CN107663543A

CN107663543A - 检测六种禽源性成分的三重荧光pcr引物探针组、试剂盒及方法

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Publication number: CN107663543A
Application number: CN201711095505.0A
Authority: CN
Inventors: 孙端方; 孙棣; 肖洋; 董睿; 李春宇; 田志强; 张谦; 黄家瑞
Original assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE
Current assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2037-11-09
Also published as: CN107663543B

Abstract

本发明公开了检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，包括针对鸡、鸭、鹅的三重荧光PCR引物探针组，针对鹌鹑、鸽子、石鸡的三重荧光PCR引物探针组，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.14所示。本发明属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对上述六种禽源性成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于禽类产品的日常检测。

Description

检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

当前，动物产品的掺假现象频繁发生，国内外屡有此类报道，例如在2013年，欧盟不少国家发生了以马肉冒充牛肉的牛肉食品掺假事件。近年来，我国也陆续曝光了很多动物产品的掺假事件，包括各地食药监、质检、工商所查获和新闻媒体公布的各类案例：以鸭肉冒充羊肉，以猪肉、鸡肉冒充牛肉，以猫肉冒充兔肉等造假手段。由于掺假动物产品绝大部分有添加香精香料、添加调味剂、已经过深加工等迷惑措施，使消费者仅通过观察和感官品评，基本不能辨别，因此食品安全问题堪忧。

在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中，通过PCR技术扩增并检测目标动物源性基因，是目前主流的科学依据和技术手段，近年来得到广泛的应用。该技术主要分为两个部分：①提取样品DNA；②DNA的PCR检测。

样品中DNA的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。

未加工和粗加工食品的DNA损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常DNA纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.6至1.8，浓度在ng/μL级，可略作稀释或直接用于PCR检测。

深加工食品的DNA损失大且碎片化，自动化、半自动化的方法得率较低；通常采用手动提取的方法。因为样品种类、研究方式区别很大，手动提取的方法也种类广泛、差异显著，效果因而参差不齐。

第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。

中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如20151012723.2《同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒》、201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法》等。目前，尚无文献报道对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡的源性成分同时进行多重PCR的高效检测，因此，提供一种检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组及相关方法具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明针对鸡(Gallus gallus)、鸭(Anasplatyrhynchos)、鹅(Anser cygnoides)、鹌鹑(Coturnix coturnix)、鸽子(Columbalivia)、石鸡(Alectoris chukar)这六种我国常见肉用家禽的基因组设置特异性的引物探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡源性成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，有利于不同品系禽类源性的充分检出。

本发明在设计六种禽源性成分检测的三重荧光PCR引物探针组和方法时，既考虑了鸡、鸭、鹅等常见市售家禽，也考虑了鹌鹑、鸽子、鹧鸪等市售风味家禽。其中，依据标准SN/T 3731.6-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法》、实地走访数家风味家禽饲养场、通过电商网购一些标称“鹧鸪”的肉类，均发现其实为石鸡(Alectoris chukar)，又称美国鹧鸪、嘎嘎鸡等，在我国作为风味家禽，饲养规模较广。而我国传统定义中的鹧鸪(Francolinus pintadeanus)，又名中华鹧鸪，目前仍以野生为主。无论从野生动物保护方面，还是风味家禽鉴定领域，石鸡Ale.chukar的鉴定意义远大于鹧鸪F.pintadeanus。

设计鸡、鸭、鹅特异性引物和探针时，首先明确其分类学地位。家鸡Gallus gallusdomesticus、家鸭Anas platyrhynchos domesticus、中国家鹅Anser cygnoidesdomestica分别是原鸡Gallus gallus、绿头鸭Anas platyrhynchos、鸿雁Anser cygnoides的驯化种。可见家鹅注明为“中国家鹅”，原因为家鹅主要分为两大类，中国家鹅Ans.cygnoides domestica和欧洲家鹅Ans.anser domestica，欧洲家鹅为灰雁Ans.anser的驯化种，与中国家鹅为同雁属不同种。从本申请件实用目的出发，选择中国家鹅Ans.cygnoides domestica为鉴定对象。

据分子分类学相关研究，高等物种在野生亚种之间，基因差异就已非常小，通常只有个别基因差异，尤其是驯化亚种，基因组几乎与原野生种无区别。且在各基因组文库中，相关序列的物种来源备注，一般只到属、种；精确到亚种、变种、血清型、突变株的，多为某些致病菌、病毒。因此，本申请件在检索目的基因时，以原鸡属原鸡种G.gallus、鸭属绿头鸭种Ana.platyrhynchos、雁属鸿雁种Ans.cygnoides相关序列为参考依据。

检索NCBI的Genbank后获得鸡、鸭、鹅的线粒体相关序列数十条，首先用Lasergenev7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再通过Oligov7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，发明人发现根据其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)基因的特定位点可设计一对通用引物和三条特异探针。探针选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，相对TAMRA、BHQ等特异性更强，能有效避免单碱基差异带来的非特异性扩增，确保鉴定结果准确。相对SN/T 2727-2010《饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法》中鸡、鸭、鹅的三对引物和三条探针，在试剂成本和操作步骤上，有了一定程度上的优化。

设计鹌鹑、鸽子、石鸡特异性引物和探针时，首先明确其分类学地位。家鸽Columbalivia domestica是原鸽Columba livia的驯化种，同理以Columba livia为本申请件的检测对象。而鹌鹑、石鸡在人类驯化历史不长，其分类仍为鹌鹑Coturnix coturnix、石鸡Alectoris chukar。

检索NCBI的Genbank后获得鹌鹑、鸽子、石鸡的线粒体相关序列数十条，首先用Lasergene v7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再经过Oligov7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，发明人发现根据其GAPDH基因无法设计一对通用引物和三条特异探针，于是分别在鹌鹑12SrRNA、鸽子16SrRNA、石鸡CoI等基因上通过Oligo和NCBI的Primer-Blast进行设计和验算可能的引物探针。

鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡的引物探针组检测位点举例如下：

(1)G.gallus的GAPDH基因，检测位点如NCBI中NC006088.4序列上的2370bp至2483

(2)Ana.platyrhynchos的GAPDH基因，检测位点如NCBI中NC004676785.1序列上的1533bp至1629bp。

(3)Ans.cygnoides的GAPDH基因，检测位点如NCBI中NC013185931.1序列上的2080bp至2176bp。

(4)Cot.coturnix的线粒体基因，检测位点如NCBI中KF469290.1序列上的146bp至269bp。

(5)Col.livia的线粒体基因，检测位点如NCBI中GQ240309.1序列上的775bp至880bp。

(6)Ale.chukar的线粒体基因，检测位点如NCBI中KY829450.1序列上的6484bp至6585bp。

本申请件设计的鹌鹑、鸽子、石鸡特异性引物和探针，相对SN/T 3731.1-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第1部分：鹌鹑成分检测PCR法》，多重荧光PCR法效率更高；相对SN/T 3731.3-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第1部分：鸽子成分检测实时荧光PCR法》、SN/T 3731.6-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第1部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法》中探针为28bp和24bp，分别缩短至23bp和20bp，相对降低了由于探针越长，其序列中段发生非特异性匹配的可能性越高的情况，提升了特异性。此外同样选用NFQ-MGB荧光淬灭基团。

本发明提供的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组包括针对鸡、鸭、鹅的三重引物探针组A，针对鹌鹑、鸽子、石鸡的三重引物探针组B，具体如表1所示：

表1 引物探针对照表

采用上述技术方案，相对标准方法，鸡、鸭、鹅的上游引物和下游引物相同，荧光探针序列和激发基团不同，在实现特异性检测并避免干扰的同时，减少了引物的种类，降低了成本，增强了操作便利性；鸽子和石鸡特异性探针序列较短，降低了非特异性匹配的可能性，提高了特异性。此外，通过所有探针选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，相对TAMRA、BHQ等特异性更强，能有效避免点差异带来的非特异性扩增，确保鉴定结果准确。

优选地，既可选择三重引物探针组A、三重引物探针组B同步检测以提升效率，也可根据样品实际检测需要，选择使用A或B进行鉴定以节省操作和试剂。

本发明还提供检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，包括上述的引物探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照。在配套试剂选择上，对于多重荧光PCR试剂，选择带热敏Taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；所述荧光PCR试剂中包括ROX染料，对于需要ROX染料的多重荧光PCR仪可提升检测准确性。更优选地，所述空白对照为3dH₂O。

优选地，所述通用上游引物和通用下游引物的浓度分别为30μmol/L；所述鹌鹑上游引物、鹌鹑下游引物、鸽子上游引物、鸽子下游引物、石鸡上游引物和石鸡下游引物的浓度分别为10μmol/L，所述鸡源性探针、鸭源性探针、鹅源性探针、鹌鹑源性探针、鸽子源性探针和石鸡源性探针的浓度分别为10μmol/L。

优选地，所述阳性对照为用上述引物探针组中包含的引物组进行扩增，并用上述引物探针组中包含的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为10⁵copies/μL级。

优选地，所述阴性对照为非禽源性DNA。

此外，本发明还提供检测六种禽源性成分的三重荧光PCR方法，包括如下步骤：

1)进行样品前处理，提取样品DNA；

2)建立包括上述的三重引物探针组A和三重引物探针组B的多重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃ 20-120s或10-15min；95℃ 5-60s，60℃ 20-120s；40循环并收集荧光信号，根据荧光信号变化进行禽源性成分检测结果的判断。

更优选地，样品DNA提取方法，根据样品种类的不同，包括：未加工和粗加工食品可使用自检工作站、核酸提取仪、商品化试剂盒、CTAB法、SDS法等提取样品DNA；深加工食品可参考下述步骤提取DNA：

①样品用球磨机粉碎，处理后质量应≥10g；优选地，根据样品特性和状态增大初始质量；

②加入等体积正己烷、20mL的CTAB抽提液或TE缓冲液，在空气摇床中100rpm速度以上、匀质5h以上，间或颠倒混匀；

③静止至水相和有机相明显分层；或通过转速≥3krpm、时间≥10min离心使水相和有机相明显分层，移去有机相并移取水相；

④将所得水相在离心机中转速≥6krpm、时间≥10min离心，移取上清水相；用商品化的柱膜法或磁珠法的大体积DNA提取试剂盒进行DNA提取，再通过真空浓缩仪或柱膜浓缩管浓缩DNA样品至10–100μL以作后续检测。

(2)建立包括权利要求1所述的引物探针组的多重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃20-120s或10-15min；95℃ 5-60s，60℃ 20-120s，40个循环，收集荧光信号；

优选地，所述检测结果的判断方法包括：

①质控标准：阳性对照的三重引物探针组A和三重引物探针组B的PCR反应体系中，FAM、HEX、TAMRA均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且Ct值≥40.0，进行②的禽源性成分检测结果的判断；

②样品检测结果的判断：样品的三重引物探针组A的PCR反应体系中，FAM和/或HEX和/或TAMRA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的鸡和/或鸭和/或鹅源性成分；样品的三重引物探针组B的PCR反应体系中，FAM和/或HEX和/或TAMRA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的鹌鹑和/或鸽子和/或石鸡源性成分；若上述一种或几种荧光无信号及对数增长，则不含相应的禽源性成分；若30.0<Ct值<40.0时，增加模板量复检，如果Ct值≥40.0，则检测结果为阴性，如果Ct值<40.0，则检测结果为阳性。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明针对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡特异性基因设置引物探针组，各引物探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，特异性好，检测灵敏度高。

(2)本发明提供的检测方法有利于不同品系禽类源性的充分检出，相对多重PCR方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为10⁵级时，定量标准误差在10⁴级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μL级)的优点；相对荧光PCR方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通PCR方法，兼具上述两种优点。

(3)本发明提供的引物、探针、试剂盒和方法已应用于本单位的日常检测中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间70％以上、节约试剂成本70％以上，具有较好的实用价值。

附图说明

图1本发明实施例二的检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中，所涉及的试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。

实施例一检测六种禽源性成分的三重荧光试剂盒的构建及验证

①引物探针组：如表1所示，可通过具有引物和探针合成能力的公司合成，本实施例选择上海生工生物工程技术服务有限公司合成，将引物和探针干粉稀释至100μmol/L作为储备液，按照表2配制成10μmol/L作为使用液。

表2 100μmol/L储备液配制为10μmol/L使用液

注：*指分别用1.5mL透明离心管封装；#指分别用1.5mL黑色离心管封装。

②荧光PCR试剂：常见市售荧光PCR试剂，本实施例选择Path-ID^TM qPCRMaster Mix。

③阳性对照：取全部引物储备液，分别稀释至10μmol/L。提取鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡DNA，用对应引物和普通PCR试剂在普通PCR仪上进行扩增，将目的条带切胶回收后转入TaKaRa T-Vector pMD^TM 20载体，用感受态E.coli细胞JM109复制，提取pMT-20质粒，分别稀释至10⁶copies/μL级浓度，各取10μL混匀后用3d H₂O定容至100μL，终浓度即为10⁵copies/μL级。

④阴性对照：非禽源性DNA。

⑤空白对照：3d H₂O。

⑥多通道荧光PCR仪选用ABI One Step Plus，验证样品特征如表3、按表4进行反应液配制、按表5进行反应。

表3 样品特征

表4 50μL反应体系(单位：μL)

注：a1指体系A的引物组包括序列1和序列2；a2指体系A的探针组包括序列3至序列5；b1指体系B的引物组包括序列6至序列11；b2指体系B的探针组包括序列12至序列14。

表5 反应条件

注^*：检测荧光信号。

⑦反应结果如表6所示：

表6 样品检测结果：实测Ct值及有无S型曲线

⑧验证结果：将试剂盒送至省内同行业检测单位的微生物(含分子生物学)检测实验室，结果一致。通过阳性对照、加标对照、阴性对照、空白对照的设置，表明试剂盒成分有效，且特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本。

实施例二国家食品安全监督抽查风险监测样品——泡椒凤爪、甜辣鸭舌、生鲜鹅肝、鹌鹑蛋、生态乳鸽(鸽肉)、冷冻鹧鸪(石鸡肉)、灯影牛肉、风干羊肉、蔬菜猪肉脯的检测

调取国抽风险样品泡椒凤爪、甜辣鸭舌、生鲜鹅肝、鹌鹑蛋、生态乳鸽(肉)、冷冻石鸡(肉)、灯影牛肉、风干羊肉、蔬菜猪肉脯，分别编号为#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9样品。将样品球磨粉碎后使用外购DNA提取试剂盒(Qiagen MagAttract Hmw DNA kit)在小型磁力架(Qiagen MagAttract Magnetic Rack)上提取样品DNA，均用3d H₂O稀释(或真空浓缩)至50ng/μL左右浓度，引物针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光PCR试剂为Multiplex PCR Kit，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为Step one plus)。

表7 样品DNA特征

检测结果见图1和表8：

图1中，曲线1至6、曲线7至12、曲线13至18分别为阳性对照、阴性对照、空白对照的FAM鸡、HEX鸭、TAMRA鹅、FAM鹌鹑、HEX鸽子、TAMRA石鸡的荧光信号；曲线19、曲线20、曲线21分别为#1、#2、#3样品的FAM鸡、HEX鸭、TAMRA鹅的荧光信号，曲线22至36分别为#1、#2、#3样品的其他荧光信号；曲线37、曲线38、曲线39分别为#4、#5、#6样品的FAM鹌鹑、HEX鸽子、TAMRA石鸡的荧光信号，曲线40至54分别为#1、#2、#3样品的其他荧光信号；曲线55至72分别为#7、#8、#9样品的FAM鸡、HEX鸭、TAMRA鹅、FAM鹌鹑、HEX鸽子、TAMRA石鸡的荧光信号。

①质控标准：阳性对照的FAM鸡、HEX鸭、TAMRA鹅、FAM鹌鹑、HEX鸽子、TAMRA石鸡均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行样品成分检测。

②检测结果：如表8所示。

③标准比对：按照SN/T 2727-2010《饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法》、SN/T 3731.1-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第1部分：鹌鹑成分检测PCR法》、SN/T 3731.3-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第3部分：鸽子成分检测实时荧光PCR法》、SN/T 3731.6-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法》对上述样品进行六种禽源性检测，#1的鸡源性、#2的鸭源性、#3的鹅源性、#4的鹌鹑源性、#5的鸽子源性、#6的石鸡源性均有荧光信号及对数增长，Ct值均在15至25之间，#1、#2、#3、#4、#5、#6的其余荧光通路和#7、#8、#9所有荧光通路均无信号及对数增长。可见本实施例的结果与标准检测结果相符。

表8 样品检测结果：实测Ct值及有无S型曲线及判定结果

实施例三省级食品监督抽查样品——辣子鸡、香酥鸭的检测

调取省抽样品辣子鸡、香酥鸭，分别编号为#10、#20样品。从样品的制作方法看，辣子鸡中鸡肉经过高温烹饪且调料众多、香酥鸭中鸭肉经过高温油炸，两者DNA损失均非常严重，选择试剂法与大体积DNA提取试剂盒方式，手动提取DNA：①样品用球磨机粉碎，处理后质量10.0g；②加入10mL正己烷、20mL CTAB抽提液，在空气摇床中120rpm、匀质6h，间或颠倒混匀；③10krpm、10min离心使水相和有机相明显分层，移去有机相并移取水相；④将所得水相10krpm、10min离心，移取上清水相；⑤用大体积DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy PlantMaxi Kit)进行DNA提取；⑥再通过柱膜浓缩管(Millipore Microcon DNA fast flow(PCRgrade))浓缩DNA样品至10μL，DNA纯度分别为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.75、OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.66、DNA浓度分别为25.09ng/μL、13.33ng/μL，-20℃保存。

引物探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光PCR试剂为ABI TaqMan^TM Environmental Master Mix 2.0，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

检测结果见表9：

②#10样品的FAM鸡有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；HEX鸭、TAMRA鹅、FAM鹌鹑、HEX鸽子、TAMRA石鸡均无荧光对数增长，Ct值≥40.0；表明#10含有鸡源性成分，不含有鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡成分。

③#20样品的HEX鸭有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，复检后Ct值<40.0；FAM鸡、TAMRA鹅、FAM鹌鹑、HEX鸽子、TAMRA石鸡均无荧光对数增长，Ct值≥40.0；表明#20含有鸭源性成分，不含有鸡、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡成分。

表9样品检测结果：实测Ct值及有无S型曲线

注*：复检Ct值35.94，有荧光S型曲线。

综上所述，本发明提供的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法仅对六种禽源性成分的目的基因进行特异性扩增，并在扩增中产生荧光信号，可有效适用于禽类相关产品的源性检测，与相关标准检测方法的结果相符，节约了检测时间，降低了检测成本，具有较好的实用价值。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵州省产品质量监督检验院

<120> 一种检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法

<130> /

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 1

tgccatcaca gccacacag 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 2

acagccttag cagcccca 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 3

aacatcatcc cagcgtc 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 4

ccagaacatt atcccagcc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 5

aacattatcc cagcatct 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 6

taaccgataa tccacgatct accc 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 7

ttccatccca taggctatac ctt 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 8

attctgcacc taaattatgc g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 9

atccagccga gttatggaa 19

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 10

taagaagagg aatttaaccc ctgt 24

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 11

gccaatgtct ttgtggttt 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 12

accacccctt gccaacaca 19

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 13

tatcaccttg acactgatgc act 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 14

acactcggcc atcttacctg 20

Claims

1.检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于：包括针对鸡、鸭、鹅源性成分的三重引物探针组A和针对鹌鹑、鸽子、石鸡源性成分的三重引物探针组B；

所述三重引物探针组A包括通用上游引物Seq.ID No.1、通用下游引物Seq.ID No.2、鸡源性探针Seq.ID No.3、鸭源性探针Seq.ID No.4、鹅源性探针Seq.ID No.5；

所述三重引物探针组B包括鹌鹑上游引物Seq.ID No.6、鹌鹑下游引物Seq.ID No.7、鸽子上游引物Seq.ID No.8、鸽子下游引物Seq.ID No.9、石鸡上游引物Seq.ID No.10、石鸡下游引物Seq.ID No.11、鹌鹑源性探针Seq.ID No.12、鸽子源性探针Seq.ID No.13、石鸡源性探针Seq.ID No.14。

2.根据权利要求1所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于：所述鸡源性探针的5’端用FAM修饰，所述鸭源性探针的5’端用HEX修饰，所述鹅源性探针的5’端用TAMRA修饰，所述鹌鹑源性探针的5’端用FAM修饰，所述鸽子源性探针的5’端用HEX修饰，所述石鸡源性探针的5’端用TAMRA修饰，所述探针的3’端分别用NFQ-MGB修饰。

3.检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照。

4.根据权利要求3所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述通用上游引物和通用下游引物的浓度分别为30μmol/L；所述鹌鹑上游引物、鹌鹑下游引物、鸽子上游引物、鸽子下游引物、石鸡上游引物和石鸡下游引物的浓度分别为10μmol/L，所述鸡源性探针、鸭源性探针、鹅源性探针、鹌鹑源性探针、鸽子源性探针和石鸡源性探针的浓度分别为10μmol/L。

5.根据权利要求3所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为用权利要求1中包含的引物组进行扩增，并用权利要求1中包含的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为10⁵copies/μL级。

6.根据权利要求3所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为非禽源性DNA。

7.检测六种禽源性成分的三重荧光PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)进行样品前处理，提取样品DNA；

2)建立包括权利要求1所述的三重引物探针组A和三重引物探针组B的多重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃ 20–120s或10–15min；95℃ 5–60s，60℃ 20–120s；40循环并收集荧光信号，根据荧光信号变化进行禽源性成分检测结果的判断。

8.根据权利要求7所述的检测六种禽源性成分的三重荧光PCR方法，其特征在于：所述检测结果的判断方法包括：

②样品检测结果的判断：样品的三重引物探针组A的PCR反应体系中，FAM和/或HEX和/或TAMRA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的鸡和/或鸭和/或鹅源性成分；样品的三重引物探针组B的PCR反应体系中，FAM和/或HEX和/或TAMRA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的鹌鹑和/或鸽子和/或石鸡源性成分；若上述一种或几种荧光无信号及对数增长，则不含相应的禽源性成分；若30.0<Ct值<40.0时，增加模板量复检，Ct值≥40.0时，则检测结果为阴性，Ct值<40.0时，则检测结果为阳性。