KR102199394B1

KR102199394B1 - 이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법

Info

Publication number: KR102199394B1
Application number: KR1020190078679A
Authority: KR
Inventors: 이지언; 김우근; 이상우; 윤석주
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2021-01-06
Also published as: US20210002695A1; US11624087B2

Abstract

본 발명은 이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물, 키트 및 검출 방법은 산화그래핀 표면에 이중분자비콘과 표적 핵산의 결합으로부터 유리된 DNAzyme 서열을 갖는 단일가닥을 흡착시켜 복합체를 형성하고 이를 분리하고, 이로부터 증폭된 비색신호를 유도할 수 있는 바, 매우 낮은 농도의 표적 핵산을 고효율로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 수초내로 쉽고 빠르게 표적 핵산을 검출할 수 있어, 현장현시검사(POCT)가 가능한 새로운 비색계 표적 핵산 검출 시스템이 제공될 수 있는 유용한 효과가 있다.

Description

이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법 {Composition for detecting nucleic acid comprising duplex molecular beacon and graphene oxide, and colorimetric signal enhancement method of detecting nucleic acid using the same}

본 발명은 이중분자비콘과 산화그래핀을 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 비색신호 증폭 방법에 관한 것이다.

MicroRNAs (miRNAs)는 RNA silencing과 유전자 발현의 전사 후 조절(post-transcsriptional regulation)에 관여하는 17-25 뉴클레오티드의 non-coding RNA로서 수많은 연구들을 통해 특정조직 및 세포유형에서 특정 miRNA의 발현이 확인되었다. 이들의 비정상적인 발현은 암, 바이러스감염, 면역질환 및 신경변성장애와 같은 다양한 심각한 질병과 관련되어 있다. 예를 들어 종양유발기능이 있음이 알려진 miRNA-21은 유방암, 췌장암 및 간세포 암종과 같은 다양한 종류의 악성종양에서 지속적으로 과발현된다. 2008년에 암 이종이식 마우스의 혈청과 혈장에서 높은 안정성을 가진 종양유래의 일부 miRNA가 발견되었다. 종양특이 miRNA는 환자의 임상샘플에서도 검출되어 miRNA는 유망한 비침습적인 바이오마커로 주목받고 있다.

일반적으로, 종래에는 실시간 PCR 및 miRNA 마이크로어레이 방법이 miRNA의 정량적 검출을 위해 이용되어 왔다. 그러나 복잡한 절차, 비싼 시약과 도구로 인해 실제 임상적용에 한계가 있었다. 이 문제를 해결하기 위해 POCT (point-of-care testing) 시스템에 적용할 수 있는 간단하고 빠른 검출플랫폼을 구축하기 위한 기술적 및 과학적 시도가 많이 있었다. 비색계, 형광, 표면플라스몬공명 및 전기화학적 방법과 정교한 신호증폭방법을 조합한 다양한 기술에 기초한 많은 miRNA 검출 시스템이 최근 수십년 동안 제안되어 왔다. 그 중에서도 나노물질의 고유한 광학적 특성이나 생체분자의 효소적 반응을 이용한 육안 색상측정법은 단순성과 저비용으로 miRNA POCT에 상당한 주목을 받았다.

G-quadruplex 구조를 채택한 DNAzyme (Dz)은 표지가 없는 비색 방법에 사용되는 가장 보편적인 신호발생기 중 하나로서, 헤민 존재시 퍼옥시다아제 유사 활성을 나타낼 수 있다. 이 촉매 DNA 분자는 이미 열 안정성, 기능화 용이성 및 비용 효율성을 기반으로 다양한 신호 생성기로 수많은 검출시스템에 적용되고 있다.

산화그래핀은 저렴하고 대용량으로 합성가능한 나노물질로 친수성인 부분과 소수성인 부분을 모두 가지고 있으며, 이중가닥에 비하여 단일가닥 형태의 핵산과 강한 상호작용을 하기 때문에 다양한 바이오센서 응용에 사용되고 있다. 바이오센서에서 산화그래핀은 일반적으로 pi-pi 스태킹(stacking)이나 수소결합 상호작용을 통해 단일 가닥 핵산 (ssNAs)에 대한 강한 친화성을 나타내며, 따라서 ssNAs의 고효율 분리를 위한 물질로서의 역할을 한다. 그러나 산화그래핀의 POCT시스템에서의 높은 적용가능성에도 불구하고, 형광 또는 전기화학적 어플리케이션에 비해 비색분석방법이 개발된 경우는 거의 없었다. 또한 대부분의 경우, 표적은 일반적으로 비색 신호발생기 (예 : 금 나노 입자, 헤민, 퍼옥시다아제 DNAzyme)와 함께 산화그래핀의 응집 또는 분산(disaggregation)을 일으켜 상층액의 색을 변화시켰다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 새로운 비색계 표적 핵산 검출 시스템을 개발하기 위하여 노력하던 중, 본 발명자들이 새롭게 디자인한 이중분자비콘과 산화그래핀을 이용하면 검출 신호가 증폭되어 고효율로 표적 핵산을 검출할 수 있을 뿐 아니라 쉽고 빠른 현장현시검사(POCT) 시스템으로 사용 가능함을 확인한 바, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 쉽고 빠른 현장현시검사(POCT)가 가능하고 검출 신호가 증폭되어 고효율의 표적 핵산 검출이 가능한, 비색계 표적 핵산 검출 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 시스템을 이용한, 검출 신호가 증폭된 표적 핵산의 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 산화그래핀, 이중분자비콘(duplex molecular beacon), 및 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 포함하고,

상기 이중분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 DNAzyme 서열을 포함하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이되,

표적 핵산 존재하에 상기 제2 단일가닥은 제1 단일가닥으로부터 분리되고 산화그래핀에 흡착되어 산화그래핀 복합체를 형성하는 것인,

검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 표적 핵산을 포함하는 시료와 이중분자비콘(duplex molecular beacon)을 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및

상기 혼합물에 산화그래핀을 첨가하는 단계; 및

상기 혼합물을 여과 또는 분리시켜 농축된 산화그래핀 복합체를 얻는 단계;를 포함하는, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법이되,

상기 이중분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 DNAzyme 서열을 포함하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법을 제공한다.

나아가, 산화그래핀, 이중분자비콘(duplex molecular beacon), 및 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 포함하는 조성물을 포함하는 키트이되,

상기 이중분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 DNAzyme 서열을 포함하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이고,

검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물, 키트 및 검출 방법은 산화그래핀 표면에 이중분자비콘과 표적 핵산의 결합으로부터 유리된 DNAzyme 서열을 갖는 단일가닥을 흡착시켜 복합체를 형성하고 이를 분리하고, 이로부터 증폭된 비색신호를 유도할 수 있는 바, 매우 낮은 농도의 표적 핵산을 고효율로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 수초내로 쉽고 빠르게 표적 핵산을 검출할 수 있어, 현장현시검사(POCT)가 가능한 새로운 비색계 표적 핵산 검출 시스템이 제공될 수 있는 유용한 효과가 있다.

도 1은 GONET 기반의 비색계 miRNA 검출 방법의 개요를 나타낸 그림이다. 단계 1은 miRNA에 의한 DNAzyme의 활성화과정이고, 단계 2는 GONET에 의한 신호 증폭 과정이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용된 표적의 DNA 서열과 이중분자비콘(dMB)의 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 이중분자비콘, miRNA 및 비상보적 RNA(ncRNA)를 이용한 서열특이적 toehold mediated strand displacement(TMSD)의 폴리아크릴아마이드 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Hemin, ABTS, H2O2의 존재 하에서 이중분자비콘(dMB)과 표적 RNA 혼합물의 흡광도 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 다양한 농도의 산화그래핀에 의해 포획된 50pmol의 DNAzyme을 스핀다운한 후 측정한 상등액의 흡광도 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 GO 첨가에 따른 상등액의 상대적인 흡광도 변화를 그래프로 도시한 것이다.
도 7은 a)이중분자비콘(dMB)과 RNA 혼합물에 비색시약을 30분동안 처리한 후 기본 비색 분석법을 사용한 흡광도 스펙트럼과 b) 시간에 따른 비색(A420)의 증가량을 나타낸 도이다.
도 8은 이중분자비콘(dMB)과 RNA 혼합물에 비색시약을 30분동안 처리한 후 본 발명의 GONET을 이용한 비색 분석법을 사용한 흡광도 스펙트럼과 b) GONET을 이용한 향상된 비색 분석에서 시간에 따른 비색(A420)의 증가량을 나타낸 도이다.
도 9은 헤민, ABTS, H2O2 의 존재하에 GONET 처리하지 않은 대조군과 GONET처리한 실험군의 miRNA의 농도 의존적인 비색 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 헤민, ABTS, H2O2 의 존재하에 GONET 처리하지 않은 대조군과 GONET처리한 실험군의 표적 miRNA농도에 따른 분석한계를 나타낸 도이다.
도 11은 GONET에 기반한 종이 센서의 개략도를 나타낸 것이다.
도 12는 ABTS 및 H2O2의 존재하에 GONET 처리하지 않은 대조군과 GONET처리한 실험군의 miRNA에 농도가 매우 낮을 때의 종이의 색상변화 차이를 나타낸 도이다.
도 13은 ABTS와 H2O2의 존재 하에 표적 miRNA가 극도로 저농도일 때 종이상의 GONET 반점의 독특한 색 변화를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 제1 단일가닥은 표적 핵산 결합서열을 포함하고, 또한 DNAzyme 저해서열(Dz 블로킹 요소)을 포함하는 것일 수 있다.

여기서, 상기 표적 핵산 결합서열이란 표적 핵산이 갖는 서열과 적어도 일부분이 상보적인 결합이 가능한 서열인 것으로 이해될 수 있고, 상기 표적 핵산 결합서열과 표적 핵산의 상보적 결합을 통하여 상기 제1 단일가닥은 표적 핵산과 결합하고, 상기 제2 단일가닥과 분리되는 것으로 이해될 수 있다.

또한, 상기 DNAzyme 저해서열이란 상기 제2 단일가닥의 DNAzyme 서열이 활성화 형태가 되지 않도록 저해하는 서열로 이해될 수 있고, 상기 DNAzyme 저해서열은 상기 DNAzyme 서열에 적어도 일부가 상보적인 서열일 수 있다. 상기 DNAzyme 서열의 활성화 형태는 DNAzyme으로 기능하는 구조를 말하며, 핵산 사중체(quadruflex) 구조일 수 있고, 예를 들어 상기 핵산 사중체 구조는 G-quadruflex 구조일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 제2 단일가닥은 DNAzyme 서열을 포함하고, 선택적으로 표적 핵산 결합서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

여기서, 상기 DNAzyme 서열이란 DNAzyme으로 기능하거나 또는 기능할 수 있는 핵산 구조체가 형성될 수 있는 서열을 말하며, 예를 들어 핵산 사중체 구조가 형성될 우 있는 서열이고, 일 구체예로 G-quadruflex 구조가 형성될 수 있는 서열일 수 있다.

"DNAzyme"은 통상적으로 효소활성을 가지는 핵산분자를 의미하고, 예를 들어 DNAzyme은 과산화효소 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 이중분자비콘이 표적 핵산과 결합하였을 때 이중분자비콘으로부터 상기 제2 단일가닥이 유리되고, 여기서 상기 제2 단일가닥의 적어도 일부는 G-quadruplex 구조를 형성할 수 있는 핵산분자를 의미하는 것일 수 있다. 또한 성택적으로 상기 제2 단일가닥의 적어도 일부는 긴 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 것일 수 있다.

또한, 상기 표적 핵산 결합서열에 상보적인 서열이란 상기 제1 단일가닥의 표적 핵산 결합서열과 적어도 일부분의 상보적 결합이 형성될 수 있는 서열을 말한다.

본 발명의 일 측면에서, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 상게 제1 단일가닥과 제2 단일가닥은 각각 독립적으로 25 내지 40 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.

또한, 상기 제1 단일가닥의 적어도 일부분은 상기 제2 단일가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 예를 들어 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스(duplex)를 가질 수 있다.

나아가, 상기 제1 단일가닥의 표적 핵산 결합서열은 상보적 염기 결합을 통해 표적 핵산에 결합할 수 있는 서열로서 예를 들어 20 내지 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 핵산 결합서열은 표적 핵산의 서열에 상보적인 서열로 디자인되는 것일 수 있으며, 표적 핵산과의 결합력에 영향을 미치지 않는 범위내에서 일부 염기가 치환, 결실 또는 추가된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 제2 단일가닥의 DNAzyme 서열은, 이에 한정되지 않으나, 과산화효소 활성을 나타내는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 표적 핵산(miRNA)에 의해 본 발명의 이중분자비콘으로부터 제2 단일가닥이 유리되어 DNAzyme 서열이 활성화되는지 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동과 DNAzyme 촉매화 과산화반응으로 확인한 결과, 표적 핵산(miRNA)이 존재하는 경우에만 활성화되고 ABTS의 산화를 촉매화함을 확인하였다.

본 발명의 일 측면에서, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 상기 DNAzyme 차단서열은 3 내지 10의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 바람직하게는 4 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

또한, 상기 제1 단일가닥의 DNAzyme 차단서열은 표적 핵산의 존재하에서 활성화된 DNAzyme의 과산화효소 활성을 비교함으로써 결정할 수 있다.

나아가, 상기 제2 단일가닥의 표적 핵산 결합서열에 상보적인 서열은 예를 들어 10내지 20의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 제1 단일가닥의 표적 핵산 결합서열의 일부와 상보적인 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 이중분자비콘(dMB)의 각 가닥은 예를 들어 25 내지 40 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 바람직하게 제1 단일가닥은 25 내지 30 뉴클레오티드일 수 있고, 제2 단일가닥은 33 내지 38 뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 이중분자비콘(dMB)의 제1 단일가닥의 적어도 일부분은 제2 단일가닥의 적어도 일부분에 상보적일 수 있고, 분자는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 가질 수 있고, 바람직하게는 20 내지 23 뉴클레오티드일 수 있다.

나아가, 상기 이중분자비콘(dMB)은 제1 단일가닥의 3 ' 오버행(overhang)을 포함하는 하나 이상의 3' 오버행(overhang)을 가질 수 있으며, 상기 오버행(overhang)은 5 내지 20 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 이중분자비콘(dMB)의 제1 단일가닥의 DNAzyme 차단서열 및 표적 핵산 결합서열 사이와 상기 제2 단일가닥의 DNAzyme 서열 및 표적 핵산 결합서열에 상보적인 서열 사이에 링커를 더 포함할 수 있다.

여기서, 상기 이중분자비콘(dMB)의 링커의 길이는, 이에 제한되지 않으나, 에를 들어 1 내지 5 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있으며, 링커의 염기 서열은 특별히 제한되지 않고 임의의 서열일 수 있다.

본 발명의 일 구쳉PDp서, 상기 이중분자비콘(dMB)의 제2 단일가닥은 제1 단일가닥의 3' 오버행을 통해, 표적 핵산과 결합하였을 때 유리되어 긴 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 G-quadruplex DNAzyme(Dz) 구조를 형성할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 이중분자비콘은 다음과 같을 수 있다.

a) 폴리디옥시뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리디옥시뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가지는 분자로서 양 말단이 sticky end를 갖는 이중가닥 분자를 이루고 있으며, 상기 센스 가닥은 DNAzyme 차단서열 및 표적핵산 결합서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 DNAzyme서열 및 표적핵산 결합서열에 상보적인 서열을 포함함;

b) 센스 가닥의 DNAzyme 차단서열은 DNAzyme 서열의 5‘ 끝부분과 상보적인 4 뉴클레오티드의 염기서열을 갖으며, 이는 표적핵산 결합서열과 2-3 뉴클레오티드의 spacer를 두고 이어져 있음;

c) 안티센스는 표적핵산 결합서열에 상보적이나 6-7 뉴클레오티드 짧은 서열을 가지고 있으며, DNAzyme 서열과 2-3 뉴클레오티드의 spacer를 두고 이어져 있음;

본 발명의 일 측면에서, 상기 표적 핵산은 이중분자비콘의 제1 단일가닥과 적어도 일부가 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것으로 이해될 수 있고, 예를 들어, 시료 내에 표적 핵산인 DNA 또는 RNA가 존재할 경우 이에 상보적인 서열을 가진 상기 이중분자비콘의 제1 단일가닥이 상기 DNA 또는 RNA와 혼성화됨으로써 이중 가닥 핵산이 되고, 제2 단일가닥이 유리되어 산화그래핀에 흡착됨에 따라, 산화그래핀 표면 상에서 제2 단일가닥이 DNAzyme으로 기능하며, 비색을 나타내어 시료 내에 존재하는 상기 표적 핵산 DNA 또는 RNA를 검출할 수 있다.

여기서, 상기 표적 핵산 DNA는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 단백질을 코딩하지 않는 DNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 mRNA(messenger RNA), tRNA(transfer RNA), rRNA(ribosomal RNA), sRNA(small RNA), snRNA(small nuclear RNA), scRNA(small cytoplasmic RNA), siRNA(small interfering RNA), 또는 miRNA(microRNA)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 단백질로 번역되는 RNA, 단백질로 번역되지 않는 RNA, 5'-비번역 부위, 3'-비번역 부위, 또는 조절 RNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 RNA는 miRNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA는 생체 내 생물학적 기능에 관여하는 것일 수 있으며, 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 대장암, 골암, 피부암, 혈액암, 당뇨, 또는 알츠하이머 등의 각종 질병의 진단, 치료, 또는 예후 판단에서 중요한 바이오 마커로 사용되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA는 줄기 세포에서 계통 특이적 분화(lineage specific differentiation)에 관여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 miRNA는 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA-155, 또는 miRNA-159를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-29a, 상기 miRNA-125b, 또는 상기 miRNA-155는 인간 세포에서 발현되는 miRNA인 것일 수 있으며, 상기 miRNA-159는 식물 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-29a, 및 상기 miRNA-125b는 유방암 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-29a, 상기 miRNA-125b, 또는 상기 miRNA-155는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB435, 또는 MCF-7; 또는 기타 암세포 등에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 도 2에 확인되는 바와 같이, 상기 표적 핵산은 miRNA-122이고, UGG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G의 서열(서열번호 1)을 갖는 것일 수 있고, 상기 제1 단일가닥은 3′-ACC TCA CAC TGT TAC CAC AAA CTT CCC A-5′(서열번호 2)일 수 있고, 상기 제2 단일가닥은 5′-TG ACA ATG GTG TTT GAA GGG TAG GGC GGG TTG GGA-3′(서열번호 3)일 수 있다.

여기서, 핵산 사중체를 형성하는 DNAzyme 서열은 5′-GGG TAG GGC GGG TTG GGA-3′(서열번호 4)이고, 이 외에도, 핵산 사중체를 형성하는 것이라면 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 수 있고, 특히 G-quadruplex구조를 형성할 수 있는 것이라면 본 발명에 포함된다.

일 구체예로, 상기 5′-GGG TAG GGC GGG TTG GGA-3′를 대신하여, 5′-GTGGGGCATTGTGGGTGGGTGTGG-3′, 5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3′, 5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3′, 또는 5′-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′를 포함하는 DNAzyme 서열을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단일층의 시트 형태인 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태가 아닌 산화그래핀에 비하여 동일한 질량에서 표면적이 넓어 적은 양으로도 많은 핵산 프로브를 흡착할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 산화그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 산화그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 1 μm, 약 100 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 300 nm 내지 약 1 μm, 약 400 nm 내지 약 1 μm, 약 500 nm 내지 약 1 μm, 약 700 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 400 nm 이하인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 산화그래핀은 작은 크기 때문에 표면에 흡착된 상기 제2 단일가닥과 함께 세포막을 용이하게 통과하여 세포 내로 들어갈 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 표적 물질인 핵산은 세포 내에 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, DNAzyme 코펙터(cofactor)는 상기 제2 단일가닥의 DNAzyme 서열 부분과 함께 DNAzyme으로 기능함에 사용 가능한 것이라면 제한 없이 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 수 있으나, 본 발명 일 구체예에서, DNAzyme은 과산화효소 활성을 나타내는 것일 수 있고, 상기 DNAzyme 코펙터는 헤민일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 핵산 검출용 조성물은 비색계 시약을 더 포함하는 것일 수 있다.

여기서, 상기 비색계 시약은, DNAzyme 활성으로부터 비색을 나타낼 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 포한되나, 예를 들어, ABTS, OPD, DAB, AEC, TMB, AmplexRed, 및 Homovanilic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 1종 이상의 과산화물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 특정 이론에 본 발명이 제한되는 것은 아니나, 상기 DNAzyme은 퍼옥시다제 활성을 나타내는 것이고, 상기 DNAzyme이 상기 1종 이상의 과산화물과 상기 ABTS, OPD, DAB, AEC, TMB, AmplexRed, 및 Homovanilic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 일련의 산화환원 과정을 통해 상기 ABTS, OPD, DAB, AEC, TMB, AmplexRed, 및 Homovanilic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 비색을 검출하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 핵산 검출용 조성물은 이중분자비콘의 제1 단일가닥이 표적 핵산과 결합되면, 제2 단일가닥이 제1 단일가닥과의 분리되고, 분리된 제2 단일가닥의 DNAzyme 서열과 DNAzyme 코펙터(cofactor)가 DNAzyme으로 기능하여 표적 핵산을 검출하는 것이되, 상기 분리된 제2 단일가닥이 산화그래핀으로 흡착되는 것으로부터 검출 신호가 증폭되는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 검출 신호의 증폭은 산화그래핀 표면에 제2 단일가닥들이 흡착되어 DNAzyme 활성이 산화그래핀 표면에 집중되고 검출 신호 역시 산화그래핀 표면으로 집중되어 증폭되는 것으로 이해될 수 있고, 또는

본 발명의 다른 구체예에서, 산화그래핀/제2 단일가닥 또는 산화그래핀/제2 단일가닥/DNAzyme 코펙터가 산화그래핀 복합체를 이루어, 이 복합체를 일련의 여과 또는 분리의 과정을 산화그래핀 복합체만을 농축시켜 검출 신호를 증폭시키는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에서는 용액 중 산화그래핀 복합체를 얻어, 이를 원심분리하여 산화그래핀 복합체의 펠렛을 얻고, 이로부터 표적 핵산의 농도에 비례적으로 신호 증폭이 우수하여 표적 핵산의 정량적 분석이 가능함을 확인하였고, 다르게 산화그래핀 복합체의 크기는 걸러지고 여타의 표적 핵산이나 이중분자비콘의 크기를 갖는 물질은 투과되는 종이(종이 외의 여과 기능을 수행하는 기질은 본 발명에 모두 포함됨)를 사용하여 역시 표적 핵산의 농도에 비례적으로 신호 증폭이 우수하여 표적 핵산의 정량적 분석이 가능함을 규명하였으며, 현장현시검사(POCT)로도 우수하게 적용될 수 있는 방법임을 규명하였다.

상기 혼합물에 산화그래핀을 첨가하는 단계; 및

이하, 상기 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법을 단계별로 상세히 설명한다.

상기 표적 핵산을 포함하는 시료와 이중분자비콘(duplex molecular beacon)을 혼합하여 혼합물을 얻는 단계는, 이중분자비콘의 제1 단일가닥과 상기 표적 핵산이 결합되어 제2 단일가닥을 유리시키는 단계로 이해될 수 있다.

여기서, 상기 제1 단일가닥과 표적 핵산은 적어도 일부분의 상보적 서열을 갖는 것으로부터 혼성화되어 제2 단일가닥을 유리시키는 것으로 이해될 수 있다. 한편, 각 표적 핵산, 제1 단일가닥 및 제2 단일가닥의 정의와 설명은 상술된 바와 동일한 바, 생략한다.

상기 산화그래핀을 첨가하는 단계는 얻어진 혼합물에 산화그래핀(GO)을 첨가하는 것으로 이해될 수 있고, 이 단계는 상기 혼합물의 유리된 제2 단일가닥이 상기 산화그래핀에 흡착되어 산화그래핀 복합체를 얻는 단계로도 이해될 수 있다. 또한, 유리된 제2 단일가닥은 DNAzyme 서열을 갖는 바, 유리된 상태와 산화그래핀에 흡착된 상태에서 DNAzyme으로 기능할 수 있는 형태가 변형될 수 있고, 예를 들어, 핵산 사중체, 구체적으로 구아닌 사중체의 형상을 나타낼 수 있다. 특히, 산화그래핀 표면에 제2 단일가닥의 핵산 사중체 형상, 즉, DNAzyme 서열이 노출되어 있어, DNAzyme 코펙터와 함께 산화그래핀 표면에서 DNAzyme으로 기능한다. 한편, 산화그래핀 크기 등에 대한 보다 상세한 설명은 상술된 바와 동일한 바, 생략한다.

상기 혼합물을 여과 또는 분리시켜 농축된 산화그래핀 복합체를 얻는 단계는 상기 산화그래핀 복합체를 일련의 여과 또는 분리의 단계를 통하여 산화그래핀 복합체만을 농축하고 검출 신호를 증폭시키는 단계로도 이해될 수 있다.

상기 여과 또는 분리를 통하여 산화그래핀 복합체가 농축되고 이로부터 비색계 검출 신호가 증폭되는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 용액 중 산화그래핀 복합체를 얻어, 이를 원심분리하여 산화그래핀 복합체의 펠렛을 얻고, 이로부터 표적 핵산의 농도에 비례적으로 신호 증폭이 우수하여 표적 핵산의 정량적 분석이 가능함을 확인하였다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 산화그래핀 복합체의 크기는 걸러지고 여타의 표적 핵산이나 이중분자비콘의 크기를 갖는 물질은 투과되는 종이(종이 외의 여과 기능을 수행하는 기질은 본 발명에 모두 포함됨)를 사용하여 역시 표적 핵산의 농도에 비례적으로 신호 증폭이 우수하여 표적 핵산의 정량적 분석이 가능함을 규명하였으며, 현장현시검사(POCT)로도 우수하게 적용될 수 있는 방법임을 규명하였다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법은 상기 혼합물에 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

여기서, DNAzyme 코펙터(cofactor) 첨가로부터, 상기 산화그래핀 표면에 흡착된 제2 단일가닥의 DNAzyme 서열(예, 핵산 사중체)과 함께 DNA zyme으로서 기능할 수 있는 산화그래핀 복합체(산화그래핀/제2 단일가닥/DNAzyme 코펙터)를 형성하는 단계로도 이해될 수 있다. 한편, DNAzyme 코펙터, 핵산 사중체 등의 중복된 설명은 상술된 바와 동일한 바, 생략한다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법은 상기 농축된 산화그래핀 복합체에 비색계 시약을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 비색계 시약을 첨가하는 단계는 상기 산화그래핀 복합체(산화그래핀/제2 단일가닥/DNAzyme 코펙터)로부터 비색을 검출할 수 있도록, ABTS, OPD, DAB, AEC, TMB, AmplexRed, 및 Homovanilic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 1종 이상의 과산화물을 포함하는 비색계 시약을 첨가하는 단계로 이해될 수 있다. 본 발명이 특정 이론에 귀속되는 것은 아니나, 예를 들어 상기 산화그래핀 복합체의 DNAzyme에 의한 비색계 시약의 산화환원 반응을 통하여 비색이 나타나는 단계로 이해될 수 있다.

한편, 본 발명의 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 각 단계의 세부적인 조건 단계의 순서 등과 같이 이분야 기술자에게 자명한 변경과 수정 역시 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

나아가, 본 발명은 산화그래핀, 이중분자비콘(duplex molecular beacon), 및 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 포함하는 조성물을 포함하는 키트이되,

검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 키트는 비색계 시약을 더 포함하는 것일 수 있다. 여기서, 상기 비색계 시약은, DNAzyme 활성으로부터 비색을 나타낼 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 포한되나, 예를 들어, ABTS, OPD, DAB, AEC, TMB, AmplexRed, 및 Homovanilic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 1종 이상의 과산화물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 키트는 상기 조성물과 표적 핵산을 혼합하여 혼합물이 얻어지면 상기 혼합물을 여과 또는 분리하여 농축된 산화그래핀 복합체를 얻을 수 있는 장치를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 장치는 산화그래핀 복합체는 유지시키고 이보다 작은 물질은 여과시키는 기질일 수 있고, 이외에도 상기 혼합물로부터 농축된 산화그래핀 복합체를 여과 또는 분리시킬 수 있는 장치이되, 키트에 포함될 수 있는 것이라면 본 발명에 포함된다.

여기서, 상기 기질은 상기 혼합물로부터 산화그래핀 복합체를 거를 수 있는 여과지와 같은 종이일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> miRNA에 의한 DNAzyme 활성화 시스템 제조

miRNA에 의한 DNAzyme 활성화 시스템으로서 miRNA 결합서열과 비활성화 DNAzyme 서열을 포함하는 이중분자비콘(dMB)을 준비하기 위해 100μM 센스 가닥 DNA 2.5μL를 1×에서 같은 양의 안티센스 가닥 DNA와 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 90℃에서 5분간 가열하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 서서히 냉각시킴으로써 어닐링(anealing)시켰다. 표적으로는 간에서의 특이적인 발현과 간 손상과의 강한 관련성 때문에 miR-122를 선택하였다.

구체적으로, 이중분자비콘(dMB) 구조는 toehold-mediated strand displacement(TMSD) 메커니즘에 대한 기존의 연구(D.Y.Zhang,S.X.Chen,P.Yin, Optimizing the specificity of nucleic acid hybridization, Nat. Chem, 4(2012) 208-214) 에 따라 7-nt toehold 영역으로 설계하였다. 이중분자비콘(dMB)의 센스 가닥은 2- 아데닌 스페이서(2- adenine spacer)로 연결된 miRNA 결합 서열과 DNAzyme 차단 서열로 구성된다. DNAzyme 차단 서열(Dz blocking element)의 길이는 표적 핵산의 존재하에서 활성화된 DNAzyme의 과산화효소 활성을 비교함으로써 4 nt로 결정되었다. 안티센스 가닥은 G - quadruplex DNAzyme 시퀀스, 2 - 티민 스페이서(2- thymine spacer), 그리고 단일 꼬리 요소 (= 부분적인 miR - 122 모방 시퀀스)로 구성된다. 두 가닥을 하이브리드화함으로써, DNAzyme의 활성을 위한 G-quadruplex 구조 형성이 차단되었고, miRNA-122에 의한 가닥 치환을 위해 7 개의 뉴클레오티드 toehold가 준비되었다(도 2 참조).

<실험예 1> 표적miRNA에 의한 DNAzyme 활성화 확인

<1-1> 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 분석

표적miRNA에 의해 본 발명의 이중분자비콘으로부터 DNAzyme이 활성화되는지를 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동과 DNAzyme 촉매화 과산화반응으로 확인하였다.

구체적으로, 12% 네이티브 폴리아크릴아마이드젤에 10 pmol의 이중분자비콘과 0-20 pmol의 표적핵산의 혼합물들, 각 폴리뉴클레오티드 컨트롤을 준비하여 100 V에서 한시간동안 전기영동을 통해 분리하였다.

실험 결과, 1 ×Dz 완충액 하에서, miRNA-122만이 RNA농도에 비례하여 새로운 밴드를 생성시키는 반면, 비특이적인 RNA는 원래의 dMB 밴드에 영향을 미치지 않았다 (도 3 참조). 이는 서열 특이적인 miRNA-122가 이중분자비콘(dMB)의 가닥 교체를 유발하고 DNAzyme가닥을 대체 할 수 있음을 제시한다.

<1-2> 이중분자비콘(dMB)을 이용한 서열특이적 비색 분석

miRNA-122 및 비색 기질로 2,2'- 아지노 - 비스 (3- 에틸 벤조 티아 졸린 -6 술폰산 (ABTS)) 시약과 함께 처리된 이중분자비콘(dMB)을 사용하여 서열특이적 비색 분석을 수행하였다( 4 μM 헤민, 5 mM ABTS, 0.5 mM H₂O₂).

구체적으로, 표적 핵산이 포함된 1X 완충액 (20mM Tris 완충액(pH 7.2), 20mM KCl 및 100mM NaCl)에 50 pmol의 이중분자비콘을 혼합한 뒤, 30분 후 4 pmol 헤민, 5 nmol ABTS, 0.5 nmol H₂O₂ 을 추가하였다.

실험 결과, 무색의 ABTS가 녹색 ABTS 양이온으로 산화됨으로써 420nm(A420)에서의 흡광도 증가가 확인되었다. 이와 대조적으로 scrambled RNA 또는 이중분자비콘(dMB)만을 함유하는 용액은 A420에서 거의 변화를 나타내지 않았다(도 4). 이는 DNAzyme은 서열특이적 표적이 존재하는 경우에만 활성화되고 ABTS의 산화를 촉매화함을 제시한다.

<실험예 2> DNAzyme 가닥을 포획하는데 필요한 GO의 양의 최적화

본 발명의 산화그래핀그물(GONET)방법을 이용한 비색 분석을 위한 실험에 앞서, 이중분자비콘으로부터 유리된 DNAzyme 가닥을 포획하는데 필요한 산화그래핀(graphene oxide, GO)의 최적량을 결정하고자 하였다.

산화그래핀은 알려진 합성 프로토콜(Y.K.Kim, D.H.Min, The structural influence of graphene dxide on its fragmentation during laser desorption/ionization mass spectrometry for efficient small-molecule analysis, Chemistry 21(2015) 7217-7223) 에 의해 준비하였으며, 주사 전자 현미경 (SEM), 원자 힘 현미경 (AFM), RAMAN 분광법 및 Fouriertransform 적외선 분광법 (FT-IR)을 이용하여 확인하였다. 단일가닥 DNAzyme(50 pmol)을 다양한 양의 산화그래핀(0-10 μg)을 함유하는 1 x Dz 완충액에서 20 분 동안 처리하였다. 산화그래핀이 흡착된 단일 가닥 DNAzyme을 스핀 다운시켜 상등액을 수득하고, 비색 시약(4 pmol 헤민, 5 nmol ABTS, 0.5 nmol H₂O₂)과 혼합하였다.

실험 결과, 상등액의 비색(A420)은 DNAzyme과 산화그래핀의 흡착으로 인해 산화그래핀의 농도가 증가함에 따라 감소하였고, 초기 상등액의 비색(A420)의 90 % 이상은 6 ㎍ 산화그래핀의 존재 하에 감소되었다 (도 5 참조). 고농도의 산화그래핀은 DNAzyme 포획의 효율을 높이지만, 고농도의 산화그래핀 자체의 갈색은 육안으로 관찰되는 배경색에 영향을 미쳤다. 산화그래핀에 의한 DNAzyme의 흡착은 소광에 의해 확인되었으며, 이는 비색 최적화 실험의 결과와 일치한다.

따라서 이중분자비콘으로부터 유리된 50 pmol DNAzyme 가닥을 포획하는데 필요한 산화그래핀(graphene oxide, GO)의 최적량을 6μg으로 확인되었다.

<실험예 4> GONET 기반 비색계 miRNA 분석의 성능 평가

산화그래핀그물(GONET) 방법을 이용한 비색계 miRNA 분석의 성능을 평가하기 위해 표적 miRNA에 의한 DNAzyme 활성화 및 산화그래핀그물(GONET)을 이용한 DNAzyme 포획을 용액내에서 수행했다.

구체적으로, miR-122를 100 nM 의 이중분자비콘(dMB)을 함유하는 1 x Dz 완충액(20mM Tris 완충액(pH 7.2), 20mM KCl 및 100mM NaCl) 500 μl에서 30분 동안 처리하였다. 활성화된 DNAzyme을 포획하기 위해 6μg 산화그래핀을 용액에 첨가한 후, 상기 혼합물을 15000rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 산화그래핀 펠렛을 1×완충액 100μL에 재현탁시키고 4nmol의 헤민(hemin), 5nmol의 ABTS 및 0.5 nmol의 H₂O₂와 비색계 시약을 첨가하여 발색시켰다.

실험 결과, miR-122를 함유한 시료는 산화그래핀 처리와 상관없이 표적 핵산이 없는 대조군에 비해 시간이 지남에 따라 녹색을 나타냈다(도 7 참조). 그러나, 산화그래핀을 처리한 샘플은 비색(A420)이 약 4 배 더 큰 차이를 나타내었고 활성화된 DNAzyme을 응집시킴으로써 더 명확하게 검출이 가능한 신포 증폭을 확인하였다. 산화그래핀이 처리된 샘플은 육안으로 쉽게 구별할 수 있는 짙은 녹색의 음영을 나타내었다.(도 8 참조).

이후, 2 개의 다른 대표적인 예측 바이오 마커인 miR-21과 let-7a를 사용하여 산화그래핀그물(GONET)을 이용한 miRNA검출을 반복하였다.

이 2개의 miRNA에 대한 이중분자비콘은 그 서열에 기초하여 miRNA결합 서열 및 그의 부분적으로 상보적인 서열을 간단히 변형시킴으로써 제조하였다.

그 결과, 동일한 실험 조건에서, miR-21과 let-7a에 대한 산화그래핀을 처리한 시료는 각각 3.2 배와 5.2 배 증가된 녹색을 보였다. 이 결과는 산화그래핀그물(GONET)이 비색계 검출 신호 향상을 위한 간편하면서도 매우 효율적인 방법이라는 것을 뒷받침한다.

<실험예 5> 표적 핵산 농도에 따른 분석한계의 결정

표적 핵산 농도에 따른 분석한계(LOD)를 결정하기 위하여 다양한 농도의 miR-122에 GONET을 이용한 비색 분석을 수행하였다.

구체적으로, 이중분자비콘(dMB) 100nM을 다양한 농도의 miR-122에 처리하고, 산화그래핀을 각 용액에 첨가한 후, 발색을 위한 비색계 시약을 첨가하였다.

실험 결과, 대조군인 산화그래핀 처리 없이 miR-122에 의해 활성화된 DNAzyme은 miR-122 농도가 증가함에 따라 색에서 유의한 차이가 없었으며, 흡광도에서 약간의 증가만을 보였다 (도 9 참조). 대조군은 12.92 nM의 분석한계로 표적 RNA 농도의 높은 범위 (> 10 nM)에서 선형성을 보였다(LOD = 3.3 (SD / S) (SD : 표준 편차, S : 검량선의 기울기))를 나타내는 반면에, 산화그래핀 처리된 샘플은 miR-122 농도가 증가함에 따라 점차 강한 녹색을 나타내었고, A420 값의 유의한 증가가 확인되었다. 분석한계(LOD)는 대조군 검출보다 10배 낮은 1.21nM를 나타내었다(도 9 참조).

상기한 실험 결과부터 본 발명에 따라 검출 신호가 증폭된 핵산 검출 방법은 보다 적은 농도의 표적 핵산에도 민감하고, 또한 표적 핵산 농도 증가에 따라 확연한 비색 검출 신호의 증폭을 확인할 수 있어, 표적 핵산의 정량 분석으로도 사용 가능한 방법임을 알 수 있다.

<실험예6> GONET 시스템의 종이 센서에의 응용

산화그래핀그물(GONET) 방법을 고효율의 현장현시검사(POCT)로 직접 사용할 수 있도록 종이에 적용하여 실험하였다.

구체적으로, miR-122 (~ 10 nM)로 사전 처리한 이중분자비콘(dMB)을 산화그래핀 및 헤민과 혼합한 혼합물을 종이 표면에 도포하였다.

그 결과, 산화그래핀은 DNA 나 RNA와 같은 대부분의 생체 분자보다 큰 2차원 물질이기 때문에 목표로하는 DNAzyme 분자(산화그래핀 복합체)는 산화그래핀 용액을 떨어뜨린 종이의 선택된 영역에 녹색을 축적할 수 있음을 알 수 있었다(도 11 참조).

산화그래핀을 처리하지 않은 경우, DNAzyme 분자뿐만 아니라 다른 DNA 나 RNA 분자가 종이 위에 흘러서 비색계 시약의 도포시 녹색이 거의 관찰되지 않은 반면, 산화그래핀을 처리하면 산화그래핀에 의해 포획된 DNAzyme 가닥은 의도한대로 특정 부위(종이 상)에 고정되었고, 비색계시약 도포시 miR-122의 농도에 따라 옅은 녹색에서 진한 녹색으로 색상이 몇 분 내에 검출되었다(도 12 참조).

또한, 둥근 반점 대신에 GONET 용액을 사용하여 문자를 찍어 DNAzyme 분자의 위치 특이적 증착 (site-specific deposition) 및 이에 상응하는 발색을 확인하였다.

종이에 활성화된 산화그래핀을 처리하면, 옅은 갈색빛의 Dz/GO 복합체가 글자의 모양에 따라 종이에 침착되었다. 비색계 시약을 처리 한 후, 산화그래핀을 처리하면 녹색이 몇 분만에 뚜렷하게 나타났으며 산화그래핀 처리가 없는 문자는 육안으로 거의 확인할 수 없었다(도 13 참조).

이러한 결과는 산화그래핀그물(GONET) 방법이 종이에 명확한 검출 지점을 형성할 뿐만 아니라 활성화된 DNAzyme 분자를 크기와 모양을 제어할 수 있는 지점에 응축시킴으로써 검출 성능을 향상 시킨다는 것을 나타낸다.

상기한 실험 결과부터 본 발명에 따라 검출 신호가 증폭된 핵산 검출 방법은 증폭된 검출 신호와 함께 종이 상에 빠르고 정확한 현장현시검사(POCT)로 유용한 방법임을 알 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Composition for detecting nucleotide comprising duplex molecular beacon and graphene oxide, and colorimetric signal enhancement method of detecting nucleotide using the same <130> 2019P-06-040 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> purchased from Bioneer (Daejeon, Korea) <400> 1 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> purchased from Genotech (Daejeon, Korea) <400> 2 acccttcaaa caccattgtc acactcca 28 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> purchased from Genotech (Daejeon, Korea) <400> 3 tgacaatggt gtttgaaggg tagggcgggt tggga 35 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> purchased from Genotech (Daejeon, Korea) <400> 4 gggtagggcg ggttggga 18

Claims

산화그래핀, 이중분자비콘(duplex molecular beacon), 및 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 포함하고,
상기 이중분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 DNAzyme 서열을 포함하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이되,
표적 핵산 존재하에 상기 제2 단일가닥은 제1 단일가닥으로부터 분리되고 산화그래핀에 흡착되어 산화그래핀 복합체를 형성하는 것인,
검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 이중분자비콘의 제1 단일가닥이 표적 핵산과 혼성화되면, 제2 단일가닥은 상기 이중분자비콘으로부터 분리되고, 분리된 제2 단일가닥은 산화그래핀에 흡착되어 산화그래핀 복합체를 형성하고, 상기 산화그래핀 복합체를 여과 또는 분리를 통해 농축시켜 이로부터 증폭된 검출 신호를 얻을 수 있는 것인,
검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 비색계 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 비색계 시약은,
ABTS, OPD, DAB, AEC, TMB, AmplexRed, 및 Homovanilic acid로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상; 및
1종 이상의 과산화물을 포함하는 것인,
검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DNAzyme 코펙터(cofactor)는 헤민(hemin)인, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산화그래핀은 10nm 내지 1μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 조성물.
표적 핵산을 포함하는 시료와 이중분자비콘(duplex molecular beacon)을 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및
상기 혼합물에 산화그래핀을 첨가하는 단계; 및
상기 혼합물을 여과 또는 분리시켜 농축된 산화그래핀 복합체를 얻는 단계;를 포함하는, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법이되,
상기 이중분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 DNAzyme 서열을 포함하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법.
제8항에 있어서,
상기 혼합물에 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법.
제8항에 있어서,
상기 농축된 산화그래핀 복합체에 비색계 시약을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법.
제8항에 있어서,
상기 여과 또는 분리를 통하여 농축된 산화그래핀 복합체로부터 증폭된 비색계 검출 신호가 얻어지는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법.
제11항에 있어서,
상기 여과는 산화그래핀 복합체는 유지시키고 이보다 작은 물질은 여과시키는 기질 상에 수행되는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법.
제11항에 있어서,
상기 분리는 원심분리를 통하여 농축된 산화그래핀 복합체 펠렛을 얻는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산의 검출 방법.
산화그래핀, 이중분자비콘(duplex molecular beacon), 및 DNAzyme 코펙터(cofactor)를 포함하는 조성물을 포함하는 키트이되,
상기 이중분자비콘은 표적 핵산 결합 서열을 포함하는 제1 단일가닥과 DNAzyme 서열을 포함하는 제2 단일가닥이 적어도 일부분에서 상보적으로 결합되어 이루어지는 것이고,
표적 핵산 존재하에 상기 제2 단일가닥은 제1 단일가닥으로부터 분리되고 산화그래핀에 흡착되어 산화그래핀 복합체를 형성하는 것인,
검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 키트.
제14항에 있어서,
상기 키트는, 상기 조성물과 표적 핵산을 혼합하여 혼합물이 얻어지면 상기 혼합물을 여과 또는 분리하여 농축된 산화그래핀 복합체를 얻을 수 있는 장치를 더 포함하는 것인, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 키트.
제 14항에 있어서,
상기 키트는 비색계 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 키트.
제15항에 있어서,
상기 장치는 산화그래핀 복합체는 유지시키고 이보다 작은 물질은 여과시키는 기질인 것을 특징으로 하는, 검출 신호가 증폭된 핵산 검출용 키트.