CN108588252A - 一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及寄生虫检测领域，公开一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法。一种寄生虫检测试剂盒，试剂盒的核酸反应体系内包括一种或多种核酸扩增引物对，用于扩增锥虫、利什曼原虫、巴西利什曼原虫、chagasi利什曼原虫、克氏锥虫、朗杰尔氏锥虫、利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫或亚马逊利什曼原虫、panamensis杜氏利什曼原虫、guyanensis利什曼原虫、或peruviana利什曼原虫的DNA的核苷酸序列，检测方法为使用一种或多种核酸扩增引物对进行核酸扩增反应，并通过检测核酸扩增引物对的特异性扩增子检测寄生虫的DNA的存在。与PCR相比，RPA的扩增方式来诊断是在恒温简单的设备进行的，低成本，灵敏度高，可用于锥虫、利什曼原虫在人类早期感染和感染的狗的鉴定，以减少在人体的VL发病率。

Description

一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及寄生虫检测领域，尤其涉及一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
利什曼病，是影响超过88个国家在世界上显著全球影响的疾病，引起利什曼病的原生动物为利什曼原虫。皮肤利什曼病(CL)的特征是慢性皮肤溃疡，可能影响个体的功能状态，导致昂贵的和不及时治疗，并导致毁容疤痕。总的来说，全球有10-20万例利什曼病。利什曼病导致包括局部皮肤利什曼病疾病(LCL)，破坏性鼻腔和粘膜利什曼病(ML)的口咽病变的频谱。LCL是最常见的Viannia亚属种(L.(V.)braziliensis，L.(V.)panamensis，L.(V.)guyanensis，L.(V.)peruviana)，并引起由利什曼原虫亚属种程度较轻(L.(V.)墨西哥，L.(V.)亚马逊)。ML通常由L.braziliensis和较不频繁由L.(V.)panamensis或L.(V.)guyanensis引起的。
在利什曼病的诊断的主要挑战是，这种疾病在资源有限的地区发生。目前寄生虫学诊断必须在医院设置，多数患者没有诊断的条件。在军事野外作业和训练中，先进的实验室设备和医务人员稀缺。对于CL或ML，皮肤(皮肤)或粘膜组织或病变活检打孔刮出是必要的，经病理组织学诊断的敏感性，涂片培养在显微镜下观察成功率低(40-70％)。基于抗体的测试利什曼病的任何临床形式是有用的，利用PCR实现，但成本高，其在资源贫乏的地区实施不够现实。
因此需要其它方法检测传染病，方法需要快速，廉价，特异性和灵敏，并不需要昂贵的设备或容易出现故障的设备。
本发明人已经开发了基于其能够在生物样品中检测锥虫的的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法下的一个敏感等温扩增试验。锥虫是由仅具有单鞭毛区分一组动质体原生动物。锥虫涉及脊椎动物、无脊椎动物或植物的生命周期。寡核苷酸引物被设计为扩增利什曼原虫或锥虫核酸，引物被引导到动基体的DNA(kDNA)。如本文中所使用的动基体是包含线粒体基因组的许多拷贝的大线粒体内的环状DNA(称为kDNA)的网络。Kinetoplasts仅在类动基体目原生动物发现。一个动基体通常是相邻的生物体的鞭毛基体，这表明它是紧密结合的细胞骨架。引物被设计成使得它们不其它利什曼原虫属或锥虫的横扩增核酸(例如，kDNA)。通过使用这些引物之一可以识别的受试者，例如人或狗，感染了特定寄生虫(例如，婴儿利什曼原虫)和排除的检测具有重叠宿主范围相关原生动物寄生虫的可能性。
重组酶聚合酶扩增(RPA)是一个单管等温替代聚合酶链反应(PCR)。通过加入逆转录酶的RPA反应可以检测RNA以及DNA，而不需要一个单独的步骤，以产生cDNA的。因为它是等温的，RPA反应需要比PCR简单得多的设备。RPA反应在理论上可以快速简单地通过保持管运行。这使得RPA为开发低成本，快速，定点护理分子测试的理想选择。与常规的PCR需要昂贵的设备相比，RPA在恒定温度、不复杂的设备进行的，可以用作低成本，且灵敏度高的诊断测试，以减少或改善公共卫生机构的电流的VL的控制程序的有效性的中断利什曼原虫(如，婴儿利什曼原虫)，以人类群体的传输，这是着眼于人类早期检测和受感染的狗的鉴定。狗是婴儿利什曼原虫感染的人类的主要来源，受感染的动物，并从发送周期随后除去的准确识别是最有效的策略之一，以减少在人体的VL发病率。
试剂盒本文所述的反应混合物包含一种或多种重组酶的，单链DNA结合蛋白(SSB)，链置换聚合酶。在进一步的方面的试剂盒反应混合物可以进一步包括外切核酸酶(例如，外切III)中，核酸内切酶(IV)或逆转录酶。除了酶反应混合的试剂盒可包括补液缓冲剂，反应缓冲剂，引物，标签，检测试剂等。作为利用PCR，所有形式的RPA反应可通过加入进一步的引物/探针对被复用，允许多个分析物的检测或在同一管内部对照。
由RPA等温扩增，相比环介导等温扩增(LAMP)或其它的等温扩增方法较不复杂，并且可以容易地适用于侧向流动检测。最近的出版物已经证实这种技术的适用性，以检测病毒和细菌感染。本文所描述的方法使用RPA探测等温扩增的条件下寄生虫。
发明内容
本发明针对现有技术中需要昂贵的设备的缺点，提供一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
寄生虫检测试剂盒，试剂盒的核酸反应体系内包括一种核酸扩增引物对，包括以下至少一项：
(A)能够扩增锥虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28中的一种或多种和SEQ ID NO：23；(2)SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28中的一种或多种和SEQ ID NO：24；(3)SEQ ID NO：26，SEQID NO：27，或SEQ ID NO：28中的一种或多种和SEQ ID NO：25；
(B)能扩增利什曼原虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8中的一种或多种和SEQ ID NO：3；(2)SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8中的一种或多种和SEQ ID NO：4；(3)SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8中的一种或多种和SEQ ID NO：5；(4)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13中的一种或多种和SEQ ID NO：10；(5)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13中的一种或多种和SEQ IDNO：11；
(C)能够扩增巴西利什曼原虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21中的一种或多种和SEQ ID NO：16；(2)SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21中的一种或多种和SEQ ID NO：17；(3)SEQID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21中的一种或多种和SEQ ID NO：18；
(D)能够扩增chagasi利什曼原虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：32；(2)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：33；(3)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：34；(4)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：35；(5)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：36；(6)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：38；
(E)能够扩增克氏锥虫的DNA的核苷酸序列：SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51；
(F)能够扩增克氏锥虫的DNA的核苷酸序列：SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；
(G)能够扩增朗杰尔氏锥虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58中的一种或多种和SEQ ID NO：59；(2)SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58中的一种或多种和SEQ ID NO：60；
(H)能够扩增朗杰尔氏锥虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64；
(I)能够扩增利什曼原虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67中的一种或多种和SEQ ID NO：68；
(J)能够扩增墨西哥利什曼原虫或亚马逊利什曼原虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71；
(K)能够扩增巴西利什曼原虫，panamensis杜氏利什曼原虫，guyanensis利什曼原虫，或peruviana利什曼原虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74中的一种或多种；
作为优选，步骤A-K中，用于检测扩增的利什曼原虫或锥虫DNA片段的核酸探针组成包括：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：65，SEQ IDNO：69，SEQ ID NO：72：
作为优选，用核酸探针检测标记试剂盒，核酸探针是包括核酸序列SEQ ID NO：76的寡核苷酸。
作为优选，还包括扩增试剂、试剂、一种或多种重组酶、核酸内切酶、一个外切酶、单链DNA结合蛋白或链置换聚合酶；
作为优选，核酸外切酶是核酸外切酶III，核酸内切酶是一种内切核酸酶IV。
作为优选，包含可检测至少一种标记的寡核苷酸核酸探针的核酸序列：SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：52，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：69，SEQ IDNO：72，SEQ ID NO：76。
作为优选，包括使用权利要求1的寄生虫检测试剂盒中一种或多种核酸扩增引物对进行核酸扩增反应，并通过检测核酸扩增引物对的特异性扩增子检测寄生虫的DNA的存在。
检测核酸扩增引物对的特异性扩增子的方法，包括用包含以下核酸序列的核酸探针结合的扩增核酸：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：65，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76。
作为优选，还包括形成包含至少一个引物对和参与扩增反应的生物样品的混合物，生物样品为体液或组织样品。样品来源包括组织，如活检和尸检样品，并取组织学目的的冷冻切片的切片。体液包括血液和血液组分或产物(例如，血清，血浆，血小板，红细胞等)，唾液，痰，粪便，尿等。生物样品通常是从真核生物得到，最优选哺乳动物如灵长类动物例如黑猩猩，人，牛，狗，猫，啮齿动物，例如，豚鼠，大鼠，小鼠，兔子，鸟，爬虫，昆虫。
作为优选，扩增反应是一个重组酶聚合酶扩增(RPA)的等温扩增反应。
A“靶序列”或“靶核酸序列”如本文所用是指如本文中所描述的，或其互补，被放大，检测，或同时扩增和检测的寄生虫的核酸序列使用的一个或多个多核苷酸。另外，虽然术语靶序列有时指的是一个双链核酸序列，但靶序列也可以是单链的。在目标是双链的情况下，本发明的多核苷酸引物序列优选将扩增靶序列的两条链。靶序列可以由特定生物体或多或少特定。例如，靶序列可以是特定于整个属，多个属，一个物种或亚种，血清群，血清型，应变，分离或生物体的其他子集。本发明的多核苷酸序列被选择为他们专门与一系列亚种，或血清型，锥虫的杂交的能力。
如本文所用，“分离的”一词可以指一个核酸或寡核苷酸原籍源的(当通过重组DNA技术生产)，它是基本上不含细胞物质，细菌材料，病毒材料或培养基，或者化学前体或其他化学品(当化学合成时)。而且，“分离的核酸片段”或“分离的寡核苷酸”是核酸或寡核苷酸，其不是天然存在的。
在某些方面，核酸序列被检测到之前扩增。“扩增”一词定义了从核酸序列分子的单个或低级拷贝数使核酸的多个拷贝的过程。扩增的核酸可以被称为扩增子。
例如寡核苷酸或扩增子可以被标记，即缀合或共价或非共价连接到其他部分，如蛋白质，肽，载体，荧光部分，或标签。术语“缀合物”或“免疫”广泛地用来定义一个部分的与另一种药物的有效结合，并不旨在以仅仅指任何类型的操作关联的，并没有特别的限制，以化学“缀合。“在某些方面的分离的核酸或寡核苷酸缀合有可检测标记。
关于探针的术语“标记”旨在通过与另一试剂是直接耦合(即，物理连接)探针的可检测物质至探针，以及间接标记由反应以包围探针的直接标记标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的抗体和末端标记或生物素，使得它可以用荧光标记的链霉抗被检测的DNA探针的中央标记的探针的检测。
“标记”，“可检测标记”或“可检测部分”是通过光谱学，光化学，生物化学，免疫化学，化学或其他物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，在ELISA中常用的)，生物素，洋地黄毒苷，或半抗原和蛋白质，可制成可检测的，例如，通过掺入放射性标记成肽或用于检测的抗体与肽特异性反应。
染料，如FAM染料，共价连接到寡核苷酸探针的5'端。其他染料示例包括诸如TAMRA，AlexaFluor染料如AlexaFluor 495或590，瀑布蓝，蓝色滨海，太平洋蓝，俄勒冈绿，罗丹明，荧光素，TET，HEX。每一个都可以通过在3'末端或其他非荧光淬灭染料淬灭。淬火分子适当地匹配到最大荧光的染料。用于核酸扩增检测系统中使用的任何合适的荧光探针是在本发明示例性操作。
“特异性结合”到目标指的是决定性的分子在其它生物制剂的异质群体中的存在的存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，指定的分子优先结合特定靶，并在显著量样品中存在的其他生物制品不结合。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：与传统的PCR扩曾方法设备昂贵、成本高相比，RPA的扩增方式来诊断是在恒温简单的设备进行的，低成本，灵敏度高，可用于锥虫、利什曼原虫在人类早期感染和感染的狗的鉴定，以减少在人体的VL发病率。
附图说明
图1是不同动质体寄生虫特异性扩增图。(几组引物被设计为扩大动基体小环的DNA特异性地扩增婴儿利什曼原虫，克氏锥虫的内侧区域，巴西利什曼原虫。特定寄生虫DNA靶标(扩增的特异性通过用不同的DNA模板，其中包括培养该引物证实(第1泳道：婴儿利什曼原虫；第2泳道：克氏锥虫，第3泳道：巴西利什曼原虫)，不相关的靶DNA(第4泳道：人类；第5泳道：狗；第6泳道：贾第虫)和无模板的引物(第7泳道)。此外，第8泳道为100bp的标记物)
图2是从血液净化DNA的各种寄生虫飙升灵敏度测试RPA电泳图。制备稀释DNA：狗肝血液DNA稀释至100微升，其对应于，A稀释度1：130000；B稀释度1：32,500；C稀释度1：8,125；D稀释度1：2031；E稀释度1：508；F稀释度1：127；G稀释度1：32；H稀释度1：8；寄生虫)用作对RPA的模板。稀释A-D表现出较强的扩增(未示出)，以及扩增阳性降到寄生虫(第1泳道)。无模板(J)和100bp的标记(MK)的引物也显示。
图3是与rangeli锥虫(面板)基本RPA电泳图。(引：T.rangeli ITS1。样品:水，T.rangeli，克氏锥虫，L.braziliensis，L.chagasi，人，狗，和贾第虫。)
图4是硕大利什曼原虫(面板)基本RPA电泳图。(引：硕大利什曼原虫。样品:水，硕大利什曼原虫，L.braziliensis，L.亚马逊，克氏锥虫，人，狗，和贾第虫。)
图5是与克氏锥虫(面板)基本RPA电泳图。(引：克氏锥虫。样品：水，Meraloo，Tejapileo，T.rangeli，L.braziliensis，L.亚马逊，L.chagasi，人，狗，和贾第虫。)
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种寄生虫检测试剂盒，如图1-5所示，扩增引物或RPA引物特异性地扩增特定寄生虫产生寄生虫特异性扩增子。探针和扩增子是特定扩增杜氏利什曼原虫，利什曼chagasi，婴儿利什曼原虫。用寡核苷酸探针检测这些寄生虫特异性扩增子。探针是专门设计为靶向独特的DNA序列之间，并通过两个引物扩增。引物和探针的组合决定的特异性(该DNA序列将被检测)对测试。在某些方面，杜氏利什曼原虫，利什曼chagasi，婴儿利什曼原虫特异性扩增引物，包括具有90％，95％，98％或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：3，4，5，6，7，8，10，11，12，或13。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45个连续的寡核苷酸。
某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：3/6，3/7，3/8，4/6，4/7，4/8，5/6，5/7，5/8，10/12，10/13，11/12，11/13。RPA探针包括寡核苷酸核苷酸序列SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：14。进一步的，SEQ ID NO：14包括四氢呋喃(THF)代替鸟苷的28位间隔。
实施例2
引物，探针和扩增子是特定扩增巴西利什曼原虫的。寡核苷酸探针为检测这些寄生虫特异性扩增子。巴西利什曼原虫扩增引物包括具有70，75，80，85，90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：16，17，18，19，20，21。在某些方面，扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：16/19，16/20，16/21，17/19，17/20，17/21，18/19，18/20，或18/21。RPA探针包括的核苷酸序列的寡核苷酸SEQ ID NO：77。
实施例3
引物，探针和扩增子是特定扩增锥虫锥虫或锥虫rangeli的。寡核苷酸探针为检测这些寄生虫特异性扩增子。在某些方面，克氏锥虫扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：23，24，25，26，27，28。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：23/26，23/27，23/28，24/26，24/27，24/28，25/26，25/27，或25/28。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：T.rangeli锥虫或SEQ ID NO：29，30。
实施例4
引物，探针和扩增子是特定扩增利什曼原虫属chagasi的。进一步的，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。该利什曼原虫chagasi扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：32，33，34，35，36，37，38，39，40，41。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：32/39，32/40，41分之32，32/42，39分之33，33/40，41分之33，33/42，34/39，34/40，41分之34，34/42，35/39，35/40，41分之35，35/42，36/39，36/40，36/41，36/42，38/39，38/40，38/41或38/42。RPA探针包括寡核苷酸SEQ ID NO：37。
实施例5
引物，探针和扩增子是特定扩增克氏锥虫的。寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。引物和探针能够被设计以扩增锥虫的亚端粒区。克氏锥虫扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：50，51。具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：50/51。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：52。
实施例6
引物，探针和扩增子是特定扩增克氏锥虫的。进一步的，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。引物和探针能够被设计以扩增锥虫的ITS1区域。克氏锥虫扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：5354。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：53/54。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：55。
实施例7
引物，探针和扩增子是特定扩增锥虫rangeli的。在进一步的方面，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。在某些方面，引物和探针能够被设计以扩增T.rangeli的亚端粒区。在某些方面，该锥虫rangeli扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：56，57，58，5960。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：56/59，57/59，58/59，56/60，57/60，58/60。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：61或62。
实施例8
引物，探针和扩增子是特定扩增锥虫rangeli的。进一步的，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。引物和探针能够被设计以扩增锥虫rangeli的ITS1区域。该锥虫rangeli扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：63或64。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：63/64。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：65。
实施例9
引物，探针和扩增子是特定扩增硕大利什曼原虫的。进一步的，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。引物和探针能够被设计以扩增利什曼原虫的ITS1间区域。硕大利什曼原虫扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：66，67，或68。在某些方面，扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：66/68或67/68。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：69。
实施例10
引物，探针和扩增子是特定扩增墨西哥利什曼原虫或利什曼原虫亚马孙的。进一步的，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。引物和探针能够被设计以扩增墨西哥利什曼原虫或利什曼亚马孙的ITS1区域。墨西哥利什曼原虫或利什曼亚马孙扩增引物包括90，95，98或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：70或71。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。涉及扩增引物对包括SEQ ID NO：70/71。RPA探针可以包括具有SEQID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：72。
实施例11
引物，探针和扩增子是特定扩增巴西利什曼原虫，杜氏利什曼panamensis，利什曼guyanensis，利什曼原虫peruviana的。进一步的，寡核苷酸探针被设计为检测这些寄生虫特异性扩增子。引物和探针能够被设计以扩增巴西利什曼原虫，杜氏利什曼panamensis，利什曼guyanensis，利什曼原虫peruviana的ITS1区域。巴西利什曼原虫，杜氏利什曼panamensis，利什曼guyanensis，利什曼原虫peruviana扩增引物包括90，95，8或100％相同的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列包括SEQ ID NO：73，74或75。扩增引物包括：具有25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45个连续的寡核苷酸。某些方面涉及扩增引物对包括SEQ ID NOS：七十五分之七十三或75分之74。RPA探针可以包括具有SEQ ID NO的核苷酸序列的寡核苷酸：76。
实施例12
用于检测样品中利什曼原虫或锥虫寄生虫，其包括使用一种或多种核酸引物对如本文所述进行的核酸扩增反应并通过检测引物对特异性扩增子检测寄生虫的DNA的存在的方法。检测引物对特异性扩增子包括与核酸探针结合的扩增核酸的核酸序列SEQ ID NO：9，14，77，29，30，37，52，55，61，62，65，69，72，或76，其中所述探针对扩增的DNA的结合表明所述样品中的寄生虫的存在。该方法可以进一步包括：形成包含至少一个引物对和之前进行的扩增反应的样品部分的反应混合物。
某些实施方案涉及具有序列90，95，98或100％相同，寡核苷酸序列包括SEQ IDNO：2，3，4，5，6，7，8，16，17，18，19，20，21，23，24，25，26，27，28，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，或49-77。
实施例13
利什曼chagasi((GI 394857980)；SEQ ID NO：1)。
引物包括：LchaFW1，GATCGAGGCTGACACAATTTGATGGCCTGTG(SEQ ID NO：3)，31nt，GC％51.6，TM 64，HG，3，SF 20；
Lcha FW1.1-TGGCCTGTGTAAATATATCTTACCTTAAGGTGGC(SEQ ID NO：4)，34nt，GC％41.2，TM 60.7，HG1，SF20；
LchaFW3-TCTGTTTGGTTATGTTATGATCGAGGCTGAC(SEQ ID NO：5)，31nt，NCR区，GC41.9％，59.8TM，HG6，SF 16；
Lcha RV2-CTACCCGGAGGACCAGAAAAGTTTGGGA(SEQ ID NO：6)，28个核苷酸，区域CR，GC％53.6，TM 63.2；
Lcha RV4-TTCGGGATTTTCCACCAATTCCCAACCATC(SEQ ID NO：7)，30个核苷酸，GC含量46.7，TM 62.5；
Lcha RV4.5-ACCAATTCCCAACCATCCAACACGTCCCAA(SEQ ID NO：8)，30个核苷酸，GC％50，TM 65.1，HG4，SF 9。(HG＝hairpin，SF＝selfdimer)
实施例14
巴西利什曼原虫动基体的小环(GI|643458|GB|U19803.1；SEQ ID NO：15)。
引物包括：LBRA 10-FW-TGCGCAGAGTTATTATGTTGTCAATGAATAA(SEQ ID NO：16)，31nt，GC％32.3，TM 57.2，HG10，SF 25；
LBRAFW20-GATGAAAATGTACTCCCCGACATGCCTCTG(SEQ ID NO：17)，30nt，GC％50，TM62，HG2，SF 17；
LBRAFW25-AATTTGATGAAAATGTACTCCCCGACATGC(SEQ ID NO：18)，30nt，GC％40，TM59.4，HG3，SF 20；
LBRARV30-TGAGACGGGGTTTCTGTATGCCATTTTTCGGT(SEQ ID NO：19)，31nt，GC％45.2，TM 63.4，HG1，SF 18；
LBRARV40-CTAATTGTGCACGGGGAGGCCAAAAATAGCGA(SEQ ID NO：20)，32nt，GC％50，TM 64.9，HG2，SF 20；
LBRARV45-AACCCCTAATTGTGCACGGGGAGGCCAAA(SEQ ID NO：21)，29nt，GC％55.2，TM67.1，HG1，SF 19。
实施例15
克氏锥虫Y株动基的小环序列，克隆M835，ORF，(SEQ ID NO：22)。
引物包括：锥虫-60-FW-AGCCTTATCACCCTTACCACCCACAGCCTA(SEQ ID NO：23)，30nt，GC％53.3，TM 65.2，HG2，SF14；
Tcruzi-65-FW-CAGCCTATATTACACCAACCCCAATCGAAC(SEQ ID NO：24)，30nt，GC％46.7，TM 60.5，HG2，SF 15；
T.cruzi-70-FW-ACCCTTACCACCCACAGCCTATATTACACCA(SEQ ID NO：25)，31nt，GC％48.4，TM 63.3，HG3，SF14；
Tcruzi-80-RV-GCGTTCAACTTTTGGGGCCCAGAATCATGC(SEQ ID NO：26)，30nt，GC％53.3，65.1，HG4，SF19；
锥虫-85-RV-AACTTTTGGGGCCCAGAATCATGCATCTCC(SEQ ID NO：27)，30nt，GC％50，TM 64，HG4，SF20；
锥虫-90-RV-CTGCAAGAAACTGGAAAATATGGTTTTGGGAG(SEQ ID NO：28)，32nt，GC％40.6，TM 59.9，HG2，SF19。
实施例16
利什曼原虫chagasi动基体微环DNA，完整的序列(SEQ ID NO：31)。
引物包括：
LDOCHIN-FW100-TAGCCATAGCGCTTTAGAATAGTTCGRCTCCGAA(SEQ ID NO：32)，34nt，GC 45.6Tm为63.5；
LDOCHIN-FW110-TATAGCCATAGCGCTTTAGAATAGTTCGRCTCCGA(SEQ ID NO：33)，35nt，GC 44.3，TM 62.9；
LDOCHIN-FW120-TATAGCCATAGCGCTTTAGAATAGTTCG(SEQ ID NO：34)，28nt，GC39.3，TM 56.3；
LDOCHIN-FW130-TRCTCGTACACTATAAGTATTATGTTTAATATAT(SEQ ID NO：35)，34nt，GC 22.1，TM 52.1；
LDOCHIN-FW140-CTGACATTRCTCGTACACTATAGTATTATG(SEQ ID NO：36)，31nt，GC33.9，TM 54.2；
TAATAACTFACATTACTCGTACACTATAAGTATTATGTTTAATAT(SEQ ID NO：37)；
LDOCHIN-FW150-TAGTAATATCTRTACCGATATATTTRTAGGTTG(SEQ ID NO：38)；
LDOCHIN-RV160-CAACCTAYAAATATATCGGTAYAGATATTACTA(SEQ ID NO：39)，33nt，GC27.3，TM 52.6；
LDOCHIN-FW170-CATACTGCAGTGAATTGRAAATTAATRAATTGG(SEQ ID NO：40)，33nt，GC30.3TM 55.9；
LDOCHIN-RV180-CCAATTYATTAATTTYCAATTCACTGCAGTATG(SEQ ID NO：41)；LDOCHIN-RV190-CCCTACCCGGAGGACCAGAAAAGTTTGG(SEQ ID NO：42)，28nt，GC 57.1，TM63.9；
探针CCAAACTTTTCTGGTCCTCCGGGTAGGGGCGTTCTGCAAA(SEQ ID NO：43)。
实施例17
其他引物包括GAAAAATGGGTCCAGAAATGCCGTTCAA(SEQ ID NO：44)；
TTGAACGGGATTTCTGCACCCATTTTTC(SEQ ID NO：45)；
AAACTGGGGGTTGGTGTAAAATAGGGCCGG(SEQ ID NO：46)；
CCGGCCCTATTTTACACCAACCCCCAGTTT(SEQ ID NO：47)；
GGAAACTGGGGGTTGGTGTAAAATAGGGC(SEQ ID NO：48)；
GCCCTATTTTACACCAACCCCCAGTTTCC(SEQ ID NO：49)
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种寄生虫检测试剂盒，其特征在于，试剂盒的核酸反应体系内包括一种或多种核酸扩增引物对，包括以下至少一项：
(A)能够扩增锥虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28中的一种或多种和SEQ ID NO：23；(2)SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28中的一种或多种和SEQ ID NO：24；(3)SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，或SEQ ID NO：28中的一种或多种和SEQ ID NO：25；
(B)能扩增利什曼原虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8中的一种或多种和SEQ ID NO：3；(2)SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8中的一种或多种和SEQ ID NO：4；(3)SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8中的一种或多种和SEQ ID NO：5；(4)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13中的一种或多种和SEQ ID NO：10；(5)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13中的一种或多种和SEQ ID NO：11；
(C)能够扩增巴西利什曼原虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21中的一种或多种和SEQ ID NO：16；(2)SEQID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21中的一种或多种和SEQ ID NO：17；(3)SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21中的一种或多种和SEQ ID NO：18；
(D)能够扩增chagasi利什曼原虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQID NO：32；(2)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：33；(3) SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：34；(4)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：35；(5)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：36；(6)SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42中的一种或多种和SEQ ID NO：38；
(E)能够扩增克氏锥虫的DNA的核苷酸序列：SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51；
(F)能够扩增克氏锥虫的DNA的核苷酸序列：SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；
(G)能够扩增朗杰尔氏锥虫的DNA的核苷酸序列至少包括下列核苷酸序列中的一种：(1)SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58中的一种或多种和SEQ ID NO：59；(2)SEQID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58中的一种或多种和SEQ ID NO：60；
(H)能够扩增朗杰尔氏锥虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64；
(I)能够扩增利什曼原虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67中的一种或多种和SEQ ID NO：68；
(J)能够扩增墨西哥利什曼原虫或亚马逊利什曼原虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ IDNO：70和SEQ ID NO：71；
(K)能够扩增巴西利什曼原虫，panamensis杜氏利什曼原虫，guyanensis利什曼原虫，或peruviana利什曼原虫的DNA的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种寄生虫检测试剂盒，其特征在于：步骤A-K中，用于检测扩增的利什曼原虫或锥虫DNA片段的核酸探针组成包括：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：77，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：55，SEQ IDNO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：72。
3.根据权利要求2所述的一种寄生虫检测试剂盒，其特征在于：用核酸探针检测标记试剂盒，核酸探针是包括核酸序列SEQ ID NO：76的寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的一种寄生虫检测试剂盒，其特征在于：还包括扩增试剂、试剂、一种或多种重组酶、核酸内切酶、一个外切酶、单链DNA结合蛋白或链置换聚合酶。
5.根据权利要求4所述的一种寄生虫检测试剂盒，其特征在于：核酸外切酶是核酸外切酶III，核酸内切酶是一种内切核酸酶IV。
6.根据权利要求1所述的一种寄生虫检测试剂盒，其特征在于：包含可检测至少一种标记的寡核苷酸核酸探针的核酸序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：61，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76。
7.一种寄生虫检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括使用权利要求1的寄生虫检测试剂盒中一种或多种核酸扩增引物对进行核酸扩增反应，并通过检测核酸扩增引物对的特异性扩增子检测寄生虫的DNA的存在。
8.根据权利要求7所述的一种寄生虫检测试剂盒的检测方法，其特征在于：检测核酸扩增引物对的特异性扩增子的方法包括用包含以下核酸序列的核酸探针结合的扩增核酸：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76。
9.根据权利要求7所述的一种寄生虫检测试剂盒的检测方法，其特征在于：还包括形成包含至少一个引物对和参与扩增反应的生物样品的混合物，生物样品为体液或组织样品。
10.根据权利要求7所述的一种寄生虫检测试剂盒的检测方法，其特征在于：扩增反应是一个重组酶聚合酶扩增的等温扩增反应。
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