KR20190043687A - 분자비콘을 포함하는 비브리오균의 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 분자비콘을 포함하는 비브리오속 균의 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
인체에 수많은 질병을 일으키는 병원성 미생물의 검출 및 진단은 인류의 복지를 위해 매우 중요한 분야로, 특히 인간에게 가장 중요한 에너지원인 식품의 경우 이러한 병원성 미생물에 대한 안전성 검사가 이루어지지 않는다면 이를 통한 발병이 빈번하게 일어날 수 있다. 이러한 이유로 병원성 미생물을 검출하고 진단하기 위한 노력이 많이 이루어져 왔다. 인간에게 나타나는 주요한 질병 중에 증상으로 나타나는 임상적인 특징들은 발견되나 이러한 증상을 설명할만한 원인이 규명되지 않은 대부분의 질병들이 분류학적 구분이 모호하여 아직까지 동정되지 않은 세균에 의한 것이라는 보고가 있은 후 수년 전부터 이러한 병원성 미생물에 대한 새로운 검출방법의 개발이 모색되고 있다.
최근 전통적인 PCR 기반의 진단방법보다 진일보한 LAMP(loop-mediated isothermal amplification, 고리매개 등온증폭) 반응이 개발되었다. LAMP 반응은 기존 PCR에서 증폭반응이 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 신장(extension)의 3단계로 이루어지던 것과는 다르게, 온도변화 없이 일정한 온도에서 어닐링 및 신장이 가능하기 때문에 반응 시간이 1시간 이내로 짧고, 온도 변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없으며, 일정온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비 필요없이 간단한 항온기만으로 실험이 가능하여 현장 활용성이 높다. 또한 증폭하고자 하는 유전자 서열의 6개 부위를 인지하는 특이적인 4개의 프라이머를 사용하기 때문에 표적 유전자에 대한 특이성이 매우 높다.
비브리오균은 슈도모나스목 스피리륨(나선균)에 속하는 세균으로, 그람 음성이며 하나 또는 여러 개의 편모가 있으며, 굽은 막대 모양을 하고 있다. 지금까지 34종이 알려져 있다. 세포가 길지 않지만 휘어져 있고 단립(單立)하거나 몇 개 연결되어 나선상이 된다. 몸의 한쪽 끝에는 1개 또는 여러 개의 편모가 나 있고, 이것으로 활발히 유영하여 움직인다. 그람음성균으로써 야생종은 바닷물에 널리 분포하며, 담수와 토양에서도 많이 발견되는데 생활은 부생적(腐生的)이다. 사람이나 어류에서 병원성을 나타내는 것이 있는데, 병원성이 있는 대표종으로는 비브리오콜레라균(Vibrio cholerae)과 세균성 식중독으로 알려진 장염비브리오(V. parahaemolyticus)가 있다.
한편, 한국등록특허 제0607901호에는 '분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0027011호에는 '장염비브리오균의 내열성 용혈독 유사독소 유전자의 검출시약'이 개시되어 있으나, 본 발명의 분자비콘을 포함하는 비브리오속 균의 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도는 기재된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 비브리오속 균에 특이적인 LAMP용 프라이머 세트와, 상기 프라이머 세트를 통해 증폭되는 산물에 결합할 수 있는 DNA 기반 효소 서열을 포함한 분자비콘을 제작하였고, 상기 프라이머 세트와 분자비콘을 이용하여 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 및 이속(異屬)의 미생물을 대상으로 LAMP 반응을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트 및 분자비콘을 포함하는 LAMP용 조성물이 비브리오 균을 특이적으로 검출하며, LAMP 반응의 위양성(false positivev)을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 비브리오속 균의 검출용 LAMP 조성물; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 비브리오 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 비브리오속 균의 검출용 LAMP 조성물을 이용하여 등온 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 등온 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 비브리오 속 균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 비브리오속 균의 검출용 LAMP 조성물 및 이를 이용한 비브리오속 균의 검출 방법은 등온 조건에서 유전자를 증폭할 수 있어 온도 구배가 필요한 전통적인 PCR에 비해 상대적으로 반응시간이 짧고, 온도변화에 따른 DNA 손상 및 손실이 적어 증폭 효율이 우수하며, 고가의 유전자 증폭기(thermal cycler)와 같은 장비가 필요없고, 비색반응을 통한 육안 검출이 가능하여 현장검시에 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 LAMP 조성물은, 위양성을 배제하고자 증폭된 산물에 혼성화되는 분자비콘을 사용하여 검출의 정확도를 향상시켜, 비브리오균의 감염이 의심되는 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 작용원리를 모식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘을 이용한 비브리오균의 검출 결과를 보여주는 것으로, (A)는 최종 반응 산물의 비색 반응 결과로, 상측은 반응 종료 시약을 첨가하기 전의 모습이고, 하측은 반응 종료 시약을 첨가한 후의 모습을 보여준다. 또한, (B)는 비색 반응 종료 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정한 값을 그래프화한 것이고, (C)는 등온 증폭 반응 산물의 아가로스 겔 로딩 사진이다.
도 3은 LAMP 반응의 최적화를 위해, 분자비콘의 농도(A) 및 등온 증폭 반응 시간(B)의 조건을 확인한 결과이다. Signal to noise : {음성 시료의 흡광도/양성 시료의 흡광도)-1} x 100.
도 4는 본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘을 이용한 비브리오균 검출능의 민감도를 확인하기 위해, 다양한 농도의 시료 DNA를 이용한 LAMP 반응의 결과이다.
도 5는 본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘을 이용한 비브리오균 검출능의 특이도를 확인하기 위해, 비브리오균 또는 다른 종류의 미생물 단독, 및 비브리오균과 다른 미생물종과의 혼합 시료를 대상으로 LAMP 반응을 수행한 결과이다. VP: Vibrio parahaemolyticus, BC: Bacillus cereus, EC: Escherichia coli, SA: Staphylococcus aureus, ST: Salmonella Typhimurium, LM: Listeria monocytogenes.
도 6의 (A)는 LAMP에서 흔히 나타나는 위양성(false positive) 결과를 확인할 수 있는 전기영동 결과이며, (B)는 위양성 결과를 보였던 LAMP 반응물의 분자 비콘을 이용한 검정 결과이다. P: 양성 시료, N: 음성 시료.
도 2는 본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘을 이용한 비브리오균의 검출 결과를 보여주는 것으로, (A)는 최종 반응 산물의 비색 반응 결과로, 상측은 반응 종료 시약을 첨가하기 전의 모습이고, 하측은 반응 종료 시약을 첨가한 후의 모습을 보여준다. 또한, (B)는 비색 반응 종료 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정한 값을 그래프화한 것이고, (C)는 등온 증폭 반응 산물의 아가로스 겔 로딩 사진이다.
도 3은 LAMP 반응의 최적화를 위해, 분자비콘의 농도(A) 및 등온 증폭 반응 시간(B)의 조건을 확인한 결과이다. Signal to noise : {음성 시료의 흡광도/양성 시료의 흡광도)-1} x 100.
도 4는 본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘을 이용한 비브리오균 검출능의 민감도를 확인하기 위해, 다양한 농도의 시료 DNA를 이용한 LAMP 반응의 결과이다.
도 5는 본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘을 이용한 비브리오균 검출능의 특이도를 확인하기 위해, 비브리오균 또는 다른 종류의 미생물 단독, 및 비브리오균과 다른 미생물종과의 혼합 시료를 대상으로 LAMP 반응을 수행한 결과이다. VP: Vibrio parahaemolyticus, BC: Bacillus cereus, EC: Escherichia coli, SA: Staphylococcus aureus, ST: Salmonella Typhimurium, LM: Listeria monocytogenes.
도 6의 (A)는 LAMP에서 흔히 나타나는 위양성(false positive) 결과를 확인할 수 있는 전기영동 결과이며, (B)는 위양성 결과를 보였던 LAMP 반응물의 분자 비콘을 이용한 검정 결과이다. P: 양성 시료, N: 음성 시료.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 'LAMP(Loop-mediated isothermal amplification, 고리매개 등온증폭법)'는 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 표적 서열의 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법이다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 올리고뉴클레오티드 프라이머(FIP, BIP, F3, B3)가 필요하다. 상기 4종의 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2 종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 LAMP 조성물에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 비브리오속 균의 용혈소(hemolysin) 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트로, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이고, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이고, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이다.
본 명세서에서 용어, "올리고뉴클레오티드" 란 수 개에서 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르결합으로 중합한 상태로서, 당부분이 리보오스로 구성된 올리고리보뉴클레오티드와 디옥시리보오스로 구성된 올리고디옥시리보뉴클레오티드가 있다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2 내의 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3 내지 4의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(42개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "분자비콘(molecular beacon)" 이란, LAMP 반응 산물에 상보적이도록 디자인된 올리고뉴클레오티드로, 가운데 DNA 기반 효소(DNAzyme)인 HRPzyme의 서열을 포함하고 있으며, 양 말단 10bp는 증폭산물의 표적 서열에 상보적으로 디자인하였다.
본 발명에서는 양성 시료가 포함된 경우 LAMP 증폭산물에 분자비콘이 혼성화되어, 반응물 내 유리하는 분자비콘이 아예 없거나 극히 소량으로 존재하게 되므로, 헤민(hemin)과 G-quadruplex를 형성하지 않거나, 형성된 G-quadruplex의 양이 적으며, 음성 시료가 포함된 경우 LAMP 증폭산물에 분자비콘이 혼성화되지 않기 때문에, 반응물 내에 분자비콘이 유리상태로 존재하여 헤민과 반응하여 G-quadruplex를 형성하게 된다. 따라서, TMB 등과 같은 기질용액을 첨가하면, 음성 시료에서는 형성된 G-quadruplex가 기질과 반응하여 강한 비색 반응을 나타내며, 양성 시료에서는 약한 비색 반응 또는 비색 반응이 나타나지 않아, 음성 시료에 비해 발색의 정도가 낮게 확인된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 LAMP 조성물에 있어서, 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘은 LAMP 반응에 의해 증폭된 표적 산물에 혼성화될 수 있는 프로브로, 양 말단 8~12bp의 염기는 LAMP 반응에 의해 증폭된 산물과 상보적인 서열로 이루어져 있으며, 내부에는 DNA 기반 효소(DNAzyme)의 서열을 포함하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "DNA 기반 효소(DNAzyme)"란 다른 핵산 분자들을 효소적으로 쪼갤 수 있는 합성 DNA 분자로, 본 발명의 상기 DNA 기반 효소는 HRP(horseradish peroxidase)-like DNA(HRPzyme) 서열일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 5의 11번째부터 28번째 염기가 HRPzyme 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 비브리오속 균의 검출용 LAMP 조성물에 있어서, 상기 비브리오 속 균은 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 미미쿠스(V. mimicus), 비브리오 플루비알리스(V. fluvialis), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 또는 비브리오 신신나티엔시스(V. cincinnatiensis)일 수 있고, 바람직하게는 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 LAMP 조성물; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 LAMP 조성물은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약은 본 발명의 분자비콘 서열 내에 포함된 DNA 기반 효소(DNAzyme)의 촉매 및 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
비브리오 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 이용하여 등온 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 등온 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 비브리오속 균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 비브리오 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 LAMP 프라이머 세트와 분자비콘를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 검출 방법에서, 상기 표적 서열을 증폭하는 단계는 57~62℃의 온도 조건에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 58.8℃의 온도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표적 서열을 증폭하는 단계에서 분자비콘의 농도는 3~5μM일 수 있으며, 바람직하게는 4μM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 표적 서열을 증폭하는 단계에서 등온 증폭 반응 시간은 30~40분일 수 있으며, 바람직하게는 40분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 비색 분석, 형광 측정, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 바람직하게는 비색(colorimetric) 분석을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 비브리오속 균의 검출법은, 등온 증폭 반응 종료 후 반응 용액에 헤민(hemin)을 첨가하여, 유리(free) 분자비콘 서열의 HRP-like DNA 서열과 헤민이 결합하여 G-quadruplex/hemin 복합체를 형성하도록 유도한 후, 과산화수소(H2O2)와 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)를 넣어 반응시킨 후, 발색 반응 종료 시약(황산 또는 염산)을 첨가하여 반응을 종료하게 한다. 반응 종료 후의 용액 내의 흡광도는 당업계의 공지된 기술을 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 방법은 비브리오속 균에 대해 양성인 시료에서는 분자비콘이 증폭된 산물에 혼성화가 이루어져 등온 증폭 반응 종료 후의 반응 용액에 유리 분자비콘이 적게 존재하고, 반대로 비브리오속 균에 대해 음성인 시료에서는 분자비콘이 증폭된 산물에 혼성화가 이루어지지 않아 등온 증폭 반응 종료 후의 반응 용액에 유리 분자비콘이 많이 존재하는 원리를 이용한 것으로, 검출하고자 하는 표적 DNA의 농도가 높게 존재할수록 흡광도가 낮아지고, 음성 시료에서는 흡광도가 높아지도록 하였다. 본 발명은 방법은 LAMP 반응에서 문제시 되고 있는 위양성(false positive) 문제를 해결하여 검출의 정확도를 향상시킨 방법이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
사용균주
본 발명에서는 생물자원센터(KCTC)에서 분양받은 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)와 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받은 비브리오속 균종인 비브리오 미미쿠스(V. mimicus), 비브리오 플루비알리스(V. fluvialis), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus) 및 비브리오 신신나티엔시스(V. cincinnatiensis)를 이용하였다. 또한, 본 발명의 검출 특이성을 확인하기 위하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus; KCTC 7464), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes; KCTC 11994), 대장균(Escherichia coli; KCCM 40405), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium; ATCC 19585) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus; ATCC 14458)를 분양받아 실험에 사용하였다.
시약 및 기기
DNA 증폭은 T100TM Thermal Cycler(Bio-Rad, 미국)를 사용하였고, 아가로스 겔은 아가로스 LE(iNtRON, 한국)를 사용하였으며, 전기영동장치는 Mupid-α(Advance, 일본)를 이용하였다. 증폭산물의 비색반응은 1-StepTM Ultra TMB-ELISA (Thermo, 미국)와 30% 과산화수소(DUKSAN, 한국) 및 2M 황산(Thermo)을 사용하였다. 또한, 아가로스 겔의 이미지는 Fusion FX(VILBER LOURMAT, 독일)로 촬영하였고, 흡광도는 SPARK 10M TECAN, 스위스)을 사용하여 450nm에서 측정하였다.
배지 및 DNA 분리
비브리오속 균은 TCBS 고체배지(Difco, 프랑스)에 도말하여 형성된 단일 콜로니를 2% 염화나트륨이 포함된 TSB(Tryptone Soya Broth; OXOID, 영국)에 접종하고 37℃에서 18시간 진탕배양한 후 사용하였다. DNA의 분리는 상기 배양한 비브리오속 균의 배양액을 LabopassTM Genomic DNA Isolation 키트(Cosmo genetech, 한국)를 이용하여 공급자가 제시한 방법에 따라 DNA를 분리하였다.
LAMP 프라이머 세트 및 분자비콘(molecular beacon) 디자인
비브리오속 균에 특이적인 용혈소(hemolysin) 유전자를 표적 부위로 하는 염기서열을 NCBI(National center for biotechnology information)에서 검색하였으며, 검색된 염기서열을 사용하여 Primer Explorer V4 software program and Primer3 Input(version 0.4.0, DNA STAR, Inc., Madison, W1, 미국) 프로그램을 이용하여 LAMP용 프라이머 세트(FIP, BIP, F3 및 B3)와 분자비콘을 설계하였으며, 설계된 프라이머 세트 및 분자비콘은 Xenotech사(미국)에 의뢰하여 합성하였다(표 1).
| 염기서열 (5'→3') | |
| FIP | TATCGCACCAGCTACTCGAAAGCATCTTCGTTTTTTGCCCAT (서열번호 1) |
| BIP | ACAGCGAACATAGGTATAGGTTTGGAGAGCCAACCTTATCACC (서열번호 2) |
| F3 | CACCAGTAGCCGTCAATG (서열번호 3) |
| B3 | TAACTGCATTACTCCCGC (서열번호 4) |
| molecular beacon | CTGTTGGTAT GGGTAGGGCGGGTTGGGT GATGATCCAG (서열번호 5) |
LAMP 반응 조건
등온비색 PCR법은 Notomi 등(Nucleic Acids Research, 2000, 28(12):E63)의 방법을 이용하여 시행하였으며, 총 반응용액은 반응 튜브당 다음과 같이 제조하였다. 10X 반응 버퍼(20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 2mM MgSO4, 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, Enzynomics, 한국) 5.0㎕, 40μM의 내부 프라이머(FIP, BIP)와 10μM의 외부 프라이머(F3, B3)가 혼합된 프라이머 혼합물 4.0㎕, 100μM의 molecular beacon 2.0㎕, 10nM dNTP mix(2.5 mM each, Cosmo, 한국) 8.0㎕, Bst DNA 중합효소(Large length, Enzynomics) 4.0㎕와 멸균수를 포함하여 44㎕가 되도록 혼합하였으며 한 번에 제조하여 분주하였다. 여기에 시료 50㎍/㎖ 농도의 DNA 6㎕를 첨가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 하였고, 58.8℃에서 30분 반응하였다.
전기영동에 의한 증폭산물 확인
1.0%(w/v) 아가로스 겔을 이용하여 Mupid-α 전기영동 장치로 PCR 산물을 분석하였다. 각 레인에는 증폭산물 5㎕와 6X loading star(Dyne Bio, 한국) 1㎕를 섞어서 5㎕씩 로딩하고 100V에서 25분 동안 전기영동하였다. 그 후에 UV transilluminator 위에 겔을 올려놓고 표적 산물의 증폭여부를 확인하였다.
비색법에 의한 증폭산물 확인
DMSO(Dimethyl Sulfoxide; Sigma, 미국)을 용매로 한 100μM의 헤민(hemin; sigma)을 각 웰에 1㎕ 분주하고 PCR 산물을 10㎕ 첨가한 후, 30% 과산화수소 2㎕와 TMB 용액 1㎖을 볼텍싱하여 혼합하고 이를 상기 각 웰에 100㎕ 첨가하고 2분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응 종료를 위해 2M 황산을 100㎕씩 첨가하고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1. LAMP 프라이머 세트 및 분자비콘을 이용한 비브리오균의 검출능 확인
상기 표 1에 제시된 프라이머 세트 및 분자비콘을 이용하여, 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)의 검출능을 분석하였다.
그 결과, 비브리오균을 포함하는 양성 시료에서의 흡광도가 음성 시료보다 낮은 것으로 확인되었으며(도 2A, B), 등온 반응 산물을 아가로스 겔에 로딩한 결과, 음성 시료에서는 반응 산물이 확인되지 않음을 알 수 있었다(도 2C).
본 발명의 LAMP 반응에 있어서, 보다 최적화된 반응을 위해, 분자비콘의 농도(1, 2, 4, 8 및 10μM) 및 등온 증폭 반응 시간(10, 20, 30, 40, 50 및 60분)을 분석하였다. 그 결과, 분자비콘은 최종 농도 4μM일 때(도 3A), 등온 증폭 반응 시간은 30~40분일 때(도 3B) 최적의 LAMP 반응이 일어나는 것으로 확인되었다.
실시예
2.
LAMP
프라이머
세트 및
분자비콘의
민감도 및 특이도 분석
상기 실시예 1을 통해 비브리오균의 검출이 확인된 서열번호 1 내지 4의 LAMP 프라이머 세트 및 서열번호 5의 분자비콘을 이용하여 비브리오균 검출의 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 분석하였다.
민감도 확인을 위해 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)의 게놈 DNA를 1fg(10-15)부터 10㎍까지 준비하고 LAMP 반응을 수행하였다. 그 결과, 1fg의 DNA 시료에 대해서도 음성 대조군과 비교하여 뚜렷한 증폭신호를 확인할 수 있었다(도 4).
특이도 확인을 위해, 비브리오 파라해모리티커스, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 대장균(Escherichia coli) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 단독으로 또는 비브리오균과 혼합하여 DNA 시료를 준비하고, LAMP 반응을 수행하였다. 그 결과, 비브리오 파라해모리티커스 단독 및 상기 비브리오균을 포함하고 있는 시료에서는 바실러스 세레우스, 대장균, 리스테리아 모노시토게네스, 살모넬라 티피뮤리움 및 스타필로코커스 아우레우스균 단독 시료에 비해 옅은 비색 반응 결과가 확인되었으며(도 5A 및 5B), 아가로스 겔 로딩 결과에서도 비브리오균을 포함한 시료에서만 LAMP 특이적인 사다리 모양의 밴드가 확인되었다(도 5C).
실시예 3. 분자비콘의 사용에 따른 위양성(false positive) 분석
HRPzyme DNA 서열을 포함하는 분자비콘의 사용에 따른 LAMP 반응의 위양성 결과를 분석하였다. 비브리오균(양성)과 대장균(음성)의 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 LAMP용 프라이머 세트를 이용하여 조건 최적화 실험을 수행하던 중, 등온 증폭 반응의 시간이 60분인 조건에서, 최종 증폭 산물에서 위양성이 확인되었다(도 6A). 이에 본 발명자들은 해당 시료를 대상으로, 분자비콘을 이용한 비색반응을 통해 결과 해석의 보정이 가능한지 확인하였다.
그 결과, 아가로스 겔 로딩 결과를 통해서는 정확한 검출이 불가능하였던 시료가, 분자비콘을 이용한 비색반응 결과를 통해서는 발색 정도의 명확한 차이를 통해 양성과 음성 시료가 구분될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 6B). 즉, LAMP 반응 산물의 전기영동 결과에서는 표적 미생물의 정확한 판별이 불가능하였으나, 비색 반응을 통해서는 음성 시료의 강한 발색과 대비되는 약한 발색 수준의 양성 시료에 대한 판별이 육안으로 용이하게 구별될 수 있음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 분자비콘을 이용한 본 발명의 LAMP 방법의 위양성 문제를 효과적으로 해결하여 검출 결과의 정확도를 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY
Gwangju Institute of Science and Technology
<120> Composition for colorimetric isothermal detecting of vibrio
species containing molecular beacon and uses thereof
<130> PN17377
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
tatcgcacca gctactcgaa agcatcttcg ttttttgccc at 42
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
acagcgaaca taggtatagg tttggagagc caaccttatc acc 43
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
caccagtagc cgtcaatg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
taactgcatt actcccgc 18
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> molecular beacon
<400> 5
ctgttggtat gggtagggcg ggttgggtga tgatccag 38
Claims (6)
- 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 비브리오속 균은 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)인 것을 특징으로 하는 비브리오속 균의 검출용 LAMP 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 LAMP 조성물; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약을 포함하는 비브리오속 균의 검출용 키트.
- 비브리오 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 분자비콘(molecular beacon);을 이용하여 등온 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 등온 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 비브리오속 균의 검출 방법. - 제4항에 있어서, 상기 등온 증폭 반응은 57~62℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 비색 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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