CN109517887A

CN109517887A - 创伤弧菌干粉化lamp快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN109517887A
Application number: CN201811613274.2A
Authority: CN
Inventors: 万强; 蔡芷荷; 卢勉飞; 周杨; 吴清平; 薛仁军; 容艳芬
Original assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-03-26

Abstract

本发明公开了创伤弧菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色指示剂和裂解液组成，以上6种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的6条引物对应创伤弧菌特异性靶基因序列的8个区段，通过加入显色指示剂，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全卫生领域尤其是水产品中的创伤弧菌快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需特殊仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场对创伤弧菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

Description

创伤弧菌干粉化LAMP快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化创伤弧菌核酸快速检测试剂盒.

背景技术

创伤弧菌(vibrio vulnificus)为革兰氏阴性嗜盐菌，主要存在河口和近海海洋环境中，可从牡蛎等海产品中分离得到，具有高盐、高钠、低温、乏氧和寡营养的特点。创伤性海洋弧菌是主要的海洋致病细菌之一，主要通过食入生的或未加工成熟的海产品感染，此外还能够通过伤口接触海水造成感染，也可经口感染，其临床症状主要表现为肠胃炎、蜂窝组织炎及骨髓炎等多种炎症，经口感染时常迅速导致菌血症或败血症。感染本菌后如不及时治疗，病死率很高。创伤弧菌一般临床上比较罕见，早期正确诊断困难，大多均在典型的临床症状表现出来后，再结合接触海水或海产品病史方可做出诊断，因此在食品安全领域如何快速准确对创伤弧菌进行快速的鉴定具有重要的意义。

目前对致病微生物的检测有多种方法，传统方法以病原微生物分离培养鉴定、形态学鉴定和生化鉴定为主。目前创伤弧菌的检测主要参照FDA的细菌学分析手册、AOAC官方分析方法和NMKL相关的检测方法。检测方法主要以分离培养和理化鉴定为主，检测费时费力，检测效率低下。此外，由于创伤弧菌的表型不稳定，非典型菌株也比较多，使得鉴定更为复杂。近年来免疫学检测、以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的生物学检测方法相继应用于微生物检测，这些技术突破了传统的微生物学检测模式，可直接对样品或者样品增菌液中的致病菌进行分离和快速核酸抽提，结合分子生物学技术进行快速检测，辅以生物信息等手段进行分析，具有快速准确、灵敏度高、特异性强的特点。另一方面，这些方法也有其天然的缺陷，比如需要昂贵的检测仪器、试剂和专业计数人员，检测成本高，不适合基层及现场的快速检测。

2000年日本研究人员Notomi等人发明了一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术，即环介导的恒温扩增技术。该技术利用2对特殊引物识别靶基因的6个区段，在恒温条件下(60～65℃)，具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在1h内就可以对目的基因进行高效、特异的链置换扩增反应。与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。

LAMP引物设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因6个区域设计的4条特殊引物，并增加2条靶向扩增反应中形成的环状结构的环引物。在引物设计时候，应注意以下问题：在靶点的选择上为特异基因的保守序列，靶序列长度超过500bp会显著降低LAMP的扩增效率，最佳靶序列长度应为150bp～180bp；引物的GC含量在40～65％；对于GC含量丰富的序列，引物区的Tm值控制在60℃～65℃，AT含量丰富的序列，引物区的Tm值则控制在55℃～60℃；为了保持引物末端的稳定性，其末端稳定性自由能(ΔG)值小于-4kcal/mol；引物设计应避免出现二级结构；环引物的加入可以把原来的LAMP反应缩短一半左右，但在引物设计中，其设计区域常常因为序列区间长度不够无法用软件生成，因此会出现只有1条环引物或没有环引物序列符合条件，此时通过标记设计区域进行手动设计；引物的设计满足以上条件的一般为5～10套，实际扩增效果仍然需要通过反应扩增的各种参数，如灵敏度、指数增长期的起始时间、扩增产物量等，如果只采用单一引物组，不能保证所选的引物能够进行高效扩增。

在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是Bst DNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前创伤弧菌的尚未发布国家检验标准，现行的标准有《地方检测标准DBS13/004-2016食品安全地方标准创伤弧菌检验》和《SN/T2754.13-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第13部分：创伤弧菌》。LAMP方法已经在出口食品中开展创伤弧菌的检验，但市场上基于LAMP技术的创伤弧菌快速诊断试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。

发明内容

本发明的目的在于针对现有创伤弧菌的传统检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化创伤弧菌快速检测试剂盒。该试剂盒可满足相关食品的生产、流通中各个环节的快速检测的需求。

本发明所采取的技术方案是：

一种创伤弧菌的LAMP引物组，包括上下游外部引物F3/B3、上下游内部引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：

创伤弧菌-F3：tgcgtgctacacacaagtg

创伤弧菌-B3：accaactgtgatcttgctgt

创伤弧菌-FIP：tgccacattgacgcgaacatcgatttcaacgccacacgagac

创伤弧菌-BIP：tcctgacgccaaaattgtccgcaaatggatacccgtgccag

创伤弧菌-LF：gcgcccgcattacacca

创伤弧菌-LB：tttaccgtcgatgccgac

一种创伤弧菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其LAMP引物组序列如上所示。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色指示剂和裂解液。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂的预混液在冻干前含：150～250μmol/L MnCl₂、0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干保护剂，余量为无菌超纯水。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成，各组分在检测试剂的预混液中的终浓度为：3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1wt％～1wt％牛血清白蛋白。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO₄、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，显色指示剂为15～75μmol/L钙黄绿素。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/LTris-HCl pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照干粉为提纯的创伤弧菌基因组DNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非创伤弧菌基因组DNA冻干粉。

作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，使用方法包括如下步骤：

1)取25g待检食品样品置于225mLPNCC增菌液8～12h，对增菌液中的菌体富集后粗提DNA用于LAMP快速检测；

2)增菌液6000r/min离心，弃上清，如食品样品有大块悬浮物导致增菌液不易吸取，可简单过滤取滤后增菌液进行离心；

3)向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液进行悬浮，99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，收集的上清即含有待检致病菌的粗提核酸；

4)(4)取n个冻干粉管(n＝待检测样品数+1管阳性对照+1管阴性对照)，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，将待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的创伤弧菌基因组DNA作为阳性对照，以溶解的非创伤弧菌基因组DNA为阴性对照，所有样本最后按照一定比例加入显色指示剂，充分混匀并短暂离心后64℃恒温反应；

5)(5)反应后结果判读：建议在自然光线充足的环境条件下，将反应结束后的反应管置于白色背景下观察，阴性对照反应前后无颜色变化呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

本发明的有益效果是：

本发明的试剂盒基于LAMP技术快速检测创伤弧菌，利用3对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，在恒温条件下(60～65℃)进行高效特异的链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板等缺点，同时产品采用一管式冻干粉，检测操作简便，对操作人员的技术素质要求也低，可对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需5～7天。而采用本试剂盒从收集样本到检测完成仅需12～14小时，且本试剂盒采用钙黄绿素作为结果判读显色指示剂，常见的钙黄绿素指示剂混合氯化锰做淬灭剂，长时间存放后指示能力会大大下降，本产品将氯化锰配置到冻干粉中，可保障指示剂的指示能力，肉眼判读结果更加直观清晰。

本发明的试剂盒还具有如下优势：

①该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，且便于常温运输，节约运输成本；

②该干粉化试剂已将部分反应组分按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，避免反复加样，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；

③恒温条件下反应，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；

④反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至5CFU/Test；

⑤利用靶基因序列的3对特殊引物，特异性地识别靶序列上的8个独立区域，具有高度特异性，实现反应在30～45min内完成；

⑥反应前加入显色指示剂，可通过肉眼颜色变化判读结果，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且避免反应后开盖鉴定扩增产物造成的气溶胶二次污染。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

引物的筛选

表1、不同的引物组序列表

引物序列的编号如下：

表2、引物组的序列编号表

使用浓度为40ng/μL用商品化试剂盒提取的溶藻弧菌基因组DNA做为模板，用荧光染料10×SYBR Green I替代钙黄绿素混合反应液，分装后最后加入引物，用荧光检测仪设置恒温进行扩增，分3次反应，每次每组设置3个平行样品，记录每组引物所在体系的最早出峰时间。

最终比较分析3次反应3个平行样的出峰时间，引物组1的出峰效果最佳，约在13～16分钟出峰，9～11分钟左右峰值最大，进入稳定区。其他的引物组在15～18分30秒陆续出峰，在9～11分钟后峰值最大，由此判定引物组1的扩增效率最高。

试剂盒的制备

(1)引物合成：按照引物组1提供的序列合成寡聚核苷酸引物，并定量配制。

(2)制备该试剂冻干粉：按照表3所示在无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，置于液氮预冻后再按照常规冷冻干燥，最后得到干粉化的检测试剂。

表3、冻干体系组分分配

注：w/v为g/mL。

(3)制备复溶液：按照表4所示在无菌环境下混合复溶液混合液，置于容器中。

表4、复溶液组分

组分	终浓度
		KCl	8mmol/L
Tris-HCl，pH 8.8	16mmol/L
		(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	9mmol/L
MgSO<sub>4</sub>	6mmol/L
		Triton X-100	0.2％
甜菜碱	1.0mol/L

(4)制备阳性对照干粉：向提纯的创伤弧菌基因组DNA溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阳性对照干粉。

(5)制备阴性对照干粉：向提纯的非创伤弧菌基因组DNA溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阴性对照干粉。

(6)配制显色指示剂：10x浓度，由0.3mmol/L钙黄绿素配置得到，置于避光管中。

(7)配制裂解液：含有10～20mmol/L Tris-HCl，pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS，置于容器中。

(8)组装试剂盒，提供使用说明书，封装。

稳定性试验

根据上述试剂冻干粉制备获取9例不同组分的试剂冻干粉，并相应地组装成9种不同的试剂盒，存放于2～8℃环境中，每隔3个月对该9种试剂盒产品进行灵敏度试验，每组不少于3个平行样，检验限通过最低稀释倍数的菌的阳性扩增对应的菌落计数结果，检验限见表5。

表5、不同保质期时间的最低检验限

灵敏度指标是保质期重要的制订指标之一，采用例9复合冻干保护剂进行反应试剂的冻干，经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较高的稳定性，最长的保质期可延长到时间为21～24个月，高于同类型产品的12个月保质期。本试剂在12个月常规保质期内，仍然可以达到30CFU/Test的检验限，保质期12个月后，其检验限略有下降，部分试剂样品有失活情况。除含5％海藻糖的复合保护剂有吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。

最低检验限和灵敏度的比较

(1)用无菌接种环分别挑取创伤弧菌ATCC27562的纯菌菌落，用无菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为10⁰，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸)，并分别取各个稀释菌液100μL螺旋接种到3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板进行培养和计数；

(2)分别取以上稀释菌液100μL，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μL裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，菌体裂解液12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因；

(3)以上粗提DNA为模板进行PCR和LAMP反应，创伤弧菌PCR引物为：PF-5’-tgtgccggtcgacgaatgcgta-3’(SEQ ID No.37)，PR-5’-gcgtagctacgacgttcgaacg-3’(SEQID No.38)，扩增产物片段长度为324bp；

(4)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，35个循环；

(5)以上粗提DNA为模板进行LAMP反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提DNA模板2.5μL，无菌超纯水2.5μL，充分混匀后紧盖，设置64℃恒温反应50min；

(6)以上PCR与LAMP扩增产物用1.6％琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限，平板螺旋计数每次涂板不少于2块。

结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示创伤弧菌PCR的最低检验限在10⁵倍数稀释处，LAMP最低检验限制在10⁶倍数稀释处。并参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》，测定对应的菌落计数，结果创伤弧菌在10⁶倍数稀释处约为5CFU，显示LAMP检测的灵敏度远高于PCR。

纯菌的检测

(1)样品处理

用于平板培养的菌落的筛选鉴定。用接种环挑取各菌的单菌落半环，转移到含有30μL裂解液的无菌试管中，充分混匀后99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组DNA，选用的菌株见表6。

表6、纯菌检测选用的菌株

(2)恒温扩增反应

取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各类菌粗提的DNA模板2.5μL。另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色指示剂2.5μL，充分混匀后紧盖，Biometra professional PCR仪设置64℃恒温反应50min。

(3)反应后判读

反应结束后，在自然光线条件下白色背景对比观察反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照结果与上述任一情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。检测结果见表7。

表7、菌株检测的检测结果

结果显示，经本发明检测，以上所选的创伤弧菌和非创伤弧菌的核酸快速检测中，创伤弧菌的标准菌株和分离株在各自的反应液中出现明显荧光绿，而所有非创伤弧菌属各菌反应前后都为淡橙色，显示为阴性，可见本发明具有极好的特异性，能有效鉴定创伤弧菌。

常规食品中创伤弧菌的快速检测

(1)样品处理，取25g待检食品样品置于225mLPNCC，均质后37±1℃条件下增菌10h±2h，该步骤也可根据检测实验室自己建立的有效增菌方法；吸增菌液1mL到无菌离心管中，6000r/min离心5min，完全弃上清；加入30μL裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的DNA；

(2)恒温扩增反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各样品粗提的DNA模板2.5μL；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色指示剂2.5μL，充分混匀后紧盖，设置金属浴至64℃恒温反应50min；

(3)反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有创伤弧菌检出，如颜色无变化，表示无检出。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东环凯微生物科技有限公司

广东环凯生物科技有限公司

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 33

ccgcaaccgt tttgtcaccg tgagcaacaa cgatctctgc 40

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 34

ggttcggtta acggctggag ctcggctacg gtaacgttct t 41

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 35

ctcaccataa acatctag 18

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 36

tgtcacggca gttggaacc 19

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 37

tgtgccggtc gacgaatgcg ta 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 38

gcgtagctac gacgttcgaa cg 22

Claims

1.一种创伤弧菌的LAMP引物组，包括上下游外部引物F3/B3、上下游内部引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：

创伤弧菌-F3：tgcgtgctacacacaagtg

创伤弧菌-B3：accaactgtgatcttgctgt

创伤弧菌-FIP：tgccacattgacgcgaacatcgatttcaacgccacacgagac

创伤弧菌-BIP：tcctgacgccaaaattgtccgcaaatggatacccgtgccag

创伤弧菌-LF：gcgcccgcattacacca

创伤弧菌-LB：tttaccgtcgatgccgac。

2.一种创伤弧菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。

3.根据权利要求2所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色指示剂、裂解液和干粉化的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂的预混液在冻干前含：150～250μmol/L MnCl₂、0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干保护剂，余量为无菌超纯水。

5.根据权利要求4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成，各组分在检测试剂的预混液中的终浓度为：3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1wt％～1wt％牛血清白蛋白。

6.根据权利要求3或4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有：2～9mmol/L MgSO₄、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。

7.根据权利要求3或4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：显色指示剂为15～75μmol/L的钙黄绿素。

8.根据权利要求3或4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：裂解液含有：10～20mmol/L Tris-HCl,pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。

9.根据权利要求3或4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：阳性对照干粉为提纯的创伤弧菌基因组DNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非创伤弧菌基因组DNA冻干粉。

10.根据权利要求3或4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其使用方法包括如下步骤：

1)取25g待检食品样品置于225mL蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多粘菌素E(PNCC)增菌液8～12h，对增菌液中的菌体富集后粗提DNA用于LAMP快速检测；

2)取1～1.5mL增菌液，6000r/min离心，完全弃上清，如食品样品有大块悬浮物导致增菌液不易吸取，可简单过滤取滤后增菌液进行离心；

3)向离心得到沉淀加入裂解液，充分悬浮，99℃热裂解10min，紧接着12000r/min离心15min，收集的上清即含有待检致病菌的粗提核酸；

4)取冻干粉管，向管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，加入待检测核酸样品，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的创伤弧菌基因组DNA作为阳性对照，以溶解的非创伤弧菌基因组DNA为阴性对照，后所有样品按照一定比例加入显色指示剂，充分混匀并短暂离心后64℃恒温反应；

5)反应后结果判读：阴性对照反应前后无颜色变化呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。