CN107541566B - 哺乳纲和鸟纲动物源性成分的检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哺乳纲和鸟纲动物源性成分的检测方法及试剂盒。本发明揭示了可以定量检测哺乳纲和鸟纲动物的通用引物、探针及PCR体系，本发明的定性和定量检测方法具有良好的灵敏度、稳定性和可重复性。

Description

哺乳纲和鸟纲动物源性成分的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于物种检测领域，更具体地，本发明涉及哺乳纲和鸟纲动物源性成分的检测方法及试剂盒。

背景技术

目前，国内外已经有大量的研究利用实时荧光PCR技术鉴定食品中动物源性成分。几种常见肉类物种的鉴定方法，例如牛、猪、鸡、火鸡、鸭、鹅、马、绵羊、山羊等大多采用PCR、实时荧光PCR和巢式PCR技术。然而，大多数方法都是基于线粒体基因包括18S rRNA、12SrRNA、细胞色素b，COI基因，线粒体基因由于它进化快速并且有效，在不同的物种之间差异性较大，选其作为目的基因，能提高定性检测下限，使得定性检测的灵敏度、稳定性大大提升。

但是，正是由于线粒体基因为多拷贝这一特点，大大限制了其应用于定量鉴定中的研究。线粒体基因在不同物种细胞中通常不是恒定的拷贝数，不同组织细胞中的线粒体数量各异，各靶基因的拷贝数不同，有时甚至会达到十到几千倍的差异，导致很难定量食品中目标物种的成分。因此，无法选择线粒体基因为目标基因进行食品中肉类种源的定量研究。

因此，本领域需要进一步地对动物物种进行研究，以期找到可以有效地、准确地实现肉类物种的定性和定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供哺乳纲和鸟纲动物源性成分的检测方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的方法，所述方法包括：获得来自待测样品的核酸，以该核酸为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含哺乳纲和鸟纲动物源性成分。

在一个优选例中，所述的方法包括：以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物以及SEQ ID NO:3所示序列的探针进行PCR检测.

在另一优选例中，所述的SEQ ID NO:3所示序列的探针是Taqman荧光探针；所述的PCR检测是实时荧光PCR检测。

在另一优选例中，所述的待测样品包括(但不限于)：食品、饮品、保健品。

在另一优选例中，所述的哺乳纲和鸟纲动物包括：猪；鸭(包括野鸭)；牛(包括水牛；牦牛)；猴(包括白簇耳狨猴，绿长尾猴，飞狐猴，食蟹猕猴，猕猴，小耳夜猴，玻利维亚松鼠猴，眼镜猴)；骆驼；狗；羊(包括山羊，绵羊)；鼠(包括豚鼠，长尾南美洲栗鼠，灰色仓鼠，非洲跳鼠，金仓鼠，橙腹田鼠，灰色短尾负鼠，老鼠，八齿鼠，沟鼠)；白犀牛；普金鼹；鸽子(包括岩鸽)；乌鸦(包括美洲乌鸦)；刺猬(包括马达加斯加小刺猬)；蝙蝠(包括大褐蝙蝠，食虫蝙蝠，黑狐蝠)；马；猎隼；猫(包括家猫)；鸡；猩猩(包括银背大猩猩，矮黑猩猩，黑猩猩，苏门答腊猩猩)；人；海豹(包括威德尔氏海豹)；江豚；火鸡(包括野火鸡)；鹦鹉(包括虎皮鹦鹉)；貂(包括养殖雪貂)；鼠兔(包括美洲鼠兔)；海象(包括太平洋海象)；兔；虎(包括东北虎)；藏羚；狒狒；鹿(包括草原鼠鹿；马鹿；梅花鹿)；鲸(包括抹香鲸)；海牛(包括佛罗里达海牛)；北极熊；羊驼；麻雀(包括白颌麻雀)；鹅；鹌鹑；驴；狐狸；貉。

在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的探针，所述的探针的序列如SEQ ID NO:3所示；较佳地，所述的探针是Taqman荧光探针。

在本发明的另一方面，提供所述的引物所述的探针的用途，用于以待测样品的DNA为模板进行PCR反应，形成含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的扩增产物，从而鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性的试剂盒，其中包括所述的引物(如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)；较佳地，所述试剂盒中还包括所述的探针(更佳地，如SEQ ID NO:3所示)。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、定量PCR方法的特异性结果。

图2、定量PCR方法的异质性结果。

图3、本发明PCR扩增体系获得的目标片段的拷贝数分析。Gal表示采用针对鸡γ-干扰素基因的引物扩增，Sus表示采用针对猪β-肌动蛋白基因的引物扩增，Bta表示采用针对牛生长激素基因的引物扩增，Uni表示采用本发明设计的哺乳纲和鸟纲通用引物扩增。

图4、动物成分特异性序列标准曲线及曲线方程。A-F分别为鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的标准曲线和曲线方程。

图5、混合样品的定量检测结果。

图6、混合样品真实值与测定值的相对偏差结果。

图7、70种动物物种的DNA序列比对结果以及设计的引物和探针的位置。

具体实施方式

为了有效地区分哺乳纲和鸟纲动物来源的成分，本发明人针对大量的动物、禽类及其它物种进行比较，在此基础上建立了一个可以定量检测哺乳纲和鸟纲动物的通用体系，其具有良好的灵敏度、稳定性和可重复性。

检测试剂

本发明人在针对大量动物进行分析研究中发现，利用线粒体基因18S rRNA、12SrRNA、细胞色素b，COI基因等并不能从各种动物中有效地区分哺乳纲和鸟纲动物。为了找到可实现对哺乳纲和鸟纲动物进行有效鉴定的、具有广泛通用性的基因，本发明人深入比较、分析了大量的动物基因组信息。确定了哺乳纲和鸟纲动物核基因组中特定片段作为分析鉴定的靶标，可以有效地区分出哺乳纲和鸟纲动物。

所述的靶标片段的核苷酸序列尽管在哺乳纲和鸟纲动物有所不同，但可以由本发明的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物进行PCR扩增而获得。

因此，本发明提供了一种鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的方法，所述方法包括：获得来自待测样品的核酸，以该核酸为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含哺乳纲和鸟纲动物源性成分。

所述的靶标片段在不同的物种之间拷贝数差异很小。因此，除了作为鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的靶标，本发明所述的靶标片段(即本发明的PCR体系扩增产物)还能够用作哺乳纲和鸟纲动物的内参照基因。

本发明人通过哺乳纲和鸟纲动物及其它物种在基因层面的比较和筛选，确定将哺乳纲和鸟纲动物中核基因组的特定区段作为检测的靶基因，并经比对分析和反复试验，获得了特异性地扩增该特定区段的引物、探针，从而建立了用于检测哺乳纲和鸟纲动物源性成分的实时荧光PCR方法，达到鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的目的，确保食品质量安全；同时，也可应用于检测哺乳纲和鸟纲动物的内参照基因。

本发明提供了一种可特异性鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的引物，所述引物针对含有哺乳纲和鸟纲动物源性成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有哺乳纲和鸟纲动物源性成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

本发明所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明所述的引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是Taqman探针，从而便于实时荧光检测。

PCR方法

基于本发明所提供的适用于鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含哺乳纲和鸟纲动物源性成分。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

在本发明的优选实施方式中，采用Taqman实时荧光PCR检测技术：在PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的标记有荧光素的Taqman探针，该探针为一寡核苷酸，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct(cycle threshold，Ct)值。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，也即Ct值越小，从而实现对起始模板定量及定性的分析。

利用本发明的引物及探针，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有哺乳纲和鸟纲动物源性成分，而且所需的样品量很少，对于微量的哺乳纲和鸟纲动物源性成分也能检出，灵敏度非常高。

经全面测试，本发明建立的检测方法是特异于哺乳纲和鸟纲动物源性成分的检测。

作为本发明的优选方式，所述的哺乳纲和鸟纲动物包括：猪；鸭(包括野鸭)；牛(包括水牛；牦牛)；猴(包括白簇耳狨猴，绿长尾猴，飞狐猴，食蟹猕猴，猕猴，小耳夜猴，玻利维亚松鼠猴，眼镜猴)；骆驼；狗；羊(包括山羊，绵羊)；鼠(包括豚鼠，长尾南美洲栗鼠，灰色仓鼠，非洲跳鼠，金仓鼠，橙腹田鼠，灰色短尾负鼠，老鼠，八齿鼠，沟鼠)；白犀牛；普金鼹；鸽子(包括岩鸽)；乌鸦(包括美洲乌鸦)；刺猬(包括马达加斯加小刺猬)；蝙蝠(包括大褐蝙蝠，食虫蝙蝠，黑狐蝠)；马；猎隼；猫(包括家猫)；鸡；猩猩(包括银背大猩猩，矮黑猩猩，黑猩猩，苏门答腊猩猩)；人；海豹(包括威德尔氏海豹)；江豚；火鸡(包括野火鸡)；鹦鹉(包括虎皮鹦鹉)；貂(包括养殖雪貂)；鼠兔(包括美洲鼠兔)；海象(包括太平洋海象)；兔；虎(包括东北虎)；藏羚；狒狒；鹿(包括草原鼠鹿；马鹿；梅花鹿)；鲸(包括抹香鲸)；海牛(包括佛罗里达海牛)；北极熊；羊驼；麻雀(包括白颌麻雀)；鹅；鹌鹑；驴；狐狸；貉。

本发明的引物和探针以及基于它们的检测方法对于哺乳纲和鸟纲动物体系具有很高的特异性和较低的异质性。

本发明所建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系的检测绝对灵敏度为5pg DNA，大约等于不同物种的2-5个拷贝数。可准确定量的样品DNA浓度最低可以为10pg。

本发明建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系的相对检测下限可低至0.001％，相对定量下限可低至0.01％。

本发明建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系具有很好的重复性，标准偏差和相对标准偏差均在较小的范围之内，表明本发明建立的定量方法具有较好的稳定性和可重复性。

因此，本发明的检测方法完全能够满足日常检测的要求。

试剂盒

本发明还涉及一种用于鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO:3所示的探针。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测哺乳纲和鸟纲动物源性成分的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示一种可特异性鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的目标片段，该目标片段还能用作哺乳纲和鸟纲动物的内参照基因。

(2)首次揭示可特异性鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的引物，所述的引物特异性良好，对于哺乳纲和鸟纲动物源性成分能够实现特异性扩增，而对于其它物种源性的成分则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(3)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测哺乳纲和鸟纲动物源性成分，从待测样品中快速准确地区分真假哺乳纲和鸟纲动物源性成分，并且所需样品量少，操作简单。较佳地，本发明应用Taqman实时荧光PCR技术，可快速实现待测样品如食品中哺乳纲和鸟纲动物成分的准确鉴定。

(4)本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

1.1样品收集

肉类样品采集于上海的各大超市、市场、批发商及口岸，主要有：

鸟纲动物包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、鸽子；哺乳纲动物包括牛、猪、绵羊、山羊、水牛、牦牛、兔子、驴、骆驼、狗、老鼠、豚鼠、猫、马、狐狸、貂、貉、猴子、马鹿、梅花鹿；

8种水产类样品，包括：三文鱼、草鱼、虹鳟、山瑞鳖、河虾、青蛙、牡蛎、螃蟹；以及

14种植物样品，包括：棉花、玉米、大豆、大米、油菜、小麦、高粱、苜蓿、土豆、番茄、蓝莓、木瓜、荔枝、龙眼。

1.2基因组DNA提取

用无菌手术刀切取肉类内部肌肉，并将其切成小块，置于烘箱(105℃)烘干48个小时，然后采用冷冻研磨机(Spex 6850型，美国)将肉研磨成均匀的干粉，用于DNA提取。称取研磨后的100mg样品，采用天根植物组织基因组DNA提取试剂盒(Cat：#DP305-02，TianGen，北京)并，参照其说明书进行提取，3个平行，1个提取空白。提取得到的DNA溶液利用微量分光光度计(GE公司Nanovue Plus，美国)测定其浓度和纯度，保存于-20℃备用。

所有肉类基因组DNA提取与纯化均采用氯仿/乙醇法。具体操作如下：

(1)取研磨好的肉类粉末100mg于2mL离心管中，加入700-800μL组织细胞裂解液(Tiangen，GP1)，颠倒混匀；

(2)继续加入10-20μL蛋白酶K，迅速颠倒混匀，将离心管放置于恒温孵育器内65℃孵育30-60min；

(3)向经过水浴后的离心管中加入700μL氯仿，充分混匀后，置于离心机中12000rpm离心5-10min；

(4)经过离心后的溶液会出现分层现象，将上层水相小心地转移至新的离心管，加入700μL缓冲液(Tiangen，GP2)，充分混匀；

(5)吸取700μL混匀后的溶液转入吸附柱(Tiangen，CB3)中，12000rpm离心30s，弃掉废液；

(6)重复上述操作，将剩余混匀的溶液转入吸附柱(Tiangen，CB3)中，12000rpm离心30s；

(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液(Tiangen，GD)，置于离心机中12000rpm离心30s，离心后弃掉废液；

(8)向吸附柱中加入600μL缓冲液(Tiangen，PW)，置于离心机中12000rpm离心30s，离心后弃掉废液；

(9)重复操作步骤8；

(10)将吸附柱12000rpm离心2min，弃掉废液。将吸附柱在室温下放置2-5min左右，晾干吸附滤膜上残余的缓冲液；

(11)吸附滤膜彻底晾干后，将吸附柱转入一个新的离心管中，悬空向吸附滤膜的中央加入100μL缓冲液(Tiangen，TE)，室温放置5-10min，待吸附滤膜充分吸收洗脱液后，将离心管置于离心机中12000rpm离心2min，此时，离心管中收集到的溶液即为提取的DNA溶液；

(12)重复操作步骤(11)可以增加基因组DNA的得率。

1.3引物和探针设计

本发明人在研究中发现，由于线粒体基因的不恒定拷贝数，利用线粒体基因18SrRNA、12S rRNA、细胞色素b，COI基因等并不能从各种动物中有效地区分和对哺乳纲和鸟纲动物成分进行定量。为了找到更良好的可实现对哺乳纲和鸟纲动物进行有效鉴定和定量的基因，本发明人深入比较、分析了大量的动物基因组信息。发现以动物的核基因组中特定片段作为分析鉴定的靶标，可以有效地区分和定量哺乳纲和鸟纲动物成分。

根据所有收集到的动物的基因序列，进行序列比较，设计了许多特异性引物和探针，经过比较和优化，找到一对引物和相匹配的探针鉴别哺乳纲和鸟纲动物，作为通用的基因序列。引物序列详见表1。

表1、PCR所用的引物、探针序列

注：Y：简并基因，替代C/T。

Gal表示鸡γ-干扰素基因，Sus表示猪β-肌动蛋白基因，Bta表示牛生长激素基因。

1.4实时荧光PCR扩增反应条件

实时荧光PCR反应体系总体积25μL，包含2×Taqman Master Mix(AppliedBiosystems，美国)12.5μL；上游引物(10μM)1.00μL；下游引物(10μM)1.00μL；探针(10μM)0.50μL；超纯水(ddH₂O)8.00μL DNA；模板DNA 2.00μL。

实时荧光PCR扩增反应条件为：50℃热启动2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火/延伸60s，共计45个循环；60℃收集荧光信号。利用ViiA^TM7 Real Time PCRSystem仪数据分析软件ViiA^TM7 Software Version 1.2.2对实验结果进行分析。

1.5特异性和异质性实验

特异性实验

为了测试建立的哺乳纲和鸟纲物种的实时荧光PCR检测方法的特异性，以猪为阳性对照；8种水产样品，包括三文鱼、草鱼、虹鳟、山瑞鳖、河虾、青蛙、牡蛎、螃蟹以及14种植物样品，包括棉花、玉米、大豆、大米、油菜、小麦、高粱、苜蓿、土豆、番茄、蓝莓、木瓜、荔枝、龙眼，共23个基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个样本三个平行试验。

异质性实验

为了测试建立的哺乳纲和鸟纲物种的实时荧光PCR检测方法的同异性，以16种可食用的动物样品，鸟纲动物包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、鸽子，哺乳动物类包括牛、猪、绵羊、山羊、水牛、牦牛、兔子、驴、骆驼、狗；10种食物链中不可食用的肉类，包括老鼠、豚鼠、猫、马、狐狸、貂、貉、猴子、马鹿、梅花鹿，共26个动物基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个样本三个平行试验。

1.6拷贝数测定

将目标片段与鸡、猪、牛的单拷贝基因的拷贝数进行比较，验证该目标片段的拷贝数。将提取的鸡、猪、牛的DNA溶液进行梯度稀释，稀释为4个浓度，依次为50，25，12.5和2.5ng/μL，进行实时荧光PCR扩增，扩增后，分别比较哺乳纲和鸟纲动物的相应的目标片段与鸡的γ-干扰素基因、猪的β-肌动蛋白基因、牛的生长激素基因的Ct值大小。每个样本三个平行试验，整个实验重复三次。

1.7绝对灵敏度实验

为了测试所建立的肉类种源定量PCR检测方法的检测下限，绝对灵敏度通过提取的鸡、猪、牛、羊、鸭、老鼠的DNA溶液，依次用0.1×TE缓冲液梯度稀释为1、0.1、0.01、0.005、0.0025和0.0001ng/μL，每个浓度5个平行，整个实验重复4次，共有20个反应，计算20次反应中出现阳性扩增的次数。

1.8相对灵敏度实验

为了测试所建立的肉类种源定量PCR检测方法的检测下限，相对灵敏度通过将鸡、猪、牛、羊、鸭、老鼠的肉粉分别与大豆粉混合成5个不同比例(10.0％、1.0％、0.1％、0.01％和0.001％)的混合物后，提取DNA，进行荧光PCR，每个比例5个平行，整个实验重复4次，共有20个反应，计算20次反应中出现阳性扩增的次数。

1.9标准曲线的建立

为了评估所建立的肉类种源定量PCR检测方法，提取的鸡、猪、牛、羊、鸭、老鼠的DNA溶液的5个连续稀释度(100、10、1、0.1、0.05ng/μL)制作标准曲线，每个PCR反应中的实际DNA量为200、20、2、0.2、0.1ng。每个浓度3个平行，整个实验重复三次。建立横坐标为DNA模板量的对数值，纵坐标为相对应Ct值的标准曲线，计算标准曲线的R²和反应效率(E＝[10^(-1/slope)-1]×100％)。

1.10可重复性分析

为了验证所建立的肉类种源定量PCR检测方法的可重复性，将提取的鸡、猪、牛、羊、鸭、老鼠的DNA溶液连续梯度稀释为：100、10、1、0.1、0.05ng/μL，进行实时荧光PCR扩增，每个浓度设置4个平行，实验重复3次。分别计算四次平行间Ct值的标准偏差(SD_r)与相对标准偏差(RSD_r)；三次重复间Ct值的标准偏差(SD_R)与相对标准偏差(RSD_R)。

1.11盲样测试

为了评估所建立的肉类种源定量PCR检测方法的准确性，制备了12种含有不同比例鸡、猪、牛、羊、鸭、老鼠肉粉的混合样品。首先，将6个品种的肉切成小块，放置于恒温箱中80℃烘干48h，然后将烘干的肉类样品置于冷冻研磨器中充分粉碎。然后将充分磨碎的6个动物品种的肉粉按照一定比例进行混合，制备成混样，12份混样的详细比例记录于表2。提取12份混合样品的DNA，进行实时荧光PCR实验。哺乳纲和鸟纲动物的通用体系在相对定量中作为分母来估计全部肉类含量的拷贝数，鸡、猪、牛的体系分别作为分子来估计目的种源肉类含量的拷贝数。通过制备的鸡、猪、牛及通用体系的标准曲线得出各自的Ct值，根据线性方程求出各自的拷贝数，最后计算目的种源肉拷贝数与通用基因拷贝数的比值即为定量结果。混合样品中含有的鸡、猪、牛的比例根据以下公式可以计算得出：

w(％)＝C(meat)/C(universal)。每个样品三个平行，整个实验重复三次，分别计算测试结果的偏差、SD值和RSD值。

表2、12种模拟混合样品对应的不同物种的含量

II.实施例

实施例1、特异性

分别以23个动植物基因组DNA为模板(三文鱼、草鱼、虹鳟、山瑞鳖、河虾、青蛙、牡蛎、螃蟹、棉花、玉米、大豆、大米、油菜、小麦、高粱、苜蓿、土豆、番茄、蓝莓、木瓜、荔枝、龙眼、猪)，应用表1的PCR所用的引物、探针(Uni-F，Uni-R引物、Uni-P探针)进行实时荧光PCR。其中只有猪的基因组DNA有明显的特异性扩增，其它常见水产类以及植物基因组DNA、阴性对照和空白对照均无特异性扩增，不存在交叉污染(图1)。

结果表明，本发明建立的哺乳纲和鸟纲动物体系具有较高的特异性。

实施例2、异质性

分别以26个动物基因组DNA为模板(鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、鸽子，哺乳类包括牛、猪、绵羊、山羊、水牛、牦牛、兔子、驴、骆驼、狗、老鼠、豚鼠、猫、马、狐狸、貂、貉、猴子、马鹿、梅花鹿)，应用表1的PCR所用的引物、探针(Uni-F，Uni-R引物、Uni-P探针)进行实时荧光PCR。结果显示，26个基因组DNA都有明显的特异性扩增，并且Ct值介于23.13-24.51之间(图2)，变化范围很小。

结果表明，本发明建立的实时荧光PCR方法在哺乳纲和鸟纲的不同物种间具有较低的异质性。

实施例3、拷贝数测定

目标基因的拷贝数对于目标物种的定量研究至关重要。为了验证本发明PCR扩增体系获得的目标片段在物种中的拷贝数，本发明人制备了猪、鸡、牛样品的四个梯度浓度(50，25，12.5和2.5ng/μL)的基因组DNA，用于实时荧光PCR检测。

如图3所示，使用鸡的DNA为模板时，目标片段和γ-干扰素基因出现荧光曲线的Ct值大小的偏差分别为0.88％(100ng DNA)，1.17％(50ng DNA)，1.47％(25ng DNA)和1.61％(5ng DNA)；使用猪的DNA为模板时，目标片段和β-肌动蛋白基因出现荧光曲线的Ct值大小的偏差分别为1.95％(100ng DNA)，2.25％(50ng DNA)，2.10％(25ng DNA)和1.47％(5ngDNA)；使用牛的DNA为模板时，目标片段和生长激素基因出现荧光曲线的Ct值大小的偏差分别为0.85％(100ng DNA)，1.15％(50ng DNA)，0.93％(25ng DNA)和0.07％(5ng DNA)。偏差均小于2.5％，表明目标片段与三个所测试的基因具有相同的拷贝数，并且在不同的物种之间拷贝数差异很小。

结果表明，本发明PCR扩增体系获得的目标片段适合作为哺乳纲和鸟纲物种的内参照基因用于肉类成分含量的定量检测和鉴定。

实施例4、绝对灵敏度

绝对检测下限和定量下限代表可被检测到的DNA模板浓度的最小值的置信区间要≥95％。绝对灵敏度采用6个10倍梯度稀释的鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的DNA溶液(1，0.1，0.01，0.005，0.0025，0.0001ng/μL)，应用表1的PCR所用的引物、探针(Uni-F，Uni-R引物、Uni-P探针)分别进行实时荧光PCR扩增。检测下限需满足置信区间要≥95％，意味着在20个反应中阳性扩增的次数需要≥19次。如表3所示，当使用2，0.2，0.02和0.01ng DNA模板量进行扩增时，20个反应中均出现阳性荧光信号；当使用0.005ngDNA模板量进行扩增时，20个反应中出现阳性荧光信号的次数对应鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的检测分别为20，20，19，19，20和19；当使用0.002ngDNA模板量进行扩增时，阳性扩增的次数均少于19次。

表3、实时荧光检测方法绝对检测下限实验结果

*：表示这个样品在20次反应中出现阳性扩增的次数为16次，依次类推。

结果表明，本发明所建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系的绝对灵敏度为5pgDNA，大约等于不同物种的2-5个拷贝数。为了定量哺乳纲和鸟纲动物成分的可靠性，在20次重复中Ct值的偏差应小于0.25，也就是说食物样品中的DNA浓度最低为10pg。

实施例5、相对灵敏度

相对灵敏度采用6个不同比例(10％，1.0％，0.1％，0.01％，0.001％和0.0001％(W/W))的鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠混合物的DNA溶液分别作为模板，应用表1的PCR所用的引物、探针(Uni-F，Uni-R引物、Uni-P探针)进行实时荧光PCR扩增。

结果显示，当使用肉类含量为10％，1.0％，0.1％，0.01％，0.001％的模板进行扩增时，20个反应中均出现阳性荧光信号；阳性荧光信号出现次数发生不同时，是当使用肉类含量为0.0001％模板进行扩增时，20个反应中出现阳性荧光信号的次数对应鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的检测分别为15，14，12，11，14和12(表4)。

表4、实时荧光检测方法相对检测下限实验结果

*：数字2-6分别表示1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％的混合样品。

**：表示这个样品在20次反应中有15次阳性扩增。

结果表明，本发明建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系的相对检测下限可低至0.001％，相对定量下限可低至0.01％。

实施例6、标准曲线的建立

为了测试所建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系，以六个物种(鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠)5个浓度稀释液为模板(100、10、1、0.1、0.05ng/μL)，应用表1的PCR所用的引物、探针(Uni-F，Uni-R引物、Uni-P探针)分别进行实时荧光PCR扩增，建立标准曲线。

当使用鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的DNA稀释液为模板进行扩增时，回归系数R²值均大于0.990，分别为0.998、0.999、0.998、0.999、0.999和0.999，表明6条标准曲线都具有良好的线性相关性。鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的标准曲线的斜率分别为-3.47、-3.51、-3.51、-3.47、-3.47和-3.43，反应效率分别为93.96％、92.74％、92.80％、94.24％、94.33％和95.39％。反应效率均大于90％，斜率接近于理论值-3.32即PCR反应效率为100％。如图4。

标准曲线良好的线性相关性和较好的PCR反应效率表示所建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR方法可以用于肉类种源产品中动物成分定量的深入研究。

实施例7、可重复性分析

可重复性实验采用鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的5个连续稀释度DNA溶液，应用表1的PCR所用的引物、探针(Uni-F，Uni-R引物、Uni-P探针)分别进行实时荧光PCR扩增，计算在一个实验中四次重复的偏差与标准偏差，记为SD_r和RSD_r，以及三次实验重复的偏差与标准偏差，记为SD_R和RSD_R。

当使用鸡的DNA稀释液为模板进行扩增时，实时荧光定量PCR方法的RSD_r值介于0.23-0.49％，SD_r值介于0.06-0.19。当使用猪、牛、羊、鸭、鼠的DNA稀释液为模板进行扩增时，RSD_r值分别介于0.15-0.38％，0.12-0.34％，0.15-1.11％，0.17-0.72％和0.19-0.68％，SD_r值介于0.04-0.15，0.04-0.13，0.05-0.37，0.04-0.29和0.05-0.26(表5)。

三轮实验的可重复性结果为当使用鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠的DNA稀释液为模板进行扩增时，SD_R值为0.11、0.15、0.10、0.13、0.09和0.11，RSD_R值的变化范围很小，均小于1％，介于0.02％-0.46％(表5)。

表5、哺乳纲和鸟纲动物实时荧光检测方法可重复性实验结果

注：*：SD_r：四次平行反应的标准偏差；SD_R：三次重复实验的标准偏差；RSD_r：四次平行反应的相对标准偏差；RSD_R：三次重复实验的相对标准偏差

结果表明，本发明建立的哺乳纲和鸟纲动物定量PCR体系可重复性均很好，标准偏差和相对标准偏差均在可接受范围之内，表明本发明建立的定量方法具有较好的稳定性和可重复性。

实施例8、盲样测试

为了验证哺乳纲和鸟纲动物定量PCR方法在食品中定量检测动物成分的实际应用能力，采用12种含有不同比例的6种肉类(鸡、猪、牛、羊、鸭、鼠)混合样品进行PCR扩增，这12种混合样品分别标记为S1-S12(表2)。

在本实施例中，采用本发明建立的实时荧光PCR方法分别分析和计算12种混合样品中鸡、猪、牛的含量。为了评估方法的准确性和精确性，分别计算三个物种测量值与真实值之间的标准偏差和相对标准偏差。上列三个物种的检测含量以及测量值与真实值之间的偏差结果示于图5和图6。混合样品S1-S12中鸡的检测含量分别为22.23％、19.37％、42.33％、25.52％、8.68％、11.98％、1.18％、40.99％、21.57％、29.25％、1.17％、31.65％，猪的检测含量分别为46.02％、0.00％、0.00％、23.58％、41.45％、26.51％、17.48％、15.47％、14.06％、26.95％、10.13％、30.21％，牛的检测含量分别为47.44％、45.56％、35.05％、36.50％、9.75％、38.86％、30.71％、1.99％、58.81％、10.39％、50.42％、0.81％。在鸡、猪、牛含量的定量检测中，12种混合样品的测量值与真实值之间的相对标准偏差分别介于2.47-20.43％，0.69-22.66％，0.61-21.65％，均在可接受水平25％之内。

结果表明，基于单拷贝基因建立的实时荧光定量检测方法适合用于食品中哺乳纲和鸟纲动物成分含量的检测，本发明的引物扩增获得的核基因组中的靶片段可以作为肉类种源定量的一个内参照检测体系。

实施例9、针对哺乳纲和鸟纲动物的通用性

基于本发明PCR扩增所针对的靶片段，分析本发明的PCR体系在其它物种中的适用性。所分析的动物物种如下：野鸭，牛，水牛，白簇耳狨猴，骆驼，狗，山羊，豚鼠，白犀牛，长尾南美洲栗鼠，绿长尾猴，普金鼹，岩鸽，美洲乌鸦，灰色仓鼠，马达加斯加小刺猬，大褐蝙蝠，马，猎隼，家猫，飞狐猴，鸡，银背大猩猩，人，非洲跳鼠，威德尔氏海豹，江豚，食蟹猕猴，猕猴，野火鸡，虎皮鹦鹉，金仓鼠，橙腹田鼠，灰色短尾负鼠，老鼠，养殖雪貂，食虫蝙蝠，美洲鼠兔，八齿鼠，太平洋海象，兔，小耳夜猴，绵羊，矮黑猩猩，黑猩猩，东北虎，藏羚，狒狒，草原鼠鹿，抹香鲸，苏门答腊猩猩，黑狐蝠，沟鼠，玻利维亚松鼠猴，猪，眼镜猴，佛罗里达海牛，北极熊，羊驼，白颌麻雀。墨西哥丽脂鲤，姥鲨，绿海龟，白斑狗鱼，腔棘鱼，青鳉，孔雀鱼，缅甸蟒蛇，双色雀鲷，热带爪蟾。

所有收集到的动物的基因序列利用DNAMAN软件比对。物种序列比对结果见图7。可见，属于哺乳纲和鸟纲动物的物种均具有很高的靶区域相同性，可以应用本发明的引物探针实现检测。而墨西哥丽脂鲤，姥鲨，绿海龟，白斑狗鱼，腔棘鱼，青鳉，孔雀鱼，缅甸蟒蛇，双色雀鲷，热带爪蟾这些非哺乳纲和鸟纲动物的物种，则相关区段序列差异大，无法应用本发明的引物探针获得阳性结果。

讨论

肉类掺假的现象只通过定性的检测只能确定肉类中的成分，而无法得知具体掺假的量，进而无法判定是人为故意掺假还是加工过程中的污染，那么就无法有效地监管市场中肉类及其制品的掺假。因此，需要建立一个快速、有效、可行、准确的定量方法为食品质量与安全的管理提供技术支持。

目前，国内外也有一些研究选择单拷贝基因为目标基因设计引物探针检测动物成分。Brodmann等以生长激素(growth hormone gene)基因为内参照基因建立哺乳动物的通用体系，结合建立的牛源性成分定量体系，定量食品中牛成分的含量，但是只是通过比较两体系Ct值差异作结论，并且内参照体系只包含了哺乳类动物，在应用范围和实际应用能力上都比较差。

在本发明中，本发明人针对哺乳纲和鸟纲动物开发了基于核基因组的实时荧光PCR方法，共分析了70多种动物品种，可以很大范围地定量动物成分含量。并且，所建立的哺乳纲和鸟纲动物的实时荧光PCR方法具有较高的特异性，很低的异质性，恒定的拷贝数，良好的灵敏度，良好的重复性和较高的准确性，因此，该方法适合用于肉及其制品中动物成分的定量鉴定，并且所建立的通用体系可以作为哺乳纲和鸟纲动物的内参照体系。更重要的是，所建立的哺乳纲和鸟纲动物的PCR系统可以定量多种物种的肉，该方法适合用于常规分析。虽然，哺乳纲和鸟纲系统只能检测哺乳纲和鸟纲动物样品，不能检测水产品，爬行或两栖动物，但是肉类掺假主要是采用价格较为低廉的哺乳纲和鸟纲动物肉来替代更有经济价值的肉类，所以本发明人所建立的内参照体系足以实现对目前市场上的一些肉类制品的检测，进而实现有效监管。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分的方法，其特征在于，所述方法包括：获得来自待测样品的核酸，以该核酸为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物以及SEQID NO:3所示序列的探针进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含哺乳纲和鸟纲动物源性成分；所述的哺乳纲和鸟纲动物为：猪，鸭，牛，猴，骆驼，狗，羊，鼠，白犀牛，普金鼹，鸽子，乌鸦，刺猬，蝙蝠，马，猎隼，猫，鸡，猩猩，人，海豹，江豚，火鸡，鹦鹉，貂，鼠兔，海象，兔，虎，藏羚，狒狒，鹿，鲸，海牛，北极熊，羊驼，麻雀，鹅，鹌鹑，驴，狐狸，貉。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SEQ ID NO:3所示序列的探针是Taqman荧光探针。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR检测是实时荧光PCR检测。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品包括：食品、饮品、保健品。

5.一种鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性的试剂盒，其特征在于，其中包括引物和探针；

所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

所述的探针的序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的哺乳纲和鸟纲动物为：猪，鸭，牛，猴，骆驼，狗，羊，鼠，白犀牛，普金鼹，鸽子，乌鸦，刺猬，蝙蝠，马，猎隼，猫，鸡，猩猩，人，海豹，江豚，火鸡，鹦鹉，貂，鼠兔，海象，兔，虎，藏羚，狒狒，鹿，鲸，海牛，北极熊，羊驼，麻雀，鹅，鹌鹑，驴，狐狸，貉。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针是Taqman荧光探针。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括说明鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性的方法的使用说明书。

9.权利要求5～8任一所述的试剂盒的用途，用于以待测样品的DNA为模板进行PCR反应，形成含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的扩增产物，从而鉴定哺乳纲和鸟纲动物源性成分；所述的哺乳纲和鸟纲动物为：猪，鸭，牛，猴，骆驼，狗，羊，鼠，白犀牛，普金鼹，鸽子，乌鸦，刺猬，蝙蝠，马，猎隼，猫，鸡，猩猩，人，海豹，江豚，火鸡，鹦鹉，貂，鼠兔，海象，兔，虎，藏羚，狒狒，鹿，鲸，海牛，北极熊，羊驼，麻雀，鹅，鹌鹑，驴，狐狸，貉。

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