CN114438235A

CN114438235A - 一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件、试剂盒及其应用

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Publication number: CN114438235A
Application number: CN202011218372.3A
Authority: CN
Inventors: 鞠长燕; 张茂俊; 段永翔; 马艳萍; 袁梦; 胡鹏威
Original assignee: SHENZHEN NANSHAN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: SHENZHEN NANSHAN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明适用于细菌检测技术领域，提供了一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件、试剂盒及其应用，公开了同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的检测引物组和检测探针组的核苷酸序列，共2套，包含所述检测引物组和检测探针组的试剂盒。本发明检测结果准确可靠，特异性强，灵敏度高，检测低限为10²CFU/mL，且无需对目的基因扩增产物进行电泳检测，操作简单，检测周期短，减少了操作人员的工作量，简化了弓形杆菌检测流程，可作为敏感的初筛手段，提高弓形杆菌培养检测的阳性率，为我国今后制定食品中弓形杆菌卫生学标准提供有力的技术支撑。

Description

一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，尤其涉及一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件、试剂盒及其应用。

背景技术

弓形杆菌(Arcobacter)属于革兰氏阴性短杆菌，被认为是新发肠道病原菌和人畜共患菌，逐渐引起研究者的重视。目前发现的弓形杆菌属有21个菌种，其中布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)、嗜低温弓形杆菌(Arcobacter cryaerophilμs)和斯氏弓形杆菌(Arcobacter skirrowii)与人类和动物疾病相关。弓形杆菌感染的主要症状为持续性腹泻，伴有腹痛、胃痉挛、恶心呕吐和发热等症状。食用了污染的食品或饮用污染的水是导致人感染弓形杆菌最常见的途径。经本研究组前期试验发现，嗜低温和斯氏弓形杆菌在我国深圳地区零售鸡肉、猪肉，牛肉、蔬菜、海鲜等产品中均有检出。其中，嗜低温弓形杆菌在零售鸡肉中检出率最高(56.5％)，其次为海鲜类(44.4％)，在猪肉、牛肉、生菜中检出率较低(3.7～13.3％)。斯氏弓形杆菌在海鲜类产品中检出率最高 (25.9％)，其他零售肉类和蔬菜类检出较低(0～6.2％)。

目前，嗜低温和斯氏弓形杆菌的检测技术主要有分离培养和普通PCR法。分离培养的方法要经过增菌培养、分纯鉴定、生化检测等鉴定过程，存在操作繁琐、耗时较长且灵敏度不高的问题。普通PCR检测技术需要琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物的大小，费时且易损害检测人员的健康，且目前国内可同时检测两种弓形杆菌的技术未见报道。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的试剂盒，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的试剂盒，所述的试剂盒包括引物探针组件、模板DNA以及反应试剂；

其中，所述引物探针组件包括检测引物组和检测探针组；

所述检测引物组为引物组1或者引物组2；所述引物组1由引物序列SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2组成，或者由所述引物序列的核苷酸互补序列组成；所述引物组2由引物序列SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4组成，或者由所述引物序列的核苷酸互补序列组成；

所述检测探针组的探针序列为SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:6，或者为所述探针序列的核苷酸互补序列。

进一步地，所述探针序列的5’端标记的荧光基团为FAM、VIC中的一种；所述探针序列的3’端标记的淬灭基团为BHQ1。

进一步地，每组中的检测引物组和检测探针组的体积比为2∶1，且在每组中的两条引物的体积比为1∶1。

进一步地，所述反应试剂包括qPCR Master以及H₂O。

进一步地，所述qPCRMaster包括Taq酶，PCRbuffer，三磷酸脱氧核糖核苷，MgCl₂。

进一步地，所述试剂盒中各种成分的体积为：qPCR Master 10.0μL，10μM 引物各0.4μL，10μM探针各0.2μL，10-100ng模板DNA 2μL，H₂O 7.0μL。

本发明实施例的另一目的在于一种用于同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件，所述引物探针组件为以上所述的的引物探针组件。

本发明实施例的另一目的在于一种上述的试剂盒的应用，所述试剂盒在同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌中的应用。

本发明实施例以嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌为目标菌株，建立了可同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件、试剂盒，具有特异性强的特性，同时，灵敏度高，检测低限为10²CFμ/mL，检测结果准确可靠；无需对目的基因扩增产物进行电泳法检测，操作简单，检测周期短，可以减少操作人员的工作量，及时获取精确的检测信息，大大简化了弓形杆菌检测的流程，缩短检测周期，可作为敏感的初筛手段，提高弓形杆菌培养检测的阳性率，可为我国今后制定食品中弓形杆菌卫生学指标提供有力的技术支撑。

附图说明

图1是本发明实施例提供的嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌的特异性测试图；

图2是本发明实施例提供的一组不同浓度嗜低温弓形杆菌的荧光PCR扩增曲线；

图3是本发明实施例根据图2得到的标准曲线；

图4是本发明实施例提供的一组不同浓度斯氏弓形杆菌的荧光PCR扩增曲线；

图5是本发明实施例根据图4得到的标准曲线；

图6是本发明实施例提供的斯氏弓形杆菌探针0.2μL和0.1μL的荧光曲线；

图7是本发明实施例提供的嗜低温弓形杆菌退火温度55℃与60℃的荧光曲线。

具体实施方式

为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。

实施例1同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR检测试剂盒

本发明实施例提供了一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的试剂盒，首先，将嗜低温弓形杆菌(Arcobacter cryaerophilμs)、斯氏弓形杆菌 (Arcobacterskirrowii)和11种非目标菌(布氏弓形杆菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌、阪杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌)的基因组DNA序列进行比对，最后确定嗜低温、斯氏弓形杆菌不同与其它弓形杆菌以及不同与其它食源性病原菌的的特异基因 cpn60序列。其次，在嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌的目标区域，通过引物设计原则和多种计算机程序，设计获得了嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR 引物组，并通过大量实验筛选出既可保证种内保守，又能保证种间特异的引物序列，其中包括2组，其核苷酸序列分别如下所示：

引物组1：

SEQ ID NO:1GACAACAGAGTTTAATAATCCA

SEQ ID NO:2CTTCACCATCAACATCTTCAG

或者为所述引物序列的核苷酸互补序列；

引物组2：

SEQ ID NO:3GACAACAGAGTTTGATAATCCA

SEQ ID NO:4CCATCAACATCTTCAGCAA

或者为所述引物序列的核苷酸互补序列。

在本发明实施例中，所述的试剂盒包括引物探针组件、模板DNA以及反应试剂；其中，所述引物探针组件包括检测引物组和检测探针组；所述检测引物组为引物组1或者引物组2；所述引物组1由上述引物序列SEQ ID NO:1以及 SEQ ID NO:2组成，或者由所述引物序列的核苷酸互补序列组成；所述引物组2 由上述引物序列SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4组成，或者由所述引物序列的核苷酸互补序列组成；所述检测探针组的探针序列为SEQ IDNO:5或者SEQ ID NO:6，或者为所述探针序列的核苷酸互补序列。

SEQ ID NO:5TTTAGAAGGTGTTAATAAATCTGGAAGACCTC

SEQ ID NO:6ACTAGAAGGTGTAAATAA

其中，探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、VIC中的一种；所述探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ1。

进一步地，将所述引物和探针溶解成100μM，稀释成10μM。分别向20μL 体系中加入引物0.6μL、0.3μL，探针0.2μL、0.10μL，模板DNA(10-100ng) 1μL、3μL。qPCR Master 10.0μL不变。探针0.2μL和0.1μL的荧光曲线见图 5，经优化后，确定PCR反应体系(20μL)如下：

qPCR Master 10.0μL，引物(10μM)各0.4μL，探针(10μM)各0.2μL，模板DNA(10-100ng)2μL，H₂O 7.0μL；

其中，qPCR Master为购买所得，其包括Taq酶，PCR buffer，三磷酸脱氧核糖核苷，MgCl₂。

实施例2

利用实施例1建立的同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的试剂盒，对待检测样品进行检测，使用试剂盒或仪器提取，或照如下步骤提取：

获取待测样本的模板DNA：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集；2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新做一遍；3、加入 5ml DNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/L EDTA,o.5％SDS)，混匀；4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100μg/ml,混匀，50℃水浴3h；5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的(酚，氯仿，异戊醇) 混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相；6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.；7、2500rpm离心10min. 转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min；2500rpm,离心10min；弃上清；8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇；-20℃ 20min；9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中；

进一步地，按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR反应体系，其中，20μL PCR反应体系配制比例如下：

qPCRMaster 10.0μL，引物(10μM)各0.4μL，探针(10μM)各0.2μL，模板DNA(10-100ng)2μL，H₂O7.0μL。

将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，优化PCR反应条件，退火温度55℃与60℃的荧光曲线见图7.最终确定如下扩增程序并启动PCR反应，其扩增程序为：第一步，94℃热启动和预变性6min；第二步，94℃变性15s；第三步55℃退火和延伸55s；重复第二步、第三步共45个循环。

所述PCR反应体系混合离心后，在预设的扩增程序下进行PCR反应，并基于荧光定量PCR仪进行荧光强度的测定，以对嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌进行检测。

测试例1特异性测试

将嗜低温弓形杆菌、斯氏弓形杆菌及11种非目标菌(布氏弓形杆菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌、阪杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌培养后提取DNA，用优化确定的扩增体系和扩增程序进行特异性试验，结果显示：嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌呈典型的S型扩增曲线，其它11种非目标菌无交叉反应(如图1所示)。判定依据：Ct<35.0判为阳性，Ct>35.0判为阴性。

因此，根据特异性试验结果可知，本发明设计的引物和探针能够扩增嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌，11种非目标菌(布氏弓形杆菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌、阪杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌)均未扩增，表明本发明设计的引物探针具有良好的特异性。

测试例2

本发明实施例采集237份深圳某市场市售食品，同时进行双重荧光PCR法和分离培养法。最终，采用62份分离培养弓形杆菌阳性和175份分离培养弓形杆菌阴性标本验证检测嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌的PCR检测方法的准确性。240份标本中，海鲜27份，半边鸡20份，大鸡腿8份，鸡盲肠50份，鸡肉41份，牛肉30份，生菜31份，猪肉30份。

食品标本提取核酸的步骤：1、采集250g左右的食品样品，加200～500mL 缓冲蛋白胨水。揉搓整鸡需要500mL缓冲蛋白胨水，鸡腿需要200mL缓冲蛋白胨水，蔬菜需要500mL缓冲蛋白胨水。充分漂洗后，放4度2h；2、取50mL 漂洗液，高速离心8000rpm，5min，取沉淀1mL，混匀；3、70℃孵育5min。 14000rpm离心1min；4、吸取3步骤中的上清液200μL加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h；5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm 离心收集水相，用等体积的(酚，氯仿，异戊醇)混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相；6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的 LiCL,混匀，冰浴，10min.；7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min；2500rpm,离心10min；弃上清；8、加入0.1 倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃ 20min；9、 12000r/min,室温离心5min；弃上清；将DNA溶于适量TE中。

以食品标本中提取的DNA为模板，按照前述的PCR反应体系和扩增程序进行荧光PCR扩增后记录结果，经荧光定量PCR仪测试得到的分离培养阳性标本以及阴性标本的Ct值如表1-2所示。结果显示，扩增结果与分离培养结果一致。62份弓形杆菌分离培养阳性样本中，56份样本多重荧光PCR扩增阳性，符合率达到90％。符合率未达100％的原因可能在于食品中菌液含量较低，虽然分离培养出弓形杆菌，但在DNA提取过程中核酸损失导致荧光PCR无法检出。 175份弓形杆菌分离培养阴性的样本中，9份样本双重荧光PCR扩增阳性。这9 份样本经荧光PCR扩增后测序，证实为弓形杆菌。分离培养法和双重荧光PCR 法存在差异的原因可能为：1、双重荧光PCR法的灵敏度高于传统生化培养的方法；2、标本中存在死菌残留的核酸。

表1 62份嗜低温或斯氏弓形杆菌培养阳性标本Ct值总表

注：“—”表示未检出

表2分离培养阴性标本汇总表

测试例3灵敏度测试

(1)用平板计数法对嗜低温弓形杆菌菌悬液的浓度定量

a将嗜低温弓形杆菌从-80℃冰箱取出，待解冻后，挑取一环涂布于LB平板上，37℃培养24h；b用棉签沾取少量菌苔于10mL灭菌生理盐水中，混匀；c吸取100μL菌悬液检测OD值，直至OD600值达到1.0；d通常认为OD600值为 1.0时，菌的含量约为10⁸CFμ/mL。将c测得的1OD菌悬液逐级稀释(100μL 菌液+900μL生理盐水)；e分别取10⁴、10³、10²、10¹的菌液100μL涂布于血平板上，37℃培养24h，计数。

(2)荧光PCR扩增嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌标准曲线(如图2-5所示)

a将稀释好的10⁸-10¹的菌液于95℃孵育10min，12000rpm离心5min，吸取上清液于新的离心管中；b以一体系20μL，每个浓度做两个重复，按照优化好的扩增体系于离心管中分别加入所需的预混液qPCR Master、高压灭菌水、引物、探针、混匀分装于微量离心管中。

(3)加入(2)a中的模板后离心，按照实施例3优化的扩增程序(第一步， 94℃热启动和预变性6min；第二步，94℃变性15s；第三步55℃退火和延伸55s；重复第二步、第三步共45个循环)进行PCR扩增。

经试验确定嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌的检测低限均为10² CFU/mL，表明本发明设计的引物以及探针灵敏度高。

综上，本发明实施例以嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌为目标菌株，建立了可同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法，一方面，本发明用两对引物和探针特异性检测嗜低温弓形杆菌和斯氏弓形杆菌，对其他11种非目标菌(布氏弓形杆菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌)无扩增，具有特异性强的特性，同时，灵敏度高，检测低限为10²CFU/mL，检测结果准确可靠；另一方面，本发明无需对目的基因扩增产物进行电泳法检测，操作简单，检测周期短，可以减少操作人员的工作量，及时获取精确的检测信息，大大简化了弓形杆菌检测的流程，缩短检测周期，可作为敏感的初筛手段，提高弓形杆菌培养检测的阳性率，可为我国今后制定食品中弓形杆菌卫生学指标提供有力的技术支撑。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市南山区疾病预防控制中心

<120> 一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件、试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqµence)

<400> 1

gacaacagag tttaataatc ca 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqµence)

<400> 2

cttcaccatc aacatcttca g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqµence)

<400> 3

gacaacagag tttgataatc ca 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqµence)

<400> 4

ccatcaacat cttcagcaa 19

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqµence)

<400> 5

tttagaaggt gttaataaat ctggaagacc tc 32

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqµence)

<400> 6

actagaaggt gtaaataa 18

Claims

1.一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括引物探针组件、模板DNA以及反应试剂；

其中，所述引物探针组件包括检测引物组和检测探针组；

2.根据权利要求1所述的一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针序列的5’端标记的荧光基团为FAM、VIC中的一种；所述探针序列的3’端标记的淬灭基团为BHQ1。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，每组中的检测引物组和检测探针组的体积比为2∶1，且在每组中的两条引物的体积比为1∶1。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂包括qPCR Master以及H₂O。

5.根据权利要求5所述的一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述qPCRMaster包括Taq酶，PCRbuffer，三磷酸脱氧核糖核苷，MgCl₂。

6.根据权利要求1所述的一种同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各种成分的体积为：qPCR Master 10.0μL，10μM引物各0.4μL，10μM探针各0.2μL，10-100ng模板DNA 2μL，H₂O 7.0μL。

7.一种用于同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌的引物探针组件，其特征在于，所述引物探针组件为权利要求1或2中所述的引物探针组件。

8.一种根据权利要求1-6任一权利要求所述的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒在同时检测嗜低温弓形杆菌及斯氏弓形杆菌中的应用。