JP5019431B2 - インフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キット - Google Patents

Description

本発明はインフルエンザ菌の検出方法に関し、特にインフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キットに関する。

インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、以下「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ」については「Ｈ．」と略記することもある。）は中耳炎、肺炎、髄膜炎、菌血症の原因菌の一つで、近年様々な耐性菌が出現して問題となっている。

従来、インフルエンザ菌を検出するために、培養による選別と生化学的検査が併用されていたが、培養による選別と生化学的検査の併用した場合には、感染が判明するまでに３日以上を要するのに加え、コロニーをその形状や色の相違などから精確に選別するためには熟練した技術が必要であり、臨床診断及びその後の処置に支障をきたすおそれがあった。
一方、近年においては、特許文献１にも示されるように、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いた検出方法も採用されている。

ＰＣＲ法を用いて検出する場合には、インフルエンザ菌に特徴的な遺伝子を標的として増幅反応を行うのが一般的であり、このようなインフルエンザ菌に特徴的な遺伝子として、例えば表層蛋白質であるＰ６蛋白質をコードするＰ６蛋白遺伝子が知られている。しかしながら、Ｐ６蛋白遺伝子を標的とした場合にも、インフルエンザ菌と同一環境内で共生しかつ遺伝的にも近似したパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、以下「Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ」と略記することもある。）との区別は困難であった。また、この場合、ハイブリダイゼーション法を併用することにより特異性を高めることも可能であるが（参照文献１：Ｔ．Ｕｅｙａｍａ，他４名，“Ｈｉｇｈ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｒ Ｅｆｆｕｓｉｏｎｓ ａｓ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９５，Ｊｕｌｙ，ｐ．１８３５−１８３８）、検出するまでに多くの時間や費用を要する。

また、インフルエンザ菌は、莢膜の相違によって莢膜ａ〜ｆ型及び莢膜のない無莢膜型が存在し、これらの中でも莢膜ｂ型インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｔｙｐｅ ｂ、以下、「Ｈｉｂ」と記すこともある。）が、特に小児において髄膜炎、喉頭蓋炎、菌血症、肺炎等の深刻な病気をもたらす病原の１つとなっている。このため、日本以外の先進国を中心に、小児に対してＨｉｂワクチンの接種が行われているものの、ワクチン接種後にＨｉｂ感染症を発症する例が報告されており、感染の早期発見という本来の目的に加えて、ワクチン接種後の効果の確認という要請から簡便で感度に優れたＨｉｂ検出方法が求められている。また、Ｈｉｂワクチンの接種が行われていない開発途上国におけるＨｉｂ感染拡大の可能性も報告されており、このような国でも簡便、迅速に行えるＨｉｂの検出方法が求められている。

しかし、従来から行われている血清学的型別法は、Ｈｉｂによっては特徴的な形質の発現が抑制されていることがあり、感染を陰性と誤診断したり、非感染を陽性と誤診断したりしてしまうおそれがあり、あいまいな結果しか提供しなかった。また、非特許文献１に示されるようにＰＣＲ法に基づき検出する方法もあるが、この方法はコストや手間、時間を要し、さらにサーマルサイクラーのような特別な設備が必要なため、設備の不十分な病院の検査室や、上記のような開発途上国で手軽に実施するがことできなかった。

本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであり、精確、迅速にインフルエンザ菌及び莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出可能なインフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キットを提供する。
特開２０００−３４２２６８号公報 Ｆａｌｌａ，Ｔ．Ｊ．，Ｄ．Ｗ．Ｃｒｏｏｋ，Ｌ．Ｎ．Ｂｒｏｐｈｙ，Ｄ．Ｍａｓｋｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．Ｋｒｏｌｌ，ａｎｄ Ｅ．Ｒ．Ｍｏｘｏｎ，１９９４，ＰＣＲ ｆｏｒ ｃａｐｓｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３２：２３８２−２３８６

上記課題を解決するために、本発明者らは、従来のＰＣＲ法による増幅反応よりも特異性に優れるＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法に着目した。これとともに、ＬＡＭＰ法による核酸増幅に用いるＬＡＭＰプライマーの配列に、インフルエンザ菌に特徴的なＰ６蛋白遺伝子配列のうち、さらにパラインフルエンザ菌とも異なる領域を組み込むことで、パラインフルエンザ菌及びその他の菌に対しても優れた特異性を有するインフルエンザ菌の検出方法を開発することに成功した。

すなわち、本発明のインフルエンザ菌の検出方法は、ＬＡＭＰプライマーセットを用いた核酸増幅反応による核酸増幅の有無に基づいてインフルエンザ菌を検出する方法であって、
前記プライマーセットとして、全てのプライマーが、インフルエンザ菌のＰ６蛋白遺伝子のうち９０番目より下流塩基領域中の部分塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなり、かつ、少なくとも１つのプライマーが、インフルエンザ菌のＰ６蛋白遺伝子のうち、９０番目から１８３番目、又は、３３７番目から４６２番目までの非相同領域中の部分塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるＬＡＭＰプライマーセットを用いることを特徴とする。

なお、インフルエンザ菌ＲｄのＰ６蛋白遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿０００９０７）の塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。
ここで、プライマーの設定範囲を９０番目より下流塩基領域としたのは、１〜９０番目の領域は、配列中に、水素結合力の強いＧＣの含有率が低いため、プライマーの反応の安定性に劣り、インフルエンザ菌が存在しても検出しない等検出の信頼性に劣るので、検出に用いるプライマーとして適さない。９０番より下流塩基領域の中でもより３’末端側の領域が好ましい。

また、全てのプライマーが、インフルエンザ菌のＰ６蛋白遺伝子のうち９０番目より下流塩基領域中の部分塩基配列と同一若しくは実質的に同一な塩基配列、又は、これらと相補的な塩基配列からなり、かつ、９０番目から１８３番目、又は、３３７番目から４６２番目までの非相同領域中の部分塩基配列と同一若しくは実質的に同一な塩基配列、又は、これらと相補的な塩基配列としたのは、この領域がインフルエンザ菌に特徴的、特にパラインフルエンザと比べてもインフルエンザ菌に特異的な領域であるためである。なお、これらのうちでも、上記のように３’末端よりの領域の方がＧＣ含有率の高いことから、３３７番目から４６２番目までの非相同領域中の部分塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いることが好ましい。

本発明のインフルエンザ菌の検出方法は、前記ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）〜（ｒ）に示すプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットのいずれかであることを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号１〜４に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｂ）上記（ａ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｃ）配列番号６〜９に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｄ）上記（ｃ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｅ）配列番号７〜９及び配列番号１１に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｆ）上記（ｅ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｇ）配列番号１５〜１８に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｈ）上記（ｇ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｉ）配列番号２０〜２３に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｊ）上記（ｉ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｋ）配列番号２４〜２７に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｌ）上記（ｋ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｍ）配列番号２６及び配列番号２８〜３０に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｎ）上記（ｍ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｏ）配列番号２６及び配列番号３０〜３２に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｐ）上記（ｏ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｑ）配列番号３３〜３６に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（ｒ）上記（ｑ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。

ここで、実質的に同一な塩基配列からなるプライマーは、上記所定の配列番号に記載の塩基配列からなるプライマーと略同様の反応を行い、略同様の作用効果を発揮するプライマーであって、例えば、ＬＡＭＰプライマーを構成するＦ３，Ｆ２，Ｆ１，Ｂ１ｃ，Ｂ２ｃ，Ｂ３ｃなどの各領域（詳細は後述する。）のＰ６蛋白遺伝子における対応位置が、上記所定の配列番号の塩基配列からなるＬＡＭＰプライマーを構成する各領域と比べ、次のように変わったものが挙げられる。
１）上記領域のＰ６蛋白遺伝子における対応位置が、１〜２塩基シフトしたもの（例えば、Ｐ６蛋白遺伝子の２５４番目−２７５番目に設定される領域と、２５５番目−２７６番目に設定される領域の関係）。
２）上記領域の５’末端及び３’末端のいずれか一方のＰ６蛋白遺伝子における対応位置が、１〜２塩基伸縮したもの（例えば、Ｐ６蛋白遺伝子における設定位置が２５４番目−２７５番目に設定される領域と、２５５番目−２７５番目のプライマーに設定される領域の関係）。
３）上記領域の５’末端及び３’末端の双方のＰ６蛋白遺伝子における対応位置が１塩基ずつ異なる方向に向かって伸びたもの（例えば、Ｐ６蛋白遺伝子における設定位置が２５５番目−２７５番目に設定される領域と、２５４番目−２７６番目に設定される領域の関係）、又は縮んだもの（例えば、Ｐ６蛋白遺伝子における設定位置が２５５番目−２７５番目に設定される領域と、２５６番目−２７４番目に設定される領域の関係）。
４）上記領域の１〜２塩基がＰ６蛋白遺伝子とは異なる塩基に置換され、又は１〜２塩基が欠失したものも含まれる。
上述のようなＬＡＭＰプライマーセットを用いれば、特異性、検出感度に優れる。

前記ＬＡＭＰプライマーセットは、以下の（ｓ）〜（ｘ）に示すプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットのいずれかであることを特徴とする。
（ｓ）請求の範囲第２項（ａ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（ｔ）請求の範囲第２項（ｂ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（ｕ）請求の範囲第２項（ｃ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（ｖ）請求の範囲第２項（ｄ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（ｗ）請求の範囲第２項（ｇ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号１９に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（ｘ）請求の範囲第２項（ｈ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号１９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。

配列番号５、１０及び１９に記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を有するプライマーはいわゆるＬｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒであり、これを用いることで増幅反応速度がより迅速になり、迅速にインフルエンザ菌を検出することができる。
本発明のインフルエンザ菌の検出方法は、プライマーセットを用いた核酸増幅反応による核酸増幅の有無に基づいて莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出する方法であって、前記プライマーセットとして、全てのプライマーが、莢膜ｂ型インフルエンザ菌の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の１〜６６５３番目の領域中の部分塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるＬＡＭＰプライマーセットを用いることを特徴とする。

このように、Ｈｉｂに特徴的な莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を標的とすることで、Ｈｉｂを他の莢膜型及び無莢膜型のインフルエンザ菌と区別して検出することができる。このとき、６６５４番目以降の領域を標的とすると、この領域のＧＣ含有率が約２５％と低いため、Ｈｉｂに特異的で、安定した反応を行うＬＡＭＰプライマーを得ることは困難である。

本発明のインフルエンザ菌の検出方法のうち、莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出する方法は、前記ＬＡＭＰプライマーセットとして、全てのプライマーが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の５０００番目〜６６５３番目の領域中の部分塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるＬＡＭＰプライマーセットを用いることを特徴とする。

本発明のインフルエンザ菌の検出方法のうち、莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出する方法は、前記ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（Ａ）〜（Ｒ）に示すプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットのいずれかであることを特徴とする。
（Ａ）配列表の配列番号４３〜４６に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｃ）配列番号４８〜５１に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｄ）上記（Ｃ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｅ）配列番号５３〜５６に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｆ）上記（Ｅ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｇ）配列番号５８〜６１に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｈ）上記（Ｇ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｉ）配列番号６２〜６５に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｊ）上記（Ｉ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｋ）配列番号６７〜７０に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｌ）上記（Ｋ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｍ）配列番号７１〜７４に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｎ）上記（Ｍ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｏ）配列番号７３〜７６に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｐ）上記（Ｏ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｑ）配列番号７３，７４，７７及び配列番号７８に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な各塩基配列からなる４種のプライマー。
（Ｒ）上記（Ｑ）に記載の各塩基配列と相補的な各塩基配列からなる４種のプライマー。

本発明のインフルエンザ菌の検出方法のうち、莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出する方法は、前記ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（Ｓ）〜（Ｚ）に示すプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットのいずれかであることを特徴とする。
（Ｓ）請求の範囲第６項（Ａ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号４７に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｔ）請求の範囲第６項（Ｂ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号４７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｕ）請求の範囲第６項（Ｃ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｖ）請求の範囲第６項（Ｄ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｗ）請求の範囲第６項（Ｅ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号５７に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｘ）請求の範囲第６項（Ｆ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号５７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｙ）請求の範囲第６項（Ｉ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号６６に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。
（Ｚ）請求の範囲第６項（Ｊ）に記載の４種のプライマー、及び、配列表の配列番号６６に記載の塩基配列と相補的な塩基配列に同一又は実質的に同一な塩基配列からなるプライマー。

本発明のインフルエンザ菌検出用プライマーセットは、請求の範囲第１項〜第７項に記載のＬＡＭＰプライマーセットのいずれかであることを特徴とする。
本発明のインフルエンザ菌検出用キットは、請求の範囲第１項〜第７項に記載のＬＡＭＰプライマーセットを含むことを特徴とする。

実施例１のＬＡＭＰプライマーセットのＰ６蛋白遺伝子における対応位置を説明する図である。 実施例１のＬＡＭＰプライマーセットの各プライマーの構成を説明する図である。 実施例２のＬＡＭＰプライマーセットのＰ６蛋白遺伝子における対応位置を説明する図である。 実施例２のＬＡＭＰプライマーセットの各プライマーの構成を説明する図である。 ＬＡＭＰ反応後の増幅産物を電気泳動したゲルを撮影した写真である（実施例１）。 ＬＡＭＰ反応後の増幅産物を電気泳動したゲルを撮影した写真である（実施例２）。 実施例１及び実施例３のＬＡＭＰ反応の濁度変化を示すグラフである。 実施例１のリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。 図８の濁度と鋳型ＤＮＡ量の常用対数の関係を示すグラフである。 第一実施形態の各実施例のプライマーセットを示す表である。 第一実施形態の特異性確認試験の結果を示す表である。 第一実施形態の感度確認試験の結果を示す表である。 第一実施形態の臨床的検出試験の結果である。 実施例１１のＬＡＭＰプライマーセットのＨｉｂの莢膜遺伝子座第ＩＩ領域における対応位置を説明する図である。 実施例１１のＬＡＭＰプライマーセットの各プライマーの構成を説明する図である。 第二実施形態の各実施例のプライマーセットを示す表である。 第二実施形態における各莢膜型及び無莢膜型インフルエンザ菌を用いた特異性確認試験の結果を示す表である。 第二実施形態におけるインフルエンザ菌以外の菌を用いた特異性確認試験の結果を示す表である。 ＬＡＭＰ反応後の増幅産物を電気泳動したゲルを撮影した写真である（実施例１１）。 第二実施形態における感度試験の結果を示す表である。 実施例１１においてＬｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ設定の効果を説明するグラフである。 実施例１１について、莢膜ａ〜ｆ型及び無莢膜型の各インフルエンザ菌のＤＮＡを鋳型として１２０分間のＬＡＭＰ反応を行った結果を示すグラフである。 実施例１１のリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。 図２３の濁度と鋳型ＤＮＡ量の常用対数の関係を示すグラフである。 （Ａ）は、実施例１のＬＡＭＰプライマーセットの各プライマーの構成を説明する図、（Ｂ）は実施例１１のＬＡＭＰプライマーセットの各プライマーの構成を説明する図である。

次に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
［第一実施形態］
本実施形態のインフルエンザ菌の検出方法は、検体中に含まれる核酸を鋳型としてＬＡＭＰ法による核酸増幅を行い、この増幅産物の有無に基づいて、インフルエンザ菌の存在の有無を判別することで、インフルエンザ菌を検出するものである。

本実施形態の検出方法に用いるＬＡＭＰプライマーセットは、インフルエンザ菌に特徴的な表層蛋白質であるＰ６蛋白質をコードするＰ６蛋白遺伝子を標的とし、かつ、前記プライマーセットとして、全てのプライマーが、インフルエンザ菌のＰ６蛋白遺伝子のうち９０番目より下流塩基領域中の部分塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなり、かつ、少なくとも１つのプライマーが、インフルエンザ菌のＰ６蛋白遺伝子のうち、９０番目から１８３番目、又は、３３７番目から４６２番目までの非相同領域中の部分塩基配列と同一若しくは実質的に同一な塩基配列、又は、これらと相補的な塩基配列からなるＬＡＭＰプライマーセットである。例えば実施例１〜９に示すようなものがあげられる。

図１及び図２に本実施形態の一例である実施例１のＬＡＭＰプライマーセットのＰ６蛋白遺伝子における対応位置及び各プライマーの構成を、図３及び図４に、本発明の他の一例である実施例２のＬＡＭＰプライマーセットのＰ６蛋白遺伝子における対応位置及び各プライマーの構成を示す。また、図１０に、各実施例のプライマーと、この塩基配列を示した配列表の配列番号と、の対応関係を示す。

図１及び図３は、３行又は４行からなる段が８段示されており、各段の「番号」と付された行は塩基の位置を、「プライマー」と付された行はプライマーの位置を示す。また、「（イ）」と付された行は配列表の配列番号１２と同様にインフルエンザ菌ＲｄのＰ６蛋白遺伝子の塩基配列を、「（パ）」と付された行はパラインフルエンザ菌Ｒｉｖｅｒｓ１９２２のＰ６蛋白遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ２８８８７）の塩基配列を、左側から右側に向かって５’→３’方向となるように示す。また、図１及び図３の「プライマー」行中の矢印はプライマーの５’→３’方向を示す。従って、左矢印で範囲指定した領域は、当該領域に相補的な領域がプライマーとされることを示す。

これらの図に示すように、Ｐ６蛋白遺伝子領域のうちでも、９０番目から１８３番目、又は、３３７番目から４６２番目までの非相同領域中の部分塩基配列と同一若しくは実質的に同一な塩基配列、又は、これらと相補的な塩基配列がインフルエンザ菌とパラインフルエンザ菌とで異なる塩基が連続する非相同領域となっており、本実施形態ではこの領域の部分塩基配列をより多くプライマーに組み込むことで、プライマーの特異性を優れたものとしている。

ＬＡＭＰプライマーセットは、標的遺伝子（Ｐ６蛋白遺伝子）上の異なる６領域（５’末端側から順にＦ３，Ｆ２，Ｆ１，Ｂ１ｃ，Ｂ２ｃ，Ｂ３ｃ）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順にＢ３，Ｂ２，Ｂ１，Ｆ１ｃ，Ｆ２ｃ，Ｆ３ｃ）、さらにこのＦ１ｃ及びＦ２ｃの間のＬＦ領域を組み合わせて構成される。実施例１及び実施例２のＬＡＭＰプライマーセットは、５’末端側からＦ１ｃ領域及びＦ２領域を連結してなるＦｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＦＩＰ」と略すこともある。）と、５’末端側からＢ１ｃ領域及びＢ２領域を連結してなるＢａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＢＩＰ」と略すこともある。）と、Ｆ３領域からなるＦ３プライマーと、Ｂ３領域からなるＢ３プライマーと、ＬＦ領域からなるＬｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ（以下、「ＬＦ」と略すこともある。）からなっている。このＬＦは、反応に必須のプライマーではなく反応の速度を向上させるために任意に設定されるプライマーであり、このＬＦがないプライマーセット（例えば、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなる４種のプライマーのみ）を用いることも可能である。なお、プライマーセットの設定位置によっては、ＬＦではなく、図示しないが、Ｂ２領域とＢ１領域の間にＬｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ Ｂａｃｋｗａｒｄ（以下、「ＬＢ」と略すこともある。）が設計されることもある。

このようなＬＡＭＰプライマーセットによる増幅のメカニズムは、公知文献１（「ヌクレイック アシッド リサーチ」、２０００、Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３）及び公知文献２（Ｋ．Ｎａｇｍｉｎｅ，他２名，“Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，２００２，ｖｏｌ．１６，ｐ．２２３−２２９）に詳細に記述されるが、４種のプライマーに含まれる６領域が設計とおりに働かなければ本発明の合成反応は進行しないので、偶然による非特異的な相補鎖合成に伴う非特異的な増幅反応が効果的に防止され、増幅反応の特異性は高い。

上述のようなインフルエンザ菌検出用のプライマーは、例えば、ＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成し、あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し他の切断片と結合する等の改変により、調製することができる。

なお、本発明においてプライマーは、前述したような所定の塩基配列を有し、他の塩基と塩基対形成が可能なオリゴヌクレオチドであって、その３’末端において相補鎖合成の基点となる‐ＯＨ基を備えるものを意味する。したがって、この条件を満たす限り、そのバックボーンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限定されず、例えばＰでなくＳをバックボーンとしたホスホチオエート体やペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであってもよい。また、公知の標識物質によって標識されたものであってもよい。標識物質としては、ジゴキシンやビオチンのような結合性リガンド、酵素、蛍光物質や発光物質、放射性元素などが挙げられる。また、本発明によるプライマーは、例えばＤＮＡチップのようにそれ自身を固相に結合させておくこともできる。固相化プライマーを合成開始点とする場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、分離、検出が容易となる。

ＬＡＭＰプライマーセットを調製した後、ＬＡＭＰプライマーセットに加え、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチドを加えることにより、ＬＡＭＰ反応を行わせる。

本発明で用いることができるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有するものであれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６０〜６５℃付近で反応を行うのが望ましい。

また、増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば前述したような標識オリゴヌクレオチドを用いることで標識物質を検出したり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけても容易に検出できる。

さらに、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅は加速度的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ等を添加することにより増幅を確認できる。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。この白濁を反応終了後の観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば６５０ｎｍの吸光度の変化を通常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である。

これらのＬＡＭＰ反応に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてインフルエンザ菌検出用キットとして供給することができる。具体的には、前記インフルエンザ検出用のＬＡＭＰプライマーセット、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類で構成されるキットである。
このように、ＬＡＭＰ法では、酵素活性を維持しうる温度で、等温のままインキュベートするだけで、増幅反応を進行させることが可能である。このため、ＰＣＲ法のような温度調節のための設備が不要であり低コストかつ簡便に検出を行うことができるとともに、温度変化に伴う時間ロスもないので迅速に検出が可能である。

［第一実施形態の実施例］
以下に実施例を挙げて第一実施形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（特異性確認試験について）
本実施形態にかかるインフルエンザ菌の検出方法を実施し、本実施形態の検出方法の特異性を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの準備
まず、試験に供する各種の菌から染色体ＤＮＡを精製し、増幅反応の鋳型となるＤＮＡを準備した。

染色体ＤＮＡは、酵母用のＤｒ．ＧｅｎＴＬＥ（登録商標、タカラバイオ株式会社製）を用いて各種の菌体から抽出し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡミニキット（キアゲン社製）を用いて精製することで得た。抽出及び精製の操作は、添付のマニュアルに従って行った。

本試験では、９種のインフルエンザ菌及び１９種のインフルエンザ菌以外の菌（１種のパラインフルエンザ菌を含む）に分類される計２８種の菌株から染色体ＤＮＡを抽出して用いた。これら２８種の菌株を図１１に示す。
（２）ＬＡＭＰ反応及びＰＣＲ反応について
次に、本実施形態の実施例１〜９及び比較例２，３のＬＡＭＰプライマーセット（図１０参照）を用いて、（１）で調製した各種の菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。

ＬＡＭＰ反応液（２５μｌ）は、ＦＩＰ及びＢＩＰ各４０ｐｍｏｌ，Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー各５ｐｍｏｌ，ＬＦプライマー１０ｐｍｏｌ，８ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製），デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各１．４ｍＭ，ベタイン０．８Ｍ，Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）２０ｍＭ，ＫＣｌ１０ｍＭ，（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄１０ｍＭ，ＭｇＳＯ₄８ｍＭ，ツイーン２０を０．１％，及び，上記（１）のようにして生成された鋳型ＤＮＡ溶液２μｌを添加して調製した。

そして、このＬＡＭＰ反応液を、６３℃で６０分間インキュベートすることでＬＡＭＰ反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。

また、ＬＡＭＰ法を用いた検出と比較するために、ＰＣＲ反応も行った（比較例１）。
この際、ＰＣＲプライマーセットは、Ｐ６蛋白質をコードするＰ６蛋白遺伝子を標的とする公知のもの（背景技術の項で示した参照文献１に示される）を用いた。その配列を、配列番号１３及び１４に示す（比較例１）。なお、このプライマーセットのターゲット位置（増幅される領域）は、１２２番目〜４３４番目である。

ＰＣＲ反応液（１０μｌ）は、デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各０．２ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）１０ｍＭ，ＫＣｌ５０ｍｌ，ＭｇＣｌ₂２ｍＭ，１ＵのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、フォワードプライマー及びリバースプライマー各０．５μＭ及び鋳型ＤＮＡ溶液１μｌを加えて調製した。

ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（ＭＪ ｒｅｓｅｒｃｈ社製）を用いて３０サイクル行った。各サイクルでは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の合成を順に行い、最後は７２℃２分間の加温を行い反応を終了させた。
（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、反応チューブを直接目視し、ＬＡＭＰ反応液の白濁の有無を観察することで検出した。すなわち、複製配列が存在する場合には反応の副産物として複製配列の量に比例した量のピロリン酸マグネシウムが産生されるのでＬＡＭＰ反応液が白濁し、一方存在しない場合にはＬＡＭＰ反応液は透明のままである。

また、ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動によっても確認した。この際、増幅産物そのままのものと、増幅産物を制限酵素ＴａｓＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）により消化したものと、をそれぞれ３％のアガロースゲル中で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して泳動パターンを確認した。増幅産物をそのまま電気泳動した場合には、複製配列はＬＡＭＰ反応に特徴的なラダー状のパターンとして現われる。また、制限酵素により消化したものを電気泳動した場合には、複製配列は実施例１では９０ｂｐ及び１２５ｂｐ、実施例２では８８ｂｐ及び９９ｂｐの断片として現われる。さらに、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシング反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシング解析を行うことで、標的部分が増幅されたか否かを確認した。なお、このシークエンシング反応では、実施例１については図１及び図２に示すＦ２及びＢ２の配列をプライマーとして用い、実施例２については図３及び図４に示すＦ２及びＢ２の配列をプライマーとして用いた。

一方、比較例１におけるＰＣＲによる増幅産物の有無も、増幅産物（２μｌ）を３％アガロースゲル中に電気泳動することで確認した。
（４）試験結果について
上述の試験結果を図１１に示す。結果は、６０分間のインキュベーションにより目視によって増幅（白濁）が確認された場合を「＋」、６０分間のインキュベーション後目視によって増幅が確認できなかった場合を「−」とした。なお、図１１中、上付きａは、菌の出所が日本大学歯学部細菌学講座であることを示し、上付きｂは、菌の出所が岐阜大学医学部微生物学教室であることを示し、上付きｃは、菌の出所が東京大学医科学研究所であることを示す。

この結果、図１１にも示すように、実施例１〜９のいずれのＬＡＭＰプライマーセットを用いても、インフルエンザ菌を鋳型とした場合には、６０分間のインキュベーションにより多量の増幅産物が確認された。対照的に、パラインフルエンザ菌を含めた他の全ての菌種では６０分間のインキュベーションを行っても増幅産物は確認されなかった。この結果は、電気泳動の結果とも一致した。図５及び図６に、ＬＡＭＰ反応後の増幅産物を電気泳動したゲルを撮影した写真を示す。両端のレーンＭは１００ｂｐの間隔を示すためのマーカーを流したレーンであり、レーン１はレーン２の増幅産物をＴａｓＩで処理後に泳動したレーン、レーン２は鋳型ＤＮＡ濃度を１０⁶コピーとした場合の増幅産物を泳動したレーン、レーン３は鋳型ＤＮＡ濃度を０コピーとした場合の増幅産物を泳動したレーンである。レーン２では、増幅産物がラダー状の泳動パターンを示しており、これより増幅産物が反転部分を有し、ＬＡＭＰ反応に特徴的なステム−ループ構造をとっていることが確認される。また、図５のレーン１には実施例１の９０ｂｐ及び１２５ｂｐ（図６では実施例２の８８ｂｐ及び９９ｂｐ）の切断片が現われており、標的となる部分が増幅されていることが確認された。また、増幅産物のシークエンシング解析も行ったが、ＬＡＭＰ反応により増幅された配列は期待した配列と一致した。

一方、ＰＣＲ法を用いて検出した場合には、インフルエンザ菌が検出されたものの、パラインフルエンザ菌も検出され、それらを区別することができなかった。また、本発明にかかる範囲外のＬＡＭＰプライマーセットである比較例２では、インフルエンザ菌及びそれ以外の菌においても検出が確認されなかった。

このことから、本発明に係るインフルエンザ菌の検出方法は、特異性に優れ、パラインフルエンザ菌も区別可能であることが確認された。
（感度確認試験について）
次に、上記実施例及び比較例１〜３のプライマーセットを用いた場合の検出感度を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの調製
本試験では、インフルエンザ菌ＩＩＤ９８４から特異性確認試験と同様にして染色体ＤＮＡを精製し、鋳型とした。反応液中の鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ Ｐｒｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、分子サイズを１．９Ｍｂｐとして定量した。

（２）ＬＡＭＰ法及びＰＣＲ法について
上記（１）のように予め定量された鋳型ＤＮＡ溶液を１０倍ずつ希釈して１〜１，０００，０００倍の溶液を調製し、これをＬＡＭＰ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。なお、ＬＡＭＰ反応液は、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度が異なる以外、鋳型ＤＮＡ溶液の添加量及びその他の添加物の添加量において前記特異性確認試験と同様とした。また、ＬＡＭＰ反応は、６３℃で３５分間又は６０分間インキュベートすることで反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。

また、本発明の検出方法と比較するために、ＰＣＲ法による増幅、検出も行った（比較例１）。この際ＬＡＭＰ反応で用いたものと同じ鋳型ＤＮＡ溶液をＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。ＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度が異なる以外、鋳型ＤＮＡ溶液の添加量及びその他の添加物の添加量において前記特異性確認試験と同様であり、ＰＣＲ反応の条件も同様とした。
（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製、型番ＬＡ−２００）を用いて濁度を測定し、濁度が０．１以上のときに増幅が生じたと判定した。
また、前記特異性確認試験と同様に、白濁の有無を目視により確認、及び、電気泳動による確認も行った。

また、比較例１におけるＰＣＲによる増幅産物の有無も、増幅産物（２μｌ）を３％アガロースゲル中に電気泳動することで確認した。
（４）試験結果について
試験結果は、上記のように増幅産物が確認された場合には「＋」とし、増幅産物が確認されなかった場合は「−」とした。試験結果を、図１２に示す。

図１２に示すように、実施例１及び実施例２のＬＡＭＰプライマーを用いた検出方法では、ＬＡＭＰ反応を６０分間行うことで、鋳型ＤＮＡ濃度が１００コピーの場合にも検出することができ、その他の実施例及びＰＣＲプライマーを用いた比較例１と比べて１０倍と、感度に極めて優れることが確認された。一方、比較例２及び比較例３の場合では１０⁶コピーでもインフルエンザ菌は検出されなかった。また、図１２に示すように、実施例１及び実施例２では、鋳型ＤＮＡ濃度が１０³コピーある場合には、３５分で検出可能であり、感度及び迅速性に優れることが確認された。

（臨床的な検出について）
実施例１及び比較例１について、臨床的な検出を行ったので説明する。
まず、口腔試料から９つの菌を分離した。その後、分離された9つの菌について、ウマ血液培地で培養しその溶血パターンを確認し、Ｖ因子（ＮＡＤ）及びＸ因子（ヘミン）要求性を確認するとともに、ＡＰＩ ２０ ＮＨ（ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を行うことにより、菌種の同定を行った。この結果、図１３に示すように、３種のインフルエンザ菌、４種のパラインフルエンザ菌、２種のＨ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓが同定された。また、公知文献３の方法により莢膜形成に関連するＢｅｘ Ａ蛋白遺伝子を標的としたＰＣＲを行うことで、３種のインフルエンザ菌は無夾膜型であることを確認した（公知文献３：ｖａｎ Ｋｅｔｅｌ， Ｒ． Ｊ．， Ｂ． ｄｅ Ｗｅｖｅｒ， ａｎｄ Ｌ． ｖａｎ Ａｌｐｈｅｎ． １９９０． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：２７１−２７６）。

そして、上記のように単離、同定された各菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、鋳型ＤＮＡ濃度１０⁶コピーについて、実施例１及び比較例１のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ反応及びＰＣＲ反応を行った。結果は、ＬＡＭＰ反応は６０分間行い、白濁を目視により確認できるものを「＋」、できなかった場合を「−」とした。また、ＰＣＲ反応は、アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。
この結果、図１３に示すように、実施例１では、インフルエンザ菌のみを検出したのに対し、比較例１では、パラインフルエンザ菌のほか、Ｈ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓについてもポジティブ反応を示した。このことから、実施例１が、臨床的な検出においても、特異性に優れ、検出の信頼性に優れることが確認された。

（リアルタイム濁度測定試験について）
（１）検出の迅速性について
実施例１〜９及び比較例２，３のプライマーセットについて、検出の迅速性を確認する試験を行った。本試験では、鋳型ＤＮＡ濃度を１０⁶コピーとし、各プライマーセットを添加し、ＬＡＭＰ反応液組成及びＬＡＭＰ反応条件を前述と同様としてＬＡＭＰ反応を行った。そして、この反応の間、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製）を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取り、スレッシュホールドタイム（Ｔｔ：濁度が０．１を超えるまでの時間）を測定した。

結果を図１０に示す。図１０に示すように、実施例１及び実施例２は、他の実施例と比べて、スレッシュホールドタイムが格段に短く、極めて迅速にインフルエンザ菌を検出できることが確認された。一方、比較例２は、前記特異性確認試験においても特異性を確認することができなかったが、本試験においてもスレッシュホールドタイムが１０９分と実施例と比べて格段に遅く、反応が不安定であることが推定される。ターゲット位置（Ｆ３プライマー〜Ｂ３プライマーの間の領域）が同じ比較例３では、各プライマーの設定位置を変えることでスレッシュホールドタイムを若干改善したものの、実施例とは依然差があり、この範囲で安定かつ迅速な反応が可能なＬＡＭＰプライマーを得るのは困難であった。

（２）定量性について
次に、特異性、感度、迅速性に優れた実施例１について、次のような試験を行った。まず、反応チューブ１本当たりの鋳型ＤＮＡコピー数を０〜１０⁶に調製し、実施例１のＬＡＭＰプライマーセットをそれぞれ添加した。そして、ＬＡＭＰ反応液組成及びＬＡＭＰ反応条件を前述と同様としてＬＡＭＰ反応を行った。この反応の間、上記リアルタイム濁度測定装置を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取った。
結果は、図８に示すように、鋳型ＤＮＡのコピー数が１００コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は前記感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ量の増加に伴い、スレッシュホールドタイムが短くなることが確認された。

図９には、実施例１の場合のスレッシュホールドタイムと当初の鋳型ＤＮＡ量の常用対数の関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ²＝０．９７８と高い相関を示した。これは、２００４年森らが示すように、インフルエンザ菌由来のＤＮＡの初濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度を定量可能であることを意味する（Ｍｏｒｉ，Ｙ．，他３名，”Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．５９，ｐ．１４５−１５７）。すなわち、例えば、濃度未知のサンプルについても、希釈倍率の異なる希釈液を調製し、各希釈液を用いてＬＡＭＰ反応を行った場合のスレッシュホールドタイムを測定することで回帰直線を作成すれば、この回帰直線から、未知の鋳型ＤＮＡの初濃度を特定することができる。

以上、本実施形態の検出方法によれば、従来のＰＣＲ法を用いた場合に区別することができなかったパラインフルエンザ菌とも区別して検出することができ、特異性に優れることが確認された。特に、従来のＰＣＲプライマーとは異なるより下流域をターゲットとしたＬＡＭＰプライマー（例えば、実施例１及び実施例２）は、検出感度が高く、かつ、迅速な検出が可能であり、またインフルエンザ菌の定量も可能である。また、ＬＡＭＰ反応は等温条件下でも進行し、また結果を目視により確認することができるため、設備もシンプルで、病院の検査室等でも簡易、迅速に行うことができる。

［第二実施形態］
本実施形態の検出方法に用いるＬＡＭＰプライマーセットは、莢膜ｂ型インフルエンザ菌の莢膜をコードする莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を標的とし、かつ、プライマーセットとして、全てのプライマーが、１〜６６５３番目の領域中の部分塩基配列と同一若しくは実質的に同一な塩基配列、又は、これらと相補的な塩基配列からなるＬＡＭＰプライマーセットである。例えば実施例１１〜１９に示すようなものがあげられる。
図１４及び図１５に本実施形態の一例である実施例１１のＬＡＭＰプライマーセットの莢膜遺伝子座における対応位置及び各プライマーの構成を示す。また、図１６に、各実施例のプライマーと、この塩基配列を示した配列表の配列番号と、の対応関係を示す。

図１４は、２行又は３行からなる段が７段示されており、各段の「番号」と付された行は塩基の位置を、「塩基」と付された行は当該位置におけるＨｉｂの莢膜遺伝子座第ＩＩ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７８５５９）の塩基を、「プライマー」と付された行はプライマーの位置を示す。なお、図１４には、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の一部を示し、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の全塩基配列を配列番号７９に示す。また、図１４の「プライマー」行中の矢印はプライマーの５’→３’方向を示す。従って、左矢印で範囲指定した領域は、当該領域に相補的な領域がプライマーとされることを示す。

この他、ＬＡＰＭプライマーセットの基本的な構成、作用等は、第一実施形態に示したので説明を省略する。
［第二実施形態の実施例］
以下に実施例を挙げて第二実施形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（特異性確認試験について）
（１）染色体ＤＮＡの準備
まず、試験に供する各種の菌から染色体ＤＮＡを精製し、増幅反応の鋳型となるＤＮＡを準備した。
染色体ＤＮＡは、各種の菌体から、ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡミニキット（キアゲン社製）を用いて抽出、精製することで得た。抽出及び精製の操作は、添付のマニュアルに従って行った。

本試験では、３３種のインフルエンザ菌及び２１種のインフルエンザ菌以外の菌、計５４種の菌株から染色体ＤＮＡを抽出して用いた。これら５４種の菌株を図１７及び図１８に示す。図１７中、株名がＣＩ−１〜ＣＩ−２６のインフルエンザ菌は、鼻咽頭から採取したサンプルより単離したもので、菌の出所が岐阜大学医学部微生物学教室であることを示す。

（２）ＬＡＭＰ反応について
次に、本実施形態の実施例１１〜１９のＬＡＭＰプライマーセット（図１６参照）を用いて、（１）で調製した各種の菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。
ＬＡＭＰ反応液（２５μｌ）は、ＦＩＰ及びＢＩＰ各１．６μＭ，Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー各０．２μＭ，ＬＦ０．４μＭ，８ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製），デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各１．４ｍＭ，ベタイン０．８Ｍ，Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）２０ｍＭ，ＫＣｌ１０ｍＭ，（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄１０ｍＭ，ＭｇＳＯ₄８ｍＭ，ツイーン２０を０．１％，及び，上記（１）のようにして生成された鋳型ＤＮＡ溶液２μｌ（鋳型ＤＮＡ濃度１０⁶コピー）を添加して調製した。
そして、このＬＡＭＰ反応液を、６３℃で６０分間インキュベートすることでＬＡＭＰ反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。

（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、反応チューブを直接目視し、ＬＡＭＰ反応液の白濁の有無を観察することで検出した。
また、ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動によっても確認した。この際、増幅産物を制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）により消化し、これをそれぞれ３％のアガロースゲル中で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して泳動パターンを確認した。増幅産物をそのまま電気泳動した場合には、複製配列はＬＡＭＰ反応に特徴的なラダー状のパターンとして現われる。また、制限酵素により消化した産物について予想されるサイズの断片（１２５ｂｐ、１３５ｂｐ）を電気泳動で確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシング反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシング解析を行うことで、標的部分が増幅されたか否かを確認した。なお、このシークエンシング反応では、図１４及び図１５に示すＦ２及びＢ２の配列をプライマーとして用いた。

（４）血清による判別について
本実施形態に係る実施例との比較のために、インフルエンザ菌莢膜型別用免疫血清（デンカ生研株式会社製）を用い、スライド凝集法により、ｂ型莢膜に対する抗体を含む血清とｂ型莢膜との抗原抗体反応により生じる凝集塊の有無を判定し、莢膜ｂ型インフルエンザ菌の検出を行った。
また、非特許文献１に従ってＰＣＲ法に基づく莢膜ｂ型インフルエンザ菌の検出も行い、これを基準に、上記ＬＡＭＰプライマーセットを用いた検出結果と、血清型別による検出結果とを評価した。

（５）試験結果について
上述の試験結果を図１７及び図１８に示す。結果は、６０分間のインキュベーションにより目視によって増幅（白濁）が確認された場合を「＋」、６０分間のインキュベーション後目視によって増幅が確認できなかった場合を「−」とした。なお、図１７中、上付きａは、非特許文献１の方法による判定結果を示し、上付きｂは、スライド凝集法による試験結果を示し、上付きｃは、菌の出所が東京大学医科学研究所であることを示し、「ｎｔ」は、無莢膜型であることを示す。また、図１８中、上付きａは、菌の出所が日本大学歯学部細菌学講座であることを示し、上付きｂは、菌の出所が岐阜大学医学部微生物学教室であることを示し、上付きｃは、菌の出所が東京大学医科学研究所であることを示す。

この結果、図１７及び図１８に示すように、実施例１１〜１９のいずれのＬＡＭＰプライマーセットを用いても、臨床的に単離した株も含めた全ての莢膜ｂ型インフルエンザ菌を鋳型とした場合について、６０分間のインキュベーションにより増幅産物が確認された。対照的に、莢膜型の異なるインフルエンザ菌を含めた他の全ての菌種では６０分間のインキュベーションを行っても増幅産物は確認されなかった。莢膜ｂ型インフルエンザ菌を鋳型とした場合の増幅産物を電気泳動した結果を図１９に示す。図１９の左端のレーンＭは１００ｂｐの間隔を示すためのマーカーを流したレーンであり、レーン１はレーン２の増幅産物をＨｐｙ１８８Ｉで処理後に泳動したレーン、レーン２は鋳型ＤＮＡ濃度を１０⁶コピーとした場合の増幅産物を泳動したレーン、レーン３は鋳型ＤＮＡ濃度を０コピーとした場合の増幅産物を泳動したレーンである。レーン２では、増幅産物がラダー状の泳動パターンを示しており、これより増幅産物が反転部分を有し、ＬＡＭＰ反応に特徴的なステム−ループ構造をとっていることが確認される。また、レーン１には実施例１１の１２５ｂｐ及び１３５ｂｐの切断片が現われており、標的となる部分が増幅されていることが確認された。また、増幅産物のシークエンシング解析も行ったが、ＬＡＭＰ反応により増幅された配列は期待した配列と一致した。

一方、スライド凝集法により検出した場合には、大半の莢膜ｂ型インフルエンザ菌が検出されたものの、１種の莢膜ｂ型インフルエンザ菌が検出されなかった。１種の莢膜ｂ型インフルエンザ菌が検出されなかったのは莢膜の発現量が少なかったためと考えれるが、莢膜ｂ型インフルエンザ菌の検出において最も大きなリスクは検出し損なうことであり、表現型により検出する場合にはこのようなリスクを回避できない。
以上の結果から、本実施形態に係る莢膜ｂ型インフルエンザ菌の検出方法は、特異性が高く、検出の信頼性に優れることが確認された。

（感度確認試験について）
次に、上記実施例１１及び１４〜１９のプライマーセットを用いた場合の検出感度を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの調製
本試験では、インフルエンザ菌ＩＩＤ９８４から特異性確認試験と同様にして染色体ＤＮＡを精製し、鋳型とした。反応液中の鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ Ｐｒｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用い、分子サイズを１．９Ｍｂｐとして定量した。
（２）ＬＡＭＰ反応について
上記（１）のように予め定量された鋳型ＤＮＡ溶液を１０倍ずつ希釈して１〜１，０００，０００倍の溶液を調製し、これをＬＡＭＰ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。ＬＡＭＰ反応液は、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度が異なる以外、鋳型ＤＮＡ溶液の添加量及びその他の添加物の添加量において前記特異性確認試験と同様とした。また、ＬＡＭＰ反応は、６３℃で３５分間又は６０分間インキュベートすることで反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。

また、本発明の検出方法と比較するために、ＰＣＲ法による増幅、検出も行った（比較例１１）。この際ＬＡＭＰ反応で用いたものと同じ鋳型ＤＮＡ溶液をＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。ＰＣＲプライマーは、上述した非特許文献１に示されるプライマーを用いた（配列番号８０〜８２）。ＰＣＲ反応液（１０μｌ）は、デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各０．２ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）１０ｍＭ，ＫＣｌ５０ｍｌ，ＭｇＣｌ₂２ｍＭ，１ＵのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、プライマー各０．５μＭ及び鋳型ＤＮＡ溶液１μｌを加えて調製した。

ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（ＭＪ ｒｅｓｅｒｃｈ社製）を用いて２５サイクル行った。各サイクルでは、９４℃１分間の変性、６０℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の合成を順に行い、最後は７２℃１０分間の加温を行い反応を終了させた。
（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製、型番ＬＡ−２００）を用いて濁度を測定し、濁度が０．１以上のときに増幅が生じたと判定した。

また、前記特異性確認試験と同様に、白濁の有無を目視により確認、及び、電気泳動による確認も行った。
また、比較例におけるＰＣＲによる増幅産物の有無も、増幅産物（２μｌ）を３％アガロースゲル中に電気泳動することで確認した。
（４）試験結果について
試験結果は、上記のように増幅産物が確認された場合には「＋」とし、増幅産物が確認されなかった場合は「−」とした。試験結果を、図２０に示す。

図２０に示すように、実施例１１及び１４〜１９のプライマーセットのいずれもが、ＰＣＲプライマーを用いた場合と同等またはそれ以上の感度を示し、特に実施例１１及び１６〜１８の感度が優れ、実施例１１に至ってはＰＣＲプライマーを用いた比較例１１と比べて１０，０００倍と、感度に極めて優れることが確認された。実施例１では、インキュベーションが３５分間の場合にも１コピーの鋳型を検出可能であり、感度及び迅速性に極めて優れることが確認された。

（リアルタイム濁度測定試験について）
（１）検出の迅速性について
実施例１１〜１９のプライマーセットについて、検出の迅速性を確認する試験を行った。本試験では、鋳型ＤＮＡ濃度を１０⁶コピーとして各プライマーセットを添加し、ＬＡＭＰ反応液組成及びＬＡＭＰ反応条件を前述と同様にしてＬＡＭＰ反応を行った。そして、この反応の間、前記したリアルタイム濁度測定装置を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取り、スレッシュホールドタイムを測定した。
結果を図１６に示す。図１６に示すように、どの実施例においても比較的スレッシュホールドタイムは短かったが、特に実施例１１が、他の実施例と比べて、スレッシュホールタイムが格段に短く、極めて迅速に莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出できることが確認された。また、実施例１１のプライマーセットについて、ＬＦを添加した場合及び未添加の場合それぞれにおけるＬＡＭＰ反応の違いを確かめるために行った試験の結果を図２１に示す。図２１に示すように、ＬＦを添加することで、スレッシュホールドタイムが２５分から１６分へ短縮されることが確認された。

また、図２２に、実施例１１について、インフルエンザ菌の莢膜型ａ〜ｆ及び無莢膜型をそれぞれ鋳型として１２０分間のＬＡＭＰ反応を行わせた場合の濁度の変化を示す。図２２に示すように、１２０分間反応させても莢膜ｂ型インフルエンザ菌を鋳型とした場合以外は、増幅産物が生じなかった。図示しないが同様の傾向が実施例１２及び１３についても確認された。臨床検査では、各プライマーセットのスレッシュホールドタイムを経過後、若干の時間をおいて白濁を確認することが想定されるが、実施例１１〜１３のプライマーセットであれば、スレッシュホールドタイムから長時間経過してしまった場合にも信頼性のある結果を得られるため、臨床の場では用い易い。
（２）定量性について
次に、特異性、感度、迅速性に優れた実施例１１について、次のような試験を行った。まず、反応チューブ１本当たりの鋳型ＤＮＡコピー数を０〜１０⁶に調製し、実施例１１のＬＡＭＰプライマーセットをそれぞれ添加した。そして、ＬＡＭＰ反応液組成及びＬＡＭＰ反応条件を前述と同様としてＬＡＭＰ反応を行った。この反応の間、上記リアルタイム濁度測定装置を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取った。

結果は、図２３に示すように、鋳型ＤＮＡのコピー数が１コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は前記感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ量の増加に伴い、スレッシュホールドタイムが短くなることが確認された。
図２４には、実施例１１の場合のスレッシュホールドタイムと当初の鋳型ＤＮＡ量の常用対数の関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ²＝０．９７９と高い相関を示した。このことから、上述したように、実施例１１が優れた定量性を有することが確認された。

以上、本実施形態の検出方法によれば、従来のＰＣＲ法を用いた場合と比較して、ＬＡＭＰ反応は等温条件下でも進行し、また結果を目視により確認することができるため、簡素な設備の病院等でも簡易、迅速かつ精確に、莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出することができる。また、本実施形態の検出方法によれば、極めて感度に優れるため、感染の早期発見、早期治療を可能にする。また、本実施形態の検出方法によれば、定量も可能である。

産業上の利用の可能性

本発明のインフルエンザ菌の検出方法によれば、精確、特にパラインフルエンザ菌とも区別してインフルエンザ菌を検出可能である（図２５Ａ）。また、本発明の莢膜ｂ型インフルエンザ菌の検出方法によれば、簡易、迅速かつ精確に、他の莢膜型及び無莢膜型のインフルエンザ菌と区別して、莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出することができる（図２５Ｂ）。

配列番号１２：Ｐ６蛋白遺伝子
配列番号１３：合成ＤＮＡ（比較例１）
配列番号１４：合成ＤＮＡ（比較例１）
配列番号７９：莢膜ｂ型インフルエンザ菌の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域
配列番号８０：合成ＤＮＡ（比較例１１）
配列番号８１：合成ＤＮＡ（比較例１１）
配列番号８２：合成ＤＮＡ（比較例１１）

Claims (3)

1. プライマーセットを用いた核酸増幅反応による核酸増幅の有無に基づいて莢膜ｂ型インフルエンザ菌を検出する方法であって、
   前記プライマーセットとして、配列表の配列番号４３〜４７に記載の塩基配列からなる５種のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いることを特徴とする、莢膜ｂ型インフルエンザ菌の検出方法。
2. 配列表の配列番号４３〜４７に記載の塩基配列からなる５種のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットであることを特徴とする、莢膜ｂ型インフルエンザ菌検出用プライマーセット。
3. 配列表の配列番号４３〜４７に記載の塩基配列からなる５種のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを含むことを特徴とする、莢膜ｂ型インフルエンザ菌検出用キット。

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