CN104685066A - 用于量化样品中核酸序列的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明特征在于用于实时地定量检测样品中的靶寡核苷酸的组合物和方法。这些方法与使用NEAR反应扩增靶寡核苷酸是相容的。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年4月9日提交的美国临时申请号61/621,975的权益,所述申请通过引用以其全文结合在此。
发明背景
核酸扩增技术已经提供了理解复杂生物学过程,检测、鉴定、和量化病原性和非病原性有机体,法医犯罪学分析,疾病相关研究,以及遗传上修饰过的有机体中的事件的检测等的手段。聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增DNA的常用热循环依赖性核酸扩增技术,所述技术由多个循环的、用于DNA熔化和使用DNA聚合酶的DNA的酶复制的反应的重复加热和冷却组成。实时定量PCR(qPCR)是用于量化生物样品中给定核酸序列的拷贝数的技术。目前,qPCR利用了贯穿所述反应的实时反应产物检测,并且比较扩增图谱与在每个反应开始时包含已知量的核酸(或核酸与未知的所测试的核酸的已知相对比率)的对照的扩增。对照的结果用于构建标准曲线,典型地基于标准反应扩增曲线的对数部分。基于与标准对照量进行比较的它们的扩增曲线的情况,这些值用于插入未知物的量。
除了PCR,现存的非热循环依赖性扩增系统或等温核酸扩增技术包括但不局限于:切口和延伸扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、单引物等温扩增(SPIA)、Q-β复制酶系统、以及重组酶聚合酶扩增(RPA)。
NEAR扩增具有与PRC热循环的相似性。类似于PRC,NEAR扩增采用与PCR中称为引物并且在NEAR中称为模板的靶序列互补的寡核苷酸序列。此外,靶序列的NEAR扩增导致靶序列的对数增长,就像它在标准PCR中的表现一样。不像PCR,NEAR反应是等温地进展。在标准PCR中,温度是增加的,用来允许两个DNA链分开。在NEAR反应中,靶核酸序列在测试样品中存在的特异性切口位点处是切口的。聚合酶渗入切口位点并且与现存互补DNA链的置换一起开始切口的靶核苷酸序列(添加的外源DNA)的互补链合成。链置换复制过程排除了对增加的温度的需求。此时,模板/引物分子从添加的外源DNA退火成置换的互补序列。聚合酶现在从模板的3’端延伸,产生先前置换的链的互补链。然后第二模板/引物寡核苷酸退火成新合成的互补链并且延伸,制成包括切口酶识别序列的NDA的双链体。所述链然后倾向于被切口,伴随通过聚合酶的随后的链置换延伸,这导致在原有靶DNA的任一侧上具有切口位点的DNA的双链体的产生。一旦这被合成,继续通过置换的链与新模板分子一起的复制指数地扩增所述分子。此外,还通过在模板引入的切口位点的切口翻译合成的重复动作,扩增从每个产物分子线性地继续进行。结果是靶信号扩增的非常迅速的增长;与PCR热循环相比,远远更快,其中扩增导致小于十分钟。
然而,量化已经成了问题。实时NEAR系统的最佳性能取决于特异性产物的产生和扩增。已知除了通过反应酶的特异性产物,NEAR系统产生显著水平的非特异性背景产物。这些背景产物可以用作可扩增实体,并且它们的产生会胜过特异性产物的产生。虽然可能设计特异性针对希望的靶的检测探针(并且因此在复杂背景中,特异性产物是可检测的),但是显著水平的非特异性背景产物隔离了可能已经另外用于特异性产物的扩增的反应组分。因此,由于非特异性背景产物产生引起的反应组分隔离导致次优的反应。当靶核酸最初处于非常低的丰度时,并且在靶的可靠检测需要高度优化的反应的情况下,这是特别麻烦的。而且,次优的反应不会表示靶核酸的真实量化,即使它是可检测的。会有利的是,产生消除非特异性背景产物的扩增的优化的NEAR反应。这样做会通过基于标准曲线的系统抑或相对量化,提供适合量化的反应。
而且,通常的做法是使用质谱法来评价NEAR反应。高水平的背景产物会模糊质谱法数据的判读。例如,如果反应包含背景产物、源自非特异性扩增(来自仍相关的不相似的靶)的一种或更多种产物、以及特异性产物,则从背景产物鉴定这些基质衍生的产物将是挑战性的。背景产物的消除导致具体测定的性能/特异性的清晰确定。
额外地,高水平的背景产物会阻碍有意的双重或多重反应的最佳扩增。虽然多重的、差异化标记的检测探针是与实时检测相容的,但是由于非特异性产物形成,仍存在反应物限制的问题。对于双重或多重反应而言,这是特别真实的,其中这些反应包含可以潜在地形成背景产物的复杂群体的多于两种的模板/引物。消除了背景产物的扩增的NEAR反应系统还提供了用于实时检测有意的双重或多重反应的条件。会高度有利的是,提供了用来消除可扩增背景产物的手段,因此使NEAR反应中产生特异性产物的潜能最大化。会希望的是,是否可以通过反应进展的实时准确监测,提供定量结果。
发明概述
如以下描述,本发明特征在于用于实时检测样品中的靶寡核苷酸的组合物和方法,所述方法减少或消除了背景产物的产生,以允许所述样品靶寡核苷酸的量化。这些方法是与使用NEAR反应扩增靶寡核苷酸相容的。本发明至少部分基于以下发现:在单重NEAR反应中可以产生特异性产物,而不产生背景产物。这些反应组合物和方法提供了未知测试样品、双重反应、以及多重反应的相对量化,以及用于未知测试样品的绝对量化的标准曲线的产生。
在一个方面,本发明提供了量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法,所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸;产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号,其中所述信号表明在所述样品中存在的靶核酸分子或其扩增子的量。
在另一个方面,本发明提供了用于检测在单个反应的过程中产生的多种不同反应产物的方法,所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸;产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号,其中所述信号表明在所述样品中存在的靶核酸分子或其扩增子的量。
在一个具体方面,本发明提供了量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法,所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,其中每个引物/模板寡核苷酸具有定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端(例如所述寡核苷酸的3’末端)或其附近的至少约5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸;产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号,其中所述信号表明在所述样品中存在的靶核酸分子或其扩增子的量。
在一个方面,本发明提供了用于实时监测切口和延伸扩增反应的方法,所述方法涉及:在基本上等温条件下,使测试样品与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸;产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且实时检测信号,由此量化所述一个或更多个靶核酸分子。
在另一个方面,本发明提供了用于实时监测NEAR反应中靶核酸分子的方法,所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、异源双链特异性的切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸;产生具有结合所述可检测寡核苷酸探针的靶序列的多个扩增子;并且实时检测信号,由此量化所述靶核酸分子。
仍在另一个方面,本发明提供了用于实时监测测试样品中靶核酸分子的方法,所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、修复酶或校正读码酶、以及可检测的多核苷酸探针,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸;产生具有结合所述可检测寡核苷酸探针的靶序列的多个扩增子;并且实时检测信号,由此量化所述靶核酸分子。
仍在另一个方面,本发明提供了用于检测NEAR反应中的靶序列的试剂盒,所述试剂盒包含一个或更多个引物/模板寡核苷酸,以及用于本发明的方法中的引物/模板寡核苷酸的用途的说明书,这个或这些引物/模板寡核苷酸特异性结合靶核酸分子上的互补序列并且在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸。
在一个方面,本发明提供给了从5’至3’,具有第一区和第二区的分离的寡核苷酸,其中所述第一区具有切口酶识别序列;其中所述第二区具有特异性结合靶核酸分子上的互补序列的至少9个或更多个核苷酸(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续的核苷酸);并且其中所述第二区具有一个或更多个2’修饰的核苷酸。在其他实施例中,所述分离的寡核苷酸是列出于图1中的那个。
在本文描绘的多个方面的不同实施例中,寡核苷酸(例如引物/模板寡核苷酸、分离的寡核苷酸)包含修饰的核苷酸,包括2’修饰的核苷酸。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,2’修饰是以下中的一个或更多个:2’-O-甲基、2′-甲氧基乙氧基、2′-氟代、2’-羟基、2′-烯丙基、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4′-巯基、4′-CH2-O-2′-桥、4′-(CH2)2-O-2′-桥、2′-LNA、2’-烷基、以及′-O-(N-氨基甲酸甲酯)或修饰的核苷酸包含碱基类似物。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描绘的任何方面的其他实施例中,一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸与切口位点隔开1、2、3、4、5或更多个未修饰的核苷酸。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,两个或更多个2’修饰的核苷酸是连续的(2、3、4、5、或更多个)。在本文描绘的任何方面的其他实施例中,两个或更多个2’修饰的核苷酸是与未修饰的核苷酸交替的。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,切口酶识别序列是5’-GAGTC-3’。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描绘的任何方面的其他实施例中,5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端。在本文描绘的任何方面的其他实施例中,与未修饰的核苷酸交替的2个或多个2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端(即靶特异性区域)。
在本文描绘的任何方面的不同实施例中,检测步骤并不检测非靶分子的扩增子。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,所述方法是实时进行的。在本文描绘的任何方面的某些实施例中,产生多个扩增子的步骤是实时进行的(例如用来确定存在于反应中的靶的量)。
在本文描绘的任何方面的不同实施例中,所述方法提供了确定在扩增前,生物样品中存在的核酸分子的量的半定量的和/或量阈值的方法。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,将一个或更多个2’修饰的核苷酸定位为更接近在与靶核酸分子互补的序列的5’端增加了扩增的检测时间。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,所述方法进一步涉及使用引物/模板寡核苷酸的比率,来提供由不同量的起始靶材料引起的反应产物的增加的分辨率。已经发现,增加在识别序列的3’端具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸与在识别序列的5’端具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率收缩了信号曲线并且移位了曲线的斜率。
在本文描绘的任何方面的不同实施例中,所述方法进一步涉及使用扩增速率改性剂,来提供由于不同量的起始靶材料引起的反应产物的增加的分辨率。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,靶核酸分子是DNA或RNA核酸分子。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,可检测探针是SYBR绿(SYBR green)或分子信标(Molecular Beacon)。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,可检测探针是具有与靶序列互补的至少约10个核苷酸、可检测部分、以及聚合酶捕获分子的非可扩增性、可检测的多核苷酸探针,其中所述聚合酶捕获分子防止聚合酶在另外支持聚合酶活性的条件下扩增所述探针。
在本文描绘的任何方面的不同实施例中,测试样品包含病原体。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,病原体是病毒、细菌、酵母或真菌。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,测试样品是生物样品。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,生物样品是细胞、组织样品、或生物流体(例如尿、精液、阴道分泌物、或粪便)。在本文描绘的任何方面的不同实施例中,测试样品是环境样品。
本发明提供了用于检测使用NEAR反应扩增的靶核酸分子的组合物和方法。通过本发明定义的组合物和物品单独地或者否则与下面提供的实例相关地进行制造。本发明的其他特征和优点将从详细描述并且从权利要求书中变得明显。
定义
在本披露中,“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”以及“具有(having)”等可以具有美国专利法中向它们所赋予的含义,并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”等;“基本上由…组成(consisting essentially of)”或“基本上由…组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中所赋予的含义,并且所述术语是开放式的,允许超过所列举的内容的存在,只要所列举的内容的基础或新颖特征不会因超过所列举的内容的存在而改变即可,但将现有技术实施例排除在外。
“聚合酶捕获分子(polymerase-arresting molecule)”是指与防止或显著减少在多核苷酸模板上的聚合酶的进展的多核苷酸模板/引物关联的部分。优选地,将所述部分并入所述多核苷酸。在一个优选实施例中,所述部分防止聚合酶在所述模板上进展。
“聚合酶延伸”是指聚合酶从易接近3’-羟基向前进展,掺入与模板多核苷酸链上的它们相对的核苷酸互补的进入的单体。
“外切酶缺陷的聚合酶”是指没有5’-3’外切酶活性或具有几乎不可检测水平的此类活性的依赖DNA的DNA聚合酶和/或依赖于RNA的DNA聚合酶。
“核苷酸加合物”是指共价结合或以另外的方式固定至标准核苷酸碱基上的部分。
如在此使用,术语“可检测的多核苷酸探针”是指用具有与靶序列的至少一个链互补的序列区的可检测部分标记的任何至少部分单链的多核苷酸,当结合至靶序列时,所述可检测的多核苷酸探针从所述可检测部分释放可检测信号,而通过此可检测部分的信号产生并不取决于由非特异性5’-3’外切酶活性切割所述可检测的多核苷酸探针。如在此使用,“可检测的多核苷酸探针”的实例是,但不局限于,如现有技术描述的荧光分子信标。
如在此使用,术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或修饰的核苷酸、以及它们的单链或双链形式的聚合物。所述术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸,这些核酸是合成的、天然存在的、及非天然存在的,具有类似于参照物核酸的相似结合特性,并以类似于参照物核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不局限于2’修饰的核糖核苷酸(例如2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-F核苷酸)。
如在此使用,“修饰的核苷酸”是指具有对核苷、核碱基、戊糖环、或磷酸基团的一个或更多个修饰的核苷酸。例如,修饰的核苷酸排除了包含一磷酸腺苷、一磷酸鸟苷、一磷酸尿苷、以及一磷酸胞苷的核糖核苷酸,以及包含一磷酸脱氧腺苷、一磷酸脱氧鸟苷、一磷酸脱氧胸苷、以及一磷酸脱氧胞苷的脱氧核糖核苷酸。修饰包括起因于通过修饰核苷酸的酶(例如甲基转移酶)的修饰的天然发生的那些。修饰的核苷酸还包括合成的或非天然发生的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然发生的修饰包括具有2’修饰的那些,这些2’修饰例如2’-烷基,像2’-O-甲基和2′-甲氧基乙氧基、2′-氟代、2’-羟基(RNA)、2′-烯丙基、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4′-巯基、4′-CH2-O-2′-桥、4′-(CH2)2-O-2′-桥、2′-LNA、以及2′-O-(N-氨基甲酸甲酯)或包含碱基类似物的那些。
“碱基置换”是指并不引起互补核苷酸链之间的杂交的显著破坏的核碱基多聚体的取代基。
“特异性产物”是指由模板寡核苷酸与互补的靶序列杂交以及靶序列的随后的聚合酶介导的延伸产生的多核苷酸产物。
“切口和延伸扩增反应”是指导致感兴趣的多核苷酸扩增的切口和延伸的交替循环。
“基本上等温条件”是指在单一温度或在并不显著变化的窄温度范围内。在一个实施例中,在基本上等温条件下进行的反应是仅变化约1℃-5℃(例如变化1、2、3、4、或5度)的温度下进行。在另一实施例中,所述反应是在所用仪器的操作参数内的单一温度下进行。
“切口酶”是指多肽,所述多肽能够识别并且结合双链核酸分子中的特异性结构,并且当结合至其识别的特异性结构时,打开单链上的邻接核苷酸之间的磷酸二酯键,由此产生可以由外切酶缺陷的聚合酶延伸的、切口位点上游的末端核苷酸上的游离3’-羟基。
“切口位点”是指由切口酶水解的双链核酸分子的一个链中的“打开的”磷酸二酯键的位置。
“扩增子”是指在感兴趣的多核苷酸的扩增期间,产生的一个多核苷酸或多个多核苷酸。在一个实例中,扩增子是在聚合酶链式反应期间产生的。
“半定量的”是指基于内部对照,提供相对量的估计。
“量阈值的方法”是指基于在量上超过抑或未超过比较标准,提供量的估计。
“扩增速率改性剂”是指能够影响聚合酶延伸的速率或由切口酶切口单链的速率,抑或这二者的试剂。
“监测反应”是指检测反应的进展。在一个实施例中,监测反应进展涉及检测聚合酶延伸和/或检测完整的NEAR反应。
“检测”是指鉴定待检测的分析物的存在、缺乏或者量。
“可检测部分”是指组合物,当把所述组合物连接至感兴趣的分子时,使后者变成经由光谱、光化学、生物化学、免疫化学、或化学的手段可检测。例如,有用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶粒、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如,如通常在ELISA中所使用的)、生物素、异羟基洋地黄毒甙元、或半抗原。
“片段”是指核酸分子的一部分。所述部分包含,优选地,参考核酸分子或多肽的整个长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。片段可以包含5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸。
“杂交”是指互补核碱基之间的氢键合,所述氢键合可以为沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏(reversed Hoogsteen)氢键合。例如,腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成进行配对的互补核碱基。
“分离的多核苷酸”是指脱离了基因(这些基因在衍生出本发明的核酸分子的有机体的天然存在的基因组中)的核酸(例如,DNA),插入所述基因侧翼。因此所述术语包括,例如,重组DNA,所述重组DNA合并进入载体、自主复制质粒或病毒、或原核生物或真核生物的基因组DNA,或者所述重组DNA作为不依赖于其他序列的分离的分子存在(例如,通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或者基因组的或cDNA的片段)。此外,所述术语包括从DNA分子转录的RNA分子,以及是对另外的多肽序列进行编码的杂合基因的一部分的重组DNA。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指在不同程度上不含在其天然状态中通常伴随其的组分的材料。“分离”是指与原始来源或环境分开的程度。“纯化”是指高于分离的分开的程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白是充分地不含有其他材料,这样使得任何杂质并不物质上影响蛋白的生物学特性或引起其他不良后果。即,本发明的核酸或肽是纯化的,前提是基本上不含有细胞材料、病毒材料、或培养基(通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其他化学品(化学合成时)。典型地使用分析化学技术,例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来确定纯度和同质性。术语“纯化的”可以指核酸或蛋白在电泳凝胶中实质上产生了条带。对于可以经受修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白而言,不同修饰可以产生不同的分离的蛋白,这些蛋白可以分开地纯化。
如在此使用,如“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买、或以另外的方式获得所述试剂。
“参考”是指标准或对照条件。如对本领域普通技术人员而言明显的是,适当的参考是在元素被改变以确定所述元素的影响的情况下。
“杂交”是指在严谨度的不同条件下,配对以形成互补多核苷酸序列(例如在此描述的基因)或它们的部分之间的双链分子。(参见例如Wahl,G.M.(瓦尔)和S.L Berger(伯杰)(1987)Methods Enzymol.(酶学方法)152:399;Kimmel,A.R.(基梅尔)(1987)Methods Enzymol.(酶学方法)152:507)。
“受试者”是指哺乳动物,包括但不局限于,人或非人类的哺乳动物,例如牛、马、犬、绵羊、或猫。
“靶核酸分子”是指待分析的多核苷酸。此类多核苷酸可以是靶顺序的有义链或反义链。术语“靶核酸分子”还指原始靶序列的扩增子。
将在此提供的范围理解为对所述范围内全部值的简写。例如,1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围,所述组由以下各项组成:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
除非明确声明或从上下文明显可见,如在此所使用,术语“或(or)”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文明显可见,如在此所使用,术语“一个、一种(a、an)”、和“所述(the)”被理解为单数的或复数的。
除非明确声明或从上下文明显可见,如在此所使用,术语“约”被理解为在本领域的正常容差范围内,例如,在平均数的2个标准差之内。约可以被理解为在声明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、或0.01%之内。除非从上下文清晰可见,在此提供的所有数值被所述术语约修饰。
在此以变量的任意定义对化学基团的清单的描述包括作为任意单独基团或所列基团的组合的变量的定义。在此针对变量或方面的实施例的描述包括所述实施例作为任何单个的实施例或与任何其他实施例或其部分的组合。
在此提供的任何组合物或方法可以与在此提供的一个或更多个任何其他组合物和方法进行组合。
附图简要说明
图1描绘了示例性聚合酶捕获实体结构。黑色=稳定子序列,蓝色=切口酶识别序列,绿色=切口酶间隔子序列,红色=靶-特异性识别序列,A=腺嘌呤,T=胸腺嘧啶,G=鸟嘌呤,C=胞嘧啶,U=尿嘧啶,mX=2’-O-甲基RNA碱基。加下划线的一个或更多个碱基描绘了修饰的序列区段。
图2A-2C描绘了对马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensissepidonicus)(Cms)靶DNA的动态范围合成长聚物(long-mer)的评价。示出了来自Cms合成“长聚物”靶的滴定的示例性结果和经由氟信标的检测。无靶核酸输入而进行的对Cms的NEAR测定被表示为无靶对照(NTC)。图2A是示出在含2’-O-甲基修饰的引物/模板的反应中抑制无靶对照(NTC)中的信号的图。图2B是示出展示了使用2’-O-甲基模板反应的广动态范围的标准曲线的图。图2C是如与未修饰的引物/模板(左侧小图)进行比较,示出使用2’-O-甲基修饰的引物/模板(右侧小图)的Cms测定系统的无靶对照(NTC)中非特异性扩增产物的消除的示例性质谱数据的比较。为了确定2’-O-甲基修饰的引物/模板对背景产物的产生的影响,经由HPLC/质谱法分析图2A中描绘的无靶对照反应的样品(10μl)。质谱数据清晰地证明在2’-O-甲基修饰的引物/模板存在下,检测到只有预期的分子种类的存在,并且消除了在未修饰的引物/模板存在下产生的复杂背景产物。
图3描绘了在使用SYBR绿检测的NEAR测定中,模板/引物的2’-O-甲基修饰消除了背景信号。示出了使用2’-O-甲基修饰的引物/模板的示例性扩增数据和非特异性扩增产物的消除。图3A是示出了在无靶对照(NTC)中观察到显著信号的图,表明在靶DNA不存在时背景产物的产生。图3B是示出在无靶对照(NTC)时,含2’-O-甲基修饰的模板的反应被抑制的图。
图4描绘了在使用分子信标检测的NEAR测定中,模板/引物的2’-O-甲基修饰消除了背景信号。示出了使用2’-O-甲基修饰的引物/模板的示例性扩增数据和非特异性扩增产物的消除。图4A是示出了在无靶对照(NTC)中观察到显著信号的图,表明在靶DNA不存在时背景产物的产生。图4B是示出在无靶对照(NTC)时,含2’-O-甲基修饰的模板的反应被抑制的图。
图5描绘了使用2’-O-甲基修饰的引物/模板的示例性聚合酶捕获实体,或2’-O-甲基修饰的引物/模板的比率可以用于操控反应的检测时间和效率两者,因此‘调谐’反应。示出了用于调谐特异性反应的示例性2’-O-甲基修饰的模板/引物的示意性图示,包括具有在3’端的五个2’-O-甲基核苷酸的嵌段的引物/模板(“末端”模板;左侧图),以及具有在切口位点后的第3个核苷酸开始的五个2’-O-甲基核苷酸的嵌段的引物/模板(“切口+2”模板;右侧图)。每个调谐条件包括特定比率的正向和反向模板,其中每组模板具有变化的结构。
图6描绘了证明用于‘调谐’特异性反应的模板/引物的2’-O-甲基修饰的实用性的扩增图。示出了使用2’-O-甲基修饰的引物/模板的示例性扩增数据。所有这些反应(一式两份)包含10,000基因组当量的Cms DNA。每个调谐条件表示特定比率的正向和反向模板,其中每组模板具有变化的结构。红色圆圈证明在用于每个调谐条件的检测时间中的移位。额外地,收缩了每个条件的对数期并且移位了曲线的斜率。
图7描绘了在用来扩增玉米ADH1基因的片段的NEAR测定中使用的两个引物/模板组(TS3&TS6)的设计。与现有技术中的中的典型的NEAR测定的引物/模板组中的情况(9至12个碱基)相比,TS3&TS6引物/模板组的序列中的靶特异性区域显著更长(15-17个碱基)。在TS3引物/模板组中,邻近3’-末端的5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸的嵌段之前是与未修饰的核苷酸交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸的上游区(开始分别是从切口位点向下游5或4个核苷酸的2’-O-甲基修饰的核苷酸)。与TS3相反,在TS6组的每个引物/模板中,仅存在五个2’-O-甲基修饰的核苷酸,它们形成了邻近未修饰的3’-末端核苷酸的连续核苷酸的嵌段。
图8示出了在SYBR绿染料检测通道中记录的、使用两组引物/模板(TS3&TS6)的ADH1测定的扩增图。
图9示出了在ROX通道中记录的相同测定反应的扩增图。
图10描绘了记录的NTC ADH1测定反应的扩增图。比较图8和9中示出的结果,变得明显的是,只有引物/模板组TS3产生了ADH1-特异性扩增子,而由TS6组产生的信号主要基于仅由SYBR绿检测的背景产物的非特异性扩增。
发明详细说明
本发明特征在于对于量化等温反应中的靶核酸分子有用的组合物和方法。在具体实施例中,本发明提供了用于量化(例如实时地)NEAR反应中的靶核酸分子的组合物和方法。
本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现:包含2’修饰的(例如2’-O-甲基、2’-氟代)核苷酸的引物-模板寡核苷酸减少或消除了由Bst DNA聚合酶I的5’-3’外切酶缺陷的衍生物引起的不合理扩增。
NEAR反应
NEAR反应已经用作用于提供靶寡核苷酸的非定量检测的端点反应。常规NEAR测定包括:(1)靶核酸分子;(2)类似于PCR的引物分子的两种寡核苷酸分子;称为包含一定数量的与靶核酸分子互补的寡核苷酸和可以由切口酶切割的位点的“模板-引物”;(3)dNTP;(4)链置换的、5’-3’-外切酶缺陷的聚合酶;以及(5)切口酶。部分由于可以模糊常规NEAR反应中靶序列的检测的样品中存在的非靶分子的不合理扩增,用于量化,特别是实时地量化NEAR反应的目前方法是不适当的。例如,在NEAR反应中始终存在不希望的扩增,这导致在靶分子不存在的情况下的可检测信号,或者具有并不准确反映反应中存在的靶核酸分子的量的信号。虽然这提供了端点产物的检测,但是它不能提供反应的实时监测。
本发明提供了克服准确定量NEAR反应中的靶核酸分子的问题的修饰的引物/模板寡核苷酸。对于实时定量NEAR反应中的靶核酸分子,它是特别有用的。本发明至少部分基于以发现:包含2’修饰的(例如2’-O-甲基、2’-氟代)的引物-模板寡核苷酸减少或消除了不合理扩增,而不防止那些修饰的引物-模板的延伸,以扩增特异性产物。本发明的引物/模板寡核苷酸在NEAR反应中是有用的,所述NEAR反应包含一个或更多个上述的NEAR组分。
在其他实施例中,本发明提供了包含位于或邻近引物-模板的3’末端的2’修饰的(例如2’-O-甲基、2’-氟代)的引物-模板寡核苷酸。令人惊讶地,位于引物-模板的3’-末端区域中的2’-O-甲基核苷酸不仅确实包含用于等温DNA扩增反应中Bst DNA聚合酶I的5’-3’外切酶缺陷的衍生物的有效引发底物,而且使用此类修饰的引物-模板完全抑制了非特异性引物-二聚物扩增。这是特别令人惊讶的,因为等温DNA扩增领域中常规想法教授了以下内容:仅能在远离3’-末端的引物/模板的5’-末端区域引入修饰的核苷酸(例如2’-O-甲基核糖核苷酸、未修饰的核糖核苷酸),这是因为已经证明,在距离引物的3’-末端6个核苷酸以内放置2’-O-甲基-连同核糖核苷酸抑制通过DNA聚合酶的引物延伸(包括作为参考文献的来自安玛西亚公司(Amersham)的专利申请和来自凯杰公司(Qiagen)的专利)。
用于NEAR和其他等温扩增技术(LAMP)的Bst DNA聚合酶I的5’-3’外切酶缺陷的衍生物属于参与低合成保真度DNA修复过程的polA-型细菌DNA聚合酶。相反,由DNAE-&POLC型DNA聚合酶III全酶催化细菌中的高保真基因组复制,这些全酶利用专用的RNA引物来起始DNA复制。在公开的现有技术中,认为RNA和DNA引物之间的辨别是用于防止用高保真基因组复制干扰高错误率DNA聚合酶I酶的一种机制。在此背景下,令人惊讶的发现是,Bst DNA聚合酶I的衍生物可以有效利用2’-修饰的核糖核苷酸作为用于DNA合成的引物,所述发现是非凡并且违反直觉的。
引物-模板设计
示例性聚合酶-捕获实体结构从5’至3’包括稳定子序列、切口酶识别序列、切口酶间隔子序列、以及靶特异性识别序列,所述靶特异性识别序列包括一个或更多个2’修饰的核苷酸(例如2’-O-甲基、2′-甲氧基乙氧基、2′-氟代、2′-烯丙基、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、2’-羟基(RNA)、4′-巯基、4′-CH2-O-2′-桥、4′-(CH2)2-O-2′-桥、2′-LNA、以及2′-O-(N-氨基甲酸甲酯))。不束缚于理论,假设在识别区域中并入一个或更多个2’修饰的核苷酸致使那些修饰的区域不适合用作用于由引物/模板的相互作用(例如引物-二聚物形成)形成的非特异性分子间的和/或分子内的复合物中的聚合酶延伸的模板,并且由此减少或消除了等温扩增中的背景信号。2’修饰的核苷酸优选具有与靶序列碱基配对的碱基。在具体的实施例中,在靶特异性识别区域中两个或更多个2’修饰的核苷酸(例如2、3、4、5或更多个2’修饰的核苷酸)是连续的(例如修饰的核苷酸的嵌段)。在一些实施例中,2’修饰的核苷酸的嵌段位于靶特异性识别区域的3’端。在其他实施例中,2’修饰的核苷酸的嵌段位于靶特异性识别区域的5’端。当2’修饰的核苷酸的嵌段位于靶特异性识别区域的5’端时,所述2’修饰的核苷酸可以与切口位点隔开一个或更多个非修饰的核苷酸(例如2、3、4、5或更多个2’未修饰的核苷酸)。诸位申请人已经发现,一个或更多个2’修饰的核苷酸的或2’修饰的核苷酸的嵌段的定位改变了扩增的动力学。当一个或更多个2’修饰的核苷酸或2’修饰的核苷酸的嵌段位于识别区域的5’端或其附近或接近切口位点,实时扩增反应示出减小的检测时间。额外地,收缩了信号曲线并且移位了曲线的斜率。诸位申请人还发现,在长度超过12个核苷酸的识别区域中,5个连续的2’-修饰的核苷酸的单个嵌段不足以抑制非特异性扩增,并且因此从所述切口位点向下游高达4或5个核苷酸的整个识别区域必定被取代为与未修饰的核苷酸交替的2’-修饰的核苷酸。
在相关实施例中,具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率可以用来改变反应的检测时间和/或效率,以用于‘调谐’这些反应,导致对扩增动力学的可预测控制。增加在识别序列的3’端具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸与在识别序列的5’端具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率收缩了信号曲线并且移位了曲线的斜率。有利的是,能够“调谐”反应提供了操控反应的检测时间连同效率这二者的手段。使用内部对照的相对量化需要符合两个重要条件。第一,有益的是,能够修改产生非竞争性反应条件的反应的检测时间。因此,通过影响在稍后时间点(相对于感兴趣的靶)可检测的对照反应,即使当感兴趣的靶处于低的初始丰度时,对照反应并不胜过感兴趣的特异性靶。第二,为了确保真实相对丰度计算,需要对照反应和特异性靶反应具有匹配的效率。通过使用“调谐”条件控制每个反应的效率,使得多个反应能够匹配,允许满意的相对量化计算。调谐这些反应可以被用于使定量PCR(qPCR)中的靶核酸扩增和参考核酸扩增(例如内标)的效率匹配。额外地,可以改变靶核酸和内标的扩增曲线,这样它们的扩增产物的检测时间被分开,同时提供了对靶核酸扩增和内标扩增的相同效率。通过使用反应内的寡核苷酸结构的特定组合和比率,可能产生使调谐的反应性能成为可能的条件。
在不同实施例中,用茎环构型构建引物/模板对。引物/模板寡核苷酸的5’端包括形成至少一部分茎的自身互补区域。在本发明的一些实施例中,茎进一步涵盖至少一部分或全部切口酶识别序列。在本发明的其他不同实施例中,引物-模板中的切口酶识别序列并不是双链茎结构的一部分,而是存在于大部分单链环内。所述切口酶识别位点连接在不含二级结构的位点的3’端,所述不含二级结构的位点包括连接在与靶序列互补的序列的3’端的切口位点。如果希望,与靶序列互补的序列可以包括二级结构或可以不含二级结构。应确定可以包括自身互补区域的二级结构存在或不存在以优化具体的NEAR测定。
在一个实施例中,本发明的方法提供了NEAR反应,所述反应包括标准NEAR组分,而且还包括当存在于具有互补DNA链的异源双链中时,能够使RNA核苷酸切口的酶。在一个实例中,切割的RNA核苷酸将存在于一串4-15个非可切割RNA核苷酸(即O-2-Me-RNA)中,朝向PTO的靶互补区域的5’端,并且模板寡核苷酸的3’端将具有3’末端‘帽’。仅在模板寡核苷酸的完全正确杂交时,其中异源双链切割分子(即RNA酶H)将能够切割RNA碱基,产生用于切口移位酶从其延伸的3’端;并且允许NEAR反应进展至完成。异常模板结合(引物二聚物,部分非靶杂交、等)不会导致形成RNA-DNA异源双链;并且因此防止NEAR反应的进展。在通过移除3’聚合酶延伸‘帽’,结合至互补核苷酸序列后,将仅扩增这些模板。这将导致增加水平的NEAR反应的特异性和敏感性。
本发明的模板寡核苷酸包括在包括以下的NEAR反应中:(1)靶核酸分子;(2)包含一定数量的与靶核酸分子互补的寡核苷酸和可以由切口酶切割的并且由4-15个RNA核苷酸(其中一个是有RNA酶倾向的)组成的位点的两种模板寡核苷酸分子;(3)dNTP;(4)链置换聚合酶;(5)切口酶;以及(6)DNA-RNA异源双链RNA切口酶和3’末端聚合酶延伸帽。因此,本发明提供了使用这些组分来定量靶核酸分子的方法。
所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及具有3’末端聚合酶延伸帽的DNA-RNA异源双链切口酶(例如RNA酶H);产生包括至少一部分结合靶序列的模板寡核苷酸的可检测扩增子。
靶核酸分子
本发明的方法和组合物对于鉴定测试样品中的靶核酸分子是有用的。从包括靶核酸分子的几乎任何样品扩增靶序列,这些样品包括但不局限于:包括真菌、孢子、病毒、或细胞(例如原核细胞、真核细胞)的样品。在特定实施例中,本发明的组合物和方法检测番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)、马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus)、丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv Tomato)、番茄疮痂病辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv Vesicatoria)、链格孢属(Alternaria spp)、分支孢子菌属(Cladosporium spp)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)、以及香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum)。示例性测试样品包括体液(例如血液、血清、血浆、羊水、唾液、尿、脑脊液、淋巴液、泪液、粪便、或胃液),组织浸出物,培养基(例如其中已经生长细胞,例如病原体细胞的液体),环境样品,农产品或其他食品,以及它们的提取物,DNA鉴定标签。如果希望,在融入NEAR反应之前,使用典型地用于从生物样品分离核酸分子的任何标准方法纯化样品。
在一个实施例中,引物/模板寡核苷酸扩增病原体的靶核酸,以检测样品中病原体的存在。示例性病原体包括真菌、细菌、病毒和酵母。可以通过鉴定测试样品中编码病原体蛋白(例如毒素)的核酸分子来检测此类病原体。实例性毒素包括但不局限于黄曲霉毒素、霍乱毒素、白喉毒素、沙门氏菌毒素、志贺毒素、肉毒梭菌毒素、内毒素、以及霉菌毒素。对于环境应用,测试样品可以包括水,空气过滤器的液体提取物,土样,建筑材料(例如干壁、吊顶板、墙板、织物、壁纸、和铺地物),环境化验标本,或任何其他样品。
在本文披露的一个实施例中,引物/模板寡核苷酸扩增在分子育种实验中用作内部对照的植物的靶核酸,这些实验例如面向改进植物的抗旱性、植物的除草剂抗性、对有害昆虫进食的抗性。在此减少至实践的这样内部对照靶核酸的一个实例是来自玉米的ADH1基因(醇脱氢酶1)。
靶核酸分子包括双链的和单链的核酸分子(例如DNA、RNA、和本领域已知的能够与在此描述的核酸分子杂交的其他核碱基聚合物)。适合用本发明的可检测寡核苷酸探针或可检测引物/模板寡核苷酸检测的RNA分子包括但不局限于包括靶序列的双链的和单链的RNA分子(例如信使RNA、病毒RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA和微小RNA前体、以及siRNA或在此描述的或本领域已知的其他RNA)。适合用本发明的可检测寡核苷酸探针或可检测引物/模板寡核苷酸检测的DNA分子包括但不局限于双链的DNA(例如基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、病毒DNA、以及合成的双链的DNA)。单链DNA靶核酸分子包括例如病毒DNA、cDNA、以及合成的单链的DNA、或本领域已知的其他类型的DNA。
总之,用于检测的靶序列长度是在10和100个核苷酸之间(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个核苷酸)。选择靶核酸分子的GC含量为小于约45%、50%、55%、或60%。希望地是,这样选择靶序列和切口酶,使得靶序列并不包含用于将包括在反应混合物中的任何切口酶的切口位点。
可检测寡核苷酸探针
本发明提供了使用非可扩增性、可检测寡核苷酸探针,在NEAR反应中靶核酸分子或其扩增子的定量检测,这些探针包括至少一个聚合酶捕获分子(例如使寡核苷酸能够结合靶核酸分子,但是不能支持利用所述可检测寡核苷酸探针作为靶的模板延伸的核苷酸修饰或其他部分)。不愿受理论束缚,并不允许聚合酶进展的一个或更多个部分的存在可能使聚合酶捕获在对寡核苷酸而言的非核酸骨架添加物中或通过复制型核酸酶的停滞(即C3-间隔子、破坏的DNA碱基、其他间隔子部分、O-2-Me碱基)。因此在NEAR反应的过程期间,这些构建体防止或减少探针的不合理扩增。这使它们与常规检测探针区别开,这些常规检测探针必须在NEAR反应结束时添加以防止它们的扩增。
对于实时定量NEAR反应而言,已经证明常规检测探针是不切实际的。如果将常规检测探针合并进入NEAR反应,则这些常规检测探针与靶一起被同时扩增。由于在反应开始时,检测探针的起始分子的数目,这些检测分子的扩增掩蔽了合理的靶扩增的检测。
本发明提供了包括至少一个聚合酶捕获分子的非可扩增性、可检测的多核苷酸探针。本发明的聚合酶捕获分子包括但不局限于通过复制型DNA聚合酶阻断引物-模板延伸的核苷酸修饰或其他部分,由此防止检测分子的扩增;但是可以允许与靶分子或靶分子的扩增的拷贝的正确杂交或核苷酸间距。在一个实施例中,本发明的可检测寡核苷酸探针包括防止或减少检测分子的不合理扩增的3碳间隔子(C3-间隔子)。
在一个实施例中,本发明的可检测寡核苷酸探针是包括可检测部分的发卡形寡核苷酸。在另一个实施例中,非可扩增性、可检测的多核苷酸探针是一端上包括荧光团并且相反端上包括淬灭染料的发卡形寡核苷酸。发卡的环包括与靶序列互补的、并且能够与其杂交的序列。通过位于环的任一侧上的互补臂序列的退火,形成了发卡的茎。荧光团和淬灭分子共价地连接在每个臂的相反端上。当所述可检测寡核苷酸探针处于发卡构型,荧光的和淬灭的分子彼此靠近,由此导致荧光共振能量转移(FRET)以及荧光团的荧光淬灭。当可检测寡核苷酸探针遇到靶分子,发生杂交;环结构被转化为具有靶分子的双链体构象,引起荧光团和淬灭分子分开,导致荧光(Tyagi(泰尔吉)等人Nature Biotechnology(自然生物技术)14:1996年3月,303-308)。
可检测寡核苷酸探针特异性针对靶序列。在一个实施例中,可检测寡核苷酸探针包括具有与互补核苷酸的增强的结合亲和力的一个或更多个修饰的核苷酸碱基。碱基的实例包括但不限于锁核酸(LNA)、2′氟代酰胺、以及2′OMe RNA酰胺(还发挥聚合酶捕获分子的功能)。可以用不同颜色的荧光团合成本发明的可检测寡核苷酸探针,并且可以将其设计为几乎与任何靶序列杂交。鉴于其非凡的特异性,本发明的非可扩增性、可检测的多核苷酸探针被用来检测样品中的单个靶核酸分子,或与其中每一个结合不同靶核酸分子的可检测寡核苷酸探针结合使用。因此,本发明的非可扩增性、可检测的多核苷酸探针可以用来检测同一反应中的一种或更多种靶核酸分子,允许同时定量这些靶。本发明涵盖了与在此描述的可检测寡核苷酸探针相关联的此类荧光团的使用。
非可扩增性、可检测的多核苷酸探针的使用
在用于在切口和延伸扩增反应(NEAR)中定量靶核酸分子的方法中,非可扩增性、可检测的多核苷酸探针是有用的。所述方法涉及:在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合靶核苷酸分子上的互补序列)、切口酶、以及在适合的缓冲液和dNTP存在下的可检测寡核苷酸探针,产生包含至少一部分所述靶核酸分子的扩增子;并且在反应期间,基于来自反应中的探针分子的荧光强度,通过定量与靶核酸分子杂交的寡核苷酸探针,实时确定反应中存在的靶核酸分子的水平。有利地,此类方法对于实时监测NEAR是有用的。
总之,本发明的非可扩增性、可检测的多核苷探针是包括在NEAR反应中的,所述NEAR反应包括:(1)靶核酸分子;(2)包含一定数量的、与靶核酸分子互补的寡核苷酸和可以由切口酶切割的位点的两种模板寡核苷酸分子;(3)dNTP;(4)链置换聚合酶;(5)切口酶。因此,本发明提供了使用这些组分来定量靶核酸分子的方法。
NEAR测定
本发明提供了在NEAR测定中扩增的靶核酸分子的检测。本领域已知并且在此描述了此类测定。参见,例如美国专利公开2009/0081670、PCT申请2009/012246、以及美国专利号7,112,423和7,282,328,将它们中的每一个以其全文结合在此。在此描述的方法中有用的聚合酶能够催化核苷酸的并入,来延伸结合至靶核酸分子的寡核苷酸(例如引物/模板寡核苷酸或其他引物)的3′羟基末端。此类聚合酶包括嗜热的那些和/或能够链置换的那些。在此描述的方法中有用的聚合酶缺乏5′-3′外切酶活性,所述活性会另外降解置换的单链的核酸链。聚合酶还具有逆转录酶活性(例如Bst(大片段)DNA聚合酶的衍生物、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶)。示例性聚合酶包括但不要局限于Bst DNA聚合酶I的Bst大片段、大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow(克列诺)片段)、Klenow(克列诺)片段(3′-5′外切-)、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Deep VentR(外切-)DNA聚合酶、Deep VentR DNA聚合酶、Therminator、Therminator II DNA聚合酶、AmpliTherm DNA聚合酶、SP6 DNA聚合酶。逆转录酶(RT)的以下非限制性实例可以被用于本方法的反应,以便在检测RNA序列时改进性能:OmniScript(凯杰公司)、SensiScript(凯杰公司)、MonsterScript(艾普中心公司(Epicentre))、Transcriptor(罗氏公司(Roche))、HIV RT(安博公司(Ambion))、SuperScript III(英杰公司(Invitrogen))、ThermoScript(英杰公司)、Thermo-X(英杰公司)、ImProm II(普洛麦格公司(Promega))。
切口酶结合双链DNA中的识别序列并且切割双链螺旋中的一个链。切口酶可以在它们的识别位点的上游或下游,抑或在所述酶的识别位点内进行切割。对于在此披露的方法,只有切割识别位点下游的顶部链(top strand)的切口酶可以用来通过聚合酶开始底物DNA切口和切口延伸的重复循环,以驱动引物-模板之间的靶核酸片段的指数式扩增。理想地,切口酶是在与聚合酶相同的反应条件下发挥功能。在本发明的优选实施例中,切口酶是热稳定的,并且在50℃和60℃之间有活性。对于在此披露的方法有用的示例性切口酶包括但不局限于Nt.BspQI(NEB公司)、Nt.BspD6I、Nt.BsmAI(NEB公司)、Nt.AlwI(NEB公司)、Nt.BbvCI(NEB公司)、N.Bst9I(茜布酶公司(Sibenzyme))、以及Nt.BstNBI(NEB公司)。
NEAR反应典型地包括核苷酸,例如像双脱氧核苷三磷酸(dNTP)。还可以在包含可检测部分的dNTP存在下进行所述反应,所述可检测部分包括但不局限于放射性同位素标记(例如32P、33P、125I、35S),酶(例如碱性磷酸酶),荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)),生物素,亲和素,异羟基洋地黄毒苷,抗原,半抗原,或荧光染料。NEAR反应进一步包括提供切口酶和聚合酶活性的某些盐和缓冲液。
有利地,在基本上等温条件下进行NEAR反应,其中在扩增反应的过程期间,反应的温度差不多是恒定的。因为所述温度并不需要在高温和低温之间循环,所以可以在将难以进行常规PCR的条件下进行NEAR反应。典型地,约在35℃和90℃之间(例如35℃、37℃、42℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、或85℃)进行所述反应。有利地,并不要求温度维持为具有大的精确度。一定的温度可变性是可接受的。
解链温度(Tm)的和反应速率的改性剂还可以被用于降低寡核苷酸的解链温度,例如(但不局限于)乙二醇和甘油。此外,DNA聚合酶反应速率改性剂(例如dNTP和镁的浓度)可用来改变反应速率,以达到更大的量化精度。
本发明提供了实时监测NEAR反应的方法,利用了如以上所述的和在专利US 007112423B2和US 20090017452A1中的NEAR扩增策略。在一个实施例中,定量NEAR利用与已知量的对照扩增一起进行的靶核酸扩增。可以基于对照的来源(外源的或内源的对照),将靶核酸的量计算为绝对量化或相对量化(半定量的)。
未知核苷酸序列的定量可以通过以下达到:在分开组的反应中抑或在相同的反应中,将未知核苷酸序列与一系列已知靶序列的对数阈值扩增进行比较;抑或作为产生阈值的内部内源性或外源的共扩增产物,表明阳性结果(如果未知核苷酸序列超过阈值)抑或阴性结果(如果未知核苷酸序列未超过阈值)。
应用
本发明提供了等温扩增NEAR反应的实时检测,所述反应可以提供起始靶核酸的量的定量测量。在人类诊断学中,本发明的组合物和方法是有用的,其中希望迅速的定量答案(例如在15、10、9、8、7、6、5min或更短之下时间内的可检测扩增)。在具体实施例中,本发明提供了在临床环境下,NEAR反应测定在人类诊断学中的使用。在其他实施例中,本发明提供了在其中访问热循环设备不可用或将是过于昂贵的诊断领域工作中NEAR反应测定的使用。仍在其他实施例中,本发明提供了在其中希望迅速定量答案的学术环境下NEAR反应测定的使用。
试剂盒
本发明还提供了用于扩增靶核酸分子的试剂盒。对于检测或定量得自受试者的生物样品中的靶核酸,此类试剂盒是有用的。例如,如在此描述,本发明的试剂盒可以包括一种或更多种聚合酶、正向和反向引物-模板、以及一种或更多种切口酶。在要扩增靶的情况下,可以将一种或两种切口酶包括在所述试剂盒中。在要扩增多个靶序列、并且针对那些靶序列设计的引物-模板包括用于同一切口酶的切口酶位点的情况下,则可以包括一种或两种切口酶。在由不同的切口酶识别引物-模板的情况下,可以将多种切口酶包括在所述试剂盒中,例如3种或更多种。
在一个方面,本发明提供了用于核酸扩增的试剂盒,所述试剂盒包括DNA聚合酶;初级引物-模板、次级引物-模板、针对引物-模板内的切口酶识别位点具有特异性的切口酶、以及脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)(例如在包含对于扩增来说充足的组分的缓冲溶液中)。在不同实施例中,初级引物-模板和次级引物-模板每一个具有与靶序列互补或基本上互补的3’-端特异性识别区域序列(其中所述端部特异性识别区域包括一个或更多个2’修饰的核苷酸);包含3’-端特异性识别区域序列的上游的切口酶识别位点的5’-端尾部序列;以及切口酶结合位点的上游(5’)的稳定化序列。
在一个方面,本发明的试剂盒包括所有NEAR反应组分的均匀混合物,这些反应组分除了靶核酸以外包括但不局限于dNTP、正向和反向引物-模板、切口酶、聚合酶、可检测靶特异性多核苷酸探针、反应缓冲液和稳定子。
本发明的试剂盒还可以包括在任何数量的分开的容器,袋,管(例如<0.2ml、0.2ml、0.6ml、1.5ml、5.0ml、>5.0ml),小瓶,微量滴定板(例如<96-孔、96-孔、384-孔、1536-孔、>1536-孔),ArrayTape,以及类似物中的一种或更多种组分,或这些组分可以合并在此类容器的不同组合中。在不同实施例中,所述试剂盒进一步包括能够结合至参考序列并且能够将其扩增的一对引物-模板寡核苷酸。仍在其他实施例中,所述试剂盒包括包含引物-模板寡核苷酸的无菌容器;此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋子、囊、泡罩包装、或本领域已知的其他适合的容器。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合容纳核酸的其他材料制成。
例如,试剂盒的组分可以存在于一个或更多个容器中,例如,所有组分可以存在于一个容器中,或例如,酶可以存在于与模板分开的容器中。例如,这些组分可以是干燥的(例如干渣)、冻干的(例如干饼)或在适合的缓冲液(例如化学上稳定的、热稳定的)中。例如可以通过冷冻干燥、真空和离心辅助的干燥和/或环境干燥制备干燥组分。在不同实施例中,聚合酶和切口酶在单个容器中处于冻干的形式,并且模板是在不同的容器中的冻干的抑或冷冻干燥的,或在缓冲液中。在一些实施例中,聚合酶、切口酶、和模板在单个容器中处于冻干的形式。在其他实施例中,聚合酶和切口酶可以分开到不同容器中。
例如,试剂盒可以进一步包括反应中使用的dNTP、或修饰的核苷酸、用于所述反应的槽或其他容器、或用于使冻干的组分再水化的一小瓶水或缓冲液。例如,使用的缓冲液可以适合聚合酶的和切口酶的活性这二者。
本发明的试剂盒还可以包括用于进行在此描述的一种或更多种方法的指导书,和/或在此描述的一种或更多种组合物或试剂的说明书。指导书和/或说明书以是印刷的形式并且可以包括在试剂盒插入物中。试剂盒还可以包括提供此类指导书或说明书的网络位置的书面说明。
试剂盒可以进一步包括用于检测方法(例如实时的或终点的)的试剂,例如像杂交探针或DNA结合染料。试剂盒可以进一步包括用于检测方法的试剂,例如像用于以下的试剂:FRET、横流装置、试纸、荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标、或聚苯乙烯珠粒。检测组分可以合并进入横流装置。可以在护理地点使用横流装置。
除非另外指明,本发明的实践采用很好地处在熟练业内人士的知识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。在文献中充分解释了此类技术,例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)”,第二版(Sambrook(萨姆布鲁克),1989);“Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)”(Gait(吉特),1984);“Animal Cell Culture(动物细胞培养)”(Freshney(弗雷谢尼),1987);“Methods in Enzymology(酶学方法)”“Handbook ofExperimental Immunology(实验免疫学手册)”(Weir(伟尔),1996);“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)”(Miller(米勒)和Calos(卡洛斯),1987);“Current Protocolsin Molecular Biology(现代分子生物学实验指南)”(Ausubel(奥苏贝尔),1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction(PCR:聚合酶链式反应)”,(Mullis(穆利斯),1994);“Current Protocols in Immunology(免疫学实验室指南)”(Colligan(科里根),1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产,并且按照这样,可以被考虑用于制造和实践本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何进行和使用测定、筛选和本发明的治疗方法的完整的披露和说明,而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。
实例
目前,NEAR反应被用来快速并且等温地检测样品中是否存在靶寡核苷酸。由于技术限制,常规NEAR方法不适合实时量化靶寡核苷酸,这至少部分归因于样品中非靶分子的不合理扩增,所述不合理扩增模糊了靶扩增子的检测和准确量化。本发明通过提供并不易受不合理扩增影响的可检测引物/模板,提供了克服这些限制的组合物和方法。在一个实施例中,可量化NEAR测定采用包含在NEAR反应期间,防止或减少非靶分子的不合理扩增的一个或更多个2’-O-Me修饰的引物。目前,NEAR扩增测定的设计局限于靶核酸内的非常短的区域,所述区域具有非常接近的至少一个天然发生的切口酶识别位点。起始自所述切口位点的链置换合成提供了具有短靶特异性区域的引物/模板可以结合并且开始多个循环的切口/聚合酶延伸靶扩增反应的单链的靶DNA分子。本发明通过利用具有更长靶特异性区域的引物/模板,提供了克服所述限制的组合物和方法,这因此能够在没有链置换合成的帮助的条件下,在扩增反应的第一期,进行50℃至60℃之间的链侵入。引物-模板中的更长靶特异性区域伴随以下缺点:提供了形成具有可以开始非特异性扩增产物的合成的可延伸3’-端的非特异性DNA杂交的更大可能性。本发明的组合物通过在五个连续的修饰的核苷酸的3’-末端嵌段外延伸2’-修饰的核苷酸的放置,用来利用2’-修饰的和未修饰的核苷酸的交替序列覆盖整个靶特异性区域,减轻了所述缺点。
实例1:包含2’--O-甲基核苷酸的引物-模板寡核苷酸减少或消除了NEAR扩增中的背景信号。
当在无靶核酸输入(即无靶对照;NTC)的情况下进行NEAR扩增时,尽管没有模板,但还是产生了信号。因此,背景信号的产生具有减小使用NEAR扩增的靶核酸定量的准确性的潜能。假设部分由于通过引物/模板寡核苷酸形成了引物-二聚物,产生了背景信号。不束缚于理论,包含2’修饰的核苷酸的聚合酶捕获结构可以被用来减少或消除引物/模板的分子间的和/或分子内的相互作用(例如引物-二聚物形成),并且由此减少或消除了NEAR测定中的背景信号。
示例性聚合酶捕获实体结构从5’至3’包括稳定子序列、切口酶识别序列、切口酶间隔子序列、以及靶特异性识别序列,所述靶特异性识别序列包括一个或更多个2’修饰的核苷酸(2’-O-甲基核苷酸)。在靶特异性识别序列中存在两个或更多个2’修饰的核苷酸的情况下,这些2’修饰的核苷酸可以是连续的(例如2、3、4、5或更多个2’修饰的核苷酸)。使用经由氟信标的检测,评价马铃薯环腐病菌(Cms)合成的双链的靶DNA分子的滴定。连续地从设计为具有靶序列和单个切口位点的、合成的250个碱基对的DNA“长聚物”的母液稀释靶DNA。
在含2’-O-甲基修饰的模板的反应中,抑制了无靶对照(NTC)中的信号(图2A)。标准曲线展示了使用2’-O-甲基模板反应的广动态范围(图2B)。经由HPLC/质谱法分析了无靶对照反应的样品(10μl),并且证实了背景扩增产物的抑制(图2C)。衍生自使用未修饰的寡核苷酸的反应的光谱示出了由衍生自与未反应的模板一起的非特异性背景产物的多种扩增产物组成的复杂光谱(图2C,左侧小图)。衍生自使用2’-O-甲基修饰的寡核苷酸的反应的光谱示出由在非特异性背景产物不存在的情况下的未反应的模板组成的简单光谱(图2C,右侧小图)。
为了研究含2’-O-甲基修饰的模板的反应对生物样品的扩增的影响,将基因组的马铃薯环腐病菌(Cms)用作靶DNA。由检测双链的DNA的SYBR绿(图3A和3B)或检测特异性产物的分子信标(图4A和4B),检测扩增的产物。用DNA寡核苷酸模板进行标准反应(图3A和4A),并且用在靶特异性识别序列中的3’-端包含5个连续的2’-O-甲基核苷酸的嵌段的寡核苷酸进行含2’-O-甲基修饰的模板的反应(DNAble反应)(图3B和4B)。在含2’-O-甲基修饰的模板的反应中,抑制了无靶对照(NTC)中的信号(图3B和4B),而在不存在靶DNA时,在表明背景产物产生的无靶对照(NTC)中观察到显著的信号(图4A和4B)。
因此,这些结果表明,包含2’-O-甲基核苷酸的引物减少或消除了NEAR扩增中的背景信号。
实例2:引物/模板寡核苷酸中2’-O-甲基核苷酸的定位改变了NEAR反应的检测时间和效率。
在特异性区域内的不同位置具有2’-O-甲基修饰的核苷酸的示例性多聚酶捕获实体被用于NEAR扩增反应,并且研究了它们的反应动力学。具体地,研究的引物/模板包括在特异性区域的3’端或在特异性区域的5’端放置有五个2’-O-甲基核苷酸的嵌段的一对寡核苷酸(切口位点下游2个核苷酸)(图5)。一式两份,用3’-端上的或在切口位点之后的第3个核苷酸处开始并且持续5个碱基的2’-O-甲基核苷酸的嵌段,或如表明的这两个结构的混合物进行标准反应。靶DNA是基因组的马铃薯环腐病菌(Cms)。检测是基于在100nM的终浓度的分子信标。
在引物/模板寡核苷酸的特异性区域内的不同位置具有2’-O-甲基修饰的核苷酸的反应速率修改实体展示了不同的扩增动力学(图6)。与具有在切口位点之后的第3个核苷酸开始的五个2’-O-甲基核苷酸的嵌段的引物/模板相比(“切口+2”模板;430sec),使用具有在3’端的五个2’-O-甲基核苷酸的嵌段的引物/模板的反应示出了减小的检测时间(“末端”模板;170sec)。因此,假设两种引物/模板寡核苷酸的比率可以用于操控用于‘调谐’反应的检测时间和/或反应的效率。具有变化的比率的“末端”模板:“切口+2”模板的反应示出了在两种模板的检测时间之间的中间检测时间(图6)。额外地,使用增加比率的“末端”模板:“切口+2”模板,收缩了曲线并且移位了曲线的斜率。因此,示出了引物/模板寡核苷酸中的2’修饰的核苷酸的定位和具有差别定位的2’修饰核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率改变了NEAR反应的检测时间和效率。本发明至少是部分基于这些发现。
实例3:利用具有长靶特异性区域的引物-模板,NEAR测定中非特异性扩增的完全抑制
利用两个替代组的正向和反向引物-模板(TS3&TS3),设计了用于量化玉米醇脱氢酶1基因(ADHl)的NEAR测定。没有适合的切口酶识别位点能够位于距离玉米gDNA中的靶序列区域的上游或下游500个核苷酸以内。全部两组引物-模板都特征在于能够与靶DNA进行链侵入介导的杂交的更长靶互补区域(分别是16和19个核苷酸)。在第一组(TS3)中,正向和反向引物-模板的靶互补区域包含就在3’-末端脱氧核苷酸上游的5个连续的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸的嵌段。靶序列互补区域的剩余部分包括开始于所述切口位点下游五个核苷酸(正向引物-模板)或四个核苷酸(反向引物-模板)的、未修饰的脱氧核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸交替的序列。第二组(TS6)的引物-模板特征在于仅有邻近3’-末端未修饰的脱氧核苷酸的五个2’-O-甲基核糖核苷酸的嵌段,而靶互补区域的剩余部分仅包括未修饰的脱氧核苷酸。
使用3.84 U Wannstart 2.0 Bst DNA聚合酶1(NEB公司)、10 K拷贝的合成的玉米ADHl靶DNA、0.3 mM dNTP、3 U Nt.BstNBI切口酶、200 nMROX/BHQ-标记的ADHl分子信标探针、0.5X SYBR绿染料(生物技术(LifeTechnologies))、1000 nM TS3或TS6反向引物-模板和100 nM TS3或TS6正向引物-模板,在以下中建立十微升NEAR反应:50 mM Tris pH8.0、15mM(NH4)2SO4、15mM Na2SO4、和15mM MgSO4。由相同组分组成一组无靶DNA对照反应(NTC),其中没有合成的玉米ADHl靶DNA。在56℃孵育所有反应15分钟,并且在520 nm(SYBR绿)和610 nm(ROX)记录荧光信号。
比较在SYBR绿(图8)和ROX(图9)检测通道中的含靶DNA反应的扩增图与在SYBR绿检测通道(图10)中的NTC反应的扩增图
除非另外指明,使用以下方法和材料获得了在此报告的结果。
NEAR扩增反应
反应(50μl)包含15 mM MgSO4、0.3 mM dNTP、19.2单位的Bst聚合酶、15单位的n.BstNBI、1000 nM模板1、和200 nM模板2。靶DNA是基因组的马铃薯环腐病菌(Cms)或基于Cms序列的“长聚物”。在56℃,总体积10μl,将模板和靶一起预孵育30秒。在56℃,总体积40μl,将剩余组分的主混合物预孵育30秒。将主混合物与靶组合,并且在56℃孵育10分钟,其中在孵育期间,每10秒收集荧光检测(SYBR绿或分子信标)。用2分钟的95℃步骤,随后回到室温,将反应‘热灭活’。基于Biorad IQ5软件中的曲线拟合公式,确定针对每个反应的循环阈值(Ct)当量,并且使用微软Excel软件,将值描绘在图上。进行线性回归并且确定相关系数(R2)。
其他实施方案
从以上说明中,将明显的是,可以对在此所述的发明作出变更和修改以使其适应于不同用途和状况。此类实施例也处于以下权利要求书的范围内。
在变量的任何定义中对元素清单的引用在此包括将所述变量定义为任何单个元素或所列元素的组合(或子组合)。对在此的实施例的引用包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分组合的实施例。
所述申请可能与2011年8月9日提交的、要求2010年8月13日提交的美国临时申请号61/373,695的权益的国际专利申请号PCT/US 2011/047049相关,将其全部内容通过引用结合在此。
本说明书中提及的全部专利及出版物通过引用方式结合在此,这达到如同如同每个独立的专利及出版物具体地且单独地指明要通过引用结合在此的相同的程度。
Claims (49)
1.量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法,所述方法包括:
(a)在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,所述两种或更多种引物/模板寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中包含一个或更多个2’修饰的核苷酸;
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号,其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。
2.权利要求1所述的方法,其中所述2’修饰选自:2’-O-甲基、2′-甲氧基乙氧基、2′-氟代、2’-羟基、2′-烯丙基、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4′-巯基、4′-CH2-O-2′-桥、4′-(CH2)2-O-2′-桥、2′-LNA、以及2′-O-(N-氨基甲酸甲酯)或包含碱基类似物的那些。
3.权利要求1所述的方法,其中所述一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端。
4.权利要求1所述的方法,其中所述一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端。
5.权利要求4所述的方法,其中定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’末端的一个或更多个2’修饰的核苷酸与切口位点隔开1、2、3、4、5或更多个未修饰的核苷酸。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法,其中两个或更多个2’修饰的核苷酸是连续的。
7.权利要求3所述的方法,其中5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端。
8.权利要求4所述的方法,其中5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述检测步骤并不检测非靶分子的扩增子。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法,其中实时地进行所述方法。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述方法提供了确定在扩增前,生物样品中存在的核酸分子的量的半定量的和/或量阈值的方法。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法,其中将一个或更多个2’修饰的核苷酸定位为更接近与所述靶核酸分子互补的序列的5’端增加了扩增的检测时间。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法,所述方法进一步包括使用引物/模板寡核苷酸的比率,来提供生成自不同量的起始靶材料的反应产物的增加的分辨率。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法,所述方法进一步包括使用扩增速率改性剂,来提供生成自不同量的起始靶材料的反应产物的增加的分辨率。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子是DNA或RNA核酸分子。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述探针是SYBR绿或分子信标。
17.权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述探针是包含与靶序列互补的至少约10个核苷酸、可检测部分、以及聚合酶捕获分子的非可扩增性、可检测的多核苷酸探针,其中所述聚合酶捕获分子防止聚合酶在另外支持聚合酶活性的条件下扩增所述探针。
18.用于检测在单个反应的过程中产生的多种不同反应产物的方法,所述方法包括:
(a)在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,所述两种或更多种引物/模板寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中包含一个或更多个2’修饰的核苷酸;
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号,其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。
19.量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法,所述方法包括:
(a)在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种引物/模板寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,这两种引物/模板寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列,其中每个引物/模板寡核苷酸包含定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端的5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸;
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且
(c)检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号,其中所述信号表明在所述样品中存在的所述靶核酸分子或其扩增子的量。
20.权利要求18所述的方法,其中实时地进行步骤(c),以确定所述反应中存在的靶的量。
21.用于实时地监测切口和延伸扩增反应的方法,所述方法包括:
(a)在基本上等温条件下,使测试样品与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,所述两种或更多种引物/模板寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中包含一个或更多个2’修饰的核苷酸;
(b)产生包含至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子;并且
(c)实时地检测信号,由此定量所述一种或更多种靶核酸分子。
22.权利要求21所述的方法,其中所述测试样品包含病原体。
23.权利要求22所述的方法,其中所述病原体是病毒、细菌、酵母或真菌。
24.权利要求21所述的方法,其中所述测试样品是生物样品。
25.权利要求24所述的方法,其中所述生物样品是生物流体、细胞、或组织样品。
26.权利要求25所述的方法,其中所述生物流体是尿、精液、阴道分泌物、或粪便。
27.权利要求21所述的方法,其中所述测试样品是环境样品。
28.权利要求21所述的方法,其中实时地进行步骤(c)。
29.用于实时监测NEAR反应中靶核酸分子的方法,所述方法包括:
(a)在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸、切口酶、异源双链特异性的切口酶、以及可检测的多核苷酸探针,所述两种或更多种引物/模板寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中包含一个或更多个2’修饰的核苷酸;
(b)产生多个扩增子,这些扩增子包含结合所述可检测的寡核苷酸探针的靶序列;并且
(c)实时地检测信号,由此定量所述靶核酸分子。
30.用于实时监测测试样品中靶核酸分子的方法,所述方法包括:
(a)在基本上等温条件下,使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸、切口酶、修复酶或校正读码酶、以及可检测的多核苷酸探针,所述两种或更多种引物/模板寡核苷酸中的每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列,其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中包含一个或更多个2’修饰的核苷酸;
(b)产生多个扩增子,这些扩增子包含结合所述可检测的寡核苷酸探针的靶序列;并且
(c)实时地检测信号,由此定量所述靶核酸分子。
31.权利要求30所述的方法,其中所述测试样品包含病原体。
32.权利要求31所述的方法,其中所述病原体是病毒、细菌、酵母或真菌。
33.权利要求30所述的方法,其中所述测试样品是生物样品。
34.权利要求33所述的方法,其中所述生物样品是生物流体、细胞、或组织样品。
35.权利要求34所述的方法,其中所述生物流体是尿、精液、阴道分泌物、或粪便。
36.权利要求30所述的方法,其中所述测试样品是环境样品。
37.权利要求30所述的方法,其中实时地进行步骤(c)。
38.用于检测NEAR反应中的靶序列的试剂盒,所述试剂盒包含一个或更多个引物/模板寡核苷酸,以及用于本发明的方法中的引物/模板寡核苷酸的用途的说明书,这个或这些引物/模板寡核苷酸特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列并且在与所述靶核酸分子互补的序列中包含一个或更多个2’修饰的核苷酸。
39.分离的寡核苷酸,所述寡核苷酸从5’至3’包含,
i)第一区,以及
ii)第二区,
其中所述第一区包含切口酶识别序列;其中所述第二区包含特异性结合靶核酸分子上的互补序列的至少9个核苷酸;并且其中所述第二区包含一个或更多个2’修饰的核苷酸。
40.权利要求36所述的分离的寡核苷酸,其中所述2’修饰选自:2’-O-甲基、2′-甲氧基乙氧基、2′-氟代、2’-羟基、2′-烯丙基、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4′-巯基、4′-CH2-O-2′-桥、4′-(CH2)2-O-2′-桥、2′-LNA、以及2′-O-(N-氨基甲酸甲酯)或包含碱基类似物的那些。
41.权利要求39或40所述的分离的寡核苷酸,其中所述一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’末端。
42.权利要求39或40所述的分离的寡核苷酸,其中所述一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端。
43.权利要求42所述的分离的寡核苷酸,其中定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸与切口位点隔开1、2、3、4、5或更多个未修饰的核苷酸。
44.权利要求39-43中任一项所述的分离的寡核苷酸,其中两个或更多个2’修饰的核苷酸是连续的。
45.权利要求44所述的分离的寡核苷酸,其中连续的2’修饰的核苷酸的数目是2、3、4、5、或更多。
46.权利要求39-45中任一项所述的分离的寡核苷酸,其中所述切口酶识别序列是5’-GAGT-3’。
47.权利要求41所述的分离的寡核苷酸,其中5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端。
48.权利要求42所述的分离的寡核苷酸,其中5个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸定位在与所述靶核酸分子互补的序列的5’端。
49.分离的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸是图1中列出的一个。
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