KR101478921B1 - 아르코박터 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 아르코박터 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification ;LAMP)을 이용한 아르코박터 신속 검출법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 아르코박터 검출을 위한 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트 , 상기 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭 반응용 조성물 및 키트 , 상기 프라이머세트를 이용하여 LAMP를 수행하는 것을 포함하는 아르코박터 검출 방법에 관한것이다.
본 발명의 아르코박터 검출을위한 서열번호 1 내지 4로 구성되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법은 기존의 PCR 방법보다 민감도와 특이도가 우수하다. 또한 등온 환경에서 검출이 가능하고 장소에 구애 받지 않기 때문에 임상진단 실험실과 현장 및 기타 어느 장소에서도 아르코박터에 대한 진단이 가능하여 실용성이 높다.

Description

아르코박터 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 아르코박터 검출 방법{Primer for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Arcobacter spp., and method for detecting Arcobacter spp. using the same}

본 발명은 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification ;LAMP)을 이용한 아르코박터 신속 검출법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 아르코박터 검출을 위한 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭 반응용 조성물 및 키트, 상기 프라이머세트를 이용하여 LAMP를 수행하는 것을 포함하는 아르코박터 검출 방법에 관한 것이다.

아르코박터(Arcobacter spp.)는 그람-음성, 포자를 형성하지 않으며, 운동성 가진 나선형 모양의 작은 세균의 일종이다(Ho et al., FEMS Immunol Med Microbiol, 50, 51-58, 2007). Family Campylobacteriaceae에 속하는 아르코박터는 15℃-30℃에 관경과 호기성 조건에서 생육이 가능한 내기성(aerotolerant) 세균으로 보고되었다(Vandamme et al ., Int J Syst Bacteriol. 41, 451-455, 1991). 아르코박터는 1977년도에 발견되었고 처음에는 캠피로박터 속에 속하였다(Ellis et al., Vet Rec. 100, 451-452, 1977). 그러나, 아르코박터가 호기 환경, 저온 환경에도 생육능력을 가지고 있으며(Neill et al ., Res Vet Sci. 27, 180-186, 1979), 전체 세포 단백질과 지방산을 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 와 DNA 혼성화(hybridization)로 분석하였고 이는 캠필로박터와는 다르다는 것이 증명됨으로써 아르코박터(Arcobacter spp.)로 재분류하였다(Vandamme et al ., Int J Syst Bacteriol. 41, 88-103, 1991).

아르코박터(Arcobacter spp.)는 현재까지 총 14개의 종으로 알려져 있다. 발견의 시간 순으로 아르코박터 크라이에어로필러스(Arcobacter cryaerophilus), 아르코박터 나이트로피지리스(Arcobacter nitrofigilis) (Vandamme et al ., Int J Syst Bacteriol. 41, 88-103, 1991), 아르코박터 부처리(Arcobacter butzleri), 아르코박터 스키로위(Arcobacter skirrowii)(Vandamme et al ., Int J Syst Bacteriol. 42, 344-356, 1992), 아르코박터 시바리우스(Arcobacter cibarius)(Donachie et al ., Int J Syst Evol Microbiol . 55, 1271-1277, 2005), 아르코박터 할로필러스(Arcobacter halophilus)(Houf et al ., Int J Syst Evol Microbiol. 55, 713-717, 2005), 아르코박터 마이틸리(Arcobacter mytili)(Collado et al ., Int J Syst Evol Microbiol . 59, 1391-1396, 2009), 아르코박터 데레유스(Arcobacter thereius)(Houf et al ., Int J Syst Evol Microbiol . 59, 2599-2604, 2009), 아르코박터 마리누스(Arcobacter marinus)(Kim et al ., Int J Syst Evol Microbiol . 60, 531-536, 2010), 아르코박터 트로피아럼(Arcobacter trophiarum)(De Smet et al ., Int J Syst Evol Microbiol . 61, 356-361, 2011), 아르코박터 데플루비(Arcobacter defluvii)(Collado et al ., Int J Syst Evol Microbiol . 61, 2155-2161, 2011), 아르코박터 머루스코럼(Arcobacter molluscorum)(Figueras et al ., Syst Appl Microbiol. 34, 105-109, 2011), 아르코박터 비발비어럼(Arcobacter bivalviorum), 아르코박터 베네러피스(Arcobacter venerupis)(Levican et al ., Syst Appl Microbiol. 35, 133-138, 2012), 그 중에서 아르코박터 부처리, 아르코박터 크라이에어로필러스, 아르코박터 스키로위는 사람의 위장염, 균혈증 등 질환을 일으키는 병원체로 알려지고 있으며, 식중독에 관한 중요한 인자로 보고 되고 있다.(Houf et al., Int J Syst Evol Microbiol 55, 713-717, 2005; Hsueh et al ., J Clin Microbiol. 35, 489-491, 1997). 이 세 가지 아르코박터 균주는 주로 계육, 그 다음 돈육, 우육에서 검출 되었다 (Ho et al., Vet Microbiol. 115, 1-13, 2006).

기존에 보고된 논문에 따르면 배양첨가물에 따른 연구를 많이 하였지만, 아르코박터의 까다로운 성장 요구와 상대적 불활성적이기 때문에 표준 분리배양법은 아직까지 확립되지 못하고 있다(Atabay et al ., Int J Food Microbiol. 109, 139-145, 2006). 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction,PCR) 기술이 성숙해진 후 아르코박터의 검출에 대해 많이 이용되기 시작하였다. 중합효소 연쇄반응은 현재 널리 사용되고 있는 분자 생물학적 검사기술이며, 검출 원하는 특정 표적 유전물질을 식별하여 대량 증폭하는 방법이다. 중합효소 연쇄반응의 원리에 따라서 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 제한효소 절편길이다형성-중합효소 연쇄반응(RFLP-PCR), 다종 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 등 여러 가지 개선된 검출법을 개발 되었으며 위 기술들을 이용해서 아르코박터의 검출에 대한 연구한 바 있다(Gonzalez et al., Lett Appl Microbiol. 30, 207-212, 2000; Abdelbaqi et al., J Clin Microbiol . 45, 3015-3021, 2007; Marshall et al ., J Clin Microbiol. 37, 4158-4160, 1999). 보고된 논문에 의해 아르코박터를 검출 시 주로 multiplex PCR 방법이 제일 많이 사용되고 있다. 이 방법은 아르코박터 부처리, 아르코박터 크라이에어로필러스, 아르코박터 스키로위 등 세가지 균을 통시에 검출할 수 있는 장점을 가진다. 본 발명과 동일 발명자의 ‘등록특허 10-1104095 : 신규한 아르코박터 및 이의용도’에서도 아르코박터를 multiplex PCR로 검출한 바 있다. 그러나 PCR 방법을 이용할 때 온도가 반복적의 변화를 소요하기 때문에 별도의 장치를 필요하며, 반응시간이 상대적 길다.

PCR의 단점을 고려해서 최근에 등온증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)을 개발되었다(Notomi et al ., Nucleic Acids Res . 28:E63, 2000). LAMP 방법은 항온수조와 같은 간단한 기구만 요구되며 보통 한시간 이내에 검출을 완성할 수 있다. 반응을 실행하기 위한 프라이머는 목적 DNA의 특정부위에서 한쌍의 외부 프라이머 및 한 쌍의 내부 혼성 프라이머로 구성되며, 반응을 촉진하기 위해 한 쌍의 루프 프라이머를 추가될 수 있다. 반응시 첨가되는 Bst DNA polymerase는 높은 활성을 가지고 등온환경에도 증폭을 이르킬 수 있는 효소이다(Niessen et al.,2012). LAMP 방법은 2000년에 처음 개발되고나서 여러 가지 병원균의 검출에서 사용 하였다(Zhang et al., Arch Virol. 157, 2383-2388, 2012; Yamazaki et al., Methods Mol Biol. 943, 267-277, 2013).

대한민국 등록특허 제10-1104095호

Gonzalez I. Garcia T., Antolin A., Hernandez P.E. and Martin R.(2000). Development of a combined PCR-culture technique for the rapid detection of Arcobacter spp. in chicken meet. Letters in Applied Microbiology. 30(3): 207-212. Houf K., Tutenel A., De Zutter L., Van Hoof J., Vandamme P.(2000). Development of a multiplex PCR for the simultaneous detection and identification of Arcobacter cryaerophilus and Arcobacter skirrowii. FEMS Microbiology Letters. 193(1): 89-94.

이에 본 발명의 발명자들은 PCR 방법의 단점을 극복하고, 표적핵산을 신속하게 증폭시킬 수 있는 LAMP 방법을 개발하고자 하였다. 이 방법으로 아르코박터 부처리(A. butzleri ), 아르코박터 크라이에어로필러스(A. cryaerophilus), 아르코박터 스키로위(A. skirrowii) 세 가지 균주를 검출할 수 있다는 것을 확인하고 검출한도를 분별 측정하였다. 아르코박터만 검출할 수 있는지를 확인하기 위해 특이성 검사를 하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는, 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 시료에서 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 23S rRNA 표적 서열을 증폭하는 단계; 및(c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아르코박터를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는, 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 프라이머 세트를 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 (a) 시료에서 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 23s rRNA 표적 서열을 증폭하는 단계; 및(c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아르코박터를 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는, 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 ‘프라이머’란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명은 아르코박터 (Arcobacter species) 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하며, 바람직하게 본 발명의 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로한다. 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머 세트는 23S rRNA 의 유전자 서열이며, 서열번호 1 및 2의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 양 말단에 해당하는 프라이머(external primer)로서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 프라이머이다. 또한, 서열번호 3 및 4의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 내부에 위치하는 프라이머(internal primer)로서, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer; FIP)이며, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 아르코박터의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환) 될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

상기 등온증폭반응은 등온 조건에서 특정유전자를 증폭시기는 방법을 의미한다. 이에 제한되지 않으나 Bst polymerase 를 이용하고, 4개의 프라이머에 의해 이루어지며 먼저 내부 프라이머가 DNA에 결합하여 신장되고, 이어 그 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장되면서 strand displacement가 발생하며 먼저 형성된 가닥이 떨어져 나오게 된다. 떨어져나온 단일 가닥의 5’- 말단에서부터 loop 구조가 형성되며 이는 3’- 말단에서도 같은 과정이 반복되고 loop 구조가 신장되게 된다.

본 발명의 아르코박터(Arcobacter species)는 그람-음성이고 포자를 형성하지 않으며 운동성 가진 나선형 모양의 작은 세균으로서, 이에 제한되지 않으나 아르코박터 크라이에어로필러스(Arcobacter cryaerophilus), 아르코박터 나이트로피지리스(Arcobacter nitrofigilis), 아르코박터 부처리(Arcobacter butzleri), 아르코박터 스키로위(Arcobacter skirrowii), 아르코박터 시바리우스(Arcobacter cibarius), 아르코박터 할로필러스(Arcobacter halophilus), 아르코박터 마이틸리(Arcobacter mytili), 아르코박터 데레유스(Arcobacter thereius), 아르코박터 마리누스(Arcobacter marinus), 아르코박터 트로피아럼(Arcobacter trophiarum), 아르코박터 데플루비(Arcobacter defluvii),아르코박터 머루스코럼(Arcobacter molluscorum), 아르코박터 비발비어럼(Arcobacter bivalviorum), 아르코박터 베네러피스(Arcobacter venerupis)일 수있다. 바람직하게는 아르코박터 부처리(Arcobacter butzleri), 아르코박터 스키로위(Arcobacter skirrowii), 아르코박터 크라이에어로필러스(Arcobacter cryaerophilus)일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 아르코박터를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이와 같은 효과는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행한 결과, 아르코박터와 다른 균종을 특이적으로 검출할수 있음이 확인되었다. 또한 기존의 PCR 법보다 높은 민감도(10배 내지 1000배)로 아르코박터를 검출 가능함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 세트를 이용하여 아르코박터를 검출하는데 필요한 실험과정(예: LAMP, 서던 블럿 등)및 결과 확인에 필요한 여러가지 시약들, 예컨대, LAMP 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

보다 상세하게는 상기 PCR 조성물은 목적 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Bst DNA Polymerase ), dNTP, 반응 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다.

상기 DNA 중합효소는 isothermal amplification을 수행할 수 있는 효소라면 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게는 Bst DNA polymerse, phi29 DNA polymerase 및 Gsp DNA polymerase 일 수있고, 더 바람직하게는 Bst DNA Polymerase 일 수 있다.

상기 반응 완충용액에는 이에 제한되지는 않으나, 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드 (dimethylsufoxide (DMSO)), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아미이드 및 소 혈청 알부민 (bovine serum albumine (BSA))이 추가로 포함될 수 있다. 또한 완충용액에는 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등이 포함될수 있으며 이들의 용법 및 용량은 당해 기술자에게 널리 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다.

본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 그리고 반응 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는(예를 들어 전기영동)작업 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함 될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은

(a) 시료에서 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 23s rRNA 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아르코박터를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 시료는 아르코박터가 검출될 수 있는 시료이면 제한되지 않으나, 바람직하게는 식품일 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 아르코박터의 23S rRNA 유전자를 증폭해 낼 수 있다. 상기 등온증폭 반응(LAMP)은 분자유전학적 기법의 하나로, 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 4개의 프라이머 세트를 이용하여, 등온조건에서 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 방법이다. 본 발명의 동온증폭 반응의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않으나, 바람직하게 상기 등온증폭반응은 59 내지 63℃, 더욱 바람직하게는 61℃에서 1시간 정도 수행될 수 있다. 또한 (b) 단계를 수행시 반응 혼합물과 더불어 형광 표지 및 방사성 표지하여 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 SYBR Green I이라는 형광시약을 첨가하여 등온증폭반응을 수행할 수 있다.

상기 (c)단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라, LAMP 반응 산물(LAMP reaction product)의 증폭된 표적 서열을 검출할 수 있다. 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram) 또는 방사성 측정 또는 DNA 칩에 의해 확인할 수 있다. 예를들어, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있는데, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있고 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있고, 방사성 측정기구 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또 다른 한 예로, SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 육안으로 확인할 수 있다.

본 발명의 아르코박터 검출을위한 서열번호 1 내지 4로 구성되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법은 기존의 PCR 방법보다 민감도와 특이도가 우수하다. 또한 등온 환경에서 검출이 가능하고 장소에 구애 받지 않게 됨에 따라 임상진단 실험실과 현장 및 기타 어느 장소에서도 아르코박터에 대한 진단이 가능한 장점을 가지고 있으므로 실용성이 높다.

도 1의 a는 프라이머 비율에 따른 LAMP반응 조건의 최적화 실험 결과이다.
(Lane M : 100bp DNA Marker, Lane NC : negative control, Lane 1- Lane5 는 [표 4]에 기재된 반응 조건과 같음)
도 1의 b는 온도에 따른 LAMP반응 조건의 최적화 실험 결과이다.
(Lane M : 100bp DNA Marker, Lane 1: 59℃, Lane 2: 60℃, Lane 3: 61℃, Lane 4: 62℃, Lane 5: 63℃)
도2는 multiplex PCR assay 의 특이도를 실험한 결과이다.
(Lane M : 100bp DNA Marker, Lane NC : negative control, Lane 1:A. butzleri ATCC 49616, Lane 2: A. cryaerophilus ATCC 43152, Lane 3: A. skirrowii ATCC 51132, Lane 4: C. jejuni ATCC 33291, Lane 5: C. jejuni NCCP 10402, Lane 6:C. jejuni NCCP 10276, Lane 7:C. jejuni NCCP 10672, Lane 8: C. coli NCCP 11191)
도3은 LAMP assay의 특이도를 실험한 결과이다.
(Lane M : 100bp DNA Marker, Lane NC : negative control, Lane 1:A. butzleri ATCC 49616, Lane 2: A. butzleri CAU 076046, Lane 3: A. skirrowii ATCC 51132, Lane 4:A. cryaerophilus CAU 090029, Lane 5: A. cryaerophilus ATCC 43158, Lane 6: C. jejuni ATCC 33291, Lane 7:C. jejuni NCCP 10402, Lane 8: C. jejuni NCCP 10276, Lane 9: C. jejuni NCCP 10672, Lane 10: C. jejuni NCCP 11211, Lane 11: C. coli NCCP 11191, Lane 12: H. pylori ATCC 43504, Lane 13: E. coli O157:H7 ATCC 43889 )
도4는 LAMP product의 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 결과이다.(Lane M : 100bp DNA Marker, Lane NC : negative control, Lane 1:A. butzleri ATCC 49616 LAMP ,Lane 2: A. butzleri ATCC 49616 restrictive enzyme ,Lane 3: A. butzleri CAU 076046 LAMP , Lane 4: A. butzleri CAU 076046 restrictive enzyme , Lane 5: A. skirrowii ATCC 51132 LAMP , Lane 6: A. skirrowii ATCC 51132 restrictive enzyme, Lane 7: A. skirrowii CAU 090017 LAMP, Lane 8: A. skirrowii CAU 090017 restrictive enzyme, Lane 9: A. cryaerophilus ATCC 43152 LAMP, Lane 10: A.cryaerophilus ATCC 43152 restrictive enzyme , Lane 11: C. jejuni NCCP 10672 LAMP , Lane 12: C. jejuni NCCP 10672 restirictive enzyme)
도5는 LAMP 및 multiplex PCR의 아르코박터에대한 민감도 실험결과인데, 1a 내지 3a 는 LAMP 결과이며 1b 내지 3b는 multiplex PCR 결과이다.
(1a 및 1b : A. butzleri ATCC 49616, 2a 및 2b :A. skirrowii ATCC 51132, 3a 및 3b : A.cryaerophilus ATCC 43152. Lane M : 100bp DNA Marker, Lane NC : negative control, lane 1 : 2×10⁵ CFU per reaction , lane 2 : 2×10⁴ CFU per reaction ,lane 3 : 2×10³ CFU per reaction , lane 4 : 2×10² CFU per reaction ,lane 5 : 2×10 CFU per reaction , lane 6 : 2 CFU per reaction , lane 7 : 2×10^-1 CFU per reaction , lane 8 : 2×10^-2 CFU per reaction )
도 6은 LAMP 및 multiplex PCR 의, 계육 샘플에서 아르코박터에 대한 민감도 실험결과인데, 1a 내지 3a 는 LAMP 결과이며 1b 내지 3b는 multiplex PCR 결과이다.(1a 및 1b : A. butzleri ATCC 49616, 2a 및 2b :A. skirrowii ATCC 51132, 3a 및 3b : A. cryaerophilus ATCC 43152. Lane M : 100bp DNA Marker, Lane NC : negative control, lane 1 : 2×10⁴ CFU per reaction , lane 2 : 2×10³ CFU per reaction ,lane 3 : 2×10² CFU per reaction , lane 4 : 2×10 CFU per reaction ,lane 5 : 2 CFU per reaction )

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험준비>

1. 균주의 준비

총 42 종류의 Arcobacter spp. 가 실험에 사용되었다. A. butzleri ATCC 49616, A. skirrowii ATCC 51132 및 A. cryaerophilus ATCC 43158 는 Americal Type Culture Collection (ATTC, Richmond, U.S.A.)에서 구입하였고, 양성대조군(positive control)으로 사용하였다. 36 종류의 A. butzleri 및 3 종류의 A. skirrowii 는 2007년 및 2009년에 본 실험실에서 계육(chicken skin)으로부터 분리한 field strain 이다(표 1).

Arcobacter spp.는 Arcobacter Selection Broth (Oxoid, Basingstoke, England)를 사용하여 배양되거나, Agar Technical (Oxoid)에서 각각 37℃(A. butzleri) , 35℃ (A. skirrowii) ,30℃(A. cryaerophilus)에서 48시간 동안 배양되었다.

또한, 27 종류의 식품유래 병원균 (foodborn pathogens)이 본 연구의 특이성 검사(specificity test)에 사용되었다. [표 1]은 본 실험에 사용된 아르코박터 및 그 밖의 식품유래 균주들을 나타낸다. E. coli O157:H7 , L. monocytogenes , S. Typhimurium, S. aureus , B. cereus 및 V. parahaemolyticus 는 Tryptone Soya Broth 또는 Agar (Oxoied)에서 37℃로 24시간 동안 배양되었다. C. jejuni , C. coli 는 Supplement (Oxoid) 및 Laked Horse Blood (Oxoid)와 함께 Bolton Broth (Oxoid) 또는 CCDA Selective Supplement (Oxoid)와 함께 Blood- free Campylobater Selective Agar Base에서 42℃, 무산소 환경에서 48시간동안 배양되었다. Helicobacter 는 미호기성(microaerophilic) 환경에서 CampyGen(Oxoid)를 사용하여 배양되었다.

Stains	Stains number
A. butzleri	ATCC 49616, CAU 076046, 076048, 076050, 080083, 080084, 080086, 080089, 080090, 080092, 080097, 080098, 080099, 080100, 080101, 080105, 080137, 080138, 080142, 080145, 080150, 080159, 080161, 080163, 080165, 080166, 080169, 080170, 080171, 080173, 080174, 080175, 080176, 080177, 080178, 080179, 080180
A. cryaerophilus	ATCC 43158, CAU 090029
A. skirrowii	ATCC 51132, CAU 090017, 090019, 090023
E. coli O157:H7	ATCC 43889, ATCC 43890
L. monocytogenes	ATCC 15313, ATCC 19117, ATCC 19114
S. Typhimurium	ATCC 43971, ATCC 19585
S. aureus	KACC 10778, 10768, 10196, ATCC 49444, 12600
V. parahaemolyticus	KCCM 4664, ATCC 43996,KCTC 2471
B. cereus	ATCC 13061, ATCC 10879
C. jejuni	ATCC 33291, NCCP 10402, 10276, 11211, 10672
C. coli	NCCP 11191
H. pylori	ATCC 43504, 49503, KTCC B0233, B0322

ATCC : Americal Type Culture Collection

CAU : Chung-Ang University]

KACC : Korean Agriculture Culture Collection

KCCM : Korean Culture Center of Microorganisms

KCTC : Korean Collection of Type Culture

NCCP : National Culture Collection for Pathogens

2. DNA 추출

상기 기재된 균주들의 DNA는 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit(Bioneer, Daegeon, Korea)로 추출되었다. 박테리아 세포를 용해하기 위하여 proteinase K가 사용되었다. 상기 키트는 column속에 고정된 glass fiber를 사용하는데, 이는 특별히 chaotropic salt의 존재 하에서 DNA와 결합한다. 단백질 및 다른 불순물들은 짧은 수세 및 centrifuge (Vision Science, Jain-Myeon, Korea)를 이용한 회전 과정을 수행함으로서 제거되었다. 게놈 DNA 는 낮은 염 용액에 녹여졌고, DNA Product는 10ng/μl 이상의 농도로 본 실험에서 사용되었다. 민감도 테스트 및 계육 샘플 테스트에 사용된 DNA 는 박테리아 배양물을 100℃ 물로 10분간 끓이는 과정으로 추출되었다.

3. Multiplex PCR

Houf et al.(2000)에 기재된 방식으로 디자인된 Multiplex PCR 프라이머는 LAMP 와 Multiplex PCR 프라이머들을 비교하는 실험에 사용되었고, [표 2]와 같다.

Species	Primer	Sequence(5'-3')	서열번호	Size(bp)
A. butzleri	ARCO	CCTGGACTTGACATAGTAAGAATGA	7	401
	BUTZ	CGTATTCACCGTAGCATAGC	8
A. skirrowii	ARCO	CCTGGACTTGACATAGTAAGAATGA	7	641
	SKIR	GGCGATTTACTGGAACACA	9
A. cryaerophilus	CRY1	TGCTGGAGCGGATAGAAGTA	10	257
	CRY2	AACAACCTACGTCCTTCGAC	11

PCR 반응 혼합물은 1mM dNTP mixture (Bioneer), 2㎕ Reaction Buffer (Tris pH 9.0 , 15mM MgCl₂)(Bioneer), 1.25 μM 각각의 프라이머 (ARCO,BUTZ,SKIR,CRY1,CRY2), 0.05 U/㎕ Top polymerase (Bioneer), 2㎕ DNA templet, 탈이온수(deionized water)로 20μl 의 Mixture 를 만들었다. PCR 반응은 초기 변성(initial denaturation)이 94℃에서 5분 동안 수행되었고, 다음에 수행되는 35 cycle 은 변성(denaturation) 94℃에서 45초, 어닐링(annealing) 61℃에서 45초, 신장(extension) 72℃에서 45초로 하여 수행되었으며, 최종 신장(final extension)단계는 72℃에서 10분동안 수행되었다. MJ Mini personal Thermal Cycler (BioRad, Delegacicn Benito Juarez, Mexico)는 상기 반응에있어서 온도를 조절하기위해 사용되었고, 4μL 의 PCR product는 12 % 아가로스 겔 상에 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electophoresis) 되었다. 아가로스 겔은 Agarose-Molecular Bioogy Grade (Invitrogen , New York, U.S.A.)을 0.1μL/mL ethidium bromide를 포함하는 1×Tris Acetate EDTA (TAE) buffer에 용해시켜 만들었다.

4. LAMP for Arcobacter species

LAMP 프라이머는 유전자은행(GenBank) 에서 제시하는 아르코박터 23s rRNA 서열(A. butzleri partial 23S rRNA gene, strain LMG 10828, GenBank: FN600698.1)에 의해 디자인하였다. A. butzleri's 23S gene을 타겟하는 4개의 프라이머는 “Primer explorer V4”(http://primerexplorer.jp/e) 로 디자인하였으며, external primer 로서 F3 및 B3, internal primer로서 FIP 및 BIP 를 포함한다. 프라이머는 Bioneer Korea에서 합성되었다. [표 3]은 상기 프라이머의 이름 및 서열을 나타낸다.

Primer	Sequence(5'-3')	서열번호	genomic position
F3	ACTGTGACAACCAGGAGGTT	1	881-900
B3	TCCAACGCTCCTTACCGG	2	1057-1074
FIP	CGCGCAGAATCACTAGACCAGTGGCTTAGAAGCAGCCATCC	3	942-963 901-919
BIP	AACGGGGCTAAGATGTACACCGACGCTGAATAGAACGCTCTC	4	972-993 1027-1046

본 발명에 사용하는 최적화된 LAMP 반응액(reaction mixture) 구성은 다음과 같다: 2 μM FIP, 2 μM BIP, 0.2 μM F3, 0.2 μM B3, 0.8 mM dNTP mixture (Bioneer), 2.5 μL 1×ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10mM KCl, 2 mM MgSO₄, 0.1% TritonX-100)(New England BioLabs Inc, Ipswich , England), 8U Bst DNA Polymerase Large Fragment(ew England BioLabs Inc), 2 μL DNA 샘플로 구성되며, DEPC 물로 반응액을 25 μL 로 보완한다. 상기 LAMP 반응액은 61℃에서 50분동안 배양되었고, 반응의 종결을 위해 5분 동안 80℃로 가열되었다.(최적 반응 조건은 2.6에 기재되어있다.) 음성대조군으로는 2μL 의 DAN template 를 deionized water로 대체하여 25μL의 반응 혼합물을 만들었다. LAMP 반응의 온도를 조절하기 위해 MJ Mini personal Thermal Cyler(Bio-Rad)가 함께 사용되었다. LAMP 반응 결과는 1.2 % 아가로스 겔 상에서 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (Bioneer)을 하여 확인하였다.

5. RFLP Restriction

LAMP 증폭 산물(LAMP amplification product)은 제한효소인 Hind III 효소로 절단하여 분석하였다. Hind III 효소는 5’-A^AGCTT-3’서열을 식별할 수 있으며 "^"부위에 절단하는 제한효소의 일종이다. 반응액은 1 U/μl Hind III 효소(Promega Madison, Walworth, U.S.A), 1 U/μl Butter E(Promega MADISON), 8 μl LAMP 증폭산물을 같이 섞은 후에 37℃에서 2시간을 반응하였다. 반응 후 1.2% 아가로스 겔 상에 전기영동을 하자, 147 bp, 198 bp, 249 bp 세 개 밴드가 관찰되었다.

6. LAMP 반응 최적화

혼합물(mixture)의 조성은 아르코박터에 최적화되었다. 다음과 같이 F3, B3, FIP, BIP 의 비율에있어서, 서로 다른 4개의 비율조합이 고안되었다; 1:1:4:4 , 1:1:6:6 , 1:1:8:8 , 1:1:10:10. A. butzleri ATCC 49616의 DNA 추출물을 DNA 샘플로서 사용되었고, [표 4]에 기재된 바와 같이, 서로 다른 프라이머 농도조합의 5개 반응이 수행되었다.

Reaction	1	2	3	4	5
F3(μM)	1.6	0.8	1.2	1.6	2
B3(μM)	1.6	0.8	1.2	1.6	2
FIP(μM)	0.4	0.2	0.2	0.2	0.2
BIP(μM)	0.4	0.2	0.2	0.2	0.2
dNTP	0.8mM
buffer	10% as total volume was added
Bst Polymerase	8U in the mixture
DNA sample	With a volume of 2μL
deionized water	Added to total volume
Total volume	25μL

최적 반응 온도를 결정하기위해, LAMP 반응 혼합액을 각각 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃에서 반응시켰다. LAMP 반응 혼합액은 standard LAMP reaction과 혼합되었으며 A. butzleri ATCC 49616의 DNA 추출물을 DNA template으로 사용하였다. 반응은 80℃에서 5분동안 열불활성화(heat inactivation) 하는 것으로 종결되었다. 반응이 종결되면, LAMP 반응 생성물은 1.2 % 아가로스 겔로 분석하였다.

2개의 loop- primer 인 LF 및 LB 는 각각 0.4μM로 standard LAMP reaction에 첨가되었다. loop- primer 의 서열은 마찬가지로 Primer explorer V4 으로 디자인되었고, Bioneer Korea 에서 합성되었으며 서열은 다음과 같다.

LF: 5‘-GCTGTTACGCTTTCT-3’(서열번호 5)

LB: 5‘- TTAATTGAGTGGTAG -3’(서열번호 6)

A. butzleri ATCC 49616의 DNA 추출물을 DNA template으로 사용하였다. loop-primer 가 사용된 경우와 사용되지 않은 경우를 standard LAMP reaction에 기초하여 비교하였다.

7. LAMP 와 PCR 의 민감도( Sensitivity ) 및 특이도( Specificity )

A. butzleri ATCC 49616, A. skirrowii ATCC 51132 및 A. cryaerophilus ATCC 43158 균주는 탈이온화 물(deionized water)에 10⁸ CFU/mL 로 희석되어 사용되었다. 또한 10 CFU/mL로 10배 연속 희석하였다. 이러한 균액은 DNA를 분리하기 위하여 100C 물로 10분간 끓였다. 검출한계를 얻기 위해서 최적화된 LAMP와 PCR assay 가 수행되었다. 반응이 종료되고 난후, 4μL 의 LAMP product 는 1.2% 아가로스겔 상에서 분석되었다.

식품에서의 검출한계를 얻기 위하여 아르코박터를 포함하지 않은 20g의 피부 및 고기 샘플에 A. butzleri , A. skirrowii 또는 A. cryaerophilus 균을 10^4-8 CFU/mL 수준으로 접종하고, 200ml peptone water를 첨가하여 스토마커 백(stomacher bag)안에서 균질화하였다. 각각 2분동안 균질화되었고, 용액은 Eppendorf tube에 옮겨졌다. 샘플은 13000 rpm 에서 15분동안 원심분리하였다. 상층액은 버리고, 박테리아 pellet 은 sterile water 로 세척하였다. pellet 을 다시 sterile water 에 현탁하고, 세포를 용해시키기위해 10 분동안 끓였다. 그 후 2분동안 8000rpm으로 원심분리 되었으며, 상층액을 DNA template로 사용하였다. 각각의 샘플로부터 2μl의 상층액이 LAMP 와 PCR 실험에 사용되었다(houf et al., 2000). LAMP assay의 특이도(specificity)는 [표 1]에 기재된 균의 DNA 추출물을 가지고 실험되었다. 특이도 테스트를 위하여 LAMP 반응 산물을 1.2% 아가로스겔을 사용하여 전기영동하였다. 비교를 위하여, LAMP의 특이도 테스트에 사용되었던 DNA는 multipelx PCR에도 사용되었다. LAMP 증폭 산물은 실험준비 5 에 기재된 방법에 의하여 제한효소인 Hind III로 처리되었다. LAMP 반응 조건의 최적화를 위해서 특이도(specificity) 및 민감도(sensitivity) 테스트가 적어도 3번 반복되었다.

8. 실험적 디자인 ( Experimental design )

본 발명에서 제시되는 LAMP 방법을 이용하여, 시중에 판매되는 생닭 30 마리를 구입하여, 아르코박터에 대한 오염여부를 확인되었다. 30개의 냉장 보관된 신선한 계육 샘플은 몇몇 지역 시장에서 구입하였다. 구입 후 12시간 안에 분석되었으며, 분석되기까지 4℃로 보관하였다. 각각 5g의 피부 샘플을 45ml peptone water와 함께 stomacher bag에 넣고 2분 동안 균질화하였다. 그 후에 1ml 의 용액을 Eppendorf tube 에 옮기고, DNA방출을 위한 세포 용해를 위하여 10분동안 끓였다. 1 ml의 균질액에 9ml의 Arcobacter broth를 C.A.T supplement(Oxoid)와 함께 첨가하였다. 용액은 30℃에서 각각 3,6,24 시간동안 배양되었고, 이 중 1ml의 용액이 DNA 방출을 위하여 제거되었다. 24시간의 배양 후에, 배양물은 0.45 μm filter 되고, Arcobacter agar 위에 500μm 로분산되었다. agar는 30℃ 에서 48시간동안 배양되었고, 하나의 콜로니를 Arcobacter broth에 옮겼다. 배양 후에, 아르코박터의 존재를 확인하기 위해 multiplex PCR 법이 사용되었다.

Multiplex PCR 및 LAMP assay는 [표 1]에 기재된 균주의 DNA 추출물을 테스트하는데 사용되었고, Multiplex PCR 및 LAMP의 결과를 확인하기위하여, 다른 PCR assay 도 사용되었는데, 이는 Gonzalez et al. at 2000 에 기재된 방법이다. Arc1 (서열목록 12: 5′-AGAACGGGTTATAGCTTGCTAT-3‘) 및 Arc2 (서열목록 13: 5′-GATACAATACAGGCTAATCTCT-3′)의 두개의 프라이머는 bioneer로 부터 합성되었고, 양성 샘플 (positive sample)에서의 증폭 산물로서 181bp DNA segment를 얻었(Gonzalez et al., 2000)다. 따라서 모든 DNA 추출물은 PCR, multipelx PCR 및 LAMP assay 로 테스트 되었으며, 증폭 생산물의 4μL를 사용하여 1.2% 아가로스 겔로 전기영동하여 분석하였다.

< 실시예 1>

LAMP 최적화

LAMP의 최적화는 일련의 실험들을 통해서 평가되었다. LAMP의 최적 반응온도 및 F3,B3,FIP,BIP 최적 비율이 조사되었다.

[도 1] 에서 보는 바와 같이, standard LAMP reaction 에서 F3,B3,FIP,BIP가 1:1:10:10 의 비율일 때, 전기영동 시 가장 선명한(strongest) 밴드를 관찰할 수 있었다. 또한 61℃ 일때 가장 결과가 잘나왔다[도 1]. 또한 데이터에 제시 않았지만, 루프 프라이머 첨가 여부는 아르코박터의 LAMP 반응에 대한 영양이 없었다.

< 실시예 2>

LAMP 및 multiplex PCR 의 특이도( specificity )

프라이머세트의 특이도를 평가하기 위하여, 아르코박터의 42개 균주 및 다른 종의 박테리아 27개로부터 추출된 DNA를 PCR (도2 참조)및 LAMP(도 3참조) assay 하였다. template 로서 Arcobacter genomic DNA sample 을 사용하여 증폭을 탐지하였다. 42개의 아르코박터 균주와 C. jejuni 중 하나의 균주가 LAMP assay에서 양성반응을 보였고, 게놈 DNA의 증폭이 탐지되었다. multiplex PCR assay 로 상기와 같은 DNA 샘플을 테스트한 결과, 아르코박터 뿐만아니라 Campylobacter 의 5개 균주도 검출되었다. 이들은 641bp의 밴드를 나타내었으며, 이는 A. skirrowii 와 정확히 같은 밴드 양상을 보인다.

reference culture 및 field 로부터의 아르코박터는 제한효소인 Hind III로 처리되었다. 효소 반응으로 인해 3개 size(147bp, 198bp,249bp)의 fragment가 산출되었다. 위양성(false-positive) 샘플, C. jejuni NCCP 10672 또한 분석이 시도되었지만, 분석이 불가능하였다. LAMP 및 multiplex PCR 의 특이도는 [표 5]와 같다.

< 실시예 3>

LAMP 및 multiplex PCR 의 민감도( sensitivity )

LAMP 및 PCR assay 의 민감도는 A. butzleri ATCC 49616, A. skirrowii ATCC 51132 및 A. cryaerophilus ATCC 43158 의 연속적인 열배 희석액들을 테스트함으로서 결정되었다. LAMP assay를 이용한 A. butzleri 및 A. skirrowii 의 검출한계는 2 CFU per reaction 이었고, A. cryaerophilus 는 20 CFU per reaction 이었다. 그러나 multiplex PCR 의 검출한계는 A. butzleri 가 20 CFU per reaction, A. skirrowii 가 200 CFU per reaction, A. cryaerophilus 가 2×10⁴ CFU per reaction 였다. 그러므로 A. butzleri , A. skirrowii 및 A. cryaerophilus 의 검출에있어 LAMP assay의 민감도는 각각 10배, 100배, 1000배로 PCR 검출보다 높았다.

계육(chicken) 샘플에서의 LAMP 및 PCR assay 검출한계도 알아보았다. LAMP assay는 10⁵ CFU per gram(200 CFU per reaction) 이하의 샘플에서 아르코박터 균주의 존재를 검출했다. 이에 비하여 PCR assay 는 10배 낮은 민감도를 보였다(A. cryaerophilus 는 100배 낮은 민감도를 보였다). LAMP 및 multiplex PCR assay의 민감도는 [표 6]과 같다. (도 5 및 도 6참조)

[표 6]은 LAMP 및 multiplex PCR assay 의 검출한계를 나타낸다.

< 실시예 4>

계육( chicken )에서의 아르코박터 검출

30개의 계육 샘플에서 아르코박터를 검출하기 위해 traditional culture method, LAMP 및 conventional PCR, multiplex PCR assay가 수행되었다. 계육 샘플 중 28개의 샘플은 multiplex PCR 및 LAMP assay 에서 양성 결과를 보였으나, conventional PCR 에서는 27개의 샘플이 양성 결과를 보였다. A. butzleri 및 A. cryaerophilus가 각각 10개와 3개의 분리주가 traditional culture method를 이용하여 배양되었다.

[표 7]에서 보는 바와 같이, incubation time 0 시간에서 LAMP 방법은 30개의 샘플 중 20개의 감염을 검출해 내었지만, multiplex PCR 은 9개를 검출 할 수 있을 뿐이었고, conventional PCR로는 검출되지 않았다. 6시간의 증균 후에는 전반적으로 각 방법들의 아르코박터 검출 능력이 향상되었다. 하지만 conventional PCR에서는 30개 샘플 중 18개를, multiplex PCR 에서는 22개의 샘플만 검출 되었을 뿐이지만, LAMP 방법은 30개의 샘플 중 27개의 샘플에서 아르코박터가 검출되었다. 이러한 결과는 본 발명의 프라이머를 사용한 LAMP 방법이 다른 방법보다 신속하고 정확하게 아르코박터를 검출할 수 있음을 나타낸다.

모든 샘플 중에서, 10개의 샘플은 A. butzleri 및 A. cryaerophilus 를 보유하는 것으로 판정되었고, 5개의 샘플은 A. butzleri , A. cryaerophilus 및 A. skirrowii 의 3개 종이 혼합감염되었으며, 13개 샘플은 단일균주의 오염으로 조사되었다. [표 8]의 숫자는 A. butzleri로 감염된 경우 초기 단계에서 검출할 수 있고, A. skirrowii의 감염 수준은 다른 두 종에 비해서 높지 않음을 보여준다.

또한 PCR assay 에서 음성반응을 보인 것들을 traditional culturing method를 사용하여 배양하였다. 24시간의 증균 후에는 다른 두개의 분자 에세이에서도 양성반응을 보여주었다. PCR assay 에서 음성반응을 나타낸것은 A. cryaerophilus 균주임이 확인되었다. 따라서 이는 위음성(false-negative) 샘플로서 생각된다.

[표 7] 은 culture, PCR 및 LAMP assay를 사용하여 계육 샘플에서 아르코박터 검출 결과를 보여준다.

[표 8]은 multiplex PCR(Houf et al., 2000)을 사용하여 계육 샘플에서 아르코박터를 식별한 결과이다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification ;LAMP)을 이용한 아르코박터 신속 검출법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 아르코박터 검출을 위한 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트 , 상기 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭 반응용 조성물 및 키트 , 상기 프라이머세트를 이용하여 LAMP를 수행하는 것을 포함하는 아르코박터 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 아르코박터 검출을위한 서열번호 1 내지 4로 구성되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법은 기존의 PCR 방법보다 민감도와 특이도가 우수하다. 또한 등온 환경에서 검출이 가능하고 장소에 구애 받지 않기 때문에 임상진단 실험실과 현장 및 기타 어느 장소에서도 아르코박터에 대한 진단이 가능하여 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Primer for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Arcobacter spp., and method for detecting Arcobacter spp. using the same <130> NP13-0049 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer(F3) <400> 1 actgtgacaa ccaggaggtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer(B3) <400> 2 tccaacgctc cttaccgg 18 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward inner primer(FIP) <400> 3 cgcgcagaat cactagacca gtggcttaga agcagccatc c 41 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward inner primer(BIP) <400> 4 aacggggcta agatgtacac cgacgctgaa tagaacgctc tc 42 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop primer F(LF) <400> 5 gctgttacgc tttct 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop primer B(LB) <400> 6 ttaattgagt ggtag 15 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARCO primer <400> 7 cctggacttg acatagtaag aatga 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BUTZ primer <400> 8 cgtattcacc gtagcatagc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SKIR primer <400> 9 ggcgatttac tggaacaca 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRY1 primer <400> 10 tgctggagcg gatagaagta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRY2 primer <400> 11 aacaacctac gtccttcgac 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARC1 primer <400> 12 agaacgggtt atagcttgct at 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARC2 primer <400> 13 gatacaatac aggctaatct ct 22

Claims (7)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는, 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 아르코박터(Arcobacter species)는 아르코박터 부처리(Arcobacter butzleri), 아르코박터 크라이에어로필러스(Arcobacter cryaerophilus) 및 아르코박터 스키로위(Arcobacter skirrowii)인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
   
3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물.
   
4. 제1항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 아르코박터(Arcobacter species)를 검출하기 위한 키트.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
   
6. (a) 시료에서 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 23s rRNA 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아르코박터를 검출하는 방법.
   
7. 제 6항에 있어서, 상기 등온증폭반응은 59 내지 63℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
   

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