального припустимого відхилення в даній галузі техніки, наприклад, у межах 2 стандартних відхилень від середнього значення. Термін "приблизно" можна розуміти як такий, що позначає величину в межах 10, 9,8, 7,6,5,4,3,2,1, 0,5, 0,1, 0,05 або 0,01 95 від заявленого значення.
Якщо інше не ясно з контексту, всі числові значення, представлені в даному документі, змінюються за допомогою терміну "приблизно".
Наведення переліку хімічних груп у будь-якому визначенні змінної в даному документі включає визначення цієї змінної як будь-якої окремої групи або комбінації перелічених груп.
Наведення варіанта здійснення для змінної або аспекту в даному документі включає даний варіант здійснення як будь-який окремий варіант здійснення або в комбінації з будь-якими іншими варіантами здійснення або їхніми частинами.
Будь-які композиції або способи, представлені в даному документі, можуть бути об'єднані з одним або декількома з будь-яких інших композицій та способів, представлених у даному документі.
На фігурі 1 зображено ілюстративні структури об'єктів, які пригнічують активність полімерази. Чорний - стабілізувальна послідовність, синій - послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, зелений - спейсерна послідовність для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, червоний - послідовність розпізнавання, специфічна для цільової молекули, А - аденін, Т - тимін, З - гуанін, С - цитозин, О - урацил, тхХ - основа РНК із 2'-О-метильною модифікацією. Підкреслена (підкреслені) основа(основи) визначає(визначають) модифікований сегмент послідовності.
На фігурах 2А-2С зображено оцінку динамічного діапазону синтетичної багатомірної цільової ДНК Сіамібасієг тіспідапепвів зерідопіси5 (Ст5). Показано ілюстративні результати титрування синтетичної "багатомірної" цільової ДНК Ст5 і виявлення за допомогою флуориметричного маяка. МЕАК-аналіз для Ст5, виконуваний без уведення цільової нуклеїнової кислоти, зазначений як контроль без цільової молекули (МТС). Фігура 2А являє собою графік, котрий показує, що сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) пригнічено в реакційних сумішах, що містять праймер/матрицю з 2'-О-метильною модифікацією. Фігура 28 являє собою графік, котрий показує, що калібрувальна крива відображає широкий динамічний діапазон із застосуванням реакційних сумішей з матрицями з 2'-О-метильною модифікацією.
Фігура 2С являє собою порівняння ілюстративних даних мас-спектрометрії, що показує усунення неспецифічних продуктів ампліфікації в контролях без цільової молекули (МТС) у системі аналізу Ст5 із застосуванням праймерів/матриць із 2''О-метильною модифікацією (права панель) порівняно з немодифікованими праймерами/матрицями (ліва панель). Для визначення ефекту праймерів/матриць із 2'-0-метильною модифікацією стосовно утворення фонових продуктів зразки (10 мкл) реакційних сумішей з контролю без цільової молекули, зображеного на фігурі 2А, проаналізували за допомогою ВЕРХ/мас-спектрометрії. Дані мас- спектрометрії чітко демонструють, що за присутності праймерів/матриць із 2'-О-метильною модифікацією виявляли присутність тільки очікуваних видів молекул, і продукти зі змішаного фону, які утворюються за присутності немодифікованих праймерів/матриць, усунуто.
На фігурі З зображено усунення матрицями/праймерами з 2'-О-метильною модифікацією сигналу фону в МЕАК-аналізі з використанням виявлення за допомогою ЗУВК Огееп. Показано ілюстративні дані ампліфікації із застосуванням праймерів/матриць із 2'-О-метильною модифікацією та усунення неспецифічних продуктів ампліфікації. Фігура ЗА являє собою графік, котрий показує, що в контролях без цільової молекули (МТС) спостерігався істотний сигнал, що бо вказувало на утворення фонового продукту за відсутності цільової ДНК. Фігура ЗВ являє собою графік, котрий показує, що в реакційних сумішах, які містили матриці з 2'-О-метильною модифікацією, сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) було пригнічено.
На фігурі 4 зображено усунення матрицями/праймерами з 2'-О-метильною модифікацією сигналу фону в МЕАК-аналізі з використанням виявлення за допомогою молекулярного маяка.
Показано ілюстративні дані ампліфікації із застосуванням праймерів/матриць із 2'-О-метильною модифікацією та усунення неспецифічних продуктів ампліфікації. Фігура 4А являє собою графік, котрий показує, що в контролях без цільової молекули (МТС) спостерігався істотний сигнал, що вказувало на утворення фонового продукту за відсутності цільової ДНК. Фігура 4В8 являє собою графік, котрий показує, що в реакційних сумішах, які містили матриці з 2'-О-метильною модифікацією, сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) було пригнічено.
На фігурі 5 зображено ілюстративні об'єкти, які пригнічують активність полімерази, котрі за допомогою праймерів/матриць із 2'-О-метильною модифікацією або певних співвідношень праймерів/матриць із 2'-О-метильною модифікацією можна застосовувати для регуляції як часу до виявлення, так і ефективності реакції, роблячи, таким чином, "налаштування" реакцій.
Показано схематичні зображення ілюстративних матриць/праймерів з 2'-О-метильною модифікацією для налаштування конкретної реакції, у тому числі праймера/матриці, що має блок з п'яти нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією на 3'-кінці (матриця "Кінцева"; ліворуч), і праймера/матриці, що має блок з п'яти нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, який починається з 3-го нуклеотиду після сайта одноланцюгового розриву (матриця "Одноланцюговий розрив 2"; праворуч). Кожна умова налаштування включає конкретні співвідношення прямих і зворотних матриць у кожному наборі матриць, що мають різні структури.
На фігурі 6 зображено графіки ампліфікації, що демонструють корисність матриць/праймерів з 2-О-метильною модифікацією для "налаштування" конкретної реакції. Показано ілюстративні дані ампліфікації із застосуванням праймерів/матриць із 2'О-метильною модифікацією. Всі реакційні суміші (у двох повторностях) містили 10000 геномних еквівалентів ДНК Ст5. Кожна умова налаштування представляє конкретні співвідношення прямих і зворотних матриць у кожному наборі матриць, що мають різні структури. Червоні кола демонструють зсув часу до виявлення для кожної умови налаштування. Крім того, логарифмічна фаза для кожної умови
Зо скорочувалася, і нахил кривої змінювався.
На фігурі 7 зображено конструкцію праймерів/матриць із двох наборів (Т53 та Т56), застосовуваних у МЕАК-аналізі для ампліфікації фрагмента гена кукурудзи АОНІ. Специфічні для цільової молекули ділянки в послідовностях праймерів/матриць з наборів Т53 та Т56 є істотно довшими (15-17 основ), ніж у праймерах/матрицях з наборів для типових МЕАК-аналізів (від 9 до 12 основ) з попереднього рівня техніки. У наборі праймерів/матриць Т53 перед блоком з 5 послідовних нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, що прилягають до 3'-кінця, міститься розташована вище ділянка з нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, що чергуються з немодифікованими нуклеотидами, яка починається з нуклеотиду з 2'-О-метильною модифікацією на 5 або на 4 нуклеотиди нижче за сайт одноланцюгового розриву, відповідно. На відміну від Т53, у кожному з праймерів/матриць із набору 756 є тільки п'ять нуклеотидів з 2'-О- метильною модифікацією, які утворюють блок з послідовних нуклеотидів, що прилягають до немодифікованого 3'-кінцевого нуклеотиду.
На фігурі 8 показано графіки ампліфікації для аналізу АОНІ з використанням двох наборів праймерів/матриць (Т53 та Т56), записані в каналі виявлення для барвника ЗУВЕ. Сгееп.
На фігурі 9 показано графіки ампліфікації для реакційних сумішей з того ж аналізу, записані в каналі для КОХ.
На фігурі 10 зображено записані графіки ампліфікації для реакційних сумішей з МТС-аналізу
АРНІ. Під час порівняння результатів, показаних на фігурах 8 та 9, стає очевидним, що тільки набір праймерів/матриць Т53 забезпечує одержання АНІ специфічного амплікону, тоді як в основі сигналу, утвореного набором Т56, головним чином лежить неспецифічна ампліфікація фонових продуктів, які виявляють тільки за допомогою ЗУВК сСгееп.
У даному винаході представлено композиції та способи, застосовувані для кількісного визначення цільової молекули нуклеїнової кислоти в ізотермічній реакції. У конкретних варіантах здійснення даний винахід забезпечує композиції та способи кількісного визначення цільової молекули нуклеїнової кислоти в МЕАК-реакції (наприклад, у режимі реального часу).
Даний винахід щонайменше частково базується на несподіваному виявленні того, що олігонуклеотидні праймери-матриці, які містять 2'-модифікований нуклеотид (наприклад, з 2'-0- метильною, 2'-фтормодифікацією), знижують інтенсивність незаконної ампліфікації за допомогою похідних ДНК-полімерази І Веї з недостатністю 5'-3'-екзонуклеазної активності або бо усувають Її.
МЕАВ-реакція
МЕАВ-реакцію застосовували як реакцію з аналізом результатів за кінцевою точкою, яка передбачає некількісне виявлення цільових олігонуклеотидів. Звичайний МЕАК-аналіз включає (1) цільову молекулу нуклеїнової кислоти; (2) дві молекули олігонуклеотидів, які є аналогами молекул праймерів у ПЛР, що мають назву "матриць-праймерів", котрі містять деяку кількість олігонуклеотидів, комплементарних цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, і сайт, який може бути розщеплений ферментом, що вносить одноланцюговий розрив; (3) аМТР; (4) полімеразу з недостатністю 5'-3'--екзонуклеазної активності, яка робить заміщення ланцюгів; і (5) фермент, що вносить одноланцюговий розрив. Сучасні способи кількісного визначення в МЕАК-реакції, зокрема, у режимі реального часу, є неприйнятними, почасти через незаконну ампліфікацію нецільових молекул, присутніх у зразку, що може ускладнювати виявлення цільових послідовностей у звичайній МЕАК-реакції. Наприклад, існує постійна небажана ампліфікація в
МЕАВ-реакціях, яка призводить до утворення виявлюваного сигналу за відсутності цільової молекули або із сигналами, які неточно відображають кількість цільової молекули нуклеїнової кислоти, присутньої в реакційній суміші. Хоча забезпечується виявлення продукту за кінцевою точкою, забезпечити контроль реакції в режимі реального часу не вдається.
Даний винахід забезпечує модифіковані олігонуклеотидні праймери/матриці, які вирішують проблему точного визначення кількості цільової молекули нуклеїнової кислоти в МЕАК-реакції.
Це є особливо застосовуваним для визначення кількості цільової молекули нуклеїнової кислоти в МЕАК-реакції в режимі реального часу. Даний винахід щонайменше частково базується на виявленні того, що олігонуклеотидні праймери-матриці, які містять 2'-модифікований нуклеотид (наприклад, з 2-О-метильною, 2'-фтормодифікацією), знижують інтенсивність незаконної ампліфікації або усувають її без запобігання добудови цих модифікованих праймерів-матриць із метою ампліфікації специфічного продукту. Олігонуклеотидні праймери/матриці за даним винаходом застосовувані в МЕАК-реакціях, що включають один або декілька зі згаданих вище компонентів МЕАК.
В інших варіантах здійснення даний винахід забезпечує олігонуклеотидні праймери-матриці, які містять 2'-модифікований нуклеотид (наприклад, з 2'-О-метильною, 2'--фтормодифікацією), що розташований на 3'-кінці праймера-матриці або прилягає до нього. Неочікувано, нуклеотиди
Зо 3 2-О-метильною модифікацією, розташовані в 3'-кінці праймера-матриці, не тільки є ефективними затравковими субстратами для похідних ДНК-полімерази І Ввії з недостатністю 5'- 3'-екзонуклеазної активності в ізотермічних реакціях ампліфікації ДНК, але застосування таких модифікованих праймерів-матриць повністю пригнічує неспецифічну ампліфікацію за участю димерів праймерів. Це особливо неочікувано, оскільки загальноприйнятий підхід в галузі ізотермічної ампліфікації ДНК припускає, що модифіковані нуклеотиди (наприклад, рибонуклеотиди з 2'-О-метильною модифікацією, немодифіковані рибонуклеотиди) можуть бути уведені тільки в 5'-кінцеву ділянку праймера/матриці далеко від 3'-кінця, оскільки розміщення 2'-
О-метилу, а також рибонуклеотидів у межах б нуклеотидів від 3'-кінця праймера, як було продемонстровано, інгібує добудову праймера за допомогою ДНК-полімераз (заявку на патент від Атег5Ппат та патент від Оіадеп включено як посилання).
Похідні ДНК-полімерази І В5ї з недостатністю 5'-3'--екзонуклеазної активності, застосовувані в МЕАК та інших методиках ізотермічної ампліфікації (АМР), належать до роїІА-типу бактеріальних ДНК-полімераз, що беруть участь у процесах репарації ДНК із низькою точністю синтезу. На відміну від цього, високоточну реплікацію геному в бактерій каталізують холоферменти ДНК-полімерази ПП типу ОМАЕ та РОГ С, які використовують винятково РНК- праймери для ініціювання реплікації ДНК. В опублікованих джерелах з попереднього рівня техніки відмінність між РНК- і ДНК-праймерами вважалася одним з механізмів запобігання втручанню ферментів ДНК-полімераз І з високою частотою помилок у високоточну реплікацію геному. У зв'язку з цим несподіване виявлення того, що похідні ДНК-полімерази І В5ї можуть ефективно використовувати 2'-модифіковані рибонуклеотиди як праймери для синтезу ДНК, є вартим уваги та парадоксальним.
Конструкція праймера-матриці
Ілюстративні структури об'єктів, які пригнічують активність полімерази, у напрямку 5'-3' містять стабілізувальну послідовність, послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, спейсерну послідовність для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, і послідовність розпізнавання, специфічну для цільової молекули, при цьому послідовність розпізнавання, специфічна для цільової молекули, містить один або декілька 2'- модифікованих нуклеотидів (наприклад, які містять 2'-О-метил, 2'-метоксіетоксі, 2'-фтор, 2"-аліл, 2-0-(2-(метиламіно)-2-оксоетилі, 2-гідроксил (РНК), «-тіо, 4-СНо-О-2'-місток, 4-(СНг)2-0-2- бо місток, 2-ЇМА та 2-0-(М-метилкарбамат). Не обмежуючись теорією, припустили, що вбудовування одного або декількох 2'-«модифікованих нуклеотидів у ділянки розпізнавання робить ці модифіковані ділянки непридатними для того, щоб слугувати як матриця для полімеразної добудови в неспецифічних міжмолекулярних та/або внутрішньомолекулярних комплексах, утворених за допомогою взаємодій праймерів/матриць (наприклад, у випадку утворення димерів праймерів), і, отже, послаблює або усуває сигнал фону в ізотермічній ампліфікації. 2'-модифікований нуклеотид переважно має основу, що утворює пари основ із цільовою послідовністю. У конкретних варіантах здійснення два або більше 2'-модифіковані нуклеотиди (наприклад, 2, 3, 4, 5 або більше 2'-модифікованих нуклеотидів) у ділянці розпізнавання, специфічній для цільової молекули, є суміжними (наприклад, блок з модифікованих нуклеотидів). У деяких варіантах здійснення блок з 2'-модифікованих нуклеотидів розташований на 3'-кінці ділянки розпізнавання, специфічної для цільової молекули. В інших варіантах здійснення блок з 2'-модифікованих нуклеотидів розташований на
Б-кінці ділянки розпізнавання, специфічної для цільової молекули. Якщо блок з 2- модифікованих нуклеотидів розташований на 5'-кінці ділянки розпізнавання, специфічної для цільової молекули, 2'-модифіковані нуклеотиди можуть бути відокремлені від сайта одноланцюгового розриву за допомогою одного або декількох немодифікованих нуклеотидів (наприклад, 2, 3, 4, 5 або більше 2'-чемодифікованих нуклеотидів). Заявники виявили, що розташування одного або декількох 2'-модифікованих нуклеотидів або блоку з 2'-модифікованих нуклеотидів змінює кінетику ампліфікації. Якщо один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів або блок з 2'-модифікованих нуклеотидів розташовані на 5'-кінці ділянки розпізнавання або поблизу від неї або близько до сайта одноланцюгового розриву, у реакціях ампліфікації в режимі реального часу демонструється зменшений час до виявлення. Крім того, крива сигналу звужується, і нахил кривої змінюється. Заявники також виявили, що в ділянках розпізнавання завдовжки понад 12 нуклеотидів один блок з 5 послідовних 2'-модифікованих нуклеотидів є недостатнім для пригнічення неспецифічної ампліфікації, і, отже, вся ділянка розпізнавання, розташована на відстані до 4 або 5 нуклеотидів нижче за сайт одноланцюгового розриву, повинна бути заміщеною 2'-модифікованими нуклеотидами, що чергуються з немодифікованими нуклеотидами.
У пов'язаному варіанті здійснення співвідношення олігонуклеотидних праймерів/матриць, що мають один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів, можна застосовувати для зміни часу до виявлення та/або ефективності реакції для "налаштування" реакцій, що зумовлює передбачуваний контроль над кінетикою ампліфікації. Збільшення співвідношення олігонуклеотидних праймерів/матриць, що мають один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів на 3'-кінці послідовності розпізнавання, та олігонуклеотидних праймерів/матриць, що мають один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів на 5'-кінці послідовності розпізнавання, звужує криву сигналу та змінює нахил кривої. Переважною є наявність можливості для "налаштування" реакції із забезпеченням засобу для регуляції як часу до виявлення, так і ефективності реакції. Відносне кількісне визначення з використанням внутрішнього контролю вимагає виконання двох важливих умов. По-перше, доцільно мати можливість змінювати час до виявлення в реакції, створюючи неконкурентні умови реакції.
Таким чином, у разі впливу на контрольну реакцію з метою одержання можливості виявлення в пізніший момент часу (стосовно цільової молекули, що становить інтерес) контрольна реакція не перешкоджає реакції зі специфічною цільовою молекулою, що становить інтерес, навіть якщо цільова молекула, що становить інтерес, від початку характеризується низьким відносним вмістом. По-друге, для забезпечення розрахунку дійсного відносного вмісту потрібно, щоб контрольна реакція та реакція зі специфічною цільовою молекулою мали рівноцінну ефективність. Шляхом контролю ефективності кожної реакції за допомогою умов "налаштування" реакції можна робити рівноцінними, що дозволяє проводити задовільні розрахунки для відносного кількісного визначення. Налаштування реакцій можна застосовувати для забезпечення рівноцінності ефективності ампліфікації цільової нуклеїнової кислоти та ампліфікації еталонної нуклеїнової кислоти (наприклад, внутрішнього стандарту) у кількісній
ПЛР (аРСК). Крім того, криві ампліфікації цільової нуклеїнової кислоти та внутрішнього стандарту можуть бути змінені таким чином, що виявлення їхніх продуктів ампліфікації буде розділено в часі, із забезпеченням при цьому такої ж ефективності ампліфікації цільової нуклеїнової кислоти та ампліфікації внутрішнього стандарту. Завдяки застосуванню конкретних комбінацій і співвідношень олігонуклеотидних структур у реакційній суміші можна створити умови, які дозволяють налаштувати продуктивність реакції.
У різних варіантах здійснення пари праймерів/матриць сконструйовані в конфігурації "стебло-петля". 5'-кінець олігонуклеотидного праймера/матриці містить самокомплементарну бо ділянку, яка утворює щонайменше частину стебла. У деяких варіантах здійснення даного винаходу стебло додатково охоплює щонайменше частину послідовності розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, або всю її. В інших різних варіантах здійснення даного винаходу послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, у праймерах-матрицях не є частиною дволанцюгової структури стебла, але перебуває в межах головним чином одноланцюгової петлі. Цей сайт розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, зв'язаний на 3'-кінці з сайтом, що не має вторинної структури, який включає в себе сайт одноланцюгового розриву, зв'язаний на 3-кінці з послідовністю, комплементарною цільовій послідовності. У разі необхідності послідовність, комплементарна цільовій послідовності, може мати вторинну структуру або може не мати вторинної структури.
Наявність або відсутність вторинної структури, яка може містити самокомплементарну ділянку, буде визначатися для оптимізації конкретного МЕАК-аналізу.
В одному варіанті здійснення способи за даним винаходом забезпечують реакційну суміш для МЕАК, яка містить стандартні компоненти для МЕАК, але також містить фермент, здатний вносити одноланцюговий розрив у нуклеотид РНК, якщо він присутній у гетеродуплексі з комплементарним ланцюгом ДНК. В одному прикладі розщеплюваний нуклеотид РНК буде присутнім у нитці з 4-15 нерозщеплюваних нуклеотидів РНК (тобто О-2-Ме-РНК) у напрямку 5'- кінця цільової комплементарної ділянки РТО, і 3'-кінець олігонуклеотидної матриці буде мати 3'- кінцевий "кеп". Тільки після повної належної гібридизації олігонуклеотидної матриці молекула, що розщеплює гетеродуплекс (тобто РНКаза Н), буде здатна розщеплювати основу РНК, надаючи 3'-кінець для добудови від нього за допомогою ферменту нік-трансляції та дозволяючи проходити МЕАК-реакції до завершення. Порушення зв'язування з матрицею (димери праймерів, часткова гібридизація з нецілюьовими молекулами тощо) не буде зумовлювати утворення гетеродуплекса РНК-ДНК і, таким чином, запобігатиме проходженню МЕАК:-реакції.
Ці матриці будуть ампліфікуватися тільки після зв'язування з комплементарною нуклеотидною послідовністю завдяки видаленню 3-"кепу" для полімеразної добудови. Це зумовить підвищення рівня специфічності та чутливості МЕАК-реакції.
Олігонуклеотидні матриці за даним винаходом включено в реакційну суміш для МЕАК, що містить (1) цільову молекулу нуклеїнової кислоти; (2) дві молекули олігонуклеотидних матриць, які містять деяку кількість олігонуклеотидів, комплементарних цільовій молекулі нуклеїнової
Зо кислоти, і сайт, який може бути розщеплений ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і містить 4-15 нуклеотидів РНК, один з яких здатний піддаватися дії РНКази; (3) амтТР; (4) полімеразу, що робить заміщення ланцюгів; (5) фермент, що вносить одноланцюговий розрив; і (6) фермент, що вносить одноланцюговий розрив у РНК у гетеродуплексі ДНК-РНК, і 3'-кінцевий кеп для полімеразної добудови. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб застосування цих компонентів для кількісного визначення цільової молекули нуклеїнової кислоти.
Спосіб включає приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою, двома олігонуклеотидними матрицями, кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і ферментом, що вносить одноланцюговий розрив у гетеродуплекс ДНК-РНК (наприклад, РНКазою Н), і 3'-кінцевим кепом для полімеразної добудови; утворення виявлюваного амплікону, який містить щонайменше частину олігонуклеотидної матриці, що зв'язується з цільовою послідовністю.
Цільові молекули нуклеїнових кислот
Способи та композиції за даним винаходом застосовувані для ідентифікації цільової молекули нуклеїнової кислоти в тестовому зразку. Цільові послідовності ампліфікують практично з будь-яких зразків, що містять цільову молекулу нуклеїнової кислоти, які включають, без обмеження, зразки, що містять гриби, спори, віруси або клітини (наприклад, прокаріоти, еукаріоти). У конкретних варіантах здійснення за допомогою композицій та способів за даним винаходом виявляють Сіамібасієг тіспідапепвзів 5иб5р. тіспідапепвів, Сіамірасієг тіспідапепвів 5ир5р. зередопіси5, Рзеидотопах зугіпдає рим Тотаїй, Хапіпотопав5 сатрезвігів рм Мезісайюгіа,
Айегпагіа 5рр., Сіадозрогіит врр., Ризагішт охузрогит, Мепісіїйшт данйііа, Реендотопаз ситидаїа,
Егміпа сагоїомога та РаЇзіопіа зоЇапасеагит. Ілюстративні тестові зразки включають біологічні рідини (наприклад, кров, сироватку, плазму, амніотичну рідину, мокротиння, сечу, спинномозкову рідину, лімфу, слізну рідину, кал або шлунковий сік), тканинні екстракти, культуральні середовища (наприклад, рідину, у якій клітину, таку як клітину патогену, було вирощено), проби з довкілля, сільськогосподарську продукцію або інші продукти харчування та їх екстракти, ДНК-мітки для ідентифікації. У разі необхідності зразок очищають перед включенням у МЕАК-реакцію за допомогою будь-якого стандартного способу, як правило, застосовуваного для виділення молекули нуклеїнової кислоти з біологічного зразка.
В одному варіанті здійснення олігонуклеотидні праймери/матриці ампліфікують цільову нуклеїнову кислоту патогену для виявлення присутності патогену в зразку. Ілюстративні патогени включають гриби, бактерії, віруси та дріжджі. Такі патогени можуть бути виявлені за допомогою ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти, що кодує білок патогену, такий як токсин, у тестовому зразку. Ілюстративні токсини включають, без обмеження, афлатоксин, холерний токсин, дифтерійний токсин, токсин сальмонели, шига-токсин, токсин Сіовігіаійт рошіїпит, ендотоксин і мікотоксин. Для шляхів застосування стосовно довкілля тестові зразки можуть включати воду, рідкі екстракти з повітряних фільтрів, зразки грунту, будівельні матеріали (наприклад, гіпсокартон, стельові плитки, стінові плити, тканини, шпалери та підлогові покриття), мазки з довкілля або будь-який інший зразок.
В одному з варіантів здійснення, розкритих у даному документі, олігонуклеотидні праймери/матриці ампліфікують цільову нуклеїнову кислоту рослини, застосовувану як внутрішній контроль в експериментах з молекулярної селекції, спрямованих на поліпшення, наприклад, стійкості рослин до посухи, стійкості рослин до гербіцидів, до хижацького винищування шкідливими комахами. Одним із прикладів такої цільової нуклеїнової кислоти внутрішнього контролю, застосовуваним на практиці в даному документі, є ген АНІ (алкогольдегідрогенази 1) кукурудзи.
Цільові молекули нуклеїнових кислот включають в себе дволанцюгові та одноланцюгові молекули нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК, РНК та інші полімери на основі нуклеїнових основ, відомі в даному рівні техніки, здатні до гібридизації з молекулою нуклеїнової кислоти, описаною в даному документі) Молекули РНК, придатні для виявлення за допомогою виявлюваного олігонуклеотидного зонда або виявлюваного олігонуклеотидного праймера/матриці за даним винаходом, включають в себе, без обмеження, дволанцюгові та одноланцюгові молекули РНК, які містять цільову послідовність (наприклад, інформаційну РНК, вірусну РНК, рибосомну РНК, транспортну РНК, мікроРНК і попередників мікроРНК та міРНК або інші РНК, описані в даному документі або відомі в даному рівні техніки). Молекули ДНК, придатні для виявлення за допомогою виявлюваного олігонуклеотидного зонда або олігонуклеотидного праймера/матриці за даним винаходом, включають в себе, без обмеження, дволанцюгову ДНК (наприклад, геномну ДНК, плазмідну ДНК, мітохондріальну ДНК, вірусну ДНК
Зо і синтетичну дволанцюгову ДНК). Цільові молекули нуклеїнової кислоти у формі одноланцюгової ДНК включають, наприклад, вірусну ДНК, кДНК ї синтетичну одноланцюгову
ДНК або інші типи ДНК, відомі в даному рівні техніки.
У цілому, цільова послідовність для виявлення має довжину від 10 до 100 нуклеотидів (наприклад, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 нуклеотидів). Вміст С у цільовій молекулі нуклеїнової кислоти вибирають таким, що він становить менше, ніж приблизно 45, 50, 55 або 60 95. Бажано вибирати цільову послідовність і ферменти, що вносять одноланцюговий розрив, таким чином, щоб цільова послідовність не містила сайтів одноланцюгового розриву для будь-яких ферментів, що вносять одноланцюговий розрив, які будуть включені в реакційну суміш.
Виявлювані олігонуклеотидні зонди
Даний винахід забезпечує кількісне визначення цільових молекул нуклеїнових кислот або їхніх ампліконів в МЕАК-реакції з використанням неампліфікованих виявлюваних полінуклеотидних зондів, які містять щонайменше одну молекулу, що пригнічує активність полімерази (наприклад, модифікацію нуклеотиду або інший фрагмент, який робить олігонуклеотид здатним до зв'язування з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти, але нездатним підтримувати добудову матриці з використанням виявлюваного олігонуклеотидного зонда як мішені). Не бажаючи обмежуватися теорією, припустили, що наявність одного або декількох фрагментів, які не дозволяють просування полімерази, імовірно, спричиняє пригнічення активності полімерази за допомогою додавань до каркаса олігонуклеотиду, відмінних від нуклеїнових кислот, або через втрату швидкості реплікативною полімеразою (тобто за допомогою СЗ-спейсера, ушкоджених основ ДНК, іншого спейсерного фрагмента, основ з модифікацією О-2-Ме). Ці конструкції, таким чином, запобігають незаконній ампліфікації зонда протягом МЕАК-реакції або знижують її інтенсивність. Це відрізняє їх від звичайних детекторних зондів, які повинні додаватися наприкінці МЕАК-реакції для запобігання їхньої ампліфікації.
Звичайні детекторні зонди виявилися непрактичними для кількісної оцінки МЕАК-реакції в режимі реального часу. Якщо звичайні детекторні зонди включено в МЕАК-реакцію, ці звичайні детекторні зонди ампліфікуються одночасно з цільовою молекулою. Ампліфікація цих детекторних молекул приховує належні цільові амплікони від виявлення у зв'язку з кількістю 60 вихідних молекул детекторного зонда на початку реакції.
Даний винахід забезпечує неампліфіковуваний виявлюваний полінуклеотидний зонд, який містить щонайменше одну молекулу, що пригнічує активність полімерази. Молекула, що пригнічує активність полімерази, за даним винаходом включає, без обмеження, модифікацію нуклеотиду або інший фрагмент, що блокує добудову праймера-матриці за допомогою реплікативних ДНК-полімераз, запобігаючи, таким чином, ампліфікації детекторних молекул; але може забезпечити правильну гібридизацію або розташування нуклеотидів для цільової молекули або ампліфікованих копій цільової молекули. В одному з варіантів здійснення виявлюваний олігонуклеотидний зонд за даним винаходом містить З-вуглецевий спейсер (С3- спейсер), що запобігає незаконній ампліфікації детекторної молекули або знижує її інтенсивність.
В одному з варіантів здійснення виявлюваний олігонуклеотидний зонд за даним винаходом являє собою олігонуклеотид у формі шпильки, який містить виявлюваний фрагмент. В іншому варіанті здійснення неампліфікований виявлюваний полінуклеотидний зонд являє собою олігонуклеотид у формі шпильки, що містить флуорофор на одному кінці та гасильний барвник на протилежному кінці Петля шпильки містить послідовність, комплементарну цільовій послідовності та здатну до гібридизації з нею. Стебло шпильки утворюють шляхом відпалу комплементарних послідовностей плечей, розташованих по обидва боки від петлі. Флуорофор і гасильна молекула ковалентно зв'язані на протилежних кінцях кожного плеча. Якщо виявлюваний олігонуклеотидний зонд перебуває в шпильковій конфігурації, флуоресцентна та гасильна молекули перебувають близько одна до одної, що, таким чином, зумовлює резонансне перенесення енергії флуоресценції (ЕКЕТ) та гасіння флуоресценції флуорофору. Коли виявлюваний олігонуклеотидний зонд зустрічається з цільовою молекулою, відбувається гібридизація; структура петлі перетворюється на конформацію дуплекса з цільовою молекулою, що викликає відокремлення молекули флуорофору від гасильної молекули, у результаті чого відбувається флуоресценція (Туаді еї аІ. Майшге Віотесппоіоду 14: Магсп 1996, 303-308).
Виявлювані олігонуклеотидні зонди є специфічними для цільової послідовності. В одному з варіантів здійснення виявлюваний олігонуклеотидний зонд містить одну або декілька модифікованих нуклеотидних основ, які мають підвищену спорідненість зв'язування з комплементарним нуклеотидом. Приклади основ включають, без обмеження, закриті нуклеїнові
Зо кислоти (МА), амідити нуклеїнових кислот з 2'-фтормодифікацією та амідити РНК із модифікацією 2'ОМе (які також функціонують як молекули, що пригнічують активність полімерази). Виявлювані олігонуклеотидні зонди за даним винаходом можна синтезувати з різними кольоровими флуорофорами та можна конструювати для гібридизації практично з будь- якою цільовою послідовністю. З урахуванням його виняткової специфічності неампліфікований виявлюваний полінуклеотидний зонд за даним винаходом застосовують для виявлення однієї цільової молекули нуклеїнової кислоти в зразку або застосовують у комбінації з виивлюваними олігонуклеотидними зондами, кожний з яких зв'язує іншу цільову молекулу нуклеїнової кислоти.
Відповідно, неампліфіковані виявлювані полінуклеотидні зонди за даним винаходом можна застосовувати для виявлення однієї або декількох цільових молекул нуклеїнової кислоти в одній і тій самій реакції, що дозволяє робити одночасне кількісне визначення цих цільових молекул.
Даний винахід охоплює застосування таких флуорофорів у поєднанні з виявлюваними олігонуклеотидними зондами, описаними в даному документі.
Застосування неампліфікованих виявлюваних полінуклеотидних зондів
Неампліфіковані виявлювані полінуклеотидні зонди застосовувані в способах кількісної оцінки цільової молекули нуклеїнової кислоти в реакції ампліфікації із внесенням одноланцюгових розривів і добудовою (МЕАК). Спосіб включає приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою, двома олігонуклеотидними праймерами/матрицями, кожний/кожна з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, і виявлюваним олігонуклеотидним зондом за присутності придатного буфера та аМТР; утворення ампліконів, які містять щонайменше частину зазначеної цільової молекули нуклеїнової кислоти; і визначення рівня цільової молекули нуклеїнової кислоти, присутньої в реакційній суміші, за допомогою кількісної оцінки олігонуклеотидного зонда, який гібридизується з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти, у режимі реального часу протягом реакції на основі інтенсивності флуоресценції молекул зонда в реакційній суміші.
Переважно такі способи застосовувані для контролю МЕАК у режимі реального часу.
У цілому, неампліфіковані виявлювані полінуклеотидні зонди за даним винаходом включено в реакційну суміш для МЕАК, що містить (1) цільову молекулу нуклеїнової кислоти; (2) дві молекули олігонуклеотидних матриць, які містять деяку кількість олігонуклеотидів, бо комплементарних цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, і сайт, який може бути розщеплений ферментом, що вносить одноланцюговий розрив; (3) аМТР; (4) полімеразу, що робить заміщення ланцюгів; і (5) фермент, що вносить одноланцюговий розрив. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб застосування цих компонентів для кількісної оцінки цільової молекули нуклеїнової кислоти.
МЕАВ-аналізи
Даний винахід забезпечує виявлення цільових молекул нуклеїнових кислот, ампліфікованих в МЕАК-аналізі. Такі аналізи відомі у даному рівні техніки та описані у даному документі. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США Мо 2009/0081670, заявку згідно з РСТ Мо 2009/012246 і патенти США МоМо 7112423 та 7282328, кожний з яких включено в даний документ у всій своїй повноті. Полімерази, застосовувані в способах, описаних у даному документі, здатні каталізувати вбудовування нуклеотидів з добудовою від 3'-гідроксильного кінця олігонуклеотиду (наприклад, олігонуклеотидного праймера/матриці або іншого праймера), зв'язаного з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти. Такі полімерази включають ті, які є термофільними, та/або ті, які здатні до заміщення ланцюгів. Полімерази, застосовувані в способах, описаних у даному документі, не мають 5'-3-екзонуклеазну активність, що в іншому випадку руйнувала б заміщений ланцюг одноланцюгової нуклеїнової кислоти. Полімераза також має активність зворотної транскриптази (наприклад, похідні ДНК-полімерази В5ї (великий фрагмент), ДНК- полімераза Тпегтіпайог, ДНК-полімераза ТПептіпайог ІІ). Ілюстративні полімерази включають, без обмеження, великі фрагменти ДНК-полімерази І Веї, ДНК-полімеразу І Е. соїї (фрагмент
Кленова), фрагмент Кленова (3-5'-екзо-), ДНК-полімеразу 714, ДНК-полімеразу Т7, ДНК- полімеразу ЮОеер Мепін. (екзо-), ДНК-полімеразу ЮОеер Мепів, Тептіпайг, ДНК-полімеразу
Тпептіпаїог ІІ, ДНК-полімеразу АтріїГпегт, ДНК-полімеразу 5Рб. Наступні необмежувальні приклади зворотних транскриптаз (КТ) можуть бути використані в реакціях способу за даним винаходом для підвищення продуктивності під час виявлення послідовності РНК: Отпізосгірі (Оіадеп), Зепвізстірі (Оіадеп), Мопвіегостірі (Ерісепіге), Тгапзепріог (Воспє), ВТ НІМ (Атрбіоп), зиреїзепірі ПІ (Іпмйкодеп), Тпегтозсетірі (Іпийгодеп), Тпепто-Х (Іпмйгодеп), ІтРгот І! (Рготеда).
Фермент, що вносить одноланцюговий розрив, зв'язується з послідовністю розпізнавання у дволанцюговій ДНК та розщеплює один ланцюг дволанцюгової спіралі. Ферменти, що вносять одноланцюговий розрив, можуть робити розщеплення вище або нижче за сайт розпізнавання
Зо для них або в межах сайта розпізнавання для ферменту. У способах, розкритих у даному документі, для запуску повторюваних циклів внесення одноланцюгових розривів у ДНК-субстрат і добудови від одноланцюгового розриву за допомогою полімерази для проведення експонентної ампліфікації цільового фрагмента нуклеїнової кислоти між праймерами- матрицями можна застосовувати лише ті ферменти, що вносять одноланцюговий розрив, які розщеплюють верхній ланцюг нижче за сайт розпізнавання. В ідеальному випадку фермент, що вносить одноланцюговий розрив, функціонує за тих самих умов реакції, що і полімераза. У переважному варіанті здійснення даного винаходу фермент, що вносить одноланцюговий розрив, є термостабільним та активним від 50 "С до 60 "С. Ілюстративні ферменти, що вносять одноланцюговий розрив, застосовувані в способах, розкритих у даному документі, включають, без обмеження, МіЕВ5рої (МЕВ), МЕВ5роОбіІ, МЕВетА! (МЕВ), МАМ (МЕВ), МЕВБУСІ (МЕВ),
М.В (Зіреплуте) і МЕВ5ІМВІ (МЕВ).
Реакційна суміш для МЕАК звичайно містить нуклеотиди, такі як, наприклад, дидезоксирибонуклеозидтрифосфати (аМТР). Реакцію можна також проводити за присутності амМтТР, які містять виявлюваний фрагмент, зокрема, без обмеження, радіоактивну мітку (наприклад, З2Р, 33Р, 1251, 5553, фермент (наприклад, лужну фосфатазу), флуоресцентну мітку (наприклад, ізотіоціанат флуоресцеїну (РІТС)), біотин, авідин, дигоксигенін, антигени, гаптени або флуорохроми. Реакційна суміш для МЕАК додатково включає деякі солі та буфери, які забезпечують активність ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, і полімерази.
МЕАВ-реакцію переважно проводять у практично ізотермічних умовах, коли температура реакції є більш-менш постійною протягом реакції ампліфікації. Оскільки температура не повинна змінюватися циклічно від верхньої температури до нижньої температури, МЕАК-реакцію можна проводити в умовах, у яких здійснити звичайну ПЛР було б важко. Як правило, реакцію проводять при температурі, що становить приблизно від 35 "С до 90 "С (наприклад, при 35, 37, 42, 60,65, 70, 75, 80 або 85С). Підтримання температури з високим ступенем точності переважно не є суттєвим. Деяка мінливість температури є прийнятною.
Для зниження температури плавлення олігонуклеотидів також можна застосовувати модифікатори температури плавлення (Тіт) і швидкості реакції, такі як (без обмеження) етиленгліколь і гліцерин. Крім того, для зміни швидкості реакції можна застосовувати модифікатори швидкості реакції за участю ДНК-полімерази (такі як аМТР і концентрація магнію), бо що зумовлює більшу точність кількісного визначення.
Даний винахід забезпечує способи контролю МЕАК-реакції в режимі реального часу з використанням стратегії МЕАК-ампліфікації, описаної вище та у патентах ОО500711242382 і
О05Б20090017452А1. В одному варіанті здійснення в кількісній МЕАВ використовується ампліфікація цільових нуклеїнових кислот поряд з контрольною ампліфікацією відомої кількості.
Кількість цільової нуклеїнової кислоти може бути розрахована у формі абсолютного кількісного визначення або відносного кількісного визначення (напівкількісного) на основі джерела контролю (екзогенного або ендогенного контролю).
Кількісну оцінку невідомої нуклеотидної послідовності можна здійснити або шляхом порівняння порогового значення з логарифмічної фази ампліфікації для невідомої послідовності з таким для серії відомих цільових послідовностей в окремій групі реакційних сумішей або в тій самій реакційній суміші; або шляхом одержання порогового значення від внутрішнього ендогенного або екзогенного продукту спільної ампліфікації, яке вказує або на позитивний результат (якщо значення для невідомої послідовності перевищує порогове значення), або на негативний результат (якщо значення для невідомої послідовності не перевищує порогове значення).
Шляхи застосування
Даний винахід забезпечує контроль ізотермічної ампліфікації в МЕАК-реакції в режимі реального часу, що може забезпечити кількісну міру кількості вихідної цільової нуклеїнової кислоти. Композиції та способи за даним винаходом застосовувані в діагностиці для людини, де бажана швидка кількісна відповідь (наприклад, виявлювана ампліфікація протягом до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 хв. або менше). У конкретних варіантах здійснення даний винахід забезпечує застосування аналізу на основі МЕАК-реакції в діагностиці для людини в клінічних умовах. В інших варіантах здійснення даний винахід забезпечує застосування аналізів на основі МЕАК- реакції в діагностиці у виїзній роботі, де доступ до обладнання для термоциклювання відсутній або буде надмірно дорогим. В ще інших варіантах здійснення даний винахід забезпечує застосування аналізів на основі МЕАК-реакції в умовах для наукової праці, де бажані швидкі кількісні відповіді.
Набори
Даний винахід також забезпечує набори для ампліфікації цільової молекули нуклеїнової
Зо кислоти. Такі набори застосовувані для виявлення або кількісної оцінки цільової нуклеїнової кислоти в біологічному зразку, одержаному від суб'єкта. Набори за даним винаходом можуть містити, наприклад, одну або декілька полімераз, прямі та зворотні праймери-матриці та один або декілька ферментів, що вносять одноланцюговий розрив, описаних у даному документі.
Якщо ампліфікації підлягає одна цільова послідовність, то в набір можуть бути включені один або два ферменти, що вносять одноланцюговий розрив. Якщо ампліфікації підлягають декілька цільових послідовностей, а праймери-матриці, сконструйовані для цих цільових послідовностей, містять сайти для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, для одного і того самого ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, тоді можуть бути включені один або два ферменти, що вносять одноланцюговий розрив. Якщо праймери-матриці розпізнаються різними ферментами, що вносять одноланцюговий розрив, то в набір можуть бути включені декілька ферментів, що вносять одноланцюговий розрив, як, наприклад, З або більше.
В одному аспекті даний винахід забезпечує набір для ампліфікації нуклеїнових кислот, що містить ДНК-полімеразу, перший праймер-матрицю, другий праймер-матрицю, фермент, що вносить одноланцюговий розрив, зі специфічністю до сайта розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, у праймерах-матрицях і дезоксинуклеотидтрифосфати (амтР) (наприклад, у буферному розчині, що містить компоненти, достатні для ампліфікації). У різних варіантах здійснення кожний з першого праймера-матриці та другого праймера-матриці має послідовність 3'-кінцевої специфічної ділянки розпізнавання, комплементарну або практично комплементарну цільовій послідовності, де кінцева специфічна ділянка розпізнавання містить один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів; послідовність 5'-кінцевого хвоста, яка містить сайт розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, вище за послідовності 3'-кінцевої специфічної ділянки розпізнавання, і стабілізувальну послідовність вище (5) за сайт зв'язування для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив.
В одному аспекті набори за даним винаходом містять гомогенну суміш всіх компонентів для
МЕАВ-реакції, у тому числі, без обмеження, аМТР, прямі та зворотні праймери-матриці, фермент, що вносить одноланцюговий розрив, полімеразу, виявлюваний полінуклеотидний зонд, специфічний для цільової молекули, буфер і стабілізатори реакції, за винятком цільової нуклеїнової кислоти.
Набори за даним винаходом можуть також містити один або декілька компонентів у будь- 60 якій кількості окремих контейнерів, пакетів, пробірок (наприклад, на «0,2 мл, 0,2 мл, 0,6 мл, 1,5 мл, 5,0 мл, »5,0 мл), флаконів, титраційних мікропланшетів (наприклад, на «96 лунок, 96 лунок, 384 лунки, 1536 лунок, 21536 лунок), АітауТаре тощо, або компоненти можуть бути об'єднані в різні комбінації у таких контейнерах. У різних варіантах здійснення набір додатково включає пару олігонуклеотидних праймерів-матриць, здатних до зв'язування та ампліфікації еталонної послідовності. В ще інших варіантах здійснення набір включає стерильний контейнер, що містить олігонуклеотидні праймери-матриці; такі контейнери можуть бути коробками, ампулами, пляшками, флаконами, пробірками, мішками, сумками, блістерними упаковками або іншою придатною формою контейнерів, відомих у даному рівні техніки. Такі контейнери можуть бути виготовлені з пластику, скла, ламінованого паперу, металевої фольги або інших матеріалів, застосовуваних для зберігання нуклеїнових кислот.
Компоненти набору можуть, наприклад, бути присутніми в одному або декількох контейнерах, наприклад, усі компоненти можуть перебувати в одному контейнері, або, наприклад, ферменти та матриці можуть перебувати в окремих контейнерах. Компоненти можуть, наприклад, бути висушеними (наприклад, сухий залишок), ліофілізованими (наприклад, сухий осад) або перебувати в стабільному буфері (наприклад, хімічно стабілізованому, термічно стабілізованому). Сухі компоненти можуть, наприклад, бути одержані шляхом ліофілізації, вакуумного сушіння та сушіння за допомогою центрифужної сушарки та/або сушіння при навколишній температурі. У різних варіантах здійснення полімераза та ферменти, що вносять одноланцюговий розрив, перебувають у ліофілізованій формі в одному контейнері, а матриці є або ліофілізованими, підданими сублімаційному сушінню, або перебувають у буфері в іншому контейнері. У деяких варіантах здійснення полімераза, ферменти, що вносять одноланцюговий розрив, і матриці перебувають у ліофілізованій формі в одному контейнері. В інших варіантах здійснення полімераза та фермент, що вносить одноланцюговий розрив, можуть бути розділені по різних контейнерах.
Набори можуть додатково включати, наприклад, аМТР, застосовувані в реакції, або модифіковані нуклеотиди, кювети або інші контейнери, застосовувані для реакції, або флакон з водою або буфером для повторної гідратації ліофілізованих компонентів. Застосовуваний буфер може, наприклад, підходити для активності як полімерази, так і ферменту, що вносить одноланцюговий розрив.
Зо Набори за даним винаходом можуть також містити інструкції для виконання одного або декількох способів, описаних у даному документі, та/або опис однієї або декількох композицій або реагентів, описаних у даному документі. Інструкції та/"або описи можуть бути в друкованій формі та можуть бути включені у вкладку для набору. Набір також може включати в себе письмовий опис адреси в Інтернеті, за якою надають такі інструкції або описи.
Набори можуть додатково включати реагенти, застосовувані в способах виявлення (наприклад, у режимі реального часу або за кінцевою точкою), такі як, наприклад, гібридизаційні зонди або барвники, що зв'язуються з ДНК. Набори можуть додатково включати реагенти, застосовувані в способах виявлення, такі як, наприклад, реагенти, застосовувані для ЕКЕТ, пристрої для аналізу в горизонтальному потоці, покажчики рівня, флуоресцентний барвник, колоїдні частинки золота, латексні частинки, молекулярний маяк або полістиролові гранули.
Компоненти для виявлення можуть бути вбудовані в пристрій для аналізу в горизонтальному потоці. Пристрій для аналізу в горизонтальному потоці можна застосовувати в місці спостереження.
У практичному здійсненні даного винаходу використовують, якщо не зазначене інше, звичайні методики молекулярної біології (у тому числі методики рекомбінантних молекул), мікробіології, клітинної біології, біохімії та імунології, які цілюм перебувають у межах компетенції фахівця в даній галузі. Такі методи докладно описані в літературі, такій як "МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаюгту Мапиа!", 5зесопа єайоп (ЗатбргооКк, 1989); "ОіІідописіеоїіде
Зупіпезіз" (Сай, 1984); "Апіта! Се! Сийигте" (Егезппеу, 1987); "МеїШодв іп Епгутоіоду", "Напарсок ої Ехрегітепіа! Іттипоіоду" (МУвїг, 1996); "Сепе Тгапетег Месюгз г Маттаїап СеїЇв" (Мійег апа Саїоз, 1987); "Сцтепі РгоїосоЇє іп МоїІесшаг Віоіоду" (Аизибеї!, 1987); "РОСА: Те
Роїутегазе СНаїіп Веасійоп" (Миїйїв, 1994); "Сцтепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду" (Соїїдап, 1991). Ці методики застосовувані для одержання полінуклеотидів і поліпептидів за даним винаходом і, таким чином, можуть розглядатися в підготовці та практичному здійсненні даного винаходу.
Особливо застосовувані методики для конкретних варіантів здійснення будуть обговорюватися в наступних розділах.
Наступні приклади запропоновані таким чином, щоб забезпечити фахівця в даній галузі повним розкриттям та описом підготовки та застосування аналізу, скринінгу та терапевтичних способів за даним винаходом, і не призначені для обмеження обсягу того, що автори даного 60 винаходу вважають своїм винаходом.
ПРИКЛАДИ
У даний час МЕАК-реакцію застосовують для швидкого та ізотермічного виявлення присутності або відсутності цільового олігонуклеотиду в зразку. У зв'язку з технічними обмеженнями звичайні способи МЕАК не підходять для кількісної оцінки цільових олігонуклеотидів у режимі реального часу щонайменше частково через незаконну ампліфікацію нецільових молекул у зразку, яка перешкоджає виявленню та точному кількісному визначенню цільових ампліконів. Даний винахід забезпечує композиції та способи, які долають ці обмеження шляхом забезпечення виявлюваних праймерів/матриць, які не піддаються незаконній ампліфікації. В одному з варіантів здійснення в кількісному аналізі МЕАК використовують праймер, що містить одну або декілька модифікацій 2'-О-Ме, який запобігає незаконній ампліфікації нецільових молекул протягом МЕАК-реакції або знижує її інтенсивність. У даний час план аналізів на основі МЕАК-ампліфікації обмежений дуже короткими ділянками в цільовій нуклеїновій кислоті, які мають щонайменше один сайт розпізнавання, який трапляється в природі, для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, у безпосередній близькості.
Синтез із заміщенням ланцюгів, ініційований у цих сайтах одноланцюгового розриву, забезпечує одноланцюгові цільові молекули ДНК, з якими праймери-матриці з короткими ділянками, специфічними для цільової молекули, можуть зв'язуватися та починати цикли внесення одноланцюгових розривів/полімеразної добудови в реакціях ампліфікації цільової молекули.
Даний винахід забезпечує композиції та способи, які долають це обмеження шляхом використання праймерів-матриць із довшими ділянками, специфічними для цільової молекули, які внаслідок цього здатні проникати в ланцюг у діапазоні від 507С до 60"С під час першої фази реакції ампліфікації без допомоги синтезу із заміщенням ланцюгів. Довші ділянки, специфічні для цільової молекули, у праймерах-матрицях привносять недолік, який полягає в наданні більшої корисної площі для утворення неспецифічних гібридів ДНК із добудовуваними 3'- кінцями, що може запустити синтез неспецифічних продуктів ампліфікації. Композиції в даному винаході послаблюють цей недолік шляхом поширення розміщення 2'-модифікованих нуклеотидів за межі 3'-кінцевого блоку з п'яти послідовних модифікованих нуклеотидів, охоплюючи всю ділянку, специфічну для цільової молекули, з використанням альтернативної послідовності з 2'--модифікованих та немодифікованих нуклеотидів.
Зо Приклад 1. Олігонуклеотидні праймери-матриці, що містять нуклеотиди з 2'-О-метильною модифікацією, послаблюють або усувають сигнал фону в МЕАК-ампліфікації
Якщо МЕАК-ампліфікацію виконують без уведення цільової нуклеїнової кислоти (тобто в контролях без цільової молекули; МТС), сигнал утворюється, незважаючи на відсутність матриці. Таким чином, утворення сигналу фону здатне знижувати точність кількісного визначення цільової нуклеїнової кислоти за допомогою МЕАК-ампліфікації. Було висловлене припущення, що сигнал фону утворювався, зокрема, за допомогою утворення димерів праймерів олігонуклеотидними праймерами/матрицями. Не обмежуючись теорією, припускають, що структури, що пригнічують активність полімерази, які містять 2'-модифіковані нуклеотиди, можна застосовувати для послаблення або усунення міжмолекулярних та/або внутрішньомолекулярних взаємодій праймерів/матриць (наприклад, утворення димерів праймерів) і, таким чином, послаблення або усунення сигналу фону в МЕАК-аналізі.
Ілюстративні структури об'єктів, що пригнічують активність полімерази, у напрямку 5'-3' містять стабілізувальну послідовність, послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, спейсерну послідовність для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, і послідовність розпізнавання, специфічну для цільової молекули, при цьому послідовність розпізнавання, специфічна для цільової молекули, містить один або декілька 2'- модифікованих нуклеотидів (наприклад, рибонуклеотиди з 2'-О-метильною модифікацією).
Якщо в послідовності розпізнавання, специфічній для цільової молекули, присутні два або більше 2'-модифіковані нуклеотиди, то 2'-модифіковані нуклеотиди можуть бути суміжними
БО (наприклад, 2, 3, 4, 5 або більше 2'-модифікованих нуклеотидів).
Титрування синтетичної дволанцюгової цільової молекули ДНК Сіамірасієї тіспідапепвів зерідопісив (Сптв) оцінювали шляхом виявлення за допомогою флуоресцентного маяка. Цільову
ДНК піддавали серійному розведенню з вихідного розчину синтезованої "багатомірної" ДНК в 250 пар основ, яку сконструювали з цільовою послідовністю та одним сайтом одноланцюгового розриву.
Сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) було пригнічено в реакційних сумішах, що містили матриці з 2'-О-метильною модифікацією (фігура 2А). Калібрувальна крива відображала широкий динамічний діапазон із застосуванням реакційних сумішей з матрицями з 2'-0- метильною модифікацією (фігура 28). Зразки (10 мкл) реакційних сумішей з контролю без бо цільової молекули проаналізували за допомогою ВЕРХ/мас-спектрометрії, і підтвердили пригнічення утворення фонових продуктів ампліфікації (фігура 2С). Спектри, одержані в реакціях із застосуванням немодифікованих олігонуклеотидів, показали складний спектр, утворений декількома продуктами ампліфікації одержаними з неспецифічних фонових продуктів, разом з матрицями, що не прореагували (фігура 2С, ліва панель). Спектри, одержані в реакціях із застосуванням олігонуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, показали простий спектр, утворений матрицями, що не прореагували, без присутності неспецифічних фонових продуктів (фігура 2С, права панель).
Для вивчення ефекту реакційних сумішей, що містили матриці з 2'-О-метильною модифікацією, стосовно ампліфікації біологічного зразка геномну ДНК Сіамірасієгї тіспідапепвів верідопісиє (Ст5) застосовували як цільову ДНК. Ампліфіковані продукти виявляли за допомогою ЗУВК Огееп, який виявляв дволанцюгову ДНК (фігури ЗА та ЗВ), або молекулярних маяків, які виявляли специфічний продукт (фігури 4А та 4В). Стандартні реакції виконували з олігонуклеотидними ДНК-матрицями (фігури ЗА і 4А), а реакційні суміші, що містили матриці з 2"-О-метильною модифікацією (ОМАбіє), виконували з олігонуклеотидами, що містили блок з 5 суміжних нуклеотидів з 2'--О-метильною модифікацією на 3'-кінці в послідовності розпізнавання, специфічній для цільової молекули (фігури ЗВ та 4В). Сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) було пригнічено в реакційних сумішах, що містили матриці з 2'-О-метильною модифікацією (фігури ЗВ та 48), тоді як у контролях без цільової молекули (МТС) спостерігався істотний сигнал (фігури 4А та 4В), що вказувало на утворення фонового продукту за відсутності цільової ДНК.
Таким чином, ці результати вказують на те, що праймери, які містять нуклеотиди з 2'-0- метильною модифікацією, послаблюють або усувають сигнал фону в МЕАК-ампліфікації.
Приклад 2. Розміщення нуклеотидів з 2''О-метильною модифікацією в олігонуклеотидних праймерах/матрицях змінює час до виявлення та ефективність МЕАВ-реакцій
Ілюстративні об'єкти, що пригнічували активність полімерази, які мали нуклеотиди з 2'-0О- метильною модифікацією в різних положеннях усередині ділянки специфічності, застосовували в реакціях МЕАК-ампліфікації і вивчали їхню кінетику реакції. Зокрема, вивчені праймери/матриці містили пару олігонуклеотидів, що мала блок з п'яти нуклеотидів з 2'-0- метильною модифікацією, розташованих на 3'-кінці ділянки специфічності або на 5'-кінці ділянки
Зо специфічності (на 2 нуклеотиди нижче за сайт одноланцюгового розриву) (фігура 5). Стандартні реакції виконували у двох повторностях із блоком з нуклеотидів 3 2'-О-метильною модифікацією, розташованим на 3'-кінці або який починався з 3-го нуклеотиду після сайта одноланцюгового розриву та охоплював 5 основ, або із сумішшю цих двох структур, як зазначено. Цільова ДНК була геномною ДНК Сіамірасієї тіснідапепвзіз зерідопісив (Ств).
Виявлення базувалося на молекулярному маяку в кінцевій концентрації 100 нМ.
Об'єкти, що модифікували швидкість реакції, які мали нуклеотиди з 2'-О-метильною модифікацією в різних положеннях усередині ділянки специфічності олігонуклеотидного праймера/матриці, відображали різну кінетику ампліфікації (фігура 6). У реакціях, у яких застосовувалися праймери/матриці, що мали блок з п'яти нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією на 3'-кінці, показано зменшений час до виявлення (матриця "Кінцева"; 170 с) порівняно з праймерами/матрицями, які мали блок з п'яти нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, який починався з 3-го нуклеотиду після сайта одноланцюгового розриву (матриця "Одноланцюговий розрив 2"; 430 с). Таким чином, припустили, що співвідношення двох олігонуклеотидних праймерівл матриць можна застосовувати для регуляції часу до виявлення та/або ефективності реакції для "налаштування" реакцій. У реакціях з різними співвідношеннями матриця "Кінцева" матриця "Одноланцюговий розрив 2" показано проміжний час до виявлення, значення якого перебуває між значеннями для цих двох матриць (фігура 6). Крім того, зі збільшенням співвідношення матриця "Кінцева": матриця "Одноланцюговий розрив 2" крива звужувалася, а нахил кривої змінювався. Таким чином, було показано, що розташування 2-модифікованих нуклеотидів в олігонуклеотидних праймерах/матрицях і співвідношення олігонуклеотидних праймерів/матриць із по-різному розташованими 2'-модифікованими нуклеотидами змінювали час до виявлення та ефективність
МЕАВ-реакцій. Даний винахід щонайменше частково базується на цих виявленнях.
Приклад 3. Повне пригнічення неспецифічної ампліфікації в МЕАК-аналізах із застосуванням праймерів-матриць із довгими ділянками, специфічними для цільової молекули
МЕАВ-аналіз для кількісного визначення гена алкогольдегідрогенази 1 (АОНІ) кукурудзи розробили з використанням двох альтернативних наборів прямих і зворотних праймерів- матриць (Т53 і Т53). Придатний сайт розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, не міг бути розташований у межах 500 нуклеотидів вище або нижче за цільову ділянку бо послідовності в геномній ДНК кукурудзи. Обидва набори праймерів-матриць відрізнялися довшими ділянками, комплементарними цільовій послідовності (16 та 19 нуклеотидів, відповідно), здатними до гібридизації із цільовою ДНК, опосередкованої проникненням у ланцюг. У першому наборі (753) ділянки прямих і зворотних праймерів-матриць, комплементарні цільовій послідовності, містили блок з 5 послідовних рибонуклеотидів з 2'-О- метильною модифікацією безпосередньо вище за 3'-кінцневий дезоксинуклеотид. Інша частина ділянки, комплементарної цільовій послідовності, містила послідовність не модифікованих дезоксинуклеотидів та рибонуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, що чергувалися, яка починалася на п'ять нуклеотидів (прямий праймер-матриця) або чотири нуклеотиди (зворотний праймер-матриця) нижче за сайт одноланцюгового розриву. Другий набір (Т56) праймерів- матриць відрізнявся тільки блоком з п'яти рибонуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією, які прилягали до 3'-кінцевого немодифікованого дезоксинуклеотиду, у той час як інша частина ділянки, комплементарної цільовій послідовності, містила тільки немодифіковані дезоксинуклеотиди.
Десять мікролітрів реакційних сумішей для МЕАК поміщали в 50 мМ Тгтгі5 з рН 8,0, 15 мМ (МНаОг26505, 15 мМ Ма»5О54 та 15 мМ Мо5о5 із застосуванням 3,84 Од ДНК-полімерази 1 В5і
Умапт:їат 2.0 (МЕВ), 10000 копій синтетичної цільової ДНК АОСНІ кукурудзи, 0,3 мМ амтРе, з Од ферменту, що вносить одноланцюговий розрив, МІ.В5ІМВІ, 200 нм КОХ/ВнНО-міченого зонда для АЮНІ типу молекулярного маяка, 0,5Х барвника 5УВЕ Огееп (І еТесппоіодієв), 1000 нм зворотного праймера-матриці з Т53 або Т56 і 100 нМ прямого праймера-матриці з Т53 або Т56.
Групу контрольних реакційних сумішей без цільової ДНК (МТС) складали з тих самих компонентів без синтетичної цільової ДНК АСНІ кукурудзи. Всі реакційні суміші інкубували при 562 С протягом 15 хвилин, і флуоресцентні сигнали реєстрували при 520 нм (ЗУВК Огееп) і 610 нм (КОХ).
Порівнюють графіки ампліфікації для реакційних сумішей, що містять цільову ДНК, у каналах виявлення для 5УВК Огееп (фігура 8) і КОХ (фігура 9) із графіками ампліфікації для реакційних сумішей з МТС у каналі виявлення для ЗУВК согееп (фігура 10).
Результати, представлені в даному документі, одержані за допомогою наступних способів і матеріалів, якщо не зазначене інше.
Реакції МЕАК-ампліфікації
Зо Реакційні суміші (50 мкл) містили 15 мМ Моа5оО», 0,3 мМ амтР, 19,2 одиниць полімерази В5і, 15 одиниць п.В5ІМВІ, 1000 нМ матриці 1 та 200 нМ матриці 2. Цільова ДНК являла собою геномну ДНК Сіамірасієї тіспідапепв5і5 зерідопісив (Ст5) або "багатомірну" ДНК на основі послідовностей Сіт5. Матриці та цільову молекулу попередньо інкубували разом при 56 С протягом 30 секунд у загальному об'ємі 10 мкл. Мастер-мікс з компонентів реакції, що залишилися, попередньо інкубували при 56 "С протягом 30 секунд у загальному обсязі 40 мкл.
Мастер-мікс поєднували з матрицями та цільовою молекулою та інкубували при 56 "С протягом 10 хвилин із флуоресцентною детекцією (ЗУВК Сгееп або молекулярні маяки), дані якої збирали кожні 10 секунд протягом інкубації. Реакційні суміші "вбивали нагріванням" на етапі, що тривав 2 хвилини при 95 "С, з наступним поверненням до кімнатної температури. Еквіваленти порогового циклу (СО) визначали для кожної реакції на основі формули для підбирання кривої в програмному забезпеченні Віогай 105, і значення відкладали на графіку за допомогою Місгозой
Ехсеї. Виконували лінійну регресію та визначали коефіцієнт кореляції (В).
Інші варіанти здійснення
З наведеного вище опису буде очевидно, що в даний винахід, описаний у даному документі, можна вносити зміни та модифікації, щоб пристосувати його до різних шляхів застосування та умов. Такі варіанти здійснення також перебувають в межах обсягу прикладеної формули винаходу.
Наведення переліку елементів у будь-якому визначенні змінної в даному документі включає визначення цієї змінної як будь-якого окремого елемента або комбінації (чи підкомбінації) перелічених елементів. Наведення варіанта здійснення в даному документі включає даний варіант здійснення як будь-який окремий варіант здійснення або в комбінації з будь-якими іншими варіантами здійснення або їхніми частинами.
Дана заявка може бути спорідненою стосовно міжнародної заявки на патент Мо
РСТ/О52011/047049, поданої 9 серпня 2011 року, яка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 61/373695, поданою 13 серпня 2010 року, повний зміст яких включено в даний документ за допомогою посилання.
Всі патенти та публікації, згадані в даному описі, включено в даний документ за допомогою посилання тією ж мірою, як якби кожний окремий патент та публікація були конкретно та окремо зазначені як включені за допомогою посилання. (510)

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб ампліфікації полінуклеотиду, який включає: (а) приведення цільової молекули нуклеїнової кислоти в контакт у практично ізотермічних умовах з полімеразою, двома або більше олігонуклеотидними праймерами, кожний з яких специфічно зв'язується з комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, ферментом, що вносить одноланцюговий розрив, де кожний з олігонуклеотидних праймерів містить один або декілька 2'-модифікованих нуклеотидів, розташованих на 3'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти; та (Б) утворення ампліконів, які містять щонайменше частину зазначеної цільової молекули нуклеїнової кислоти.
2. Спосіб за п. 1, який додатково включає виявлення ампліконів.
З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що виявлення включає зв'язування ампліконів з виявлюваним зондом.
4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що один або декілька 2'--модифікованих нуклеотидів, розташованих на 5'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти, відокремлені від сайта одноланцюгового розриву за допомогою 1, 2, 3, 4, 5 або більше немодифікованих нуклеотидів.
5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що два або більше 2'-модифікованих нуклеотидів є суміжними.
б. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що 5 суміжних нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією розташовані на 3'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти.
7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що 5 суміжних нуклеотидів з 2'-О-метильною модифікацією розташовані на 5'-кінці послідовності, комплементарної цільовій молекулі нуклеїнової кислоти.
8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що цільову молекулу нуклеїнової кислоти приводять в контакт в тестовому зразку.
9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що тестовий зразок містить патоген.
10. Спосіб за п. 9, який додатково включає виявлення амплікону з виявлюваним зондом.
11. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що патоген являє собою вірус, бактерію, дріжджі або гриб.
12. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що патоген є присутнім у біологічному зразку.
13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що біологічний зразок є вибраним з групи, що складається з крові, сироватки, плазми, амніотичної рідини, мокротиння, сечі, сперми, піхвового секрету, спинномозкової рідини, лімфи, слізної рідини, калу або шлункового соку.
14. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що патоген є присутнім в пробі з довкілля.
фвохтразнзві структури зб'юєктів, що новгнічують ввуваність подімераун Нрезутазні положення екремої сснови РНК з С еметильного моладнкаиию ВОМ АТТ ОПЛАТА АТ ТИТМУ Ж ТОВСТА ЗАТ ИСА ТТ я ТАТА ТАС УК У ю ТАТА АТО АСТОАСЯ ТИЛ Де ПУ ВІСАТАТВОАСТОЛЕ МО Па НАСЕ м на ВОАС САТАТВОАВ САЛАТИ УК воТоАСТОС АВТО ТАТА ТЕМ т ТОАСЧНМНАТОПАЦД ТАКИМ ТАКИМ кодове АТ АЮ ПАСИ М У ТОАСТО КВАС ПАСА ТАМ КЛОАСТЕСАТКНУЗАСТОА СК КВН втекти МАТИ Гінаеіни мі гази ї й м пики ня чіряєцилкі положення Олику з ДІМХ УМХ МИХ пинОох КІМ з КУ мотлох Ммепципилцю ЕУТКАПТЕ САВА ПАСА Ме ЕХВХАСТО САТ ЗАСТ ПАСИ ТИМ ТАТО САТВТВОАИТОСА ИН АТТЕСТТМХ ФлаМСТОСАТАТОЦАСТОАСЯ В х ФЛОДСТОДАТАТУВМУ САТ Ах ламитовмтопАсто АЙ ОКУ лампа ОНА ЦЕ клЛОДСТОСАТАТОВАСТС ПАН ТВО КОТВИх ФЛОВСТОИА ТОПТАТИ ОН ВУ в таАСТОСВ АТО ПАТО ТЕО ТЕКА ПАНЕ кл дАСТОПАТАТОВАСТИ ОА АРОК ВОДИ п й офі: Прибув позтокевау оку з трьох суміжних понох РМК з 2 мети льною мод майкинйю ЕТОАДТ САТ ВОМС НН МА М ХТО АСТОСАТАТОКА ТОВ КО НИВИ ТО АСТЕ с АТАТВ АВТО АсАТ КВК ШоТВАКТС С АТАТОТАВТ ААУ ді ІІІ І ТІ1ее тні КУ ТОАДТСОАТАТ ЧОЛО САСА ТІ ПЕВ ПОЗТЬУ улактеовитввАюто о АДОВ М еКу діжа ІІ ММІІІІ11121 1. ТОАОТОО ДАТ О ОТО АЙАИ ТТЛ ТИХ ТЛТОАСТ САТ ВАТ АПАЙНМ ЕЙ Ки Ня я т ТОВ Ж АТАТО МА СЯЯТИ ен ЕТО ТОП АТЦ ОА ТОДОА ДУГ ПО ТОН ЕН Приблизні положення йиску з челярних суміжних пепоя КЕ З Зб Зедетцльною молифіквиісю Еф ТОАОТООАТАТ В ОАОТОАСА ВИТКИ ВУ в ТОДСТОСАЕК НАВ ТОСТИ В Тен й ШПАЛ етану жТОДЕТООВА ВОМУ АВ НИ ОКХ влас сася в тем ен Не класса оаатЯ АН а І еТЯМХ влЛаДсТОСАТКТ ОА САТ Ми
Фіг. 1 - продовження пірвбливі цолеження слому з м'яти суміжних еоцов ВН х ЛО етильшмо модійнкоцівю ВТО ТАК ОТО Я ШМАТ КТК ФЛВАСТОСАТКОЛАВТАСЯ ТОНУ ня Нв ЕНН ех тОВетовАКТ ВАТИ КНЕУ еетна и н М КТОВСТЄАВТ ОВТ ОАСАЛИ ТИ НКУ я ТИАСТС КВТ ВАТА ЯКА КК ПАИМЕ У рибдияці ноложення дожного мебору суміжинх песця БЕН з 20 детольцеко молифакоайия ТІСТО АТ ЄВИ Ся ТАКО КВК ВХ ПОВЕ ен нн ЦО фЛПАКТОС АТАК ОН нен М НН МН ТАТА ААУ А ВАК ВИНЕН нен ни НН Ну ВеТЛАЄТОЮ КЕКТАЦТЄЯ ОВ КАНОНИ нен а В я ВУТОА ОСА ТВА АТАК ОК НОВОМУ УТВАОТ ОО АТАКА САУ ТЕО ПИСАВ УТ АТ АТ ИЕХ
Фіг. 1 - продовження Умовні позначки: Чорний - стабілізувальна послідовність Синій - послідовність розпізнавання для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив Зелений - спейсерна послідовність для ферменту, що вносить одноланцюговий розрив жхне ж ПОСЛІДОВНІСТЬ розпізнавання, специфічна для цільової молекули тХх - основа РНК з 2'-О-метильною модифікацією А аденін Те тимін о - гуанін С - цитозин и - урацил Підкреслена (підкреслені) основа(основи) визначає(визначають) модифікований сегмент послідовності. Титрувакия ДНК СМ й Ффолоти ЛВ ЖК - дзгтаці з М 3-е КС нан нн нн си ВД бони нн тя пенали ик В ори ин ї нан ннн и МОН и ВН СТЬ ЕН І и в о нн в «АК пеужпеку вм осо уст у рота юе уче яетих кот тивну МОМ ОО Й МАМ КОН КО МИ КИ ДЕ ЖИ М ХЕ КИ ї чАе
Фіг. 2А
Оцінка динамічного діапазону синтетичної баї атомірної ДНК Ст5. Ілюстративне титрування синтетичної "багатомірної" цільової ДНК Сіт5 та виявлення за допомогою флуориметричного маяка. Сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) пригнічено в реакційних сумішах, що містять матрицю з 2'-О-метильною модифікацією (ліва панель). Калібрувальна крива відображає широкий динамічний діапазон із застосуванням реакційних сумішей з матрицями з 2'-О-метильною модифікацією (права панель). ВОД грунт тн тт тя ян и птн тт Н ух ря ініх у Й Н ! ооо і З | з г | і іони зоБяфІЬ іЙйчМ ідкейх БА ДН тав пт тати Хо Часло кан
Фіг. 28 тів тіш Та ОБЛ спе із ПУ уми Блю УРІВУОТів ЗВОБЕОСМЛУМ сим БД) КЕ ма Б талі За. ЛУК КНУ Ж Тр І А хижа Без ! | ге ! заз : типа пов Є Ж : і ПО Ти се р й їі інж ! пт, іх шо М зтрудт | НН і
Фіг. 20 Ілюстративні дані мас-спектрометрії в "контролях без цільової молекули" (МТС) в системі аналізу Ств із застосуванням нсмодифікованих (ліва панель) праймерів/матриць і таких з 2'-0- метильною модифікацісіо (права панель) показують усунення неспецифічних продуктів ампліфікації. Для визначення ефекту праймерів/матриць з 2'-О-метильною модифікацією стосовно утворення фонових продуктів виконували МЕАК-аналіз Сіт5 без уведення цільової нуклеїнової кислоти. Дані мас-спектрометрії чітко демонструють усунення продуктів зі змішаного фону, на що вказує присутність тільки очікуваних видів молекул за присутності праймерів/матриць з 2'-О-метильною модифікацією порівняно зі складним спектром, що утворюється за присутності немодифікованих праймерів/матриць.
Надкленяжза звис ЗУБА Ссткек і ВУехвис стоваки т матрин Міодкфіконнні митом Ж пови ЖЕНЕ 00 дур еечккмх ккх вію днем нок ши В МЕЖ ЗАМ Кеш еМеК меми жихул тт В З ан ЕІ ан і Р уаинлую хи в а Н я і Б ї Н я СЯ Н Фіг Ілюстративні дані ампліфікації із застосуванням прайимерів/матриць з 2'-О-метильною модифікацією та усунення неспецифічних продуктів ампліфікації. Тут показано приклад МЕАК- аналізу, який демонструє корисність матриць/праймерів з 2''О-метильною модифікацією для усунення сигналу фону. Сигнал у контролях без цільової молекули (МТС) пригнічено в реакційних сумішах, що містять матриці з 2'-О-метильною модифікацією (права панель), в той час як для сигналу в контролях без цільової молекули (МТС) спостерігається істотний сигнал (ліва панель), що вказує на утворення фонового продукту за відсутності цільової ДНК. БПихвленни а допомогою пилскхлкрного джаз щ Вихідці сгввлЛарці маигмою Меолифікикоті мачтуті Е До нини піти сп дджеюнтннн епосу «МИХ нн ОВО Ех Зк - жи нення пеня дян ЖК пен о нн нт РО ддддрн няння пележнінн фея ВЕБ Ван п НО нини я дО Я-- п перен дну кон ще її ШИ Ка й Сл ПТ ія НИ що й , нн нн ЄЕК мах ог жияихх зи ие ї рі й : мм «ог ормовія ооснмй о ваш вт ми рн им ч зе я ник) | Чассхекуєдн
Фіг. 4 Ілюстративні дані ампліфікації із застосуванням праймерів/матриць з 2'-О-метильною модифікацією та поліпшення продуктів ампліфікації. Тут показано порівняння МЕАВ-аналізі в, що демонструє корисність матриць/праймерів з 2'-О-метильною модифікацією для поліпшення виявлення цільових молекул, які характеризуються низьким відносним вмістом. Показано аналіз, в якому застосовуються вихідні стандартні матриці (ліва панель), і такий самий аналіз, в якому застосовуються матриці з 2-О-метильною модифікацією (права панель). деталі Дктай сСуруплури мотух матвино Ствукзури нових мих ура сжлад матенці Ківева для Сх, скийд мутио: іднолаціюговий позриві т лия Ср Тука дк ях бмтцюю У ДОМ, умтуюмасящиях у шоннной блока я дл оон й зем. ролтямювиних ка лажтовИ хе на З. жкнце чижне сх Км па и виго рити ку ОККО діххожи пехекфінюют сеї ува дійхнка Ліцянко кнкинмекоти Є ето онов овен века. ЩО пеомлукмюе недаремно ЖИ пеМмюзУвехемо вик іДОхоКоМ. КЗ спрсснкюмие еміхавиМмов мим оформюмх. ПееКхи МІВ Ме СИНОНеЮМИ ОО хе З пеюжюютьм Іхумімюм лий Круті, мкм пи жи Ие, ККЗ плерсіисягихинтї тм гальні коли Би іде місхІМОМУ З В м теп МОМ ХУ х ЖЖ годні оиих ДНК Фіг, 5
Ілюстративні об'єкти, що пригнічують активність полімерази, які за допомогою праймсрів/матриць з 2'-О-метильною модифікацією застосовують для "налаштування" реакцій. Показано схематичні зображення ілюстративних матриць/праймерів з 2'-О-метильною модифікацією для налаштування конкретної реакції. Кожна умова налаштування включає конкретні співвідношення прямих і зворотних матриць у кожному наборі матриць, що мають різні структури. фах ШК ТТ у0и1111111111111144111111111114114111111411144414111111114444111112111141111111141111111111111110. УМХ Дон ДИН МАЛОМІ У УКУВИ і ї ен У ока цецеацечуєцюко ї Н ш ї Тл Умова авлоуууваних 2 Н г БИ І миття МеВ МедзвцувИх ї ЕЕ Слони пимипипсКмол сни кпомосос п ео й ї пня рука цшпонссуєомно З Ї снення сн НН Зоо У Боня Умова скикмиуувания 5 00 дес нв ит ит Форд МОЮ р он з НИЙ о ав ФО даддннннннннннннннннннннн ув Е Н ра М ра о шт я З щ шИ | рвіеек нят що хавинк Й | | Щ Між пиЗеЦенИих сумі ОЙ У Дю» похемихиііх 1СПОЙ Кеп пеидеМи ФПОоММЄ ДИ ХМ у форхм гне юнех секалихитя милсхулевнми пак о ГАМУ КОХ
Фіг. 6 Ілюстративні дані ампліфікації із застосуванням праймерів/матриць з 2'-О-метнльною модифікацією та "налаштування" реакцій. Тут показано графіки ампліфікації, що демонструють корисність матриць/праймерів з 2-0- метильною модифікацією для налаштування конкретної реакції. Усі реакційні суміші (в двох повторностях) містили 10000 геномних еквівалентів ДНК Ст5. Кожна умова налаштування представляє конкретні співвідношення прямих і зворотних матриць у кожному наборі матриць, то мають різні структури. Червоні кола демонструють зсув часу до виявлення для кожної умови налаштування. Крім того, слід відзначити, що логарифмічна фаза для кожної умови скорочується, і нахил кривої змінюється. Гуля ств зворотний праймени маїриц єму ЖІ Тра мий: ї ЕКО ЛАК щой і ше ї пеня т. пед ЕВ Пл 2 події вд У Зоо рен. Ж т ЗАККВАМКВ КМА шко? БУ щей ї дух мо пд їй т шок | сло й жи Прямий та звуха нав праймери-матейціл кобору ТНК Нряхна: У НОКАК ВАС» же: шо піт Ж ТЕ шоб дах х Хворотиний: К схнедпоните ТОТАСАСТ рдою дей пікети і
Фіг.
UAA201709549A 2012-04-09 2013-04-09 Спосіб ампліфікації полінуклеотиду UA125112C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261621975P 2012-04-09 2012-04-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125112C2 true UA125112C2 (uk) 2022-01-12

Family

ID=49328090

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201709549A UA125112C2 (uk) 2012-04-09 2013-04-09 Спосіб ампліфікації полінуклеотиду
UAA201412069A UA116205C2 (uk) 2012-04-09 2013-04-09 Спосіб кількісного визначення послідовності нуклеїнової кислоти в зразку

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201412069A UA116205C2 (uk) 2012-04-09 2013-04-09 Спосіб кількісного визначення послідовності нуклеїнової кислоти в зразку

Country Status (18)

Country Link
US (8) US9096897B2 (uk)
EP (2) EP3587587A1 (uk)
JP (4) JP5801513B2 (uk)
KR (4) KR102048946B1 (uk)
CN (2) CN114134207A (uk)
AU (3) AU2013246080C1 (uk)
BR (1) BR112014025262A8 (uk)
CA (1) CA2869971C (uk)
DK (1) DK2836609T4 (uk)
ES (1) ES2743050T5 (uk)
HK (1) HK1210228A1 (uk)
IN (1) IN2014DN08831A (uk)
MX (2) MX338296B (uk)
NZ (2) NZ701145A (uk)
RU (2) RU2732589C2 (uk)
UA (2) UA125112C2 (uk)
WO (1) WO2013155056A1 (uk)
ZA (3) ZA201408116B (uk)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA125112C2 (uk) 2012-04-09 2022-01-12 Енвіролоджикс Інк. Спосіб ампліфікації полінуклеотиду
MX2016013877A (es) 2014-04-22 2017-03-09 Envirologix Inc Composiciones y metodos para mejorar y/o predecir la amplificacion de adn.
CN106574299A (zh) * 2014-04-30 2017-04-19 龙公司 用来检测黄龙病的组合物和方法
EP3207159B1 (en) * 2014-10-14 2019-11-20 Abbott Laboratories Sequence conversion and signal amplifier dna having poly dna spacer sequences and detection methods using same
EP4141128A1 (en) 2014-10-20 2023-03-01 Envirologix Inc. Compositions and methods for detecting an rna virus
CA2975328A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Envirologix Inc. Substrates for a nicking and extension reaction
WO2016122698A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 Envirologix, Inc. Compositions and methods for rapid detection of salmonella
CN108027335B (zh) * 2015-06-25 2021-05-04 罗斯韦尔生物技术股份有限公司 生物分子传感器和方法
US20200208199A1 (en) * 2015-07-20 2020-07-02 Envirologix Inc. Compositions and methods for rapid detection of salmonella serovar d1
EP3368654A4 (en) * 2015-10-30 2019-06-05 Alere Inc. DETERMINATION OF POLYMORPHISMS BY ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID
US10329601B2 (en) 2015-12-28 2019-06-25 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction (NEAR) of Streptococcus species
EP4137808A1 (en) 2016-01-28 2023-02-22 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a sequencing device
US11624725B2 (en) 2016-01-28 2023-04-11 Roswell Blotechnologies, Inc. Methods and apparatus for measuring analytes using polymerase in large scale molecular electronics sensor arrays
JP6854532B2 (ja) 2016-02-09 2021-04-07 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 電子的、標識フリーのｄｎａおよびゲノムシークエンシング
US10597767B2 (en) 2016-02-22 2020-03-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Nanoparticle fabrication
GB201611469D0 (en) 2016-06-30 2016-08-17 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes
US9829456B1 (en) 2016-07-26 2017-11-28 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices
CA3052062A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods and systems for dna data storage
KR20230158636A (ko) 2017-01-19 2023-11-20 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 2차원 레이어 재료를 포함하는 솔리드 스테이트 시퀀싱 디바이스들
KR20200002897A (ko) 2017-04-25 2020-01-08 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 분자 센서들을 위한 효소 회로들
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
KR102606670B1 (ko) 2017-05-09 2023-11-24 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 분자 센서들을 위한 결합 프로브 회로들
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
TWI754652B (zh) * 2017-07-10 2022-02-11 英商盧米瑞德克斯英國有限公司 核酸擴增方法中或相關之改良
KR20200039795A (ko) 2017-08-30 2020-04-16 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 Dna 데이터 저장을 위한 진행성 효소 분자 전자 센서들
RU2020100221A (ru) 2017-08-31 2021-09-30 Иониан Текнолоджис, Ллс Реакция амплификации с разрывом и удлинением (near) разновидностей респираторно-синцитиального вируса
WO2019075100A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Roswell Biotechnologies, Inc. METHODS, APPARATUS AND SYSTEMS FOR STORING DNA DATA WITHOUT AMPLIFICATION
GB2569965A (en) 2018-01-04 2019-07-10 Lumiradx Uk Ltd Improvements in or relating to amplification of nucleic acids
CN108588252A (zh) * 2018-03-29 2018-09-28 杭州泰熙生物技术有限公司 一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法
KR20210024010A (ko) * 2018-06-26 2021-03-04 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 Crispr 이중 닉카제 기반 증폭 조성물, 시스템, 및 방법
GB201812149D0 (en) * 2018-07-25 2018-09-05 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method
KR102154628B1 (ko) 2019-01-03 2020-09-10 베트올 (주) 반정량 수평류 면역진단 기술을 이용한 랄스토니아 솔라나세아룸과 푸사리움 옥시스포룸의 동시 진단 방법
KR102199394B1 (ko) * 2019-07-01 2021-01-06 한국화학연구원 이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법
KR102531590B1 (ko) * 2019-07-16 2023-05-11 고려대학교 산학협력단 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한 표적핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 조성물
CN110408678A (zh) * 2019-07-26 2019-11-05 宁儿医院股份有限公司 单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法
WO2023107998A1 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Massachusetts Institute Of Technology Cold-temperature isothermal amplification of polynucleotides
WO2023221939A1 (en) * 2022-05-14 2023-11-23 Jiangsu Code Biomedical Technology Co., Ltd. Novel compositions and methods for cell-free dna detection
WO2024006552A1 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Sherlock Biosciences, Inc. Ambient temperature nucleic acid amplification and detection
WO2024030985A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Abbott Laboratories Assays for detecting monkeypox virus

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5455166A (en) † 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
WO1994003635A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Institute Of Molecular Biology & Biotechnology Rapid amplification and detection of nucleic acids
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5629179A (en) 1995-03-17 1997-05-13 Novagen, Inc. Method and kit for making CDNA library
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
WO1997035026A1 (en) * 1996-03-18 1997-09-25 Molecular Biology Resources, Inc. Target nucleic acid sequence amplification
DK0912767T3 (da) * 1996-07-16 2006-10-30 Gen Probe Inc Fremgangsmåde til sporing og forstærkning af nukleinsyresekvenser ved anvendelse af modificerede oligonukleotider med foröget targetspecifikt TM
GB9716231D0 (en) 1997-07-31 1997-10-08 Amersham Int Ltd Base analogues
AU1366299A (en) 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
US5952202A (en) 1998-03-26 1999-09-14 The Perkin Elmer Corporation Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification
AU1908100A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Molecular Biology Resources, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods
US6436677B1 (en) 2000-03-02 2002-08-20 Promega Corporation Method of reverse transcription
AU2001274869A1 (en) * 2000-05-20 2001-12-03 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a dna library using positional amplification
US6191267B1 (en) 2000-06-02 2001-02-20 New England Biolabs, Inc. Cloning and producing the N.BstNBI nicking endonuclease
ATE312942T1 (de) * 2000-10-25 2005-12-15 Hoffmann La Roche Amplifizierung unter verwendung von modifizierten primern
NZ527128A (en) * 2000-12-27 2005-11-25 Invitrogen Corp Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
AU2002313683A1 (en) 2001-07-15 2003-03-03 Keck Graduate Institute Nucleic acid amplification using nicking agents
US20030082590A1 (en) 2001-07-15 2003-05-01 Keck Graduate Institute Exponential nucleic acid amplification using nicking endonucleases
AU2002325538B2 (en) 2001-08-20 2007-03-22 Takara Bio Inc. Nucleic acid amplification methods
US6977148B2 (en) 2001-10-15 2005-12-20 Qiagen Gmbh Multiple displacement amplification
US6617137B2 (en) 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US20030211483A1 (en) 2002-05-09 2003-11-13 Schroeder Benjamin G. Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
JP4632788B2 (ja) 2002-09-20 2011-02-16 ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド 核酸のヘリカーゼ依存性増幅
US7662594B2 (en) 2002-09-20 2010-02-16 New England Biolabs, Inc. Helicase-dependent amplification of RNA
WO2004067726A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Keck Graduate Institute Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides
JP4380305B2 (ja) 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
US20090017452A1 (en) 2004-03-05 2009-01-15 University Of Chicago Methods and compositions relating to the pharmacogenetics of different gene variants
US20060115838A1 (en) 2004-10-19 2006-06-01 Trevigen Inc. Real-time detection of amplicons using nucleic acid repair enzymes
JP5068175B2 (ja) * 2005-01-04 2012-11-07 日立化成工業株式会社 プライマー生成ローリングサークル型増幅
JP4555136B2 (ja) * 2005-03-31 2010-09-29 本田技研工業株式会社 燃料電池の電気システム、燃料電池車両及び電力供給方法
US7435561B2 (en) 2005-07-25 2008-10-14 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
DK1924704T3 (da) 2005-08-02 2011-09-05 Rubicon Genomics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US7947286B2 (en) 2005-10-07 2011-05-24 Panthera Biopharma Llc Drosophila cell lines producing recombinant secretable filovirus surface glycoproteins lacking the membrane spanning domain
US20090092967A1 (en) 2006-06-26 2009-04-09 Epoch Biosciences, Inc. Method for generating target nucleic acid sequences
US20080096257A1 (en) 2006-08-15 2008-04-24 Zuxu Yao Methods for Rapid, Single-Step Strand Displacement Amplification of Nucleic Acids
DE102006039396A1 (de) 2006-08-22 2008-03-13 Robert Bosch Gmbh Laserlichtquelle
US8399188B2 (en) 2006-09-28 2013-03-19 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
AU2007304776A1 (en) 2006-10-06 2008-04-10 Dna Genotek Inc. Stabilizing compositions and methods for extraction of ribonucleic acid
JP2008136451A (ja) 2006-12-05 2008-06-19 Hitachi Ltd 核酸増幅法
US8202972B2 (en) 2007-01-10 2012-06-19 General Electric Company Isothermal DNA amplification
US20090081760A1 (en) † 2007-01-12 2009-03-26 Monsanto Technology Llc Dmo methods and compositions
US20080254458A1 (en) 2007-04-10 2008-10-16 Asiagen Corporation Method of pre-treating in pleural effusion for detection of Mycobacterium tuberculosis
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US9689031B2 (en) * 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009020609A2 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Nanogen, Inc. Isolation of nucleic acids molecules using modified solid supports
US20090197254A1 (en) 2007-12-14 2009-08-06 Ming-Chou Lee Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection
US20090325169A1 (en) 2008-04-30 2009-12-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers
EP2333109B1 (en) 2008-09-03 2013-08-07 Takara Bio, Inc. Composition for detection of rna
AU2010206492B2 (en) 2009-01-21 2012-07-12 Human Genetic Signatures Pty Ltd Improved isothermal strand displacement amplification
EP2408936A4 (en) 2009-03-18 2013-01-30 Sequenom Inc USE OF HEAT-STAINED ENDONUCLEASES FOR THE PREPARATION OF REPORTER MOLECULES
WO2010126913A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
WO2012021493A2 (en) † 2010-08-13 2012-02-16 Envirologix Inc. Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample
EP2420579A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-22 QIAGEN GmbH Helicase dependent isothermal amplification using nicking enzymes
DK2756101T3 (en) 2011-09-15 2018-08-27 David A Shafer PROBLEMS: ANTISON DETAIL COMPOSITIONS FOR DETECTING HIGH OR SPECIFIC DNA OR RNA
WO2013101783A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for performing nucleic acid amplification reactions
UA125112C2 (uk) 2012-04-09 2022-01-12 Енвіролоджикс Інк. Спосіб ампліфікації полінуклеотиду
EP2867366B1 (en) 2012-06-29 2018-05-16 General Electric Company Method for isothermal dna amplification starting from an rna template in a single reaction mixture
JP2014082936A (ja) 2012-10-19 2014-05-12 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素
MX2016013877A (es) 2014-04-22 2017-03-09 Envirologix Inc Composiciones y metodos para mejorar y/o predecir la amplificacion de adn.
CN106574299A (zh) 2014-04-30 2017-04-19 龙公司 用来检测黄龙病的组合物和方法
EP4141128A1 (en) 2014-10-20 2023-03-01 Envirologix Inc. Compositions and methods for detecting an rna virus
BR112017008718A2 (pt) 2014-10-28 2017-12-19 Envirologix Inc ?recipientes de preparação de amostra, circuitos de microfluídos, e sistemas e métodos para preparação, extração e análise da amostra?
WO2016122698A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Envirologix, Inc. Compositions and methods for rapid detection of salmonella

Also Published As

Publication number Publication date
US9096897B2 (en) 2015-08-04
CA2869971A1 (en) 2013-10-17
IN2014DN08831A (uk) 2015-05-22
US9631231B2 (en) 2017-04-25
US20220243262A1 (en) 2022-08-04
KR20200111287A (ko) 2020-09-28
UA116205C2 (uk) 2018-02-26
US20180094310A1 (en) 2018-04-05
DK2836609T4 (da) 2022-09-05
MX2014012214A (es) 2015-05-08
NZ701145A (en) 2016-09-30
EP2836609B2 (en) 2022-06-15
US20180363046A1 (en) 2018-12-20
CA2869971C (en) 2022-10-25
KR20150031229A (ko) 2015-03-23
ES2743050T3 (es) 2020-02-18
US20160122811A1 (en) 2016-05-05
MX338296B (es) 2016-04-11
WO2013155056A1 (en) 2013-10-17
KR20150080023A (ko) 2015-07-08
RU2014144722A (ru) 2016-06-10
HK1210228A1 (en) 2016-04-15
EP2836609A4 (en) 2015-11-11
US20170166960A1 (en) 2017-06-15
AU2013246080B2 (en) 2015-07-23
RU2732589C2 (ru) 2020-09-21
US20200239947A1 (en) 2020-07-30
WO2013155056A9 (en) 2014-01-09
JP2017029154A (ja) 2017-02-09
JP6480511B2 (ja) 2019-03-13
MX367666B (es) 2019-08-30
CN104685066B (zh) 2021-09-21
US10584376B2 (en) 2020-03-10
US9322053B2 (en) 2016-04-26
ZA201607642B (en) 2018-05-30
KR102159818B1 (ko) 2020-09-25
JP6169660B2 (ja) 2017-07-26
JP2016073273A (ja) 2016-05-12
JP6321738B2 (ja) 2018-05-09
US10077467B2 (en) 2018-09-18
US20150315635A1 (en) 2015-11-05
RU2601129C2 (ru) 2016-10-27
JP2018007658A (ja) 2018-01-18
ZA201508197B (en) 2017-05-31
EP3587587A1 (en) 2020-01-01
BR112014025262A8 (pt) 2021-06-29
EP2836609A1 (en) 2015-02-18
ZA201408116B (en) 2016-02-24
KR101570951B1 (ko) 2015-11-23
CN104685066A (zh) 2015-06-03
AU2013246080A1 (en) 2014-11-13
JP2015512654A (ja) 2015-04-30
NZ723570A (en) 2018-06-29
AU2018201671A1 (en) 2018-04-05
JP5801513B2 (ja) 2015-10-28
AU2015246059B2 (en) 2017-12-07
KR102362649B1 (ko) 2022-02-14
RU2016138585A3 (uk) 2020-03-19
DK2836609T3 (da) 2019-08-26
EP2836609B1 (en) 2019-05-22
AU2013246080C1 (en) 2018-03-29
ES2743050T5 (es) 2022-10-20
RU2016138585A (ru) 2018-12-13
US11866773B2 (en) 2024-01-09
KR20190132570A (ko) 2019-11-27
BR112014025262A2 (pt) 2017-06-20
CN114134207A (zh) 2022-03-04
US20150104788A1 (en) 2015-04-16
KR102048946B1 (ko) 2019-11-27
AU2018201671B2 (en) 2019-11-14
US11208687B2 (en) 2021-12-28
AU2015246059A1 (en) 2015-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125112C2 (uk) Спосіб ампліфікації полінуклеотиду
CN107532206B (zh) 底物分子