RU2732589C2 - Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце - Google Patents
Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце Download PDFInfo
- Publication number
- RU2732589C2 RU2732589C2 RU2016138585A RU2016138585A RU2732589C2 RU 2732589 C2 RU2732589 C2 RU 2732589C2 RU 2016138585 A RU2016138585 A RU 2016138585A RU 2016138585 A RU2016138585 A RU 2016138585A RU 2732589 C2 RU2732589 C2 RU 2732589C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- acid molecule
- target
- sequence
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 144
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 144
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 138
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 68
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 67
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 67
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 63
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 claims description 63
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 61
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 61
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 59
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 38
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 38
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 34
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 29
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 124
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 97
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 96
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 91
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 239000000047 product Substances 0.000 description 52
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 32
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 29
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 20
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 14
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 101710187578 Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 10
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 10
- 230000036319 strand breaking Effects 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 8
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000004476 near response Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241001136168 Clavibacter michiganensis Species 0.000 description 6
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- UFEJKYYYVXYMMS-UHFFFAOYSA-N methylcarbamic acid Chemical compound CNC(O)=O UFEJKYYYVXYMMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- -1 but not limited to Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 1
- 241001430228 Clavibacter sepedonicus Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 244000115658 Dahlia pinnata Species 0.000 description 1
- 235000012040 Dahlia pinnata Nutrition 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004566 building material Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000021463 dry cake Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000009408 flooring Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000803 paradoxical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N pentofuranose Chemical group OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности представлены композиции и способы выявления и количественного определения целевого олигонуклеотида в образце в режиме реального времени. Эти способы совместимы с целевыми олигонуклеотидами, амплифицируемыми с помощью NEAR-реакции. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/621975, поданной 9 апреля 2012 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Технологии амплификации нуклеиновых кислот обеспечили средство для понимания сложных биологических процессов, выявления, идентификации и количественного определения патогенных и непатогенных организмов, судебно-криминалистических анализов, исследований взаимосвязи заболеваний и выявления трансгенных объектов - генетически модифицированных организмов и т.д. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой общеизвестную зависимую от термоциклирования технологию амплификации нуклеиновых кислот, используемую для амплификации ДНК, состоящую из циклов повторяемого нагревания и охлаждения реакционной смеси для плавления ДНК и ферментативной репликации ДНК с использованием ДНК-полимеразы. Количественная ПЦР в режиме реального времени (qPCR) представляет собой методику, используемую для количественного определения числа копий данной последовательности нуклеиновой кислоты в биологическом образце. В настоящее время в qPCR используют выявление продуктов реакции в режиме реального времени в ходе реакции и сравнивают профиль амплификации с амплификацией контрольных образцов, которые содержат известное количество нуклеиновых кислот в начале каждой реакции (или известное относительное количество нуклеиновых кислот по отношению к неизвестной тестируемой нуклеиновой кислоте). Результаты контрольных образцов используют для построения калибровочных кривых, как правило, на основе логарифмического участка калибровочных кривых реакции амплификации. Эти значения используют для интерполирования количества неизвестных нуклеиновых кислот на основе сравнения их кривых амплификации с количеством в стандартных контрольных образцах.
В дополнение к ПЦР, существуют системы амплификации, независимые от термоциклирования, или технологии изотермической амплификации нуклеиновых кислот, в том числе, без ограничения: реакция амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой (NEAR), амплификация по типу «катящегося кольца» (RCA), геликаза-зависимая амплификация (HDA), амплификация с формированием петель (LAMP), амплификация с замещением цепей (SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА), самоподдерживающаяся репликация последовательностей (3SR), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), изотермическая амплификация с одним праймером (SPIA), система Qβ-репликазы и рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA).
NEAR-амплификация имеет сходство с термоциклированием при ПЦР. Подобно ПЦР, при NEAR-амплификации используются олигонуклеотидные последовательности, комплементарные целевым последовательностям, называемые праймерами в ПЦР и матрицами в NEAR. Кроме того, NEAR-амплификация целевых последовательностей приводит к логарифмическому увеличению числа копий целевой последовательности так же, как это происходит в стандартной ПЦР. В отличие от стандартной ПЦР, NEAR-реакция развивается изотермически. В стандартной ПЦР температуру повышают, чтобы разделить две цепи ДНК. В NEAR-реакции в целевую последовательность нуклеиновой кислоты вводят одноцепочечные разрывы в определенных сайтах одноцепочечных разрывов, присутствующих в тестируемом образце. Полимераза проникает в сайт одноцепочечного разрыва и начинает синтез цепи, комплементарной нуклеотидной целевой последовательности, в которую был внесен одноцепочечный разрыв (добавленной экзогенной ДНК), наряду с замещением существующей комплементарной цепи ДНК. Процесс репликации с замещением цепей устраняет необходимость в повышенной температуре. На этой стадии молекулы матрицы/праймера отжигают с замещенной комплементарной последовательностью из добавленной экзогенной ДНК. Теперь полимераза производит достраивание с 3'-конца матрицы, создавая цепь, комплементарную ранее замещенной цепи. Вторую олигонуклеотидную матрицу/праймер затем отжигают с вновь синтезированной комплементарной цепью и достраивают, получая ДНК-дуплекс, который содержит последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв. Затем эта цепь подлежит внесению одноцепочечного разрыва с последующей достройкой с замещением цепи с помощью полимеразы, что ведет к получению ДНК-дуплекса, который имеет сайты одноцепочечного разрыва по обе стороны от исходной целевой ДНК. Сразу после его синтеза молекула продолжает амплифицироваться экспоненциально благодаря репликации замещенных цепей с новыми молекулами матриц. Кроме того, амплификация также протекает линейно от каждой молекулы продукта благодаря повторным операциям синтеза путем ник-трансляции в сайтах одноцепочечного разрыва, введенных с помощью матриц. Результатом является очень быстрое увеличение интенсивности амплификации целевого сигнала, намного более быстрое, чем в случае термоциклирования при ПЦР, при этом результаты амплификации появляются в течение менее чем десяти минут.
Однако количественное определение является проблематичным. Оптимальная производительность системы NEAR в режиме реального времени зависит от образования и амплификации специфического продукта. Известно, что в системах NEAR в реакциях с помощью ферментов образуются неспецифические фоновые продукты на существенных уровнях в дополнение к специфическому продукту. Эти фоновые продукты могут служить амплифицируемыми объектами, и их образование может препятствовать образованию специфического продукта. Хотя можно сконструировать детекторные зонды, специфичные к желаемой целевой молекуле (и, таким образом, специфический продукт можно выявить в смешанном фоне), неспецифические фоновые продукты на существенных уровнях блокируют компоненты реакции, которые могли быть в противном случае использованы для амплификации специфического продукта. Таким образом, блокировка компонентов реакции в связи с образованием неспецифических фоновых продуктов приводит к реакции, которая является субоптимальной. Это особенно нежелательно, когда целевая нуклеиновая кислота изначально характеризуется очень низким относительным содержанием и когда для надежного выявления целевой молекулы требуется высокооптимизированная реакция. Кроме того, субоптимальная реакция может не отображать истинное количество целевой нуклеиновой кислоты, даже если оно может быть выявлено. Было бы выгодно создавать оптимизированные NEAR-реакции, в которых устраняется амплификация неспецифических фоновых продуктов. Это могло бы обеспечить реакцию, которая подходит для количественного определения с помощью системы на основе калибровочных кривых или с помощью относительного количественного определения.
Кроме того, обычной практикой является оценка NEAR-реакций с помощью масс-спектрометрии. Высокие уровни фоновых продуктов могут мешать интерпретации данных масс-спектрометрии. Если, например, реакционная смесь содержит фоновые продукты, один или несколько продуктов, полученных в результате неспецифической амплификации (от родственных, но неодинаковых целевых молекул), и специфический продукт, было бы сложно выявить эти полученные из матрикса продукты среди фоновых продуктов. Устранение фоновых продуктов приводит к четкому определению производительности/специфичности конкретного анализа.
Дополнительно, высокие уровни фоновых продуктов могут препятствовать оптимальной амплификации в заведомо дуплексных или мультиплексных реакциях. В то время как многочисленные дифференциально меченные детекторные зонды совместимы с выявлением в режиме реального времени, до сих пор существует проблема ограничений для реагентов из-за образования неспецифических продуктов. Это особенно справедливо для дуплексных или мультиплексных реакций, поскольку в этих реакциях используется более чем две матрицы/праймера, которые потенциально могут формировать смешанные группы фоновых продуктов. Реакционная система NEAR, в которой устраняется амплификация фоновых продуктов, также обеспечивает условия для выявления в заведомо дуплексных или мультиплексных реакциях в режиме реального времени. Было бы очень выгодным обеспечить средство для устранения амплифицируемых фоновых продуктов, максимизируя, таким образом, потенциал образования специфических продуктов в NEAR-реакциях. Было бы желательно, если бы количественный результат мог быть представлен благодаря точному контролю хода реакции в режиме реального времени.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как описано ниже, в настоящем изобретении представлены композиции и способы для выявления целевого олигонуклеотида в образце в режиме реального времени, которые снижают или устраняют образование фоновых продуктов, позволяя проводить количественное определение целевого олигонуклеотида в образце. Эти способы совместимы с целевыми олигонуклеотидами, амплифицируемыми с помощью NEAR-реакции. Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаружении того, что специфические продукты в одноплексных NEAR-реакциях могут быть образованы без образования фоновых продуктов. Реакционные композиции и способы предусматривают относительное количественное определение в неизвестных тестируемых образцах, дуплексные реакции и мультиплексные реакции и создание калибровочных кривых для абсолютного количественного определения неизвестных тестируемых образцов.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ количественного определения специфического продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой, при этом способ включает: приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой с недостатком экзонуклеазной активности, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидного праймера/матрицы имеет один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; образование ампликонов, имеющих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и выявление сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где сигнал указывает на количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ выявления множества различных продуктов реакции, получаемых в ходе одной реакции, при этом способ включает: приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой с недостатком экзонуклеазной активности, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидного праймера/матрицы имеет один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; образование ампликонов, имеющих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и выявление сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где сигнал указывает на количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
В конкретном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ количественного определения специфического продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой, при этом способ включает: приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой с недостатком экзонуклеазной активности, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц имеет по меньшей мере приблизительно 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, которые расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты (например, 3'-конце олигонуклеотида), или прилегают к нему; образование ампликонов, имеющих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и выявление сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где сигнал указывает на количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ контроля реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой в режиме реального времени, при этом способ включает: приведение тестируемого образца в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой с недостатком экзонуклеазной активности, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц имеет один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; образование ампликонов, имеющих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и выявление сигнала в режиме реального времени с количественным определением, таким образом, целевой(целевых) молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ контроля в режиме реального времени целевой молекулы нуклеиновой кислоты в NEAR-реакции, при этом способ включает: приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой с недостатком экзонуклеазной активности, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, специфичным для гетеродуплексов ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц имеет один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; образование ампликонов, имеющих целевую последовательность, связывающуюся с выявляемым олигонуклеотидным зондом; и выявление сигнала в режиме реального времени с количественным определением, таким образом, целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ контроля в режиме реального времени целевой молекулы нуклеиновой кислоты в тестируемом образце, при этом способ включает: приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, репаративным ферментом или ферментом для исправления ошибок и выявляемым полинуклеотидным зондом, где каждый из олигонуклеотидных праймеров/матриц имеет один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; образование ампликонов, имеющих целевую последовательность, связывающуюся с выявляемым олигонуклеотидным зондом, и выявление сигнала в режиме реального времени с количественным определением, таким образом, целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор для выявления целевой последовательности в NEAR-реакции, при этом набор содержит один или несколько олигонуклеотидных праймеров/матриц, которые специфически связываются с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты и имеют один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов в последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и инструкцию для применения олигонуклеотидного праймера/матрицы в способах по настоящему изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенный олигонуклеотид, имеющий в направлении 5'-3' первый участок и второй участок, где первый участок имеет последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв; где второй участок имеет по меньшей мере 9 или более нуклеотидов (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более смежных нуклеотидов), специфически связывающихся с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты; и где второй участок имеет один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов. В других вариантах осуществления выделенный олигонуклеотид является одним из представленных на фигуре 1.
В различных вариантах осуществления аспектов, определенных в данном документе, олигонуклеотид (например, олигонуклеотидный праймер/матрица, выделенный олигонуклеотид) содержит модифицированный нуклеотид, в том числе 2'-модифицированный нуклеотид. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, 2'-модификация представляет собой один или несколько из следующего: 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-фтор, 2-гидроксил, 2-аллил, 2'-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тио, 4, -СН2-O-2'-мостик, 4'-(СН2)2-O-2'-мостик, 2'-LNA, 2'-алкил и 2'-O-(N-метилкарбамат), или модифицированный нуклеотид содержит аналог основания. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты (например, на 3'-конце олигонуклеотида), или прилегают к нему. В других вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, отделены от сайта одноцепочечного разрыва с помощью 1, 2, 3, 4, 5 или более немодифицированных нуклеотидов. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, два или более 2'-модифицированных нуклеотида являются смежными (2, 3, 4, 5 или более). В других вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, два или более 2'-модифицированных нуклеотида чередуются с немодифицированными нуклеотидами. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, представляет собой 5'-GAGTC-3'. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты (например, на 3'-конце олигонуклеотида), или прилегают к нему. В других вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, 2 или более нуклеотида с 2'-O-метильной модификацией, чередующихся с немодифицированными нуклеотидами, расположены на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты (т.е. конкретному целевому участку).
В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, на этапе выявления не выявляется ампликон нецелевой молекулы. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, способ выполняют в режиме реального времени. В определенных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, этап образования ампликонов выполняют в режиме реального времени (например, для определения количества целевой молекулы, присутствующей в реакционной смеси).
В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, способ представляет собой полуколичественный и/или количественный способ порогов для определения количества молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце до амплификации. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, расположение одного или нескольких 2'-модифицированных нуклеотидов ближе к 5'-концу последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, увеличивает время выявления в амплификации. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, способ дополнительно включает применение олигонуклеотидных праймеров/матриц в определенных соотношениях для обеспечения повышенной степени выявления продуктов реакции, получаемых из различных количеств исходного целевого материала. Было установлено, что увеличение соотношения олигонуклеотидных праймеров/матриц, имеющих один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов на 3'-конце последовательности распознавания, и олигонуклеотидных праймеров/матриц, имеющих один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов на 5'-конце последовательности распознавания, сужает кривую сигнала и изменяет наклон кривой.
В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, способ дополнительно включает применение модификатора скорости амплификации для обеспечения повышенной степени выявления продуктов реакции, получаемых из различных количеств исходного целевого материала. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, целевая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты ДНК или РНК. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, выявляемый зонд представляет собой SYBR Green или молекулярный маяк. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, выявляемый зонд представляет собой неамплифицируемый выявляемый полинуклеотидный зонд, имеющий по меньшей мере 10 нуклеотидов, комплементарных целевой последовательности, выявляемый фрагмент и молекулу, подавляющую активность полимеразы, где молекула, подавляющая активность полимеразы, предотвращает амплификацию зонда с помощью полимеразы в условиях, поддерживающих полимеразную активность в остальных случаях.
В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, тестируемый образец содержит патоген. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, патоген представляет собой вирус, бактерию, дрожжи или гриб. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, тестируемый образец представляет собой биологический образец. В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, биологический образец представляет собой клетку, образец ткани или биологическую жидкость (например, мочу, сперму, влагалищный секрет или кал). В различных вариантах осуществления любого аспекта, определенного в данном документе, тестируемый образец представляет собой пробу из окружающей среды.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для выявления целевой молекулы нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью NEAR-реакции. Композиции и изделия, определенные настоящим изобретением, выделяли или иным образом изготовляли с использованием примеров, представленных ниже. Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания и из формулы изобретения.
Определения
В данном раскрытии "включает", "включающий", "содержащий" и "имеющий" и т.п. могут иметь значение, определенное для них в патентном праве США, и могут означать "включает в себя", "включающий в себя" и тому подобное; "состоящий по существу из" или "состоит по существу из" также имеет значение, определенное в патентном праве США, и термин является неограничивающим, позволяя присутствие большего, чем то, что упомянуто, до тех пор, пока основные или новые характеристики того, что упомянуто, не изменятся благодаря присутствию большего, чем то, что упомянуто, но исключает варианты осуществления из предшествующего уровня техники.
Под "молекулой, подавляющей активность полимеразы" подразумевают фрагмент, связанный с полинуклеотидной матрицей/праймером, который предотвращает или существенно снижает продвижение полимеразы по полинуклеотидной матрице. Предпочтительно, фрагмент встроен в полинуклеотид. В одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент предотвращает продвижение полимеразы по матрице.
Под "полимеразной достройкой" подразумевают продвижение полимеразы вперед от доступной 3'-гидроксильной группы, при котором происходит встраивание поступающих мономеров по принципу комплементарности по отношению к противоположным им нуклеотидам в полинуклеотидной цепи матрицы.
Под "полимеразой с недостатком экзонуклеазной активности" подразумевают ДНК-зависимую ДНК-полимеразу или РНК-зависимую ДНК-полимеразу, которая не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью или которая обладает такой активностью на практически невыявляемых уровнях.
Под "аддуктом нуклеотида" подразумевают фрагмент, который ковалентно связан или иным образом присоединен к стандартному нуклеотидному основанию.
Применяемый в данном документе термин "выявляемый полинуклеотидный зонд" относится к любому по меньшей мере частично одноцепочечному полинуклеотиду, меченному выявляемым фрагментом с участком последовательности, комплементарным по меньшей мере одной цепи целевой последовательности, который высвобождает выявляемый сигнал из выявляемого фрагмента при связывании с целевой последовательностью, тогда как образование сигнала этим выявляемым фрагментом зависит от расщепления выявляемого полинуклеотидного зонда посредством неспецифической 5'-3'-экзонуклеазной активности. Примером "выявляемого полинуклеотидного зонда", применяемого в данном документе, является, без ограничения, флуоресцентный зонд типа молекулярного маяка, описанный в предшествующем уровне техники.
Применяемый в данном документе термин "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам, рибонуклеотидам или модифицированным нуклеотидам и полимерам на их основе в одно- или двухцепочечный форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные каркасные остатки или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые имеют такие же свойства связывания, как и эталонная нуклеиновая кислота, и которые превращаются в ходе метаболизма аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, 2'-модифицированные рибонуклеотиды (например, 2'-O-метилрибонуклеотиды, 2'-F-нуклеотиды).
Применяемый в данном документе "модифицированный нуклеотид" относится к нуклеотиду, который имеет одну или несколько модификаций нуклеозида, нуклеинового основания, пентозного кольца или фосфатной группы. Например, модифицированные нуклеотиды исключают рибонуклеотиды, содержащие аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, уридинмонофосфат и цитидинмонофосфат, и дезоксирибонуклеотиды, содержащие дезоксиаденозинмонофосфат, деокси-гуанозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат и дезоксицитидинмонофосфат. Модификации включают таковые, встречающиеся в природе, которые являются результатом модификации ферментами, модифицирующими нуклеотиды, такими как метилтрансферазы. Модифицированные нуклеотиды также включают синтетические или не встречающиеся в природе нуклеотиды. Нуклеотиды с синтетическими или не встречающимися в природе модификациями в включают в себя таковые с 2'-модификациями, например, содержащие 2'-алкил, такой как 2'-O-метил и 2'-метоксиэтокси, 2'-фтор, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тио, 4'-СН2-O-2'-мостик, 4'-(СН2)2-O-2'-мостик, 2-LNA и 2'-O-(N-метилкарбамат), или таковые, содержащие аналоги оснований.
Под "заменой основания" подразумевают введение заместителя полимера на основе нуклеиновых оснований, которое не вызывает существенного нарушения гибридизации между комплементарными нуклеотидными цепями.
Под "специфическим продуктом" подразумевают полинуклеотидный продукт, полученный в результате гибридизации олигонуклеотидных матриц с комплементарной целевой последовательностью и последующей достройки целевой последовательности, опосредованной полимеразой.
Под "реакцией амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой" подразумевают чередующиеся циклы внесения одноцепочечных разрывов и достройки, приводящие к амплификации полинуклеотида, представляющего интерес.
Под "практически изотермическими условиями" подразумевают нахождение при одной температуре или в узком диапазоне температур, существенные изменения в котором не происходят. В одном варианте осуществления реакцию, выполняемую в практически изотермических условиях, выполняют при температуре, которая изменяется лишь на приблизительно 1-5°С (например, изменяется на 1, 2, 3, 4 или 5 градусов). В другом варианте осуществления реакцию выполняют при одной температуре в пределах рабочих параметров используемого прибора.
Под "ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв" подразумевают полипептид, способный распознавать конкретную структуру в двухцепочечных молекулах нуклеиновой кислоты и связываться с ней, а также разрушать фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами в одной цепи при связывании с ее распознаваемой конкретной структурой с предоставлением, таким образом, свободной 3'-гидроксильной группы в концевом нуклеотиде выше сайта одноцепочечного разрыва, от которой может быть произведена достройка с помощью полимеразы с недостатком экзонуклеазной активности.
Под "сайтом одноцепочечного разрыва" подразумевают положение "разрушенной" фосфодиэфирной связи в одной цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, подвергаемой гидролизу с помощью фермента, вносящего одноцепочечный разрыв.
Под "ампликоном" подразумевают полинуклеотид или множество полинуклеотидов, образующихся в ходе амплификации полинуклеотида, представляющего интерес. В одном из примеров ампликон образуют в ходе полимеразной цепной реакции.
Под "полуколичественным" подразумевают обеспечение оценки относительного количества на основе внутреннего контроля.
Под "количественным методом порогов" подразумевают обеспечение оценки количества на основе превышения либо отсутствия превышения количества сравнительного стандарта.
Под "модификаторами скорости амплификации" подразумевают средство, способное воздействовать либо на скорость полимеразной достройки, либо на скорость внесения одноцепочечных разрывов с помощью фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, либо на то и другое.
Под "контролем реакции" подразумевают выявление хода реакции. В одном варианте осуществления контроль хода реакции включает в себя выявление полимеразной достройки и/или выявление завершенной NEAR-реакции.
"Выявление" относится к выявлению присутствия, отсутствия или количества аналита, подлежащего выявлению.
Под "выявляемым фрагментом" подразумевают композицию, которая при связывании с молекулой, представляющей интерес, делает последнюю выявляемой с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунологических или химических средств. Например, применимые метки включают радиоактивные изотопы, магнитные гранулы, металлические гранулы, коллоидные частицы, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, обычно используемые в ELISA), биотин, дигоксигенин или гаптены.
Под "фрагментом" подразумевают часть молекулы нуклеиновой кислоты. Эта часть содержит предпочтительно по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от полной длины эталонной молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотида. Фрагмент может содержать 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов.
"Гибридизация" означает образование водородных связей, которое может представлять собой уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское образование водородных связей между комплементарными нуклеиновыми основаниями. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеиновыми основаниями, которые образуют пару путем образования водородных связей.
Под "выделенным полинуклеотидом" подразумевают нуклеиновую кислоту (например, ДНК), которая не содержит генов, которые во встречающемся в природе геноме организма, из которого получена молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, фланкируют данный ген. Термин, следовательно, включает, например, рекомбинантную ДНК, которая встроена в вектор, в автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус или в геномную ДНК прокариота или эукариота или которая существует в виде отдельной молекулы (например, в виде кДНК или фрагмента геномной ДНК или кДНК, полученных с помощью ПЦР или расщепления рестрикционной эндонуклеазой) независимо от других последовательностей. Кроме того, термин включает молекулу РНК, транскрибированную из молекулы ДНК, а также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность.
Термины "выделенный", "очищенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, в разной степени свободному от компонентов, которые обычно сопровождают его, как обнаруживается в его нативном состоянии. "Выделять" указывает на степень отделения от исходного источника или окружения. "Очищать" указывает на степень отделения, превышающую таковую для выделения. "Очищенный" или "биологически чистый" белок является в достаточной степени свободным от других материалов, так что любые примеси не оказывают существенного влияния на биологические свойства белка или не вызывают другие неблагоприятные последствия. То есть нуклеиновая кислота или пептид по настоящему изобретению являются очищенными, если они по сути свободны от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды, будучи полученными с помощью методик рекомбинантной ДНК, или химических предшественников или других химических веществ, будучи синтезированными химически. Чистоту и однородность, как правило, определяют с использованием методов аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Термин "очищенный" может обозначать, что нуклеиновая кислота или белок дает по сути одну полосу в геле для электрофореза. Для белка, который может быть подвергнут модификациям, например, фосфорилированию или гликозилированию, различные модификации могут давать различные выделенные белки, которые можно очищать по отдельности.
Как применяется в данном документе, "получение", как и "получение средства", включает синтезирование, закупку или приобретение средства иным способом.
Под "эталонным" подразумевают стандартное или контрольное состояние. Как очевидно для специалиста в данной области, подходящим эталоном является тот, где элемент изменяют для того, чтобы определить эффект элемента.
Под "гибридизацией" подразумевают образование пары между комплементарными полинуклеотидными последовательностями (например, гена, описанного в данном документе) или их частями в условиях различной жесткости с формированием двухцепочечной молекулы. (См., например, Wahl G.М. и S.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).
Под "субъектом" подразумевают млекопитающее, в том числе, без ограничения, человека или млекопитающее, отличное от человека, такое как бык, лошадь, собака, овца или кошка.
Под "целевой молекулой нуклеиновой кислоты" подразумевают полинуклеотид, подлежащий анализу. Такой полинуклеотид может представлять собой смысловую или антисмысловую цепь целевой последовательности. Термин "целевая молекула нуклеиновой кислоты" также относится к ампликонам исходной целевой последовательности.
Диапазоны, представленные в данном документе, понимаются как подразумевающие все значения внутри диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 понимают как включающий любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, включающей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.
Если специально не оговорено или не очевидно из контекста, применяемый в данном документе термин "или" следует понимать как включающий. Если специально не оговорено или не очевидно из контекста, применяемые в данном документе формы единственного числа понимают как означающие единственное или множественное число.
Если специально не оговорено или не очевидно из контекста, применяемый в данном документе термин "приблизительно" следует понимать как обозначающий величину в диапазоне нормального допустимого отклонения в данной области техники, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. Термин "приблизительно" можно понимать как обозначающий величину в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от заявленного значения. Если иное не ясно из контекста, все числовые значения, представленные в данном документе, изменяются с помощью термина "приблизительно".
Приведение перечня химических групп в любом определении переменной в данном документе включает определения этой переменной в качестве любой отдельной группы или комбинации перечисленных групп. Приведение варианта осуществления для переменной или аспекта в данном документе включает данный вариант осуществления в качестве любого отдельного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
Любые композиции или способы, представленные в данном документе, могут быть объединены с одним или несколькими из любых других композиций и способов, представленных в данном документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 изображены иллюстративные структуры объектов, подавляющих активность полимеразы. Черный = стабилизирующая последовательность, синий = последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, зеленый = спейсерная последовательность для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, красный = последовательность распознавания, специфичная для целевой молекулы, А = аденин, Т = тимин, G = гуанин, С = цитозин, U = урацил, mX = основание РНК с 2'-O-метильной модификацией. Подчеркнутое(подчеркнутые) основание(основания) определяет(определяют) модифицированный сегмент последовательности.
На фигурах 2А-2С изображена оценка динамического диапазона синтетической многомерной целевой ДНК Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms). Показаны иллюстративные результаты титрования синтетической "многомерной" целевой ДНК Cms и выявления с помощью флуориметрического маяка. NEAR-анализ для Cms, выполняемый без ввода целевой нуклеиновой кислоты, указан как контроль без целевой молекулы (NTC). Фигура 2А представляет собой график, показывающий, что сигнал в контролях без целевой молекулы (NTC) подавлен в реакционных смесях, содержащих праймер/матрицу с 2'-O-метильной модификацией. Фигура 2В представляет собой график, показывающий, что калибровочная кривая отображает широкий динамический диапазон с применением реакционных смесей с матрицами с 2'-O-метильной модификацией. Фигура 2С представляет собой сравнение иллюстративных данных масс-спектрометрии, показывающее устранение неспецифических продуктов амплификации в контролях без целевой молекулы (NTC) в системе анализа Cms с применением праймеров/матриц с 2'-O-метильной модификацией (правая панель) по сравнению с немодифицированными праймерами/матрицами (левая панель). Для определения эффекта праймеров/матриц с 2'-O-метильной модификацией в отношении образования фоновых продуктов образцы (10 мкл) реакционных смесей из контроля без целевой молекулы, изображенного на фигуре 2А, проанализировали с помощью ВЭЖХ/масс-спектрометрии. Данные масс-спектрометрии четко демонстрируют, что в присутствии праймеров/матриц с 2'-O-метальной модификацией выявляли присутствие только ожидаемых видов молекул, и продукты из смешанного фона, образующиеся в присутствии немодифицированных праймеров/матриц, устранены.
На фигуре 3 изображено устранение матрицами/праймерами с 2'-O-метильной модификацией сигнала фона в NEAR-анализе с использованием выявления с помощью SYBR Green. Показаны иллюстративные данные амплификации с использованием праймеров/матриц 2'-O-метильной модификацией и устранение неспецифических продуктов амплификации. Фигура 3А представляет собой график, показывающий, что в контролях без целевой молекулы (NTC) наблюдался существенный сигнал, что указывало на образование фонового продукта в отсутствие целевой ДНК. Фигура 3В представляет собой график, показывающий, что в реакционных смесях, содержащих матрицы с 2'-O-метильной модификацией, сигнал в контролях без целевой молекулы (NTC) был подавлен.
На фигуре 4 изображено устранение матрицами/праймерами с 2'-O-метильной модификацией сигнала фона в NEAR-анализе с использованием выявления с помощью молекулярного маяка. Показаны иллюстративные данные амплификации с использованием праймеров/матриц с 2'-O-метильной модификацией и устранение неспецифических продуктов амплификации. Фигура 4А представляет собой график, показывающий, что в контролях без целевой молекулы (NTC) наблюдался существенный сигнал, что указывало на образование фонового продукта в отсутствие целевой ДНК. Фигура 4В представляет собой график, показывающий, что в реакционных смесях, содержащих матрицы с 2'-O-метильной модификацией, сигнал в контролях без целевой молекулы (NTC) был подавлен.
На фигуре 5 изображены иллюстративные объекты, подавляющие активность полимеразы, которые при помощи праймеров/матриц с 2'-O-метильной модификацией или определенных соотношений праймеров/матриц с 2'-O-метильной модификацией можно применять для регуляции как времени до выявления, так и эффективности реакции, производя, таким образом, "настройку" реакции. Показаны схематические изображения иллюстративных матриц/праймеров с 2'-O-метильной модификацией для настройки конкретной реакции, в том числе праймера/матрицы, имеющего блок из пяти нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией на 3'-конце (матрица "Концевая"; слева) и праймера/матрицы, имеющего блок из пяти нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, начинающийся с 3-го нуклеотида после сайта одноцепочечного разрыва (матрица "Одноцепочечный разрыв +2"; справа). Каждое условие настройки включает конкретное соотношение прямых и обратных матриц в каждом наборе матриц, имеющих различные структуры.
На фигуре 6 изображены графики амплификации, демонстрирующие полезность матриц/праймеров с 2'-O-метильной модификацией для "настройки" конкретной реакции. Показаны иллюстративные данные амплификации с использованием праймеров/матриц с 2'-O-метильной модификацией. Все реакционные смеси (в двух повтори остях) содержали 10000 геномных эквивалентов ДНК Cms. Каждое условие настройки представляет конкретное соотношение прямых и обратных матриц в каждом наборе матриц, имеющих различные структуры. Красные круги демонстрируют сдвиг времени до выявления для каждого условия настройки. Кроме того, логарифмическая фаза для каждого условия сокращалась, и наклон кривой изменялся.
На фигуре 7 изображена конструкция праймеров/матриц из двух наборов (TS3 и TS6), применяемых в NEAR-анализе для амплификации фрагмента гена кукурузы ADH1. Специфичные для целевой молекулы участки в последовательностях праймеров/матриц из наборов TS3 и TS6 существенно длиннее (15-17 оснований), чем в праймерах/матрицах из наборов для типичных NEAR-анализов (от 9 до 12 оснований) из предшествующего уровня техники. В наборе праймеров/матриц TS3 перед блоком из 5 последовательных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, прилегающих к 3'-концу, находится вышерасположенный участок из нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, чередующихся с немодифицированными нуклеотидами, начинающийся с нуклеотида с 2'-O-метильной модификацией на 5 или на 4 нуклеотида ниже сайта одноцепочечного разрыва, соответственно. В отличие от TS3, в каждом из праймеров/матриц из набора TS6 есть только пять нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, которые образуют блок из последовательных нуклеотидов, прилегающих к немодифицированному 3'-концевому нуклеотиду.
На фигуре 8 показаны графики амплификации для анализа ADH1 с использованием двух наборов праймеров/матриц (TS3 и TS6), записанные в канале выявления для красителя SYBR Green.
На фигуре 9 показаны графики амплификации для реакционных смесей из того же анализа, записанные в канале для ROX.
На фигуре 10 изображены записанные графики амплификации для реакционных смесей из NTC-анализа ADH1. При сравнении результатов, показанных в фигурах 8 и 9, становится очевидным, что только набор праймеров/матриц TS3 обеспечивает получение ADH1-специфичного ампликона, тогда как сигнал, образуемый набором TS6, главным образом основан на неспецифической амплификации фоновых продуктов, выявляемых только с помощью SYBR Green.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении представлены композиции и способы, применимые для количественного определения целевой молекулы нуклеиновой кислоты в изотермической реакции. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для количественного определения целевой молекулы нуклеиновой кислоты в NEAR-реакции (например, в режиме реального времени).
Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на неожиданном обнаружении того, что олигонуклеотидные праймеры-матрицы, содержащие 2'-модифицированный нуклеотид (например, с 2'-O-метильной, 2'-фтормодификацией), снижают интенсивность незаконной амплификации с помощью производных ДНК-полимеразы I Bst с недостатком 5'-3'-экзонуклеазной активности или устраняют ее.
NEAR-реакция
NEAR-реакцию применяли в качестве реакции с анализом результатов по конечной точке, которая предусматривает неколичественное выявление целевых олигонуклеотидов. Обычный NEAR-анализ включает (1) целевую молекулу нуклеиновой кислоты; (2) две молекулы олигонуклеотидов, которые являются аналогами молекул праймеров в ПЦР, называемые "матрицами-праймерами", содержащие некоторое количество нуклеотидов, комплементарных целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и сайт, который может быть расщеплен ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв; (3) dNTP; (4) полимеразу с недостатком 5'-3'-экзонуклеазной активности, производящую замещение цепей; и (5) фермент, вносящий одноцепочечный разрыв. Современные способы количественного определения в NEAR-реакции, в частности, в режиме реального времени, являются неприемлемыми, отчасти из-за незаконной амплификации нецелевых молекул, присутствующих в образце, что может затруднять выявление целевых последовательностей в обычной NEAR-реакции. Например, существует постоянная нежелательная амплификация в NEAR-реакциях, которая приводит к образованию выявляемого сигнала в отсутствие целевой молекулы или с сигналами, которые неточно отражают количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в реакционной смеси. Хотя обеспечивается выявление продукта по конечной точке, обеспечить контроль реакции в режиме реального времени не удается.
Настоящее изобретение обеспечивает модифицированные олигонуклеотидные праймеры/матрицы, которые решают проблему точного определения количества целевой молекулы нуклеиновой кислоты в NEAR-реакции. Это особенно применимо для определения количества целевой молекулы нуклеиновой кислоты в NEAR-реакции в режиме реального времени. Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаружении того, что олигонуклеотидные праймеры-матрицы, содержащие 2'-модифицированный нуклеотид (например, с 2'-O-метильной, 2'-фтормодификацией), снижают интенсивность незаконной амплификации или устраняют ее без предотвращения достройки этих модифицированных праймеров-матриц в целях амплификации специфического продукта. Олигонуклеотидные праймеры/матрицы по настоящему изобретению применимы в NEAR-реакциях, включающих один или несколько из упомянутых выше компонентов NEAR.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает олигонуклеотидные праймеры-матрицы, содержащие 2'-модифицированный нуклеотид (например, с 2'-O-метильной, 2'-фтормодификацией), который расположен на 3'-конце праймера-матрицы или прилегает к нему. Неожиданно, нуклеотиды с 2'-O-метильной модификацией, расположенные в 3'-концевом участке праймера-матрицы, не только являются эффективными затравочными субстратами для производных ДНК-полимеразы I Bst с недостатком 5'-3'-экзонуклеазной активности в изотермических реакциях амплификации ДНК, но применение таких модифицированных праймеров-матриц полностью подавляет неспецифическую амплификацию с участием димеров праймеров. Это особенно неожиданно, поскольку общепринятый подход в области изотермической амплификации ДНК предполагает, что модифицированные нуклеотиды (например, рибонуклеотиды с 2'-O-метильной модификацией, немодифицированные рибонуклеотиды) могут быть введены только в 5'-концевой участок праймера/матрицы далеко от 3'-конца, поскольку размещение 2'-O-метила, а также рибонуклеотидов в пределах 6 нуклеотидов от 3'-конца праймера, как было продемонстрировано, ингибирует достройку праймера с помощью ДНК-полимераз (в качестве ссылки включена заявка на патент от Amersham и патент от Qiagen). Производные ДНК-полимеразы I Bst с недостатком 5'-3' экзонуклеазной активности, применяемые в NEAR и других методиках изотермической амплификации (LAMP), принадлежат к polA-типу бактериальных ДНК-полимераз, участвующих в процессах репарации ДНК с низкой точностью синтеза. В отличие от этого, высокоточную репликацию генома у бактерий катализируют холоферменты ДНК-полимеразы III типа DNAE и POLC, которые используют исключительно РНК-праймеры для инициирования репликации ДНК. В опубликованных источниках из предшествующего уровня техники различие между РНК- и ДНК-праймерами считалось одним из механизмов предотвращения вмешательства ферментов ДНК-полимераз I с высокой частотой ошибок в высокоточную репликацию генома. В связи с этим неожиданное обнаружение того, что производные ДНК-полимеразы I Bst могут эффективно использовать 2'-модифицированные рибонуклеотиды в качестве праймеров для синтеза ДНК, является примечательным и парадоксальным.
Конструкция праймера-матрицы
Иллюстративные структуры объектов, подавляющих активность полимеразы, в направлении 5'-3' содержат стабилизирующую последовательность, последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, спейсерную последовательность для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, и последовательность распознавания, специфичную для целевой молекулы, при этом последовательность распознавания, специфичная для целевой молекулы, содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов (например, содержащих 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-фтор, 2'-аллил, 2'-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 2'-гидроксил (РНК), 4'-тио, 4'-СН2-O-2'-мостик, 4'-(СН2)2-O-2'-мостик, 2'-LNA и 2'-O-(N-метилкарбамат)). Не ограничиваясь теорией, предположили, что встраивание одного или нескольких 2'-модифицированных нуклеотидов в участки распознавания делает эти модифицированные участки непригодными для того, чтобы служить в качестве матрицы для полимеразной достройки в неспецифических межмолекулярных и/или внутримолекулярных комплексах, образуемых посредством взаимодействий праймеров/матриц (например, в случае образования димеров праймеров), и, следовательно, ослабляет или устраняет сигнал фона в изотермической амплификации. 2'-модифицированный нуклеотид предпочтительно имеет основание, которое образует пару оснований с целевой последовательностью. В конкретных вариантах осуществления два или более 2'-модифицированных нуклеотида (например, 2, 3, 4, 5 или более 2'-модифицированных нуклеотидов) в участке распознавания, специфичном для целевой молекулы, являются смежными (например, блок из модифицированных нуклеотидов). В некоторых вариантах осуществления блок из 2'-модифицированных нуклеотидов расположен на 3'-конце участка распознавания, специфичного для целевой молекулы. В других вариантах осуществления блок из 2'-модифицированных нуклеотидов расположен на 5'-конце участка распознавания, специфичного для целевой молекулы. Если блок из 2'-модифицированных нуклеотидов расположен на 3'-конце участка распознавания, специфичного для целевой молекулы, 2'-модифицированные нуклеотиды могут быть отделены от сайта одноцепочечного разрыва с помощью одного или нескольких немодифицированных нуклеотидов (например, 2, 3, 4, 5 или более 2'-немодифицированных нуклеотидов). Заявители обнаружили, что расположение одного или нескольких 2'-модифицированных нуклеотидов или блока из 2'-модифицированных нуклеотидов изменяет кинетику амплификации. Если один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов или блок из 2'-модифицированных нуклеотидов расположены на 5'-конце участка распознавания или вблизи от него или близко к сайту одноцепочечного разрыва, в реакциях амплификации в режиме реального времени демонстрируется уменьшенное время до выявления. Кроме того, кривая сигнала сужается, и наклон кривой изменяется. Заявители также выявили, что в участках распознавания длиной свыше 12 нуклеотидов один блок из 5 последовательных 2'-модифицированных нуклеотидов является недостаточным для подавления неспецифической амплификации и, следовательно, весь участок распознавания, расположенный на расстоянии до 4 или 5 нуклеотидов ниже сайта одноцепочечного разрыва, должен быть замещен 2'-модифицированныгми нуклеотидами, чередующимися с модифицированными нуклеотидами.
В связанном варианте осуществления соотношения олигонуклеотидных праймеров/матриц, имеющих один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, можно применять для изменения времени до выявления и/или эффективности реакции для "настройки" реакций, что приводит к предсказуемому контролю над кинетикой амплификации. Увеличение соотношения олигонуклеотидных праймеров/матриц, имеющих один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов на 3'-конце последовательности распознавания, и олигонуклеотидных праймеров/матриц, имеющих один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов на 5'-конце последовательности распознавания, сужает кривую сигнала и изменяет наклон кривой. Предпочтительным является наличие возможности для "настройки" реакции с обеспечением средства для регуляции как времени до выявления, так и эффективности реакции. Относительное количественное определение с использованием внутреннего контроля требует выполнения двух важных условий. Во-первых, целесообразно иметь возможность изменять время до выявления в реакции, создавая неконкурентные условия реакции. Таким образом, при воздействии на контрольную реакцию с целью получения возможности выявления в более поздний момент времени (относительно целевой молекулы, представляющей интерес) контрольная реакция не препятствует реакции со специфической целевой молекулой, представляющей интерес, даже если целевая молекула, представляющая интерес, изначально характеризуется низким относительным содержанием. Во-вторых, для обеспечения расчета истинного относительного содержания требуется, чтобы контрольная реакция и реакция со специфической целевой молекулой имели равноценную эффективность. Путем контроля эффективности каждой реакции с помощью условий "настройки" реакции можно делать равноценными, что позволяет проводить удовлетворительные расчеты для относительного количественного определения. Настройку реакций можно применять для обеспечения равноценности эффективности амплификации целевой нуклеиновой кислоты и амплификации эталонной нуклеиновой кислоты (например, внутреннего стандарта) в количественной ПЦР (qPCR). Кроме того, кривые амплификации целевой нуклеиновой кислоты и внутреннего стандарта могут быть изменены таким образом, что выявление их продуктов амплификации будет разделено во времени, с обеспечением при этом такой же эффективности амплификации целевой нуклеиновой кислоты и амплификации внутреннего стандарта. Благодаря применению конкретных комбинаций и соотношений олигонуклеотидных структур в реакционной смеси можно создать условия, которые позволяют настроить производительность реакции.
В различных вариантах осуществления пары праймеров/матриц сконструированы в конфигурации "стебель-петля". 5'-конец олигонуклеотидного праймера/матрицы содержит самокомплементарный участок, которая формирует по меньшей мере часть стебля. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стебель дополнительно охватывает по меньшей мере часть последовательности распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, или всю ее. В других различных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, в праймерах-матрицах не является частью двухцепочечной структуры стебля, но находится в пределах главным образом одноцепочечной петли. Этот сайт распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, связан на 3'-конце с не имеющем вторичной структуры сайтом, включающим в себя сайт одноцепочечного разрыва, который связан на 3'-конце с последовательностью, комплементарной целевой последовательности. При необходимости последовательность, комплементарная целевой последовательности, может иметь вторичную структуру или может не иметь вторичной структуры. Наличие или отсутствие вторичной структуры, которая может содержать самокомплементарный участок, будет определяться для оптимизации конкретного NEAR-анализа.
В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению обеспечивают реакционную смесь для NEAR, которая содержит стандартные компоненты для NEAR, но также содержит фермент, способный вносить одноцепочечный разрыв в нуклеотид РНК, если он присутствует в гетеродуплексе с комплементарной цепью ДНК. В одном примере расщепляемый нуклеотид РНК будет присутствовать в нити из 4-15 нерасщепляемых нуклеотидов РНК (т.е. O-2-Ме-РНК) в направлении 5'-конца целевого комплементарного участка РТО, и 3'-конец олигонуклеотидной матрицы будет иметь 3'-концевой "кэп". Только после полной надлежащей гибридизации олигонуклеотидной матрицы молекула, расщепляющая гетеродуплекс (т.е. РНКаза Н), будет способна расщеплять основание РНК, предоставляя 3'-конец для достройки от него с помощью фермента ник-трансляции и позволяя проходить NEAR-реакции до завершения. Нарушение связывания с матрицей (димеры праймеров, частичная гибридизация с нецелевыми молекулами и т.д.) не будет приводить к формированию гетеродуплекса РНК-ДНК и, таким образом, предотвратит прохождение NEAR-реакции. Эти матрицы будут амплифицироваться только после связывания с комплементарной нуклеотидной последовательностью благодаря удалению 3'-"кэпа" для полимеразной достройки. Это приведет к повышению уровня специфичности и чувствительности NEAR-реакции.
Олигонуклеотидные матрицы по настоящему изобретению включены в реакционную смесь для NEAR, которая содержит (1) целевую молекулу нуклеиновой кислоты; (2) две молекулы олигонуклеотидных матриц, содержащие некоторое количество олигонуклеотидов, комплементарных целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и сайт, который может быть расщеплен ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв и содержит 4-15 нуклеотидов РНК, один из которых способен подвергаться действию РНКазы; (3) dNTP; (4) полимеразу, производящую замещение цепей; (5) фермент, вносящий одноцепочечный разрыв; и (6) фермент, вносящий одноцепочечный разрыв в РНК в гетеродуплексе ДНК-РНК, и 3'-концевой кэп для полимеразной достройки. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ применения этих компонентов для количественного определения целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
Способ включает приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя олигонуклеотидными матрицами, каждая из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв в гетеродуплекс ДНК-РНК (например, РНКазой Н), и 3'-концевым кэпом для полимеразной достройки; образование выявляемого ампликона, содержащего по меньшей мере часть олигонуклеотидной матрицы, которая связывается с целевой последовательностью.
Целевые молекулы нуклеиновых кислот
Способы и композиции по настоящему изобретению применимы для идентификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты в тестируемом образце. Целевые последовательности амплифицируют практически из любых образцов, которые содержат целевую молекулу нуклеиновой кислоты, включающих, без ограничения, образцы, содержащие грибы, споры, вирусы или клетки (например, прокариоты, эукариоты). В конкретных вариантах осуществления при помощи композиций и способов по настоящему изобретению выявляют Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pseudomonas syringae pv Tomato, Xanthomonas campestris pv Vesicatoria, Alternaria spp., Cladosporium spp., Fusahum oxysporum, Verticilium dahlia, Pseudomonas currugata, Erwina carotovora и Ralstonia solanacearwn. Иллюстративные тестируемые образцы включают биологические жидкости (например, кровь, сыворотку, плазму, амниотическую жидкость, мокроту, мочу, спинномозговую жидкость, лимфу, слезную жидкость, кал или желудочный сок), тканевые экстракты, культуральные среды (например, жидкость, в которой клетка, такая как клетка патогена, была выращена), пробы из окружающей среды, сельскохозяйственную продукцию или другие продукты питания и их экстракты, ДНК-метки для идентификации. При необходимости образец очищают перед включением в NEAR-реакцию с помощью любого стандартного способа, как правило, применяемого для выделения молекулы нуклеиновой кислоты из биологического образца.
В одном варианте осуществления олигонуклеотидные праймеры/матрицы амплифицируют целевую нуклеиновую кислоту патогена для выявления присутствия патогена в образце. Иллюстративные патогены включают грибы, бактерии, вирусы и дрожжи. Такие патогены могут быть выявлены с помощью идентификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок патогена, такой как токсин, в тестируемом образце. Иллюстративные токсины включают, без ограничения, афлатоксин, холерный токсин, дифтерийный токсин, токсин сальмонеллы, шига-токсин, токсин Clostridium botulinum, эндотоксин и микотоксин. Для путей применения в отношении окружающей среды тестируемые образцы могут включать воду, жидкие экстракты с воздушных фильтров, образцы почвы, строительные материалы (например, гипсокартон, потолочные плитки, стеновые плиты, ткани, обои и напольные покрытия), мазки из окружающей среды или любой другой образец.
В одном из вариантов осуществления, раскрытых в данном документе, олигонуклеотидные праймеры/матрицы амплифицируют целевую нуклеиновую кислоту растения, применяемого в качестве внутреннего контроля в экспериментах по молекулярной селекции, направленных на улучшение, например, устойчивости растений к засухе, устойчивости растений к гербицидам, к хищническому истреблению вредными насекомыми. Одним из примеров такой целевой нуклеиновой кислоты внутреннего контроля, применяемым на практике в данном документе, является ген ADH1 (алкогольдегидрогеназы 1) кукурузы.
Целевые молекулы нуклеиновых кислот включают в себя двухцепочечные и одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот (например, ДНК, РНК и другие полимеры на основе нуклеиновых оснований, известные в данной области техники, способные к гибридизации с молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе). Молекулы РНК, применимые для выявления с помощью выявляемого олигонуклеотидного зонда или выявляемого олигонуклеотидного праймера/матрицы по настоящему изобретению, включают в себя, без ограничения, двухцепочечные и одноцепочечные молекулы РНК, которые содержат целевую последовательность (например, информационную РНК, вирусную РНК, рибосомальную РНК, транспортную РНК, микроРНК и предшественники микроРНК и миРНК или другие РНК, описанные в данном документе или известные в данной области техники). Молекулы ДНК, применимые для выявления с помощью выявляемого олигонуклеотидного зонда или олигонуклеотидного праймера/матрицы по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения, двухцепочечную ДНК (например, геномную ДНК, плазмидную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК и синтетическую двухцепочечную ДНК). Целевые молекулы нуклеиновой кислоты в виде одноцепочечной ДНК включают, например, вирусную ДНК, кДНК и синтетическую одноцепочечную ДНК или другие типы ДНК, известные в данной области техники.
В целом, целевая последовательность для выявления имеет длину от 10 до 100 нуклеотидов (например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 нуклеотидов). Содержание GC в целевой молекуле нуклеиновой кислоты выбирают составляющим меньше, чем приблизительно 45, 50, 55 или 60%. Желательно выбирать целевую последовательность и ферменты, вносящие одноцепочечный разрыв, таким образом, что целевая последовательность не содержит сайтов одноцепочечных разрывов для любых ферментов, вносящих одноцепочечный разрыв, которые будут включены в реакционную смесь.
Выявляемые олигонуклеотидные зонды
Настоящее изобретение обеспечивает количественное определение целевых молекул нуклеиновых кислот или их ампликонов в NEAR-реакции с использованием неамплифицируемых выявляемых полинуклеотидных зондов, содержащих по меньшей мере одну молекулу, подавляющую активность полимеразы (например, модификацию нуклеотида или другой фрагмент, который делает олигонуклеотид способным к связыванию с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, но неспособным поддерживать достройку матрицы с использованием выявляемого олигонуклеотидного зонда в качестве мишени). Не желая ограничиваться теорией, предположили, что наличие одного или нескольких фрагментов, которые не позволяют продвижение полимеразы, вероятно, вызывает подавление активности полимеразы посредством добавлений к каркасу олигонуклеотида, отличных от нуклеиновых кислот, или из-за потери скорости репликативной полимеразы (т.е. посредством С3-спейсера, поврежденных оснований ДНК, другого спейсерного фрагмента, оснований с модификацией O-2-Ме). Эти конструкции, таким образом, предотвращают или снижают интенсивность незаконной амплификации зонда в ходе NEAR-реакции. Это отличает их от обычных детекторных зондов, которые должны добавляться в конце NEAR-реакции для предотвращения их амплификации.
Обычные детекторные зонды оказались непрактичными для количественной оценки в NEAR-реакции в режиме реального времени. Если обычные детекторные зонды включены в NEAR-реакцию, эти обычные детекторные зонды амплифицируются одновременно с целевой молекулой. Амплификация этих детекторных молекул скрывает должные целевые ампликоны от выявления в связи с количеством исходных молекул детекторного зонда в начале реакции.
Настоящее изобретение обеспечивает неамплифицируемый выявляемый полинуклеотидный зонд, который содержит по меньшей мере одну молекулу, подавляющую активность полимеразы. Молекула, подавляющая активность полимеразы, по настоящему изобретению включает, без ограничения, модификацию нуклеотида или другой фрагмент, который блокирует достройку праймера-матрицы с помощью репликативных ДНК-полимераз, тем самым предотвращая амплификацию выявляемых молекул; но может обеспечить правильную гибридизацию или расположение нуклеотидов для целевой молекулы или амплифицированных копий целевой молекулы. В одном из вариантов осуществления выявляемый олигонуклеотидный зонд по настоящему изобретению содержит 3-углеродный спейсер (С3-спейсер), который предотвращает или снижает интенсивность незаконной амплификации детекторной молекулы.
В одном из вариантов осуществления выявляемый олигонуклеотидный зонд по настоящему изобретению представляет собой олигонуклеотид в форме шпильки, содержащий выявляемый фрагмент. В другом варианте осуществления неамплифицируемый выявляемый полинуклеотидный зонд представляет собой олигонуклеотид в форме шпильки, который содержит флуорофор на одном конце и гасящий краситель на противоположном конце. Петля шпильки содержит последовательность, комплементарную целевой последовательностью и способную к гибридизации с ней. Стебель шпильки образуют путем отжига комплементарных последовательностей плеч, расположенных по обе стороны от петли. Флуорофор и гасящая молекула ковалентно связаны на противоположных концах каждого плеча. Если выявляемый олигонуклеотидный зонд находится в шпилечной конфигурации, флуоресцентная и гасящая молекулы находятся близко друг к другу, что, таким образом, приводит к резонансному переносу энергии флуоресценции (FRET) и гашению флуоресценции флуорофора. Когда выявляемый олигонуклеотидный зонд встречается с целевой молекулой, происходит гибридизация; структура петли преобразуется в конформацию дуплекса с целевой молекулой, что вызывает разделение молекулы флуорофора и гасящей молекулы, в результате чего происходит флуоресценция (Tyagi et al. Nature Biotechnology 14: March 1996, 303-308).
Выявляемые олигонуклеотидные зонды являются специфичными для целевой последовательности. В одном из вариантов осуществления выявляемый олигонуклеотидный зонд содержит одно или несколько модифицированных нуклеотидных оснований, обладающих повышенным сродством связывания с комплементарным нуклеотидом. Примеры оснований включают, без ограничения, закрытые нуклеиновые, кислоты (LNA), амидиты нуклеиновых кислот с 2'-фтормодификацией и амидиты РНК с модификацией 2'ОМе (также функционирующие в качестве молекул, подавляющих активность полимеразы). Выявляемые олигонуклеотидные зонды по настоящему изобретению можно синтезировать с различными цветными флуорофорами и можно конструировать для гибридизации практически с любой целевой последовательностью. С учетом его исключительной специфичности неамплифицируемый выявляемый полинуклеотидный зонд по настоящему изобретению применяют для выявления одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в образце или применяют в комбинации с выявляемыми олигонуклеотидными зондами, каждый из которых связывает отличную целевую молекулу нуклеиновой кислоты. Соответственно, неамплифицируемые выявляемые полинуклеотидные зонды по настоящему изобретению можно применять для выявления одной или нескольких целевых молекул нуклеиновой кислоты в одной и той же реакции, что позволяет производить одновременное количественное определение этих целевых молекул. Настоящее изобретение охватывает применение таких флуорофоров в сочетании с выявляемыми олигонуклеотидными зондами, описанными в данном документе.
Применение неамплифицируемых выявляемых полинуклеотидных зондов
Неамплифицируемые выявляемые полинуклеотидные зонды применимы в способах для количественной оценки целевой молекулы нуклеиновой кислоты в реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой (NEAR). Способ включает приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя олигонуклеотидными праймерами/матрицами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, и выявляемым олигонуклеотидным зондом в присутствии подходящего буфера и dNTP; образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и определение уровня целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в реакционной смеси, посредством количественной оценки олигонуклеотидного зонда, гибридизирующегося с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, в режиме реального времени в ходе реакции на основе интенсивности флуоресценции молекул зонда в реакционной смеси. Предпочтительно, такие способы применимы для контроля NEAR в режиме реального времени.
В целом, неамплифицируемые выявляемые полинуклеотидные зонды по настоящему изобретению включены в реакционную смесь для NEAR, которая содержит (1) целевую молекулу нуклеиновой кислоты; (2) две молекулы олигонуклеотидных матриц, содержащие некоторое количество олигонуклеотидов, комплементарных целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и сайт, который может быть расщеплен ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв; (3) dNTP; (4) полимеразу, производящую замещение цепей; и (5) фермент, вносящий одноцепочечный разрыв. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ применения этих компонентов для количественной оценки целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
NEAR-анализ
Настоящее изобретение обеспечивает выявление целевых молекул нуклеиновых кислот, амплифицированных в NEAR-анализе. Такой анализ известен в данной области техники и описан в данном документе. См., например, публикацию заявки на патент США №2009/0081670, заявку по РСТ №2009/012246 и патенты США №7112423 и №7282328, каждый из которых включен в данный документ во всей своей полноте. Полимеразы, применимые в способах, описанных в данном документе, способны катализировать встраивание нуклеотидов с достройкой от 3'-гидроксильного конца олигонуклеотида (например, олигонуклеотидного праймера/матрицы или другого праймера), связанного с целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Такие полимеразы включают те, которые являются термофильными, и/или те, которые способны к замещению цепей. Полимеразы, применимые в способах, описанных в данном документе, не обладают 5'-3'-экзонуклеазной активностью, которая в противном случае разрушала бы замещенную цепь одноцепочечной нуклеиновой кислоты. Полимеразы также обладают активностью обратной транскриптазы (например, производные ДНК-полимеразы Bst (большой фрагмент), ДНК-полимераза Therminator, ДНК-полимераза Therminator II). Иллюстративные полимеразы включают, без ограничения, большие фрагменты ДНК-полимеразы I Bst, ДНК-полимеразу I Е. coli (фрагмент Кленова), фрагмент Кленова (3'-5'-экзо-), ДНК-полимеразу Т4, ДНК-полимеразу Т7, ДНК-полимеразу Deep VentR. (экзо-), ДНК-полимеразу Deep VentR, Therminator, ДНК-полимеразу Therminator II, ДНК-полимеразу AmpliTherm, ДНК-полимеразу SP6. Следующие неограничивающие примеры обратных транскриптаз (RT) могут быть использованы в реакциях способа по настоящему изобретению для повышения производительности при выявлении последовательности РНК: OmniScript (Qiagen), Sensi Script (Qiagen), MonsterScript (Epicentre), Transcriptor (Roche), RT HIV (Ambion), Superscript III (Invitrogen), ThermoScript (Invitrogen), Thermo-X (Invitrogen), ImProm II (Promega).
Фермент, вносящий одноцепочечный разрыв, связывается с последовательностью распознавания в двухцепочечной ДНК и расщепляет одну цепь двухцепочечной спирали. Ферменты, вносящие одноцепочечный разрыв, могут производить расщепление выше или ниже сайта распознавания для них или в пределах сайта распознавания для фермента. В способах, раскрытых в данном документе, для запуска повторяющихся циклов внесения одноцепочечных разрывов в ДНК-субстрат и достройки от одноцепочечного разрыва с помощью полимеразы для проведения экспоненциальной амплификации целевого фрагмента нуклеиновой кислоты между праймерами-матрицами можно применять только те ферменты, вносящие одноцепочечный разрыв, которые расщепляют верхнюю цепь ниже сайта распознавания. В идеальном случае фермент, вносящий одноцепочечный разрыв, функционирует при тех же условиях реакции, что и полимераза. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фермент, вносящий одноцепочечный разрыв, является термостабильным и активным от 50°С до 60°С. Иллюстративные ферменты, вносящие одноцепочечный разрыв, применимые в способах, раскрытых в данном документе, включают, без ограничения, Nt.BspQI (NEB), Nt.BspD6I, Nt.BsmAI (NEB), Nt.AlwI (NEB), Nt.BbvCI (NEB), N.Bst9I (Sibenzyme) и Nt.BstNBI (NEB).
Реакционная смесь для NEAR обычно содержит нуклеотиды, такие как, например, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP). Реакцию можно также проводить в присутствии dNTP, которые содержат выявляемый фрагмент, в том числе, без ограничения, радиоактивную метку (например, 32Р, 33Р, 125I, 35S), фермент (например, щелочную фосфатазу), флуоресцентную метку (например, изотиоцианат флуоресцеина (FITC)), биотин, авидин, дигоксигенин, антигены, гаптены или флуорохромы. Реакционная смесь для NEAR дополнительно включает некоторые соли и буферы, которые обеспечивают активность фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, и полимеразы.
NEAR-реакцию предпочтительно проводят в практически изотермических условиях, когда температура реакции является более или менее постоянной в ходе реакции амплификации. Поскольку температура не должна изменяться циклически от верхней температуры до нижней температуры, NEAR-реакцию можно проводить в условиях, в которых осуществить обычную ПЦР было бы трудно. Как правило, реакцию проводят при температуре, составляющей приблизительно от 35°С до 90°С (например, при 35, 37, 42, 60, 65, 70, 75, 80 или 85°С). Поддержание температуры с высокой степенью точности предпочтительно не является существенным. Некоторая изменчивость температуры является приемлемой.
Для понижения температуры плавления олигонуклеотидов также можно применять модификаторы температуры плавления (Tm) и скорости реакции, такие как (без ограничения) этиленгликоль и глицерин. Кроме того, для изменения скорости реакции можно применять модификаторы скорости реакции с участием ДНК-полимеразы (такие как dNTP и концентрация магния), что приводит к большей точности количественного определения.
Настоящее изобретение обеспечивает способы контроля NEAR-реакции в режиме реального времени с использованием стратегии NEAR-амплификации, описанной выше и в патентах US 007112423 В2 и US 20090017452 A1. В одном варианте осуществления в количественной NEAR используется амплификация целевых нуклеиновых кислот наряду с контрольной амплификацией известного количества. Количество целевой нуклеиновой кислоты может быть рассчитано в виде абсолютного количественного определения или относительного количественного определения (полуколичественного) на основе источника контроля (экзогенного или эндогенного контроля).
Количественную оценку неизвестной нуклеотидной последовательности можно осуществить либо путем сравнения порогового значения из логарифмической фазы амплификации для неизвестной последовательности с таковым для серии известных целевых последовательностей в отдельной группе реакционных смесей или в той же реакционной смеси; или путем получения порогового значения от внутреннего эндогенного или экзогенного продукта совместной амплификации, которое указывает либо на положительный результат (если значение для неизвестной последовательности превышает пороговое значение), либо на отрицательный результат (если значение для неизвестной последовательности не превышает пороговое значение).
Пути применения
Настоящее изобретение обеспечивает контроль изотермической амплификации в NEAR-реакции в режиме реального времени, который может обеспечить количественную меру количества исходной целевой нуклеиновой кислоты. Композиции и способы по настоящему изобретению применимы в диагностике для человека, где желателен быстрый количественный ответ (например, выявляемая амплификация в течение до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 мин. или менее). В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение анализа на основе NEAR-реакции в диагностике для человека в клинических условиях. В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение анализа на основе NEAR-реакции в диагностике при выездной работе, где доступ к оборудованию для термоциклирования отсутствует или будет чрезмерно дорогим. В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение анализа на основе NEAR-реакции в условиях для научной работы, где желательны быстрые количественные ответы.
Наборы
Настоящее изобретение также обеспечивает наборы для амплификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты. Такие наборы применимы для выявления или количественной оценки целевой нуклеиновой кислоты в биологическом образце, полученном от субъекта. Наборы по настоящему изобретению могут содержать, например, одну или несколько полимераз, прямые и обратные праймеры-матрицы и один или несколько ферментов, вносящих одноцепочечный разрыв, описанных в данном документе. Если амплификации подлежит одна целевая последовательность, то в набор могут быть включены один или два фермента, вносящих одноцепочечный разрыв. Если амплификации подлежат несколько целевых последовательностей и праймеры-матрицы, сконструированные для этих целевых последовательностей, содержат сайты для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, для одного и того же фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, тогда могут быть включены один или два фермента, вносящих одноцепочечный разрыв. Если праймеры-матрицы распознаются разными ферментами, вносящими одноцепочечный разрыв, то в набор могут быть включены несколько ферментов, вносящих одноцепочечный разрыв, как, например, 3 или более.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор для амплификации нуклеиновых кислот, содержащий ДНК-полимеразу, первый праймер-матрицу, второй праймер-матрицу, фермент, вносящий одноцепочечный разрыв, со специфичностью к сайту распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, в праймерах-матрицах и дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) (например, в буферном растворе, содержащем компоненты, достаточные для амплификации). В различных вариантах осуществления каждый из первого праймера-матрицы и второго праймера-матрицы имеет последовательность 3'-концевого специфичного участка распознавания, комплементарную или практически комплементарную целевой последовательности, где концевой специфичный участок распознавания содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов; последовательность 5'-концевого хвоста, содержащую сайт распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, выше последовательностей 3'-концевого специфичного участка распознавания, и стабилизирующую последовательность выше (5') сайта связывания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв.
В одном аспекте наборы по настоящему изобретению содержат гомогенную смесь всех компонентов для NEAR-реакции, в том числе, без ограничения, dNTP, прямые и обратные праймеры-матрицы, фермент, вносящий одноцепочечный разрыв, полимеразу, выявляемый полинуклеотидный зонд, специфичный для целевой молекулы, буфер и стабилизаторы реакции, за исключением целевой нуклеиновой кислоты.
Наборы по настоящему изобретению могут также содержать один или несколько компонентов в любом количестве отдельных контейнеров, пакетов, пробирок (например, на <0,2 мл, 0,2 мл, 0,6 мл, 1,5 мл, 5,0 мл, >5,0 мл), флаконов, титрационных микропланшетов (например, на <96 лунок, 96 лунок, 384 лунки, 1536 лунок, >1536 лунок), ArrayTape и т.п., или компоненты могут быть объединены в различных комбинациях в таких контейнерах. В различных вариантах осуществления набор дополнительно включает пару олигонуклеотидных праймеров-матриц, способных к связыванию и амплификации эталонной последовательности. В других вариантах осуществления набор включает стерильный контейнер, содержащий олигонуклеотидные праймеры-матрицы; такие контейнеры могут быть коробками, ампулами, бутылками, флаконами, пробирками, мешками, сумками, блистерными упаковками или другой подходящей формой контейнеров, известных в данной области техники. Такие контейнеры могут быть изготовлены из пластика, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, применимых для хранения нуклеиновых кислот.
Компоненты набора могут, например, присутствовать в одном или нескольких контейнерах, например, все компоненты могут находиться в одном контейнере, или, например, ферменты и матрицы могут находиться в отдельных контейнерах. Компоненты могут, например, быть высушенными (например, сухой остаток), лиофилизированными (например, сухой осадок) или находиться в стабильном буфере (например, химически стабилизированном, термически стабилизированном). Сухие компоненты могут, например, быть получены путем лиофилизации, вакуумной сушки и сушки при помощи центрифужной сушилки и/или сушки при окружающей температуре. В различных вариантах осуществления полимераза и ферменты, вносящие одноцепочечный разрыв, находятся в лиофилизированной форме в одном контейнере, а матрицы являются либо лиофилизированными, подвергнутыми сублимационной сушке, или находятся в буфере в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления полимераза, ферменты, вносящие одноцепочечный разрыв, и матрицы находятся в лиофилизированной форме в одном контейнере. В других вариантах осуществления полимераза и фермент, вносящий одноцепочечный разрыв, могут быть разделены по разным контейнерам.
Наборы могут дополнительно включать, например, dNTP, применяемые в реакции, или модифицированные нуклеотиды, кюветы или другие контейнеры, применяемые для реакции, или флакон с водой или буфером для повторной гидратации лиофилизированных компонентов. Применяемый буфер может, например, подходить для активности как полимеразы, так и фермента, вносящего одноцепочечный разрыв.
Наборы по настоящему изобретению могут также содержать инструкции для выполнения одного или нескольких способов, описанных в данном документе, и/или описание одной или нескольких композиций или реагентов, описанных в данном документе. Инструкции и/или описания могут быть в печатной форме и могут быть включены во вкладыш для набора. Набор также может включать в себя письменное описание адреса в Интернете, по которому предоставляют такие инструкции или описания.
Наборы могут дополнительно включать реагенты, применяемые в способах выявления (например, в режиме реального времени или по конечной точке), такие как, например, габридизационные зонды или красители, связывающиеся с ДНК. Наборы могут дополнительно включать реагенты, применяемые в способах выявления, такие как:, например, реагенты, применяемые для FRET, устройства для анализа в горизонтальном потоке, указатели уровня, флуоресцентный краситель, коллоидные частицы золота, латексные частицы, молекулярный маяк или полистирольные гранулы. Компоненты выявления могут быть встроены в устройство для анализа в горизонтальном потоке. Устройство для анализа в горизонтальном потоке можно применять в месте наблюдения.
В практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иное, обычные методики молекулярной биологии (в том числе методики рекомбинантных молекул), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые вполне находятся в пределах компетенции специалиста в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, такой как "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology", "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Эти методики применимы к получению полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению, и, таким образом, могут рассматриваться в подготовке и практическом осуществлении настоящего изобретения. Особенно применимые методики для конкретных вариантов осуществления будут обсуждаться в следующих разделах.
Следующие примеры предложены таким образом, чтобы обеспечить специалиста в данной области полным раскрытием и описанием подготовки и применения анализа, скрининга и терапевтических способов по настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают своим изобретением.
ПРИМЕРЫ
В настоящее время NEAR-реакцию применяют для быстрого и изотермического выявления присутствия или отсутствия целевого олигонуклеотида в образце. В связи с техническими ограничениями обычные способы NEAR не подходят для количественной оценки целевых олигонуклеотидов в режиме реального времени по меньшей мере частично по причине незаконной амплификации нецелевых молекул в образце, которая препятствует выявлению и точному количественному определению целевых ампликонов. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы, которые преодолевают эти ограничения путем обеспечения выявляемых праймеров/матриц, которые не поддаются незаконной амплификации. В одном из вариантов осуществления в количественном анализе NEAR используют праймер, содержащий одну или несколько модификаций 2'-O-Ме, который предотвращает или снижает интенсивность незаконной амплификации нецелевых молекул в ходе NEAR-реакции. В настоящее время план анализа на основе NEAR-амплификации ограничен очень короткими участками в целевой нуклеиновой кислоте, которые имеют по меньшей мере один встречающийся в природе сайт распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, в непосредственной близости. Синтез с замещением цепей, инициированный в этих сайтах одноцепочечного разрыва, обеспечивает одноцепочечные целевые молекулы ДНК, с которыми праймеры-матрицы с короткими участками, специфичными для целевой молекулы, могут связываться и начинать циклы внесения одноцепочечных разрывов/полимеразной достройки в реакциях амплификации целевой молекулы. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы, которые преодолевают это ограничение путем использования праймеров-матриц с более длинными участками, специфичными для целевой молекулы, которые вследствие этого способны проникать в цепь в диапазоне от 50°С до 60°С во время первой фазы реакции амплификации без помощи синтеза с замещением цепей. Более длинные участки, специфичные для целевой молекулы, в праймерах-матрицах привносят недостаток, заключающийся в предоставлении большей полезной площади для формирования неспецифических гибридов ДНК с достраиваемыми 3'-концами, что может запустить синтез неспецифических продуктов амплификации. Композиции в настоящем изобретении ослабляют этот недостаток путем распространения размещения 2'-модифицированных нуклеотидов за пределы 3'-концевого блока из пяти последовательных модифицированных нуклеотидов с покрытием всего участка, специфичного для целевой молекулы, с использованием альтернативной последовательности из 2'-модифицированных и немодифицированных нуклеотидов.
Пример 1. Олигонуклеотидные праймеры-матрицы, содержащие нуклеотиды с 2'-О-метильной модификацией, ослабляют или устраняют сигнал фона в NEAR-амплификации
Если NEAR-амплификацию выполняют без ввода целевой нуклеиновой кислоты (т.е. в контролях без целевой молекулы; NTC), сигнал образуется, несмотря на отсутствие матрицы. Таким образом, образование сигнала фона способно снижать точности количественного определения целевой нуклеиновой кислоты с помощью NEAR-амплификации. Было высказано предположение, что сигнал фона образовывался, в частности, посредством формирования димеров праймеров олигонуклеотидными праймерами/матрицами. Не ограничиваясь теорией, предполагают, что структуры, подавляющие активность полимеразы, содержащие 2'-модифицированные нуклеотиды, можно применять для ослабления или устранения межмолекулярных и/или внутримолекулярных взаимодействий праймеров/матриц (например, формирования димеров праймеров), и, таким образом, ослабления или устранения сигнала фона в NEAR-анализе.
Иллюстративные структуры объектов, подавляющих активность полимеразы, в направлении 5'-3' содержат стабилизирующую последовательность, последовательность распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, спейсерную последовательность для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, и последовательность распознавания, специфичную для целевой молекулы, при этом последовательность распознавания, специфичная для целевой молекулы, содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов (например, рибонуклеотиды с 2'-O-метильной модификацией). Если в последовательности распознавания, специфичной для целевой молекулы, присутствуют два или более 2'-модифицированных нуклеотида, то 2'-модифицированные нуклеотиды могут быть смежными (например, 2, 3, 4, 5 или более 2'-модифицированных нуклеотидов). Титрование синтетической двухцепочечной целевой молекулы ДНК Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms) оценивали с помощью выявления посредством флуоресцентного маяка. Целевую ДНК подвергали серийному разведению из исходного раствора синтезированной "многомерной" ДНК в 250 пар оснований, которую сконструировали с целевой последовательностью и одним сайтом одноцепочечного разрыва.
Сигнал в контролях без целевой молекулы (NTC) был подавлен в реакционных смесях, содержащих матрицы с 2'-O-метильной модификацией (фигура 2А). Калибровочная кривая отображает широкий динамический диапазон с использованием реакционных смесей с матрицами с 2'-O-метильной модификацией (фигура 2В). Образцы (10 мкл) реакционных смесей из контроля без целевой молекулы проанализировали с помощью ВЭЖХ/масс-спектрометрии, и подтвердили подавление образования фоновых продуктов амплификации (фигура 2С). Спектры, полученные в реакциях с применением немодифицированных олигонуклеотидов, показали сложный спектр, образованный несколькими продуктами амплификации, полученными из неспецифических фоновых продуктов, вместе с непрореагировавшими матрицами (фигура 2С, левая панель). Спектры, полученные в реакциях с применением олигонуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, показали простой спектр, образованный непрореагировавшими матрицами без присутствия неспецифических фоновых продуктов (фигура 2С, правая панель).
Для изучения эффекта реакционных смесей, содержащих матрицы с 2'-O-метильной модификацией, в отношении амплификации биологического образца геномную ДНК Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms) применяли в качестве целевой ДНК. Амплифицированные продукты выявляли с помощью SYBR Green, который выявляет двухцепочечную ДНК (фигуры 3А и 3В), или молекулярных маяков, которые выявляли специфический продукт (фигуры 4А и 4В). Стандартные реакции выполняли с олигонуклеотидными ДНК-матрицами (фигуры 3А и 4А), а реакции, включающие матрицы с 2'-O-метильной модификацией (DNAble), выполняли с олигонуклеотидами, содержащими блок из 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией на 3'-конце в последовательности распознавания, специфичной для целевой молекулы (фигуры 3В и 4В). Сигнал в контролях без целевой молекулы (NTC) был подавлен в реакционных смесях, содержащих матрицы с 2'-O-метильной модификацией (фигуры 3В и 4В), тогда как в контролях без целевой молекулы (NTC) наблюдался существенный сигнал (фигуры 4А и 4В), что указывало на образование фонового продукта в отсутствие целевой ДНК.
Таким образом, эти результаты указывают на то, что праймеры, содержащие нуклеотиды с 2'-O-метильной модификацией, ослабляют или устраняют сигнал фона в NEAR-амплификации.
Пример 2. Размещение нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией в олигонуклеотидных праймерах/матрицах изменяет время до выявления и эффективность NEAR-реакций
Иллюстративные объекты, подавляющие активность полимеразы, имеющие нуклеотиды с 2'-O-метильной модификацией в различных положениях внутри участка специфичности, применяли в реакциях NEAR-амплификации, и изучали их кинетику реакции. В частности, изученные праймеры/матрицы содержали пару олигонуклеотидов, имеющих блок из пяти нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, расположенных на 3'-конце участка специфичности или на 5'-конце участка специфичности (на 2 нуклеотида ниже сайта одноцепочечного разрыва) (фигура 5). Стандартные реакции выполняли в двух повторностях с блоком из нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, расположенным на 3'-конце или начинающимся с 3-го нуклеотида после сайта одноцепочечного разрыва и охватывающим 5 оснований, или со смесью этих двух структур, как указано. Целевая ДНК была геномной ДНК Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms). Выявление было основано на молекулярном маяке в конечной концентрации 100 нМ.
Объекты, модифицирующие скорость реакции, имеющие нуклеотиды с 2'-O-метильной модификацией в различных положениях внутри участка специфичности олигонуклеотидного праймера/матрицы, отображали различную кинетику амплификации (фигура 6). В реакциях, в которых применяются праймеры/матрицы, имеющие блок из пяти нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией на 3'-конце, показано уменьшенное время до выявления (матрица "Концевая"; 170 с) по сравнению с праймером/матрицей, имеющим блок из пяти нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, начинающийся с 3-го нуклеотида после сайта одноцепочечного разрыва (матрица "Одноцепочечный разрыв +2"; 430 с). Таким образом, предположили, что соотношения двух олигонуклеотидных праймеров/матриц можно применять для регуляции времени до выявления и/или эффективности реакции для "настройки" реакций. В реакциях с разными соотношениями матрица "Концевая" : матрица "Одноцепочечный разрыв +2" показано промежуточное время до выявления, значение которого находится между значениями для данных двух матриц (фигура 6). Кроме того, с увеличением соотношения матрица "Концевая" : матрица "Одноцепочечный разрыв +2" кривая сужалась, а наклон кривой изменялся. Таким образом, было показано, что расположение 2'-модифицированных нуклеотидов в олигонуклеотидных праймерах/матрицах и соотношение олигонуклеотидных праймеров/матриц с по-разному расположенными 2'-модифицированными нуклеотидами изменяли время до выявления и эффективность NEAR-реакций. Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на данных обнаружениях.
Пример 3. Полное подавление неспецифической амплификации в NEAR-анализах с использованием праймеров-матриц с длинными участками, специфичными для целевой молекулы
NEAR-анализ для количественного определения гена алкогольдегидрогеназы 1 (ADH1) кукурузы разработали с использованием двух альтернативных наборов прямых и обратных праймеров-матриц (TS3 и TS3). Подходящий сайт распознавания для фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, не мог быть расположен в пределах 500 нуклеотидов выше или ниже целевого участка последовательности в геномной ДНК кукурузы. Оба набора праймеров-матриц отличаются более длинными участками, комплементарными целевой последовательности (16 и 19 нуклеотидов, соответственно), способными к гибридизации с целевой ДНК, опосредованной проникновением в цепь. В первом наборе (TS3) комплементарные целевой последовательности участки прямых и обратных праймеров-матриц содержат блок из 5 последовательных рибонуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией непосредственно выше 3'-концевого дезоксинуклеотида. Остальная часть участка, комплементарного целевой последовательности, содержит последовательность чередующихся немодифицированных дезоксинуклеотидов и рибонуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, начинающуюся на пять нуклеотидов (прямой праймер-матрица) или четыре нуклеотида (обратный праймер-матрица) ниже сайта одноцепочечного разрыва. Второй набор (TS6) праймеров-матриц отличается только блоком из пяти рибонуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, прилегающих к 3'-концевому немодифицированному дезоксинуклеотиду, в то время как остальная часть участка, комплементарного целевой последовательности, содержит только немодифицированные дезоксинуклеотиды.
Десять микролитров реакционных смесей для NEAR помещали в 50 мМ Tris с рН 8,0, 15 мМ (NH4)2SO4, 15 мМ Na2SO4 и 15 мМ MgSO4 с применением 3,84 Ед ДНК-полимеразы 1 Bst Warmstart 2.0 (NEB), 10000 копий синтетической целевой ДНК ADH1 кукурузы, 0,3 мМ dNTP, 3 Ед фермента, вносящего одноцепочечный разрыв, Nt.BstNBI, 200 нМ ROX/BHQ-меченого зонда для ADH1 типа молекулярного маяка, 0,5Х красителя SYBR Green (LifeTechnologies), 1000 нМ обратного праймера-матрицы из TS3 или TS6 и 100 нМ прямого праймера-матрицы из TS3 или TS6. Группу контрольных реакционных смесей без целевой ДНК (NTC) составляли из тех же компонентов без синтетической целевой ДНК ADH1 кукурузы. Все реакционные смеси инкубировали при 56°С в течение 15 минут, и флуоресцентные сигналы регистрировали при 520 нм (SYBR Green) и 610 нм (ROX).
Сравнивают графики амплификации для реакционных смесей, содержащих целевую ДНК, в каналах выявления для SYBR Green (фигура 8) и ROX (фигура 9) с графиками амплификации для реакционных смесей из NTC в канале выявления для SYBR Green (фигура 10).
Результаты, представленные в данном документе, получены с помощью следующих способов и материалов, если не указано иное.
Реакции NEAR-амтификации
Реакционные смеси (50 мкл) содержали 15 мМ MgSO4, 0,3 мМ dNTP, 19,2 единиц полимеразы Bst, 15 единиц n.BstNBI, 1000 нМ матрицы 1 и 200 нМ матрицы 2. Целевая ДНК представляла собой геномную ДНК Clavibacter michiganensis sepidonicus (Cms) или "многомерную" ДНК на основе последовательностей Cms. Матрицы и целевую молекулу предварительно проинкубировали вместе при 56°С в течение 30 секунд в общем объеме 10 мкл. Мастер-микс из оставшихся компонентов реакции предварительно инкубировали при 56°С в течение 30 секунд в общем объеме 40 мкл. Мастер-микс объединяли с матрицами и целевой молекулой и инкубировали при 56°С в течение 10 минут с флуоресцентной детекцией (SYBR Green или молекулярные маяки), данные которой собирали каждые 10 секунд в ходе инкубации. Реакционные смеси "убивали нагреванием" на этапе, продолжавшемся 2 минуты при 95°С, с последующим возвращением к комнатной температуре. Эквиваленты порогового цикла (Ct) определяли для каждой реакции на основе формулы для подбора кривой в программном обеспечении Biorad IQ5, и значения откладывали на графике с помощью Microsoft Excel. Выполняли линейную регрессию и определяли коэффициент корреляции (R2).
Другие варианты осуществления
Из вышеприведенного описания будет очевидно, что в настоящее изобретение, описанное в данном документе, можно внести изменения и модификации, чтобы приспособить его к различным путям применения и условиям. Такие варианты осуществления также находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.
Приведение перечня элементов в любом определении переменной в данном документе включает определения этой переменной в качестве любого отдельного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Приведение варианта осуществления в данном документе включает данный вариант осуществления в качестве любого отдельного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
Настоящая заявка может быть родственной по отношению к международной заявке на патент № PCT/US 2011/047049, поданной 9 августа 2011 года, которая заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/373695, поданной 13 августа 2010 года, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.
Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный патент или публикация были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки.
Claims (21)
1. Способ амплификации полинуклеотида, причем указанный способ включает:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, причем каждый из олигонуклеотидных праймеров содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; и
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий выявление ампликонов.
3. Способ по п. 2, причем указанное выявление включает связывание ампликонов с выявляемым зондом.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные два или более 2'-модифицированных нуклеотида, расположенные на 3’-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты, являются смежными.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией расположены на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
7. Способ по п. 1, дополнительно включающий 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, расположенных на 5'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты.
8. Способ амплификации пол и нуклеотида, причем указанный способ включает:
(a) приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя олигонуклеотидными праймерами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, причем каждый из олигонуклеотидных праймеров содержит 5 смежных нуклеотидов с 2'-O-метильной модификацией, расположенных на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; и
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
9. Способ амплификации полинуклеотида, полученного от патогена, причем указанный способ включает:
(а) приведение полинуклеотида, полученного от патогена, в контакт в практически изотермических условиях с полимеразой, двумя или более олигонуклеотидными праймерами, каждый из которых специфически связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и ферментом, вносящим одноцепочечный разрыв, причем каждый из олигонуклеотидных праймеров содержит один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 3'-конце последовательности, комплементарной целевой молекуле нуклеиновой кислоты; и
(b) образование ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
10. Способ по п. 9, дополнительно включающий выявление ампликона с выявляемым зондом.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что патоген представляет собой вирус, бактерию, дрожжи или гриб.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что патоген находится в биологическом образце.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что биологический образец выбран из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, амниотической жидкости, мокроты, мочи, спермы, влагалищного секрета, спинномозговой жидкости, лимфы, слезной жидкости, кала или желудочного сока.
14. Способ по п. 9, отличающийся тем, что патоген находится в пробе из окружающей среды.
15. Способ по п. 4, отличающийся тем, что один или несколько 2’-модифицированных нуклеотидов, расположенных на 5’-конце последовательности, комплементарной целевой нуклеиновой кислоты, отделены от сайта одноцепочечного разрыва с помощью 1, 2, 3, 4, 5 или более немодифицированных нуклеотидов.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261621975P | 2012-04-09 | 2012-04-09 | |
US61/621,975 | 2012-04-09 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014144722/10A Division RU2601129C2 (ru) | 2012-04-09 | 2013-04-09 | Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020128098A Division RU2020128098A (ru) | 2020-08-24 | 2020-08-24 | Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016138585A RU2016138585A (ru) | 2018-12-13 |
RU2016138585A3 RU2016138585A3 (ru) | 2020-03-19 |
RU2732589C2 true RU2732589C2 (ru) | 2020-09-21 |
Family
ID=49328090
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014144722/10A RU2601129C2 (ru) | 2012-04-09 | 2013-04-09 | Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце |
RU2016138585A RU2732589C2 (ru) | 2012-04-09 | 2013-04-09 | Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014144722/10A RU2601129C2 (ru) | 2012-04-09 | 2013-04-09 | Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US9096897B2 (ru) |
EP (2) | EP2836609B2 (ru) |
JP (4) | JP5801513B2 (ru) |
KR (4) | KR102362649B1 (ru) |
CN (2) | CN104685066B (ru) |
AU (3) | AU2013246080C1 (ru) |
BR (1) | BR112014025262A8 (ru) |
CA (1) | CA2869971C (ru) |
DK (1) | DK2836609T4 (ru) |
ES (1) | ES2743050T5 (ru) |
HK (1) | HK1210228A1 (ru) |
IN (1) | IN2014DN08831A (ru) |
MX (2) | MX367666B (ru) |
NZ (2) | NZ723570A (ru) |
RU (2) | RU2601129C2 (ru) |
UA (2) | UA116205C2 (ru) |
WO (1) | WO2013155056A1 (ru) |
ZA (3) | ZA201408116B (ru) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2810856C (en) | 2010-08-13 | 2022-05-17 | Envirologix Inc. | Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample |
NZ723570A (en) | 2012-04-09 | 2018-06-29 | Envirologix Inc | Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample |
RU2723079C2 (ru) | 2014-04-22 | 2020-06-08 | Инвайролоджикс, Инк. | Композиции и способы для увеличения и/или прогнозирования амплификации днк |
BR112016025349A2 (pt) * | 2014-04-30 | 2017-12-12 | Envirologix Inc | composições e métodos para a detecção de huanglongbing |
JP6773651B2 (ja) * | 2014-10-14 | 2020-10-21 | アボット・ラボラトリーズAbbott Laboratories | ポリdnaスペーサー配列を有する配列変換およびシグナル増幅dnaならびにそれらを用いた検出方法 |
EP3209802B1 (en) * | 2014-10-20 | 2022-09-07 | Envirologix Inc. | Compositions and methods for detecting an rna virus |
WO2016122698A1 (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Envirologix, Inc. | Compositions and methods for rapid detection of salmonella |
MX2017009833A (es) * | 2015-01-30 | 2017-11-02 | Envirologix Inc | Molecula de sustrato. |
JP7166586B2 (ja) * | 2015-06-25 | 2022-11-08 | ロズウェル バイオテクノロジーズ,インコーポレイテッド | 生体分子センサーおよび方法 |
EP3325495A1 (en) * | 2015-07-20 | 2018-05-30 | Envirologix Inc. | Compositions and methods for rapid detection of salmonella serovar d1 |
EP3368654A4 (en) * | 2015-10-30 | 2019-06-05 | Alere Inc. | DETERMINATION OF POLYMORPHISMS BY ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID |
US10329601B2 (en) | 2015-12-28 | 2019-06-25 | Ionian Technologies, Inc. | Nicking and extension amplification reaction (NEAR) of Streptococcus species |
KR20180104127A (ko) | 2016-01-28 | 2018-09-19 | 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 | 대량 병렬 dna 시퀀싱 장치 |
US11624725B2 (en) | 2016-01-28 | 2023-04-11 | Roswell Blotechnologies, Inc. | Methods and apparatus for measuring analytes using polymerase in large scale molecular electronics sensor arrays |
EP3882616A1 (en) | 2016-02-09 | 2021-09-22 | Roswell Biotechnologies, Inc | Electronic label-free dna and genome sequencing |
US10597767B2 (en) | 2016-02-22 | 2020-03-24 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Nanoparticle fabrication |
GB201611469D0 (en) | 2016-06-30 | 2016-08-17 | Lumiradx Tech Ltd | Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes |
US9829456B1 (en) | 2016-07-26 | 2017-11-28 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices |
KR102622275B1 (ko) | 2017-01-10 | 2024-01-05 | 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 | Dna 데이터 저장을 위한 방법들 및 시스템들 |
WO2018136148A1 (en) | 2017-01-19 | 2018-07-26 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Solid state sequencing devices comprising two dimensional layer materials |
US10508296B2 (en) | 2017-04-25 | 2019-12-17 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Enzymatic circuits for molecular sensors |
CN110546276A (zh) | 2017-04-25 | 2019-12-06 | 罗斯威尔生命技术公司 | 用于分子传感器的酶电路 |
WO2018208505A1 (en) | 2017-05-09 | 2018-11-15 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Binding probe circuits for molecular sensors |
US10538808B2 (en) | 2017-05-26 | 2020-01-21 | Vibrant Holdings, Llc | Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing |
TWI754652B (zh) * | 2017-07-10 | 2022-02-11 | 英商盧米瑞德克斯英國有限公司 | 核酸擴增方法中或相關之改良 |
CN111373049A (zh) | 2017-08-30 | 2020-07-03 | 罗斯威尔生命技术公司 | 用于dna数据存储的进行性酶分子电子传感器 |
EP3676394A4 (en) * | 2017-08-31 | 2021-06-02 | Ionian Technologies, LLC | SYNCYTIAL SYNCHRONIZATION AND EXTENSION AMPLIFICATION REACTION (NEAR) OF RESPIRATORY VIRUS SPECIES |
EP3694990A4 (en) | 2017-10-10 | 2022-06-15 | Roswell Biotechnologies, Inc. | METHODS, APPARATUS AND SYSTEMS FOR NON-AMPLIFICATION DNA DATA STORAGE |
GB2569965A (en) | 2018-01-04 | 2019-07-10 | Lumiradx Uk Ltd | Improvements in or relating to amplification of nucleic acids |
CN108588252A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-09-28 | 杭州泰熙生物技术有限公司 | 一种寄生虫检测试剂盒及其检测方法 |
US20210207203A1 (en) * | 2018-06-26 | 2021-07-08 | The Broad Institute, Inc. | Crispr double nickase based amplification compositions, systems, and methods |
GB201812149D0 (en) * | 2018-07-25 | 2018-09-05 | Sense Biodetection Ltd | Nucleic acid detection method |
KR102154628B1 (ko) | 2019-01-03 | 2020-09-10 | 베트올 (주) | 반정량 수평류 면역진단 기술을 이용한 랄스토니아 솔라나세아룸과 푸사리움 옥시스포룸의 동시 진단 방법 |
KR102199394B1 (ko) * | 2019-07-01 | 2021-01-06 | 한국화학연구원 | 이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법 |
KR102531590B1 (ko) * | 2019-07-16 | 2023-05-11 | 고려대학교 산학협력단 | 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한 표적핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 조성물 |
CN110408678A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-11-05 | 宁儿医院股份有限公司 | 单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法 |
AU2022405094A1 (en) * | 2021-12-08 | 2024-06-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Cold-temperature isothermal amplification of polynucleotides |
WO2023221939A1 (en) * | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Jiangsu Code Biomedical Technology Co., Ltd. | Novel compositions and methods for cell-free dna detection |
TW202421795A (zh) * | 2022-07-01 | 2024-06-01 | 美商夏洛克生物科學公司 | 環境溫度核酸擴增及偵測 |
WO2024030985A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Abbott Laboratories | Assays for detecting monkeypox virus |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1420069A1 (en) * | 2001-08-20 | 2004-05-19 | Takara Bio Inc. | Nucleic acid amplification methods |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
WO1994003635A1 (en) | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Institute Of Molecular Biology & Biotechnology | Rapid amplification and detection of nucleic acids |
US5648211A (en) | 1994-04-18 | 1997-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification using thermophilic enzymes |
US5629179A (en) | 1995-03-17 | 1997-05-13 | Novagen, Inc. | Method and kit for making CDNA library |
AT402203B (de) | 1995-06-13 | 1997-03-25 | Himmler Gottfried Dipl Ing Dr | Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren |
EP0914462A4 (en) * | 1996-03-18 | 2002-05-22 | Molecular Biology Resources | Amplification of target nucleic acid sequences |
WO1998002582A2 (en) * | 1996-07-16 | 1998-01-22 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting and amplifying nucleic acid sequences using modified oligonucleotides having increased target specific t¿m? |
GB9716231D0 (en) | 1997-07-31 | 1997-10-08 | Amersham Int Ltd | Base analogues |
US6355421B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-03-12 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to PNA molecular beacons |
US5952202A (en) | 1998-03-26 | 1999-09-14 | The Perkin Elmer Corporation | Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification |
WO2000028084A1 (en) | 1998-11-06 | 2000-05-18 | Molecular Biology Resources, Inc. | Isothermal nucleic acid amplification methods |
US6436677B1 (en) | 2000-03-02 | 2002-08-20 | Promega Corporation | Method of reverse transcription |
EP1290225A4 (en) | 2000-05-20 | 2004-09-15 | Univ Michigan | METHOD FOR PRODUCING A DNA BANK BY POSITIONAL REPRODUCTION |
US6191267B1 (en) | 2000-06-02 | 2001-02-20 | New England Biolabs, Inc. | Cloning and producing the N.BstNBI nicking endonuclease |
ES2254306T3 (es) * | 2000-10-25 | 2006-06-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Amplificacion usando cebadores modificados. |
WO2002057479A2 (en) | 2000-12-27 | 2002-07-25 | Invitrogen Corporation | Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
CA2492220C (en) * | 2001-07-15 | 2014-03-18 | Keck Graduate Institute | Nucleic acid amplification using nicking agents |
WO2003066802A2 (en) | 2001-07-15 | 2003-08-14 | Keck Graduate Institute | Gene expression analysis using nicking agents |
US6977148B2 (en) | 2001-10-15 | 2005-12-20 | Qiagen Gmbh | Multiple displacement amplification |
US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
US7399590B2 (en) | 2002-02-21 | 2008-07-15 | Asm Scientific, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
US20030211483A1 (en) | 2002-05-09 | 2003-11-13 | Schroeder Benjamin G. | Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides |
AU2003272438B2 (en) | 2002-09-20 | 2009-04-02 | New England Biolabs, Inc. | Helicase dependent amplification of nucleic acids |
US7662594B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-02-16 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of RNA |
WO2004067726A2 (en) | 2003-01-29 | 2004-08-12 | Keck Graduate Institute | Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides |
JP4380305B2 (ja) | 2003-11-21 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
US20090017452A1 (en) | 2004-03-05 | 2009-01-15 | University Of Chicago | Methods and compositions relating to the pharmacogenetics of different gene variants |
US20060115838A1 (en) | 2004-10-19 | 2006-06-01 | Trevigen Inc. | Real-time detection of amplicons using nucleic acid repair enzymes |
JP5068175B2 (ja) * | 2005-01-04 | 2012-11-07 | 日立化成工業株式会社 | プライマー生成ローリングサークル型増幅 |
JP4555136B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2010-09-29 | 本田技研工業株式会社 | 燃料電池の電気システム、燃料電池車両及び電力供給方法 |
CA2616241C (en) | 2005-07-25 | 2012-02-07 | Asm Scientific, Inc. | Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification |
DK1924704T3 (da) | 2005-08-02 | 2011-09-05 | Rubicon Genomics Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion |
EP1762627A1 (de) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion |
US7947286B2 (en) | 2005-10-07 | 2011-05-24 | Panthera Biopharma Llc | Drosophila cell lines producing recombinant secretable filovirus surface glycoproteins lacking the membrane spanning domain |
US20090092967A1 (en) * | 2006-06-26 | 2009-04-09 | Epoch Biosciences, Inc. | Method for generating target nucleic acid sequences |
US20080096257A1 (en) | 2006-08-15 | 2008-04-24 | Zuxu Yao | Methods for Rapid, Single-Step Strand Displacement Amplification of Nucleic Acids |
DE102006039396A1 (de) | 2006-08-22 | 2008-03-13 | Robert Bosch Gmbh | Laserlichtquelle |
EP2071927A2 (en) | 2006-09-28 | 2009-06-24 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
NZ576003A (en) | 2006-10-06 | 2012-03-30 | Dna Genotek Inc | Stabilizing compositions and methods for extraction of ribonucleic acid |
JP2008136451A (ja) | 2006-12-05 | 2008-06-19 | Hitachi Ltd | 核酸増幅法 |
US8202972B2 (en) | 2007-01-10 | 2012-06-19 | General Electric Company | Isothermal DNA amplification |
US20090081760A1 (en) † | 2007-01-12 | 2009-03-26 | Monsanto Technology Llc | Dmo methods and compositions |
US20080254458A1 (en) | 2007-04-10 | 2008-10-16 | Asiagen Corporation | Method of pre-treating in pleural effusion for detection of Mycobacterium tuberculosis |
US20080274458A1 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-06 | Latham Gary J | Nucleic acid quantitation methods |
US9689031B2 (en) | 2007-07-14 | 2017-06-27 | Ionian Technologies, Inc. | Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids |
US20090048439A1 (en) | 2007-08-06 | 2009-02-19 | Weisburg William G | Isolation of nucleic acids molecules using modified solid supports |
US20090197254A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-08-06 | Ming-Chou Lee | Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection |
AU2009242546B2 (en) | 2008-04-30 | 2015-01-22 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
WO2010026933A1 (ja) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | タカラバイオ株式会社 | Rna検出用組成物 |
JP2012515528A (ja) | 2009-01-21 | 2012-07-12 | ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド | 改良された等温鎖置換増幅 |
EP2408936A4 (en) | 2009-03-18 | 2013-01-30 | Sequenom Inc | USE OF HEAT-STAINED ENDONUCLEASES FOR THE PREPARATION OF REPORTER MOLECULES |
WO2010126913A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Gen-Probe Incorporated | Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences |
CA2810856C (en) * | 2010-08-13 | 2022-05-17 | Envirologix Inc. | Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample |
EP2420579A1 (en) | 2010-08-17 | 2012-02-22 | QIAGEN GmbH | Helicase dependent isothermal amplification using nicking enzymes |
CN103946398B (zh) | 2011-09-15 | 2019-08-13 | 健能泰格技术公司 | 探针:反义探针组合物对高特异性dna或rna的检测 |
EP2798089B1 (en) | 2011-12-30 | 2018-05-23 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for performing nucleic acid amplification reactions |
NZ723570A (en) | 2012-04-09 | 2018-06-29 | Envirologix Inc | Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample |
CN104583413B (zh) | 2012-06-29 | 2018-10-19 | 通用电气公司 | 用于自rna模板开始的等温dna扩增试剂盒 |
JP2014082936A (ja) | 2012-10-19 | 2014-05-12 | Kyoto Univ | 変異型逆転写酵素 |
RU2723079C2 (ru) | 2014-04-22 | 2020-06-08 | Инвайролоджикс, Инк. | Композиции и способы для увеличения и/или прогнозирования амплификации днк |
BR112016025349A2 (pt) | 2014-04-30 | 2017-12-12 | Envirologix Inc | composições e métodos para a detecção de huanglongbing |
EP3209802B1 (en) | 2014-10-20 | 2022-09-07 | Envirologix Inc. | Compositions and methods for detecting an rna virus |
BR112017008718A2 (pt) | 2014-10-28 | 2017-12-19 | Envirologix Inc | ?recipientes de preparação de amostra, circuitos de microfluídos, e sistemas e métodos para preparação, extração e análise da amostra? |
WO2016122698A1 (en) | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Envirologix, Inc. | Compositions and methods for rapid detection of salmonella |
-
2013
- 2013-04-09 NZ NZ723570A patent/NZ723570A/en unknown
- 2013-04-09 KR KR1020207027096A patent/KR102362649B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-09 ES ES13775206T patent/ES2743050T5/es active Active
- 2013-04-09 DK DK13775206.9T patent/DK2836609T4/da active
- 2013-04-09 KR KR1020197034264A patent/KR102159818B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-09 NZ NZ701145A patent/NZ701145A/en unknown
- 2013-04-09 EP EP13775206.9A patent/EP2836609B2/en active Active
- 2013-04-09 MX MX2016004384A patent/MX367666B/es unknown
- 2013-04-09 UA UAA201412069A patent/UA116205C2/uk unknown
- 2013-04-09 WO PCT/US2013/035750 patent/WO2013155056A1/en active Application Filing
- 2013-04-09 EP EP19175608.9A patent/EP3587587A1/en active Pending
- 2013-04-09 MX MX2014012214A patent/MX338296B/es active IP Right Grant
- 2013-04-09 KR KR1020157016789A patent/KR102048946B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-09 RU RU2014144722/10A patent/RU2601129C2/ru active
- 2013-04-09 CN CN201380029891.7A patent/CN104685066B/zh active Active
- 2013-04-09 JP JP2015505849A patent/JP5801513B2/ja active Active
- 2013-04-09 AU AU2013246080A patent/AU2013246080C1/en active Active
- 2013-04-09 IN IN8831DEN2014 patent/IN2014DN08831A/en unknown
- 2013-04-09 US US14/342,766 patent/US9096897B2/en active Active
- 2013-04-09 KR KR1020147031343A patent/KR101570951B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-09 BR BR112014025262A patent/BR112014025262A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-04-09 UA UAA201709549A patent/UA125112C2/uk unknown
- 2013-04-09 RU RU2016138585A patent/RU2732589C2/ru active
- 2013-04-09 CA CA2869971A patent/CA2869971C/en active Active
- 2013-04-09 CN CN202111049886.5A patent/CN114134207A/zh active Pending
-
2014
- 2014-11-06 ZA ZA2014/08116A patent/ZA201408116B/en unknown
-
2015
- 2015-07-01 US US14/789,545 patent/US9322053B2/en active Active
- 2015-08-26 JP JP2015166615A patent/JP6169660B2/ja active Active
- 2015-10-19 AU AU2015246059A patent/AU2015246059B2/en active Active
- 2015-11-02 HK HK15110782.4A patent/HK1210228A1/xx unknown
- 2015-11-05 ZA ZA2015/08197A patent/ZA201508197B/en unknown
-
2016
- 2016-01-06 US US14/989,687 patent/US9631231B2/en active Active
- 2016-08-25 JP JP2016164716A patent/JP6321738B2/ja active Active
- 2016-11-04 ZA ZA2016/07642A patent/ZA201607642B/en unknown
-
2017
- 2017-02-21 US US15/438,330 patent/US20170166960A1/en not_active Abandoned
- 2017-06-28 JP JP2017125772A patent/JP6480511B2/ja active Active
- 2017-11-09 US US15/808,442 patent/US10077467B2/en active Active
-
2018
- 2018-03-07 AU AU2018201671A patent/AU2018201671B2/en active Active
- 2018-08-30 US US16/117,949 patent/US10584376B2/en active Active - Reinstated
-
2020
- 2020-02-05 US US16/782,805 patent/US11208687B2/en active Active
-
2021
- 2021-11-15 US US17/526,638 patent/US11866773B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1420069A1 (en) * | 2001-08-20 | 2004-05-19 | Takara Bio Inc. | Nucleic acid amplification methods |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Шипицына Елена Васильевна. Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики трихомониаза. Журнал акушерства и женских болезней. 2011, номер 2, стр. 73-79. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2732589C2 (ru) | Композиции и способы для количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты в образце |