CN109609662B - 同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒 - Google Patents

同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一组同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三种大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒，其中，核酸包括上述三大类物种中每种大类的通用上游引物、通用下游引物和通用探针。方法为：1)从样品中提取动物基因组核酸；2)对核酸进行三重PCR扩增，得到扩增产物；3)将扩增产物进行xMAP三重微球悬浮杂交，检测杂交反应信号；4)根据检测信号，判定待测样品的检测结果。本发明方法实现同时检测鉴定鉴别禽类、鱼类和反刍类共三大类物种成分，并避免为达到相同目的而逐个检测鉴定单一物种的做法，显著降低了检测成本和检测时间，能够更好更高效率避免漏检，为防范食品和饲料相关掺杂使假欺诈行为提供技术支持，具有重要实用价值意义。

Description

同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因 芯片的核酸和方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及用于同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及其检测试剂盒，属于生物技术安全检测领域。
背景技术
(一)、动物源性成分检测鉴定技术和方法的实用意义
动物源性成分检测鉴定是食品质量安全重要内容，对维护人民健康安全、维护经济秩序和社会稳定、进出口食品监管均具有重要意义。近年来，国内外不法商人采用低价值物种肉类如禽肉等掺入甚至冒充高价值的牛、羊肉制品，并过量添加色素、香精等杂质；“假牛羊肉”制品流入超市、餐馆、熟食店和食品加工生产链，不仅危害食用安全，若原料未经检验检疫，还将涉及到疫病传播，引发健康风险，而且国内外肉类产品掺杂使假违规犯罪行为也屡被曝光，引发社会广泛关注。动物源性成分检测鉴别是饲料质量安全重要内容，涉及传染性海绵状脑病(TSE)、高致病性禽流感等重大疫病防控、饲料质量把关、进出口饲料监管等各项重要工作。饲料是动物源性食品的源头，饲料安全是食品安全的基础。在重大疫病防控方面，自1987年欧洲发生疯牛病以来，为防控疯牛病，世界各国均先后制定法律、法规，严格控制饲料中动物源性成分特别是反刍类成分的使用。我国对来自“非疯牛病风险可忽略”的国家和地区的饲用动物产品规定禁止含牛、羊等反刍动物类成分。为防控高致病性禽流感，各国也制定了针对饲料中禽类成分的禁令。例如，加拿大规定对含有禽类成分的宠物食品、出口国必须是新城疫、禽流感非疫区，对含反刍动物类成分的宠物食品、出口国必须是口蹄疫非疫区和疯牛病风险可忽略的地区。鱼粉是重要的蛋白质饲料原料，我国进口鱼粉数量位居全球第一，根据进出口管理规定，来自疫区的鱼粉不得含有禁用成分，比如，从“非疯牛病风险可忽略”国家进口的鱼粉不得含有牛、羊等反刍类成分。近年来，我国进出境检验检疫机构多次从“非疯牛病风险可忽略”国家进口的鸡肉骨粉、鱼粉等饲用原料产品中检出禁用的牛、羊成分，或从家畜类肉骨粉中检出鸡成分。此外，鉴于已发现的饲料原料掺杂使假行为，对于鱼粉等高价值的动物源性饲料原料，也有必要进行品质检验鉴定，已有媒体曝光采用羽毛粉等低价值成分冒充鱼粉的违规行为。以上事例说明，对饲料产品实施特定动物源性成分检测把关的重要性和必要性。
上述有关防控疯牛病、高致病性禽流感等涉及的质量和安全把关与检验要求，均涉及检测鉴定反刍类、禽类和鱼类成分，而并不要求鉴定识别其中具体物种。比如，对于防控疯牛病，要求来自风险地区的饲料不得含有反刍类成分，无论具体是黄牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊等物种；对于高致病性禽流感风险地区，禁止其陆生禽类和水生禽类所有品种的禽类产品进口；而对于鱼粉，国内外用于生产鱼粉的种类包括各种海水鱼类和淡水鱼类，已知采用的鱼类品种已有十多种。因此，若按传统采用单一物种特异的检测方法，难于覆盖所有品种，成本高且易造成漏检。对于禽类、反刍类、鱼类找出其同一大类中同源的基因序列，进而建立同类物种通用性检测方法是达到上述质量与安全监管把关检验目标的优选方案。
(二)、相关动物源性成分检测技术和方法研究应用现状
国内外现有动物源性成分检测鉴定技术以DNA检测分析技术为主流，主要有以下几种类型：
1)基于PCR扩增和扩增产物常规检测分析。这类技术最为常见，包括PCR、PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-AFLP、PCR-SSCP技术等。这类技术的不足主要体现如下：由于需对扩增产物进行电泳或测序分析，检测时间延长、操作繁琐并易引发核酸污染并造成假阳性反应，多种成分混合的样品其扩增产物电泳图谱较为复杂、不易分辨、结果可靠性差。
2)实时荧光PCR技术。目前国内外已针对常见食用哺乳动物如猪、牛、羊以及鸡、鸭、鹅等禽类共十余种动物建立单一物种特异的荧光PCR方法，多重荧光PCR方法方面有二重或三重荧光PCR方法。荧光PCR技术显著提高了检测速度、灵敏度和特异性，但其检测成本较高，目前仪器分辨力以及可选荧光基团的组合是制约多重荧光PCR检测通量的关键因素，现有的设备平台和可供选用的荧光染料、不能解决荧光信号交叉干扰以及仪器对不同荧光基团分辨敏感性差异问题；虽然荧光PCR设备可提供5个甚至更多通道，但能够应用的仍然只有个别二重或三重荧光PCR方法，并且对于混合阳性模板、其检测敏感性往往比单色法有明显下降、不同检测通道间常出现信号交叉，检测结果不准确。
3)传统固相基因芯片技术。基于PCR联合DNA杂交的基因芯片技术已经用于检测鉴别多种动物源性成分研究，均为传统固相基因芯片技术，采用常规尺寸的片状载体(硅片、光学载玻璃片、纤维素膜、尼龙膜等)作为固相基质载体，能够提供高通量检测，但其缺点是需要点样仪、杂交仪、扫描仪等多种专用设备，成本高，并且操作繁琐、造成干扰因素较多，检测稳定性、重复性效果不理想，影响临床应用。
4)环介导等温扩增技术(LAMP)。国内外已见动物源性成分LAMP检测方法研究。LAMP采用等温扩增原理，无需变温控制设备如PCR扩增仪，适合基层应用。但该方法不适合进行长链DNA扩增，只适合单一检测，不适合建立多重检测方法，扩增产物不能直接用于后续分析，且易产生假阳性反应。
由于肉类产品和饲料中动物源成分的检测和真伪鉴别涉及多种物种，若采用单一物种特异的检测方法逐项进行检测分析，不但使检测周期延长或需增加人力，检测成本也成倍增加，还有可能因检测项目不全造成漏检。
综上所述，现有的动物源物种检测技术以单一物种成分检测为主，国内未见禽类、鱼类、反刍类等同一类物种大类通用性检测并进行三大类之间同步鉴定鉴别的技术。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类共三种大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及检测试剂盒，该检测方法实现同步检测鉴定鉴别待测样品中禽类、鱼类和反刍类三大类动物源性成分，具有高通量、准确、灵敏度高、稳定性好、快速、检测性价比高等优势。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一组用于同步检测鉴定鉴别禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸，包括禽类、鱼类、反刍类中各类别的通用上游引物、通用下游引物和通用探针，其中，
所述禽类的通用上游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其通用下游引物序列如SEQ ID No.3所示，通用探针如SEQ ID No.4所示；
所述鱼类的通用上游引物序列如SEQ ID No.5所示，其通用下游引物序列如SEQID No.6所示，通用探针如SEQ ID No.7；
所述反刍类的通用上游引物序列如SEQ ID No.8所示，其通用下游引物序列如SEQID No.9所示，通用探针如SEQ ID No.10所示；
所有下游引物的5’端标记生物素，探针的5’端C12标记氨基。
一种用于同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的试剂盒，所述试剂盒包括上述禽类、鱼类、反刍类的各类别通用上游引物、通用下游引物和通用探针。
如上所述的试剂盒，还包括2×PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中，所述2×PCR缓冲液中包括：浓度为40mmol/L、pH8.0的Tris-HCl，8mmol/L的MgCl2，400μmol/L的dNTP，300mmol/L的KCl，1mg/mL的BSA和体积浓度为6％的甘油。
一种用于同步检测鉴定鉴别禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取待检样品中的核酸；
S2、利用如上所述检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的液相基因芯片的各类别通用上游引物、通用下游引物对上述步骤S1提取的待检样品中的核酸进行不对称PCR扩增，获得PCR扩增产物；
S3、利用分别偶联有如上所述禽类、鱼类、反刍类的各类别通用探针的聚苯乙烯乳胶微球，与步骤S2获得的扩增产物进行杂交反应；
S4、用液相芯片仪检测步骤S3杂交反应后的MFI值，根据检测的本底值，判定检测结果；
其中，
所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤S2、步骤S3的反应，其中所述空白对照为用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的检测值(MFI值)的平均值，作为本底值；
结果判定：当被检样品的MFI值大于5倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
如上所述的方法，优选地，步骤S2中，所述PCR扩增的扩增体系，包括禽类、鱼类、反刍类的各类别通用上游引物、通用下游引物、PCR缓冲液、DNA聚合酶、待检样品模板和水；其中，禽类的通用上游引物SEQ ID No.1终浓度为20nmol/L，SEQ ID No.2的终浓度为50nmol/L，禽类下游引物的终浓度为120nmol/L；鱼类的通用上游引物的终浓度为50nmol/L，其通用下游引物终浓度为120nmol/L；反刍类的通用上游引物终浓度为50nmol/L，其通用下游引物终浓度为120nmol/L。
所述PCR扩增的扩增反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，58℃退火8秒，72℃延伸2秒，共进行35个循环；最后72℃延伸1分钟；4℃停留。
如上所述的方法，优选地，步骤S3中，所述杂交反应包括：
S301、将禽类、鱼类、反刍类的各类别通用探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；
S302、将步骤S2获得的扩增产物与上述步骤S301中偶联聚苯乙烯乳胶微球的探针进行杂交反应；
S303、杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白(SAPE)进行温育，
S304、取步骤S303获得的溶液进行检测MFI值。
如上所述的方法，优选地，在步骤S302中，杂交反应条件为95℃变性5分钟，58℃杂交反应20分钟，4℃停留。
如上所述的方法，优选地，在步骤S303中，所述链亲和素藻红蛋白为其终浓度3.3μg/mL的1×TMAC溶液。
如上所述的方法，优选地，在步骤S303中，所述温育的条件为58℃温育6min，温育期间设振荡速度为300rpm。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供的用于同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类共三大类物种成分的多重液相基因芯片的核酸，能够用于进行三大类动物源性成分中各类别的通用性检测，以及同步进行区分鉴定三大类动物源性成分，包括：1)禽类大类成分通用性特异检测，能够覆盖禽类中鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡等各种禽类物种，但不区分其中具体物种；2)鱼类大类成分通用性特异检测，能够覆盖各种常见淡水鱼种和海水鱼种，但不区分其中具体物种；3)反刍类大类成分通用性特异检测，能够覆盖反刍类中牛、羊、鹿、骆驼等各种反刍动物物种，但不区分其中具体物种。本发明采用同一类物种通用性检测方案，相比为达到同一目的而逐个检测每一大类中单一物种的方法，显著降低了检测成本和检测时间。由于一些不常见物种的基因组序列信息不全，难于针对某一大类中所有物种都建立单一物种的特异检测鉴定方案，而本发明提供同一类物种的通用性检测鉴定方案，能够更好更高效率避免漏检禽类、鱼类和反刍类中的物种。
本发明对于国内和口岸防控疯牛病、高致病性禽流感等重大动物疫病和人兽共患重大疫病，以及食品和饲料质量把关、防止食品和饲料掺杂造假欺诈行为具有重要实用价值意义。
本发明利用xMAP微球悬浮芯片进行检测，与PCR、荧光PCR等各种单项检测方法相比，具有同步检测多个靶标的高通量优势，同时在检测准确性、灵敏度、稳定性、速度、操作简便性以及检测成本方面比传统固相芯片技术均有明显改进，有利于实际推广应用。本发明能够同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类成分，可为食品和饲料的质量与安全监管、进出口把关等提供技术支持。
本发明提供的一组用于同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的核酸，不仅可同时用于检测禽类、鱼类、反刍类这三大类，节约试剂与成本，且提高时效；且也可用于单独检测单一大类，只是采用单一大类的通用上游引物，通用下游引物和通用探针即可，使用方便。
具体实施方式
要实现多种靶目标的同时检测，必须保证检测这几种靶目标所采用的引物、探针及扩增产物，相互之间不能出现交叉反应，否则，容易出现假阳性结果，尤其是检测因子越多，设计引物、探针的难度越大，故目前大多是单因子的检测居多。而本发明的发明人经过大量实验、验证，建立了一种基于Luminex xMAP(Multi-Analyte Profile)聚苯乙烯微球悬浮芯片技术原理的三重液相基因芯片方法，实现同步检测鉴定鉴别饲料和食品等产品中三大类动物源性成分：即能够同步进行禽类成分通用性检测鉴定(不区分禽类中具体物种)和鱼类成分通用性检测鉴定(不区分鱼类中具体物种)以及反刍类成分通用性检测鉴定(不区分反刍类中具体物种)，并同时区分这三大类成分。
本发明提供一组用于检测鉴定鉴别三大类动物源性成分的三重液相基因芯片方法中使用的特异寡核苷酸，包括七条特异扩增通用引物和三条特异通用探针。并提供三重液相基因芯片检测方法具体操作步骤，包括：1)提取待检样品中的动物基因组核酸；2)进行三重不对称核酸扩增；3)联合三重xMAP微球悬浮基因芯片(液相基因芯片)检测；实现同步检测鉴定鉴别待测样品中禽类、鱼类和反刍类动物源性成分。具有高通量、准确、灵敏度高、稳定性好、快速、检测性价比高等优势。
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1引物与探针的设计与制备
首先分别筛选禽类、鱼类和反刍类的特异目标基因，通过序列检索比较，选定禽类、鱼类和反刍类的线粒体序列作为PCR扩增靶基因。从GenBank分别下载禽类、鱼类和反刍类各自代表性物种的线粒体基因组序列多条，进行比对分析，选取种属特异性好的保守区序列，再将此序列进行种属间的比对，最后分别选取禽类线粒体基因组中的COI基因、鱼类线粒体基因组中的12s rRNA、反刍动物类线粒体基因组中的16srRNA作为PCR扩增的靶基因。
PCR扩增引物和液相基因芯片反应体系中的杂交探针在发明人多年经验的基础上，设计采用Array Designer 4.0和DNAMAN 7辅助进行，设计引物的原则主要有确保每一大类适用的引物的3'端与其目的物种靶基因能完全匹配，而与其它大类的物种不匹配，同时在引物的中间位置也存在2个以上的不匹配位点，从而PCR在严谨控制退火温度的条件下，只能特异性的扩增该大类的目的物种的基因序列，由于引物与其它大类的物种存在多个碱基的不匹配，不能与其结合，因此其他大类的物种的扩增不能进行。另外，设计时使三大类物种的PCR特异性引物的退火温度基本一致，以便能采用一致的扩增反应条件。而杂交探针的设计也是首先保证每一大类的探针与该类中各目的物种完全匹配，而与其他大类的物种在探针的中间存在至少2个以上的不匹配，从而保证了杂交探针的特异性，并且设计时使三大类物种的特异杂交探针的退火温度基本一致，以便能采用同样的检测条件。按照上述设计原则，通过序列分析分别设计出禽类、鱼类和反刍类特异的多条引物序列和杂交探针序列，采用NCBI的Blast在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过大量检测试验，最终筛选确定出禽类、鱼类和反刍类特异的且适合液相基因芯片反应体系的引物与探针组合，序列如表1中所示，通过生物公司合成，其中，在所有下游引物的5’端标记生物素，探针的5’端C12标记氨基。
表1禽类、鱼类、反刍类三重液相基因芯片方法中通用引物、通用探针
Figure GDA0003298546580000091
Figure GDA0003298546580000101
其中，SEQ ID No.10中的R表示简并碱基，代表G或A，合成时，TTCAGCTTTAAAGATACCAAAA与TTCAGCTTTAAAAATACCAAAA，是对半合成。
实施例2三重液相基因芯片检测方法的建立与优化
检测过程包括三重不对称PCR扩增和三重悬浮微球杂交检测。需要对扩增反应体系(各通用引物、各种试剂的用量)、扩增反应条件(反应温度、时间、扩增循环次数等)，以及杂交反应体系、杂交反应条件等进行研究和大量试验摸索验证，从而建立优化反应条件。
1.在三重不对称PCR扩增，主要进行三套引物的用量、PCR反应退火温度和时间、扩增循环次数等关键因素进行优化，通过对引物浓度梯度、反应温度和时间梯度的大量比对试验，建立了较佳的扩增反应体系和扩增反应条件。所建立的优化扩增反应体系详见表2。
表2三重液相基因芯片方法优化扩增反应体系
Figure GDA0003298546580000102
Figure GDA0003298546580000111
所建立的优化扩增反应条件：95℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：95℃变性5秒，58℃退火8秒，72℃延伸2秒，共进行35个循环；最后72℃延伸1分钟；4℃停留。
其中，模板为将从饲料、食品等样品中提取核酸，具体操作为样品经过研磨、粉碎等处理后，可采用商品化硅基质离心柱试剂盒提取法等方法提取纯化样品中的动物基因组核酸作为模板，采用上述优化的扩增反应体系和扩增反应条件进行三重不对称PCR扩增，获得PCR扩增产物。
2.在杂交反应阶段，主要进行杂交温度和时间、洗涤条件以及SAPE报告液工作浓度和时间的最佳参数摸索。根据本发明人的技术经验和大量的比对试验，建立了较佳的杂交反应条件，具体如下进行：
采用三重液相基因芯片方法对扩增产物进行检测
(1)将带有氨基的寡核苷酸探针偶联到带有COOH的聚苯乙烯乳胶微球。
将禽类、鱼类或反刍类特异的寡核苷酸探针分别偶联到不同编码微球上，包括：禽类特异的寡核苷酸通用探针，序列如SEQ ID No.4所示，5’端标记氨基；鱼类特异的寡核苷酸通用探针，序列如SEQ ID No.7所示，5’端标记氨基；反刍类特异的寡核苷酸通用探针，序列如SEQ ID No.10所示，5’端标记氨基。
这一步骤可独立进行，可以按Luminex公司提供的标准程序进行探针偶联，偶联好探针的微球可在4℃保存1年以上，可随时取出进行后续微球杂交检测。
(2)对上述1.中三重核酸扩增产物进行三重微球悬浮杂交检测。
主要过程包括：配制3种偶联微球混合液，加入5-10μL上述1.中的PCR扩增产物，在PCR仪上按以下优化的微球杂交反应条件进行杂交反应；反应结束后，加入TMAC-SAPE报告液，温育。
优化的微球杂交反应条件如下：
2.1用1.5×氯化四甲铵(Tetramethylammonium chloride，TMAC)缓冲液将微球稀释成微球工作液，分装微球工作液33μL/管至PCR管中，包含上述3种偶联了不同通用探针的微球，微球数达每管含每种探针偶联微球400个以上；
2.2每管中加入5μL-10μL PCR产物，加1×TE(PH8.0)至总体积为50μL。涡旋振荡全速震荡30秒，把PCR管放入PCR仪，按下列条件进行杂交反应；
2.3在PCR仪上进行杂交反应，杂交反应条件为：95℃变性5分钟，58℃杂交反应20分钟，4℃停留；
2.4杂交反应结束，取出反应管，每管加入100μL 1×TMAC溶液，然后，置离心机，13000rpm离心4分钟，小心吸弃上清，收集微球沉淀；
2.5用1×TMAC洗涤微球1-2次，每次加入100μL 1×TMAC，振荡混匀，13000rpm离心4分钟，小心吸弃上清；同时用1×TMAC将链亲和素藻红蛋白(Streptavidin-phycoerythrin，SAPE)稀释至3.3μg/mL，配制TMAC-SAPE报告液；
2.6在每管微球沉淀中，加入75μL的TMAC-SAPE报告液，振荡混匀；
2.7置恒温混匀仪，58℃温育6min，温育期间设振荡速度为300rpm；
2.8上机检测：取完成上述杂交反应的微球反应液，用LuminexTM200system液相芯片仪或其他等效设备测量MFI值。
2.9检测结果的判定
2.9.1本底值的测定：每次检测同时设3个空白对照样品，对空白对照样品同步进行三重核酸扩增和三重微球悬浮杂交，在空白样品反应体系中，以扩增反应用水取代核酸模板，其余试剂成分与反应条件与检测样品一致；计算3个空白对照样品的MFI值平均值，作为本底值；
2.9.2结果判定：设被检样品的MFI值大于5倍本底值为判定阈值；被检样品检测结果达到判定阈值判为阳性，否则判为阴性。
实施例3三重液相基因芯片方法的特异性试验
采用本发明实施例2中提供的三重液相基因芯片方法对41种动植物样品的基因组核酸进行检测，包括7种反刍动物和牛肉粉标准品、12种鱼类样品、8种禽类样品和鸡肉粉标准品、其他11种常见食用和饲用陆生和水生动物物种样品以及植物蛋白粉(主要成分为大豆、小麦和豌豆)进行检测。检测结果详见下表3。
表3三重液相基因芯片特异性试验结果
Figure GDA0003298546580000131
Figure GDA0003298546580000141
检测结果说明与物种样品实际情况相符：7种反刍动物和牛肉粉标准品均呈反刍类检测阳性，12种鱼类样品均呈鱼类检测阳性，8种禽类样品和鸡肉粉标准品均呈禽类检测阳性。三大类物种样品的检测结果无交叉反应现象，其他11种陆生和水生动物物种、植物蛋白粉样品均呈检测阴性，空白对照呈检测阴性，说明本发明方法能有效同时检测三大类物种样品，特异性强。
实施例4三重液相基因芯片方法的检测敏感性(LOD)测试
选取黄牛肌肉组织、黄羽鸡鸡肉组织、进口鱼粉样品作为代表性物种样品，按上文所述方法分别提取纯化基因组核酸，采用NanoDrop公司ND1000超微量分光光度计精准测核酸浓度。取已测浓度的黄牛基因组DNA、黄羽鸡基因组DNA，用无RNA酶、无DNA酶超纯水进行10倍系列稀释。取上述浓度范围为10ng/μL到1fg/μL的各梯度稀释样品，采用本发明实施例2提供的三重液相基因芯片方法进行检测，每种DNA模板的每个稀释度均同步做3个平行反应。检测终点为3个平行反应均呈检测阳性的最高稀释度，所检测DNA模板的最高稀释度对应的核酸浓度即为检测低限(LOD)。
根据本发明人试验结果，利用上述三重液相基因芯片方法对黄牛基因组DNA、黄羽鸡基因组DNA、鱼粉DNA模板的检测低限分别为0.2pg/μL、0.7pg/μL、15pg/μL。
实施例5三重液相基因芯片方法对人工制备混合样品的检测敏感性试验
将牛肉粉、鱼粉、鸡肉粉分别添加到不同基质中，按以下方法制备3组混合样品：
1)用万分之一精密度分析天平，准确称取牛肉粉标准物质(添加物)，添加到猪血浆蛋白粉(基质)中，分别制备重量(含量)比(牛肉粉/猪肉粉)为0.05％、0.1％的混合样品；
2)同样方法，制备重量(含量)比(鸡肉粉/鱼粉)为0.01％、0.1％的鸡肉粉(添加物)添加到鱼粉(基质)中的混合样品；
3)同样方法，制备重量(含量)比分别为0.01％、0.1％的鱼粉(添加物)与植物蛋白粉(基质)混合样品。
对上述各组混合样品，每种含量比分别取6个样品，均独立提取核酸，并采用本发明实施例2提供的三重液相基因芯片方法分别进行检测，取等同量基质样品同步提取核酸和进行检测。记录每组6个取样样品的MFI检测值并计算其平均值，记录对应基质样品的MFI检测值。
检测结果显示，对于上述三组人工制备的混合样品，每组的6个取样样品均呈检测阳性，其MFI平均值与对应基质样品MFI值的比值均大于5。以上试验表明：采用三重液相基因芯片方法从猪源性基质中均检出含量为0.1％和0.05％的牛肉粉成分，从鱼粉基质中均检出含量为0.1％、0.01％的鸡肉粉成分，从植物蛋白粉基质中均检出含量为0.1％和0.01％的鱼粉成分(详见下表4)。
表4混合样品检测试验结果
Figure GDA0003298546580000161
注：表中*表示混样与基质的对应检测结果均呈阴性，不计算比值；
**表示混样与基质均呈鱼类成分检测强阳性，MFI值接近。
根据上述检测结果，测得三重液相芯片方法对不同基质混合样品中禽类、鱼类和反刍类物质的检测敏感性可达0.05％～0.01％。
实施例6应用三重液相基因芯片方法对饲料样品进行检测
本发明人共收集55份进口饲料样品进行检测试验。所指进口饲料样品包括：28份不同批次的分别来自欧洲、北美、大洋洲和亚洲等多个国家的宠物食品，均为高温膨化成型配合饲料；12份不同批次的分别来自北美、南美和亚洲等多个国家的饲用鱼粉；7份不同批次来自北美和大洋洲的饲用鸡肉骨粉；6份不同批次来自大洋洲的饲用牛羊肉骨粉；2份不同批次分别来自北美和欧洲的饲用猪血浆蛋白粉。
采用本发明实施例2提供的三重液相基因芯片方法对上述55份进口饲料样品进行检测，检出37份样品与标签标示成分相符；检出18份样品含有标签未标示的成分：其中从1份进口牛羊肉骨粉中检出禽类成分，从17份宠物食品中检出禽类、鱼类和/或反刍类成分。检测呈禽类、鱼类和/或反刍类成分阳性的样品，其MFI值为对应本底值的6倍-80倍。对于55份饲料样品的检测情况详见下表5和表6。
表5 55份饲料样品检测总体情况
Figure GDA0003298546580000171
表6饲料样品检出不符合情况
Figure GDA0003298546580000172
Figure GDA0003298546580000181
根据上述对饲料样品的检测应用情况，本发明提供的三重液相基因芯片方法能够从单一饲料原料产品及混合多种成分的配合饲料产品中高效检测鉴定并鉴别禽类、鱼类、反刍类成分，对12份鱼粉样品、7份鸡肉骨粉、5份牛羊肉骨粉、2份猪血浆蛋白粉以及11份宠物食品的检测的检测结果与标签标示信息相符。从17份宠物食品以及1份进口牛羊肉骨粉中检出标签未标示的成分。表明本发明方法能够用于饲料检测把关。
实施例7应用于检测市售加工食品样品
采用本发明提供的三重液相基因芯片方法，对本发明人收集的市售肉丸、肉肠、肉松、包点馅料等15份加工动物源性食品样品进行检测。检出4份样品与食品标签或标示内容不符合。详见下表7：
表7加工食品样品检出不符合情况
Figure GDA0003298546580000182
根据上述对食品样品的检测情况，表明本发明方法能够高效识别加工食品中禽类、鱼类、反刍类成分，能够用于食品检测把关。
小结：
根据本发明进行的上述特异性、敏感性试验情况，以及对实际饲料和食品样品的检测情况，充分说明本发明提供的方法：1)特异性强。能进行禽类、鱼类、反刍类三种大类物种成分的通用性检测以及进行三大类之间的鉴别鉴定；2)敏感性高。能够满足实际检测需求；3)实际应用检测效果好。通过对多种饲料和食品样品的检测结果显示，该法能够有效检测鉴定饲料和加工食品中的三大类动物源性成分，并能从样品中检出与标签或标示内容不符合的情况，说明实际应用效果可靠，检出率高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaacaggaa tcgtccttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaacaggaa ttgtcctcgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaatcctg ctaggatggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtagtcgccc acttccacta 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggagcctgt tctagaac 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcacagggt aagctgac 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccgttaaa cctcacc 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggttgtcca gaaaatga 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtacctttt tagactaact t 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcagcttta aarataccaa aa 22

Claims (10)

1.一组用于同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的引物及探针，其特征在于，由禽类、鱼类、反刍类中各类别的通用上游引物、通用下游引物和通用探针组成，其中，所述禽类的通用上游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其通用下游引物序列如SEQ ID No.3所示，通用探针如SEQ ID No.4所示；
所述鱼类的通用上游引物序列如SEQ ID No.5所示，其通用下游引物序列如SEQ IDNo.6所示，通用探针如SEQ ID No.7；
所述反刍类的通用上游引物序列如SEQ ID No.8所示，其通用下游引物序列如SEQ IDNo.9所示，通用探针如SEQ ID No.10所示；其中，SEQ ID No.10中的R表示简并碱基，代表G或A；
所有下游引物的5’端标记生物素，所有探针的5’端C12标记氨基。
2.一种用于同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的禽类、鱼类、反刍类的各类别通用上游引物、通用下游引物和通用探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中，所述2×PCR缓冲液中包括：浓度为40mmol/L、pH8.0的Tris-HCl，8mmol/L的MgCl2，400μmol/L的dNTP，300mmol/L的KCl，1mg/mL的BSA和体积浓度为6％的甘油。
4.一种用于同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、提取待检样品中的核酸；
S2、利用如权利要求1所述的用于检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的液相基因芯片的通用上游引物、通用下游引物对上述步骤S1提取的待检样品中的核酸进行不对称PCR扩增，获得PCR扩增产物；
S3、利用分别偶联有如上所述禽类、鱼类、反刍类的通用探针的聚苯乙烯乳胶微球，与步骤S2获得的扩增产物进行杂交反应；
S4、用液相芯片仪检测步骤S3杂交反应后的信号值即MFI值，根据检测的本底值，判定检测结果；
其中，所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤S2、步骤S3的反应，其中在所述空白对照，用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的测得的MFI值的平均值，作为本底值；
结果判定：当被检样品的MFI值大于5倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的扩增体系，包括禽类、鱼类、反刍类的各类别通用上游引物、通用下游引物、PCR缓冲液、DNA聚合酶、待检样品模板和水；其中，禽类的通用上游引物SEQ ID No.1终浓度为20nmol/L，SEQ ID No.2的终浓度为50nmol/L，禽类的通用下游引物的终浓度为120nmol/L；鱼类的通用上游引物的终浓度为50nmol/L，其通用下游引物终浓度为120nmol/L；反刍类的通用上游引物终浓度为50nmol/L，其通用下游引物终浓度为120nmol/L。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的扩增反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，58℃退火8秒，72℃延伸2秒，共进行35个循环；最后72℃延伸1分钟；4℃停留。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述杂交反应包括：
S301、将禽类、鱼类、反刍类的通用探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；
S302、将步骤S2获得的扩增产物与上述步骤S301中偶联聚苯乙烯乳胶微球的探针进行杂交反应；
S303、杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白进行温育，
S304、取步骤S303获得的溶液进行检测MFI值。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S302中，杂交反应条件为95℃变性5分钟，58℃杂交反应20分钟，4℃停留。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S303中，所述链亲和素藻红蛋白为其终浓度3.3μg/mL的1×TMAC溶液。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S303中，所述温育的条件为58℃温育6min，温育期间设振荡速度为300rpm。
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